Влажность препарата «БИОМ-М» определяли по разности массы проб до и после высушивания при температуре (105±2)°С.

Величину относительной гигроскопичности порошка определяли по формуле:

(1)

где К - относительная гигроскопичностъ, ед;

U - влагосодержание в исследуемом материале при соответствующей влажности воздуха, кг/кг (по абсолютно сухому веществу);

Uэ - влагосодержание эталона при соответствующей влажности воздуха, кг/кг.

За эталон была принята фильтровальная бумага, удельная влагоемкость которой считается величиной постоянной во всем диапазоне относительной влажности окружающей среды и равной 0,01 Umax (Umax ~ максимальное сорбционное влагосодержание эталона при температуре 25°С).

Коэффициент неоднородности смеси массы рассчитывали по формуле:

(2)

где Rc - коэффициент неоднородности смеси, %;

Ci - истинная концентрация одного из компонентов, %;

С - средняя концентрация того же компонента, %;

n- число проб;

? - сумма.

Для определения сыпучести порошков пробу весом (50+0,5) г засыпали в воронку. С открытием конуса и началом высыпания порошка регистрировали время истечения всей навески. Расчет проводили по формуле:

(3)

где V - сыпучесть порошка, г/мин;

m - навеска порошка, г;

?S - время истечения всей навески порошка через воронку, мин.

Определение адсорбционной активности по ГОСТ 4453-74.

Для определения сроков годности и условий хранения «БИОМ-М» использовали метод «ускоренного старения» в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода «ускоренного старения» при повышенной температуре. И-42-2-82. Министерство здравоохранения СССР. Министерство медицинской промышленности. 1983 г.» и «Методами контроля бактериологических питательных сред. Методические указания. Мук 4.2.2316-08 (утв. Роспотребнадзором 18.01.2008)».

Отбор проб производился в соответствии с инструкцией. Почва: точечные пробы отбирали в квадратах 1х1 м, расположенных по периметру и в центре площадки, с помощью пробоотборника. Глубина отбора, 0-20 см. Вода: точечные пробы отбирали из озера на различной глубине, из полученного количества составляли усреднённую пробу объёмом 1,5 л.

Контроль метанолутилизирующей активности.

ПДК для метанола в почве не разработана, поэтому должен проводиться пересчет данных по водной вытяжке из почвы (в мг/кг почвы) на содержание в почвенном растворе (в мг/л раствора). Содержание метанола в почвенном растворе (мг/л) рекомендуется сравнивать с санитарной нормой для водоемов (ПНДФ 14.1:2.102-97, РД 52.24.423-2006).

Для извлечения метанола из почвы рекомендуется метод экстракции его дистиллированной водой при соотношении почвы к воде 1:3. Пробы отбирают в банку с притертой пробкой (возможно использование плотно завязанных полиэтиленовых пакетов) и анализируют в тот же день. Хранение образцов почвы допускается при температуре не выше 2-3°С в течение 1-2 суток. Перед анализом почву растирают в фарфоровой ступке и просеивают через сито 1-2 мм. Все операции с почвой (растирание, просеивание и взятие навески) проводят в вытяжном шкафу.

Полученные в экспериментах результаты подвергали статистической обработке на компьютере с использованием стандартного пакета программ "Statistica" по общеизвестным методам вариационной статистики с оценкой статистической значимости показателей и различий рассматриваемых выборок по t-критерию Стьюдента. Различия в сравниваемых группах считались достоверными при уровне значимости 95% (p<0,05).



3. Результаты

3.1. Выбор штаммов микроорганизмов

Штаммы микроорганизмов биопрепарата выбирали из коллекции ВКПМ обладающих метанолдеструктирующими свойствами и микроорганизмы, способствующие восстановлению ризосферы, находящиеся в открытом доступе:

1. Номер штамма - B2664. Род штамма - Corynebacterium. Вид штамма - sp. Родословная штамма и способ его получения - почва, загрязненная метанолом, ЩПО "Азот".

Оптимальная температура роста - 40С.

Применение штамма - утилизация метанола.

Среда для переноса штамма (номер) - 113.

Параметры среды: NH4H2PO4 - 2,0; (NH4)2 HPO4 - 0,5; K2SO4 - 0,2; MgSO4x7H2O - 0,2; агар - 20,0; раствор микроэлементов - 0,5мл; вода дист. - 1,0 л; рН=6,8-7,0э

Раствор микроэлементов (г/л): KI - 0,02; H3BO3 - 0,02; MnSO4x5H2O - 0,02; (NH4)6Mo7O24x4H2O - 0,02; FeSO4x7H2O - 0,1; вода дист. - 1,0 л.

Метанол в концентрации 0,5-1% добавляют после стерилизации.

Штамм ВКПМ B-2664 Corynebacterium sp. не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Corynebacterium sp. не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

2. Номер штамма - В5603. Род штамма - Methylobacterium. Вид штамма - sp. Название (имя) штамма - 1K. Родословная штамма и способ его получения - почва, выделен в 1987 году из ассоциации микроорганизмов, утилизирующих метанол методом накопительных культур с использованием метанола в качестве единственного источника C.

Оптимальная температура роста - 30С.

Применение штамма - деструкция метанола; очистка сточных вод; категория С.

Среда для переноса штамма (номер) - 234.

Параметры среды: KH2PO4 - 3,0; K2HPO4 - 7,0; NH4NO3 - 1,0; MgCl2 - 0,1; метанол - 5,0 мл; агаp - 15,0; вода дист. - 1,0 л; pH=7,6. Метанол добавить после стерилизации.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): (г/л): КН2РО4- 3,0, NH4NO3 - 1,0, MgCl2 - 0,1, *метанол - 5,0 мл, агар - 15,0, вода дист. - 1,0 л; рН=7,6 *Метанол добавить после стерилизации, t -30°С. Инкубация 2-4 суток.

Штамм ВКПМ В-5603 Methylobacterium sp. 1К не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Methylobacterium sp. 1К не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

3. Номер штамма - В3780.

Род штамма - Acinetobacter. Вид штамма - calcoaceticus. Название (имя) штамма - 134. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - (Pseudomonas sp.). Родословная штамма и способ его получения: сточные воды производства фенолформальдегидных смол.

Оптимальная температура роста - 25 - 28С.

Применение штамма - деструкция метанола; деструкция формальдегида; деструкция фенола; очистка сточных вод.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): МПА; среда L:(г/л): дрож. экстракт - 5,0; пептон - 15,0; NaCl - 5,0; агар - 15,0; вода дист. - 1,0 л., t-25-28°C.

Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом ВКПМ В-3780 Acinetobactercalcoaceticus 134 не требует специальных мер предосторожности.

4. Номер штамма - В5150. Род штамма - Pseudomonas. Вид штамма - putida. Автор(ы) вида или подвида - (Trevisan 1889) Migula 1895. Название (имя) штамма BS-2. Родословная штамма и способ его получения - почва около предприятия газовой промышленности, выделен в 1987г. из ассоциации м/о, утилизирующих диэтиленгликоль методом накопительных культур.

Оптимальная температура роста - 20 - 25С.

Применение штамма - деструкция диэтиленгликоля; очистка сточных вод.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма - МПА (МПБ), температура культивирования - 20-25°С. Не растет при температуре 37°С. Инкубация 2-4 суток.

Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida BS-2 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida BS-2 не относится к микроорганизмам, патогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.

5. Номер штамма - Y1246. Род штамма - Candida. Вид штамма - methylica. Автор(ы) вида или подвида - Trotsenkoetal., 1974. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - BKM Y-2356.

Оптимальная температура роста - 28С.

Применение штамма - способность утилизировать метанол.

Среда для переноса штамма (номер) - 140.

Параметры среды: глюкоза - 20,0; пептон - 10,0; дрож. экстракт - 5,0; агар - 20,0; вода дист. - 1,0 л

Условия культивирования штамма: полная дрожжевая среда (г/л): глюкоза - 20; дрожжевой экстракт - 5; пептон - 10; t = 28°С.

Штамм Candidaboidinii ВКПМ Y-1246 относится к микроорганизмам 4 группы патогенности согласно классификации микроорганизмов, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом ВКПМ Y-1246 требует специальных мер предосторожности, соответствующих уровню работы с патогенными микроорганизмами 3-4 групп патогенности.

6. Номер штамма - В607. Род штамма Bacillus. Вид штамма - megaterium. Автор(ы) вида или подвида - deBary 1884. Имена-синонимы штамма (номера в других коллекциях) - BKM-396, ИHMИA 909. Родословная штамма и способ его получения - серозем, Таджикистан.

Оптимальная температура роста - 30С.

Применение штамма - категория С.

Среда для переноса штамма (номер) - 1.

Параметры среды: мясная вода - 1,0л; NaCl - 5,0; пептон - 10,0; агар (если нужно) - 20,0; рН= 6,8-7,0.

Стерилизовать при 1 атм. 30 минут.

Мясная вода: 500 г обезжиренного фарша залить 1л водопроводной воды, проэкстрагировать при 37-39С в течение 2 часов, отжать через марлю, затем прокипятить 30 минут, отфильтровать через вату и довести объем до 1 л.

Условия культивирования штамма (состав среды, температура и т. д.): L-среда (г/л): дрож. экстракт - 5,0, пептон - 15,0, NaCl - 5,0, агар - 15,0, вода дист. - 1,0л, 30С.

Штамм Bacillusmegaterium ВКПМ В-607 не является генетически модифицированным штаммом. Штамм Bacillusmegaterium ВКПМ-607 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека, согласно классификации микроорганизмов, приведенных в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. Работа со штаммом Bacillusmegaterium ВКПМ В-607 не требует специальных мер.

Штамм Bacillusmegaterium ВКМ В-396 (RU 2147181, 2000) входит в состав биопрепарата «Альбит» повышающего урожай растений и защищающего их от болезней. Штамм синтезирует комплекс рост стимулирующих соединений: естественный биополимер поли-бета-гидроксимасляная кислота.

Штамм ВКПМ B-2664 Corynebacterium sp. оказался не жизнеспособным. Штамм Candidaboidinii ВКПМ Y-1246 относится к микроорганизмам 4 группы патогенности, что определило невозможность его использования в биопрепарате. Штамм ВКПМ В-5150 Pseudomonasputida обладает выраженными свойствами деструкции ароматических углеводородов и не является метанолодеструктором.

Учитывая, что метанол, как источник углерода и энергии, используется бактериями, объединенными в группу метилотрофов, выбор штаммов, обладающих метанолутилизирующей способностью, проводился на основе аналитического анализа микроорганизмов, обладающих этим свойством и находящихся на хранении в ВКПМ. В результате были отобраны и приобретены следующие штаммы:

- Acinetobactercalcoaceticus, ВКПМ В-3780,

- Methylobacterium sp, ВКПМ В-5603.

В качестве почвенного микроорганизма был выбран и приобретен штамм Bacillusmegaterium, ВКПМ В-607.

Наиболее эффективным и экономически выгодным является препарат с клеточным титром 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г препарата, получивший условное наименование «БИОМ-М».

Увеличение концентрации клеток более 1010 мкл/г не приведет к значительному увеличению скорости деструкции загрязнителя, однако неоправданно увеличит стоимость работ по очистке, так как увеличение скорости биодеструкции будет незначительным по сравнению с увеличением стоимости препарата. При концентрации клеток микроорганизмов менее 107 KOE/г в биопрепарате, технический результат достигнуть не удастся, вследствие снижения требуемой скорости биодеструкции загрязнителя.

3.2. Выбор компонентов препарата

Выбор компонентов биопрепарата основывался в первую очередь на выборе эффективного сорбента для иммобилизации микроорганизмов биопрепарата, сорбента для использования при контактно-сорбционном обезвоживании биопрепарата, с целью отказаться от высокого затратного способа лиофилизации, ионообменника способствующего восстановлению ризосферы обрабатываемых участков, удобрения для роста растительности на обрабатываемых участках почвы и как следствие более длительного действия микроорганизмов биопрепарата и безопасного для флоры и фауны.

Все этим требованиям в полной мере отвечает природный алюмосиликат, ионообменник - глауконит.

По решению Международного номенклатурного комитета глауконитом следует называть железистую диоктаэдрическую слюду, неразбухающую, с (Al, Fe3+) IV> 0.2, (Fe3+, Al) IV1.2, Fe3+ ? Al.

Отличительной особенностью глауконита от остальных цеолитов в первую очередь является то, что он обладает слоистым строением, благодаря чему площадь активной поверхности значительно увеличивается и самое главное глауконит содержит обширный набор микроэлементов, которыми он может обмениваться по ионообменному принципу, и плюс он содержит в значительном количестве K, являющийся незаменимым удобрением для большинства растений. Еще одно преимущество глауконита, то, что он увеличивает диффузию кислорода и влаги в почве, что обеспечивает оптимальный водный, газо-воздушный и тепловой режим для роста численности микроорганизмов, как иммобилизованных на нем, так и содержащихся в почве. При этом усиливается активность метаболитных ферментов и значительно увеличивается энергия всех биохимических процессов.

Выявлено стимулирующее действие глауконита на развитие полезной микрофлоры почв, определяющих их плодородие. Предпосылкой этому, прежде всего, является высокое содержание в глауконитах оксида калия (от 5,0 до 9,5%), способность его быстро разрушаться в почве с высвобождением калия в виде легко усвояемых соединений. Важным обстоятельством является то, что в глауконитах нередко в значительных количествах присутствуют микроэлементы (Mn, Cu, Co, Ni, B и др.), а многие залежи глауконитовых пород содержат высокую примесь P2O5 и даже включают горизонты фосфоритов. Все это дает основание рассматривать глаукониты как природное минеральное удобрение, позволяющее не только обогащать почву калием, но и улучшать ее структуру, сохранять влагу, стимулировать рост и снижать заболеваемость растений.

Глаукониты обладают высокими адсорбционными и катионообменными свойствами и могут использоваться в качестве адсорбента тяжелых металлов, нефтешламов, загрязняющих водные объекты и почву, а также для ликвидации загрязнений, находящихся в осадках очистных сооружений и промышленных стоков, в грунтах и водных объектах, с помощью площадного внесения и создания геохимических барьеров. Глауконит применяется при реабилитации территорий, пораженных радионуклидами или имеющих высокую техногенную нагрузку в результате деятельности промышленных предприятий.

Высокая поглотительная способность глауконита может быть использована для решения задач инженерной геоэкологии по защите окружающей среды от воздействия различных экотоксикантов, способных интенсивно мигрировать в гидро- и геосфере и тем самым нарушать нормальный ход биохимических процессов.

С помощью глауконита из загрязненных вод практически полностью удаляются соединения аммиака, нейтрализуются соединения кальция и железа. Сорбционные свойства глауконита позволяют осуществить комплексную очистку вод до требований СанПин 2.1.4.1074-01. При этом глауконит не только детоксицирует, но и регулирует кислотность и жесткость любой воды.

В животноводстве и птицеводстве глауконит используется как кормовая добавка (до 30%) и основа конструирования БАД к пище с энтеросорбционными и ионообменными свойствами. Он улучшает обменные процессы, повышает переваримость и усвояемость корма, снижает концентрацию аммиака, микотоксинов и других токсичных компонентов, образующихся в организме при пищеварении и жизнедеятельности, а также поступающих с кормом тяжелых металлов, радионуклидов и других токсикантов, в том числе биологического происхождения; регулирует соотношение кальция и натрия и улучшает снабжение организма железом. Так как он в итоге представляет собой минеральное удобрение, то после применения биопрепарата отпадает необходимость его утилизации.

Глауконит относится к IV группе классификации химических соединений (ГОСТ 12.1.00.76), не обладает кумулятивным, аллергизирующим действием, не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистые оболочки. Биологическая проба, проведенная на белых крысах, показала, что скармливание животным кормов, содержащих 4% глауконита, способствует увеличению массы тела крыс.

В качестве глауконит содержащего носителя может использоваться как чистый глауконит, так и глауконитовую породу, содержащую от 60 до 80% глауконита.

Уникальность свойств глауконита определило его использование как компонента биопрепарата.

3.3. Конструирование биопрепарата

На основании проведенного аналитического анализа данных литературы была предложена экспериментальная лабораторная пропись метанолутилизирующего препарата «БИОМ-М», состоящая из масс. %: алюмосиликата осадочного происхождения (глауконита) - 89%; аэросила - 1%; биокомпонента, содержащего культуры штаммов метанолутилизаторов - 10%.

Микроорганизмы биопрепарата Bacillusmegaterium ВКПМ B-607; Methylobacterium sp. ВКПМ B-5603; Acinetobactercalcoaceticus ВКПМ B-3780 выращиваются раздельно в биореакторе до содержания 1011-1012 мкл/мл, известными способом и, затем готовят микробную ассоциацию смешиванием в реакторе при 25С определенного соотношения культуральных жидкостей, до содержания 1012 мкл/мл, полученную микробную ассоциацию захолаживают в реакторе при температуре 14-16С.

Выращивание культур проводили в цехе культивирования ООО «СИНБИОНТ» г. Киров.

Раздельное культивирование позволяет широко варьировать при конструировании биопрепаратов в отличие от совместного выращивания.

Глауконит препарата измельчается на шаровой мельнице до 50% содержания частиц размером 500-600 мкм, просеивается через сита №600 и досушивается до остаточной влажности 4% при температуре 190С в сушильных шкафах. Приготовление биопрепарата осуществляется методом контактно сорбционного обезвоживания на глауконите смешивание ассоциации с глауконитом осуществляется, в специализированном смесителе обеспечивающим смешиванием в одном объеме расчетных долей культуральных жидкостей с глауконитом до содержания 109 мкл/мл. Процесс в смесителе осуществляется напылением расчетного количества (10 л) микробного аэрозоля ассоциации микроорганизмов на фонтанирующий слой глауконита (50 кг) при температуре теплоносителя - воздуха (стерильного) 40С и скорости 10 м/с. Иммобилизация завершается при достижении влажности в конечном биопрепарате 4% и содержании живых бактериальных клеток 109 мкл/г.

Наиболее экономически оправдано проводить процесс при содержании глауконита в носителе не менее 60%.

Следующим этапом конструирования биопрепарата стало установление диапазона метилутилизирующей способности штаммов микроорганизмов, полученных из ВКПМ, уточнение прописи биокомпонента с учетом совместимости микробных культур, их биологической концентрации и внесения дополнительных ингредиентов для улучшения эксплуатационных свойств конечного препарата.

Оценку метанолутилизирующей способности штаммов Acinetobactercalcoaceticus, Methylobacterium sp., Bacillusmegaterium проводили на основании определения их способности к росту и накопительной активности при культивировании на плотной питательной среде в чашках Петри (пропись 1) содержащих 20 г/л метанола.

Оценку метанолутилизирующей способности при выращивании на плотной питательной среде проводят на основании способности к формированию колоний при аналогичных условиях выращивания.

Результаты теоретических и экспериментальных исследований свидетельствуют о том, что отобранные штаммы метилотрофных микроорганизмов Acinetobactercalcoaceticus ВКПМ В-3780 и Methylobacterium sp. ВКПМ В-5603 обладают способностью к росту при культивировании на плотной питательной среде при добавлении в качестве источника углерода 2% метанола.

С учетом полученных результатов исследований на следующем этапе экспериментальных работ было проведено определение минимально подавляющей концентрации метанола, блокирующей полное развитие микробных культур на плотной (пропись 1) питательной среде, в которую после приготовления вносился метанол в концентрации 20, 40, 60, 80, 100, 120 см3/дм3. Концентрация вносимых микробных клеток в реакционную смесь соответствовала аналогичному показателю для экспериментального образца биопрепарата, а также рекомендациям для оценки ингибирующего действия антибиотиков, химиопрепаратов, дезинфектантовinvitro и составляла 1,3х10^8 живых микробов.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1. Результаты оценки устойчивости изучаемых штаммов микроорганизмов к метанолу в плотной питательной среде

Используемая культура	Наличие роста исследуемой культуры при содержании метанола, см3/дм3	Величина мпк, см3/дм3
	20	40	60	80	100	120
Acinetobacter Calcoaceticus	+	+	+	+	-	-	100
Methylobacterium sp.	+	+	+	+	+	-	120
Bacillus megaterium	+	-	-	-	-	-	40

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

Наличие жизнеспособности изучаемых микробных штаммов определяли на основании контрольного высева из опытных проб на плотную питательную среду (пропись 2). Заключение о величине минимально подавляющей концентрации при выращивании на плотной питательной среде, содержащей метанол, делали на основании отсутствия роста колоний.

Полученные результаты исследований показали, что величина минимально подавляющей концентрации метанола составляет для штаммов метилотрофов:

Acinetobactercalcoaceticus - 100 см3/дм3;

Methylobacterium sp. - 120 см3/дм3.

Для культуры Bacillusmegaterium аналогичный показатель соответствовал показателю 40 см3/дм3.

В то же время изучение морфологии микробных клеток в мазках, окрашенных по Грамму, свидетельствовало о том, что при содержании метанола в концентрации 20 см3/дм3 происходит переход изучаемых микроорганизмов из бациллярной формы в споровую.

Оценка совместимости микробных культур, входящих в состав предлагаемого биопрепарата, не выявила взаимного ингибирующего действия отобранных штаммов. На последующем этапе экспериментальных исследований была проведена оценка метанолутилизирующей способности двух вариантов биопрепарата, состоящих из:

Acinetobactercalcoaceticus, Methylobacterium sp. - первый вариант и аналогичный, но с включением Bacillusmegaterium - второй вариант.

При приготовлении первого варианта биопрепарата соотношение культур составляло с учетом исходной концентрации микробов 1х10^9 КОЕ/см3:

Acinetobactercalcoaceticus - 50%;

Methylobacterium sp. - 50%.

Второй вариант содержал:

Acinetobactercalcoaceticus - 30%;

Methylobacterium sp. - 60%;

Bacillusmegaterium - 10%

и соответствовал композиции экспериментального образца, в котором концентрация микробов каждого штамма составляла 1х109 КОЕ/см3.

Заключение о величине ингибирующей дозы делали на основании контрольного высева из реакционной среды на чашки с плотной питательной средой (пропись 2), обеспечивающий формирование колоний исследуемых микроорганизмов на ее поверхности при наличии жизнеспособных клеток. Аналогичный метод использовался при определении минимально подавляющей концентрации метанола при ингибировании изучаемых биокомпонентов на чашках с плотной питательной средой (пропись 1).

Концентрация вносимых микробных клеток в реакционную смесь соответствовала аналогичному показателю для экспериментального образца биопрепарата, а также рекомендациям для оценки антибактериального действия антибактериальных препаратов и дезинфектантовinvitro.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2. Результаты оценки устойчивости изучаемых композиций метанолутилизаторов к метанолу в плотной питательной среде

Используемая культура	Наличие роста исследуемой культуры при содержании метанола, см3/дм3	Величина мпк, см3/дм3
	20	40	60	80	100	120
Acinetobactercalcoaceticus+ Methylobacterium sp.	+	+	+	+	+	-	100
Acinetobactercalcoaceticus+ Methylobacterium sp. + Bacillus megaterium	+	+	+	+	+	-	40

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

При пересеве и выращивании на плотной универсальной накопительной питательной среде определялось формирование колоний всех штаммов, входящих, как в первую, так и во вторую композицию метанолутилизаторов.

Таким образом, проведенные исследования позволяют сделать заключение о возможности использования разработанной композиции биокомпонента при содержании метанола в воде или почве, не превышающие 100 см3/кг (см3/дм3).

3.4. Экспериментальная оценка возможности применения метанолутилизирующего препарата в морской воде, засоленной почве

Для оценки метанолутилизирующей способности метилотрофов, входящих в состав биопрепарата при наличии в реакционной среде различных концентраций солей (в перерасчете на NaCl), была проведена экспериментальная оценка по определению блокирующей размножение изучаемых микробов величины содержания NaCl в плотной питательной среде (пропись 1), содержащей 100 г метанола на 1 дм3 среды.

При определении количества вносимой соли (NaCl) учитывали имеющиеся данные литературы об аналогичной величине в морях (Черном, Азовском, Балтийском, Каспийском и других), находящихся на территории России, и составляющей максимально 50 г на дм3 воды. На основании этих результатов в питательную среду вносили 10, 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140 г NaCl на 1 дм3 плотной питательной среды (пропись 1). Величина посевной дозы соответствовала количеству микробных клеток, содержащихся в одном грамме биопрепарата. Культивирование осуществляли при температуре 30°С в шуттель-аппарате. По истечении указанного срока для оценки наличия жизнеспособных микроорганизмов производили высев на накопительную плотную питательную среду (пропись 2).

Полученные результаты показали, что величина 120 см3/дм3 NaCl в плотной питательной среде, содержащей метанол, блокирует развитие микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата. При внесении 100 см3/дм3 NaCl после инкубирования на плотной питательной среде с последующим высевом на плотную накопительную питательную среду (пропись 2) выявляется рост колоний изучаемых штаммов.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты оценки устойчивости изучаемой композиции метанолутилизаторов к действию NaCl

Исследуемый материал	Наличие роста исследуемых культур при содержании NaCl, см3/дм3	Величина мбк, см3/дм3
	10	20	40	60	80	100	120	140
Биопрепарат, включающий Acinetobactercalcoaceticus; Methylobacterium sp.; Bacillus megaterium	+	+	+	+	+	+	-	-	120

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

Таким образом, проведенные исследования показали, что при концентрации метанола в плотной питательной среде в качестве единственного источника углевода для размножения микроорганизмов, входящих в состав биокомпонентаметанолутилизатора, в концентрации 100 см3/дм3 сохраняется способность к утилизации метанола и накоплению биомассы при содержании в плотной питательной среде солей (в перерасчете на NaCl) не более 100 см3/дм3.

Полученные результаты определили пограничные условия использования созданного биопрепарата в морской воде и засоленной почве.

3.5. Оценка возможности улучшения эксплуатационных характеристик за счет внесения дополнительных ингредиентов в состав биопрепарата

На заключительном этапе данной научно-исследовательской работы изучалась возможность улучшения эксплуатационных свойств разработанного биопрепарата, что определялось следующими показателями:

- повышением выживаемости микробных клеток при аэрозольном нанесении на сорбент (глауконит) в процессе витания в аэрозоле и последующем его прикреплении к алюмосиликату осадочного происхождения;

- повышением устойчивости к ингибирующему действию метанола на основании повышения минимально подавляющей концентрации роста метанолутилизаторов при наличии избыточного количества соли, в перерасчете на NaCl.

Анализ данных литературы свидетельствует о том, что повышение устойчивости микробных клеток к действию экстремальных факторов определяется созданием псевдокапсулы, за счет дополнительно вносимых ингредиентов, и в первую очередь глицерина.

Для оценки возможности улучшения эксплуатационных характеристик были приготовлены две разновидности биопрепарата, одна из которых содержала микробные культуры отобранных штаммов, а во вторую, приготовленную по аналогичной прописи, был добавлен глицерин в количестве 6%.

Для оценки выживаемости микробных клеток при аэрозольном нанесении 10 см3 эмульсии, содержащей 2,5х10^9 живых микробных клеток, на 90 г сорбента определяли содержание живых микробов в 1,0 г готового биопрепарата.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 4.

Проведенные исследования позволяют сделать заключение о повышении концентрации микробных клеток в биопрепарате в результате внесения в композицию биопрепарата 6% глицерина, обеспечивающее повышение устойчивости микробов к аэрозолированию с последующим осаждением на сорбент.



Таблица 4. Результаты оценки внесения глицерина в композицию биокомпонента на конечную концентрацию живых микробов в биопрепарате

Исследуемый биопрепарат	Концентрация микробных клеток в биопрепарате, КОЕ/ см3, 109	Концентрация микробных клеток в 1 г бипрепарата, КОЕ/г, 109	Эффективность нанесения, %
Без внесения глицерина	2,52	0,16	6,3
С внесением 6% глицерина	2,50	0,23	9,2

На следующем этапе проводимых исследований было изучено влияние вводимого в композицию глицерина на повышение устойчивости метанолутилизаторов к действию метанола на основании определения его минимально подавляющей концентрации при выращивании на плотной питательной среде, содержащей метанол в количестве 60, 80, 100, 120, 140 см3/дм3. Результаты проведенных исследований представлены в таблицах 5, 6.

Таблица 5. Результаты оценки внесения глицерина в композициюбиопрепарат на устойчивость к метанолу в плотной питательной среде

Используемый биопрепарат	Наличие роста исследуемых культур при содержании метанола, см3/дм3	Величина мпк, см3/дм3
	60	80	100	120	140
Без внесения Глицерина	+	+	+	-	-	120
С внесением 6% глицерина	+	+	+	-	-	120

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов



Таблица 6. Результаты оценки внесения глицерина в композицию биопрепарата на ее устойчивость к действию NaCl в плотной питательной среде

Используемый биопрепарат	Наличие роста исследуемых культур при содержании метанола, см3/дм3	Величина мпк, см3/дм3
	60	80	100	120	140
Без глицерина	+	+	+	-	-	120
С 6% глицерина	+	+	+	-	-	120

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

Количество метанола в пробах составляло 100 см3/дм3.

Проведенные исследования показали, что внесение глицерина в состав биопрепарата не обеспечивает повышение устойчивости метанолутилизаторов к метанолу.

Аналогичная оценка метанолутилизирующей способности метилотрофов, входящих в состав биокомпонента, при наличии в реакционной среде различных концентраций солей в перерасчете на NaCl для определения показателя их блокирующей размножение микробов концентрации (таблица 7) показала, что внесение 6% в пропись композиции метилотрофных штаммов также не повышало устойчивость к действию NaCl при культивировании на плотной питательной среде, содержащей предельно допустимую концентрацию метанола, что подтверждалось показателем минимально блокирующей концентрации NaCl.

Таблица 5. Результаты оценки внесения глицерина в композицию биокомпонента на ее устойчивость к действию NaCl в плотной питательной среде

Изучаемый биопрепарат	Наличие роста исследуемых культур при содержании NaCl, см3/дм3	Величина мпк, см3/дм3
	60	80	100	120	140
Без внесения Глицерина	+	+	+	-	-	120
С внесением 6% глицерина	+	+	+	-	-	120

+ Наличие роста изучаемых микроорганизмов

- Отсутствие роста изучаемых микроорганизмов

Количество метанола в пробах составляло 100 см3/дм3.

3.6. Разработка технических условий на биопрепарат «БИОМ-М» и технологического регламента на промышленный выпуск биопрепарата

Разработано ТУ 9291?002?26447891?2016 включающее контрольные показатели качества и безопасности и методы контроля.

По органолептическим показателям «БИОМ-М» должен соответствовать требованиям, приведенным в таблице 8.

Таблица 8. Органолептическим показателям «БИОМ-М»

Наименование Показателя	Содержание характеристики
Внешний вид Цвет (в массе продукта) Запах	Однородная порошкообразная масса (допускается слабое комкование) От серого до светло зеленого Без запаха

По физико-химическим показателям «БИОМ-М» должен соответствовать требованиям, указанным в таблице 9.

Таблица 9. Физико-химическим показателям «БИОМ-М»

Наименование показателя	Значение показателя
Массовая доля влаги, %, не более Средний размер частиц, мм, не более Наличие металлических примесей Фазовый состав (подлинность) Глауконит, %, не менее Адсорбционная активность по индикатору метиленовому синему в мг/г продукта, не менее рН водной вытяжки Метанолутилизирующая активность, %, не менее	5,0 0,30,05 Не допускается 333 2,0 6,5-7,5 98,0

«БИОМ-М» по содержанию токсичных элементов должен соответствовать требованиям безопасным для гидробионтов и указанным в таблице 10.

Таблица 10. Содержание токсичных элементов «БИОМ-М»

Наименование вещества (элемента)	Допустимый уровень его содержания, мг/кг, не более
Токсичные Элементы	Свинец	6,0
	Мышьяк	3,0
	Кадмий	1,0
	Ртуть	1,0

Суммарная удельная эффективная активность естественных радионуклидов в «БИОМ-М» должна соответствовать требованиям НРБ-99 и быть не более 370 Бк/кг.

По микробиологическим показателям «БИОМ-М» должен соответствовать требованиям безопасным для гидробионтов и указанным в таблице 11.

Таблица 11. Микробиологические показатели «БИОМ-М»

Наименование показателя	Значение Показателя
Общее количество жизнеспособныхBacillusmegaterium ВКПМ B-607; Methylobacteriumsp. ВКПМB-5603; Acinetobactercalcoaceticus ВКПМB-3780, КОЕ/г, не менее	1 000 000 000
Подлинность культур в препаратеBacillusmegaterium ВКПМ B-607; Methylobacteriumsp. ВКПМ B-5603; AcinetobactercalcoaceticusВКПМ B-3780	Характеристика культурально-морфологических свойств
Масса продукта (г), в которой не допускается:	БГКП (колиформы)	1,0
	Патогенные (в том числе сальмонеллы)	25,0
Посторонняя микрофлора	не более 5% от общего количества клеток, рост плесневых грибов не допускается

Таблица 12. Нормы расхода биопрепарата «БИОМ-М» в зависимости от степени загрязнения

Степень загрязнения, %	Концентрация метанола в 1 т. почвы	Норма расхода биопрепарата (кг) /1 т почвы	Количество обработок	Количество препарата на все обработки на га почвы, кг
До 0,5 %	5 кг метанола	0,5	1	1,7
0,5-1%	5-10 кг метанола	0,5	1	3,4
1-5%	10-50 кг метанола	0,5	1	17,0
5-10%	50-100 кг метанола	0,5	1	34,0
10-20%	100-200 кг метанола	0,5	1	68,0

Максимальная концентрация метанола, допустимая при биологической очистке - 30 мг/л

Приведенные исследования убедительно доказали, что создан высоко эффективный, простой и экономичный биопрепарат - метанолдеструктор «БИОМ-М» с высокой метанолутилизирующей активностью, простым и рентабельным режимом получения перспективный для очистки метанолзагрязненных почв, сточных вод, водоемов и резервуаров, в частности, в районах с коротким тепловым периодом.



4. Обсуждение

В результате исследований была предложена пропись биокомпонентаметанолутилизатора, состоящая из комбинации штаммов:

Bacillus megaterium, ВКПМ, В-607 - 10%;

Acinetobactercalcoaceticus, ВКПМ, В-3780 - 30%;

Methylobacterium sp., ВКПМ В-5603 - 60% и дополнительного ингредиента - глицерина, вносимого в количестве 6% в приготовленный биокомпонент.

С его использованием был приготовлен метанолутилизирующий биосорбент, состоящий из масс. %: биокомпонента - 10%; сорбента (алюмосиликата осадочного происхождения) - 89%; аэросила - 1%.

Определены показатели минимально-подавляющей концентрации метанола для штаммов:

Bacillus megaterium, ВКПМ, В-607;

Acinetobactercalcoaceticus, ВКПМ, В-3780;

Methylobacterium sp., ВКПМ В-5603

и их комбинации - 120 см3/дм3 (кг).

Показана возможность применения биопрепарата в морской воде и засоленной почве при содержании солей (в перерасчете на NaCl), не превышающем 100 см3/кг (см3/дм3).

Установлено, что внесение глицерина в рецептуру биокомпонента повышает устойчивость микробов к аэрозолированию с последующим осаждением на сорбент. Полученные результаты обеспечили выполнение работ по определению эксплуатационных характеристик экспериментального образца метанолутилизирующего препарата.



Выводы

1. В результате анализа были отобраны и приобретены штаммы:

Acinetobactercalcoaceticus, ВКПМ В-3780, Methylobacteriumsp, ВКПМ В-5603, в качестве почвенного микроорганизма был выбран и приобретен штамм Bacillusmegaterium, ВКПМ В-607. Уникальность глауконита не только как депо для иммобилизации микроорганизмов биопрепарата, но и как калийное удобрение с ионообменными свойствами убедительно определило его использование как компонента биопрепарата.

Наиболее эффективным и экономически выгодным является биопрепарат с клеточным титром 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г биопрепарата.

Определена пропись метанолутилизирующего препарата «БИОМ-М», состоящая из масс. %: алюмосиликата осадочного происхождения (глауконита) - 89%; аэросила - 1%; биокомпонента, содержащего культуры штаммов метанолутилизаторов - 10%.

Пропись штаммов биопрепарата метанолутилизатора «БИОМ-М»:

Bacillus megateriumВКПМВ-607 - 10%;

AcinetobactercalcoaceticusВКПМВ-3780 - 30%;

Methylobacteriumsp. ВКПМ В- 5603 - 60%

и дополнительного ингредиента - глицерина, вносимого в количестве 6% в приготовленный биопрепарат.

В результате анализа были отобраны и приобретены штаммы: Acinetobactercalcoaceticus,ВКПМ В-3780, Methylobacteriumsp,ВКПМ В-5603, в качестве почвенного микроорганизма был выбран и приобретен штамм Bacillusmegaterium,ВКПМ В-607. Уникальность глауконита не только как депо для иммобилизации микроорганизмов биопрепарата, но и как калийное удобрение с ионообменными свойствами убедительно определило его использование как компонента биопрепарата.

Наиболее эффективным и экономически выгодным является биопрепарат с клеточным титром 109 колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 г биопрепарата.

Определена пропись метанолутилизирующего препарата «БИОМ-М», состоящая из масс. %: алюмосиликата осадочного происхождения (глауконита) - 89%; аэросила - 1%; биокомпонента, содержащего культуры штаммов метанолутилизаторов - 10%.

Пропись штаммов биопрепарата метанолутилизатора «БИОМ-М»:

Bacillus megateriumВКПМВ-607 - 10%;

AcinetobactercalcoaceticusВКПМВ-3780 - 30%;

Methylobacteriumsp.ВКПМ В- 5603 - 60%

и дополнительного ингредиента - глицерина, вносимого в количестве 6% в приготовленный биопрепарат.

2. Минимально подавляющей концентрации метанола составляет для штаммов метилотрофов: Acinetobactercalcoaceticus- 100 см3/дм3; Methylobacteriumsp.- 120 см3/дм3; Bacillusmegaterium - 40 см3/дм3.

3. Определение пограничных условий использования созданного биопрепарата в морской воде и засоленной почве установило возможность использования разработанной композиции биопрепарата при содержании метанола в воде или почве, не превышающие 100 см3/кг (см3/дм3). При концентрации метанола в плотной питательной среде в качестве единственного источника углевода для размножения микроорганизмов, входящих в состав биопрепарата метанолутилизатора, в концентрации 100 см3/дм3 сохраняется способность к утилизации метанола и накоплению биомассы при содержании в плотной питательной среде солей (в перерасчете на NaCl) не более 100 см3/дм3.

4. На биопрепарат «БИОМ-М» разработаны технические условия ТУ 9291?002?26447891?2016 включающее контрольные показатели качества и безопасности и методы контроля.



Список использованной литературы

1. Гриценко А.И., Истомин В.А., Кульков А.Н., Сулейманов Р.С. Сбор и промысловая подготовка газа на северных месторождениях России. - М.: ОАО «Издательство «Недра», 1999. - 473 с.: ил. - ISBN 5-247-03818-5.

2. Воронцов А.И., Николаевская Н.Г. Вопросы экологии и охраны окружающей среды.: М, 1986.

3. Воронцов А.И., Щетинский Е.А., Никодимов И.Д. Охрана природы.: М, Агропромиздат, 1989.

4. Истомин В.А. Предупреждение и ликвидация газовых гидратов в системах сбора и промысловой обработки газа, и нефти. - М.: ВНИИЭгазпром, 1990, 214 с.

5. Природные и техногенные газовые гидраты: Сборник научных трудов/Под редакцией А.И. Гриценко, В.А. Истомина. - М.: ВНИИГАЗ, 1990, 210 с.

6. Истомин В.А., Якушев В.С., Карпюк В.В. Аналитический библиографический указатель литературы по газовым гидратам (1983-1987 гг.). - М.: ВНИИГАЗ, 1988, 246 с.

7. Дегтярев Б.В., Бухгалтер Э.Б. Борьба с гидратами при эксплуатации газовых скважин в северных районах. - М.: Недра, 1976, 197 с.

8. Бухгалтер Э.Б. Предупреждение и ликвидация гидратообразования при подготовке и транспорте нефтяного и природного газов. - Нефтепромысловое дело. - М.: ВНИИОЭНГ, 1982, выпуск 10 (34), 41 с.

9. Девликамов В.В., Кабиров М.М., Фазлутдинов А.Р. Борьба с гидратами при эксплуатации газлифтных скважин: Учебное пособие. - Уфа: УфНИИ, 1984, 80 с.

10. Макогон Ю.Ф., Малышев А.Г., Седых А.Д., Унароков К.Л., Топчев Ю.И. Временная инструкция по предупреждению и ликвидации гидратов в системах добычи и транспорта газа. - М.: ВНИИГАЗ, 1983, 132 с.

11. Временное методическое руководство по предупреждению и ликвидации гидратных пробок в нефтяных скважинах. - Тюмень: СибНИИНП, 1984.

12. Жданова Н.В., Халиф А.Л. Осушка углеводородных газов. - М.: Химия, 1984, 192 с.

13. Грунвальд А.В. Использование метанола в газовой промышленности в качестве ингибитора гидратообразования и прогноз его потребления в период до 2030 г. // Нефтегазовое дело. 2007. № 2.

14. Сборник документов по безопасности работы с метанолом на объектах министерства газовой промышленности. Под редакцией заместителя начальника Управления охраны труда, военизированных частей и охраны предприятий Министерства газовой промышленности Яновича А.Н., 1987 г.

15. Инструкция о порядке получения от поставщиков, перевозки, хранения, отпуска и применения метанола на объектах газовой промышленности. 1975 г.

16. Инструкция по расчету нормативов потребления метанола для использования в расчетах предельно допустимых или временно согласованных сбросов метанола для объектов ОАО "ГАЗПРОМ" ВРД 39-1.13-010-2000, Москва 2000.

17. Чуракаев А.М. Газоперерабатывающие заводы и установки. - М.: Недра, 1994, 333 с.

18. Гухман Л.М. Подготовка газа северных газовых месторождений к дальнему транспорту. - Л.: Недра, 1980, 161 с.

19. Бекиров Т.М. Промысловая и заводская обработка природных и нефтяных газов. - М.: Недра, 1980, 293 с.

20. Международная программа химической безопасности, метанол, критерий здоровья окружающей среды, ВОЗ, 1997 г.

21. Производственная гигиена и токсикология Патти, 5-е издание.

22. Опасные материалы. Руководство по противопожарной защите, 13-е издание.

23. Ланиган С. (Lanigan, S.), Сводный отчет, по оценке безопасности метилового спирта, InternationalJournalofToxicology., том 20, (2001 г.).

24. Руководство NIOSH по опасным химическим веществам.

25. База данных по опасным веществам.

26. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Хмеленина В.Н., Понаморева О. Н. Биология и биотехнология аэробных метилотрофов/ Уч. пос. Тула.:ТулГУ. 2010.

27. Безбородов А.М., Загустина Н.А., Попов В. О. Ферментативные процессы в биотехнологии / М.: Наука. 2008. 335 с.

28. Гальченко В.Ф. Метанотрофные бактерии / М.: ГЕОС. 2001. 500 с.

29. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии. ОНТИ ПНЦ РАН, Пущино, 2010.325 с.

30. Троценко Ю.А., Торгонская М.Л. Метилотрофные дрожжи. «ТР-Принт», М., 2011.313 с.

31. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Экстремофильныеметанотрофы. ОНТИ ПНЦ РАН, Пущино, 2008.208 с.

32. Федоров Д.Н., Доронина Н.В., Троценко Ю.А. Фитосимбиоз аэробных метилобактерий: новые факты и гипотезы. Микробиология 80: 2011.435-446.

33. Малашенко Ю.Р., Хайер Ю., Бергер У., Романовская В.А., Мучник Ф.В. Биология метанобразующих и метанокисляющих микроорганизмов / Киев: Паукова думка. 1993. 255 с.

34. Пиневич А.В. Микробиология. Биология прокариотов: Учебник В 3 т. / 2-е изд., СПб.: Изд-во СПбГУ. 2007. Т. 1-3.

35. Подгорский B.C. Физиология и метаболизм метанолусваивающих дрожжей / Киев: Паукова думка. 1982. 152 с.

36. Троценко Ю.А., Хмеленина В.Н. Экстремофильныеметанотрофы / Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 2008. 206 с.

37. Троценко Ю.А., Доронина Н.В., Торгонская М.Л. Аэробные метилобактерии / Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН. 2010. 325 с.

38. Труды Института микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН. Выпуск XIII. К 100-летию открытия метанотрофии / Под ред. В.Ф. Гальченко, М.: Нау¬ка. 2006. 343 с.

39. AnthonyC.The Biochemistry of methylotrophs/London: Acad. Press. 1982.404 p.

40. Large P.J., Bamforth C.B. Methylotrophy and biotechnology / New York: Longman Scientific & Technical. John Wiley & Sons Inc. 1988. 303 p.

41. Methane and methanol utilizers / Eds.: J.C. Murrell, H. Dalton // New York: Ple¬num Press. 1992. 286 p.

42. Belanger L., Figueira M.M., Bourque D., Morel L., Beland M., Laramee L., Groleau D., Miguez C.B. (2004) Production of heterologous protein by Methylobacteriumextorquens in high cell density fermentation. FEMS Microbiol. Lett. 231: 197-204.

43. Bodrossy L., Kovacs K.L. (1994) Methane utilizing bacteria and their biotechnological applications.Indian J. Experim. Biol. 32: 443-449.

44. Bothe H., Jensen K.M., Mergel A., Larsen J., Jorgensen C., Bothe H., Jorgensen L. (2002) Heterotrophic bacteria growing in association with Methylococcuscapsulatus (Bath) in a single cell protein production process. Adv. Appl. Microbiol. 59: 33-39.

45. Clark D.S., Geresh S., DiCosmo R. (1995) Enantioselective oxidation of 2-methyl-1-alkanols by alcohol oxidase from methylotrophic yeasts. Bioorg. Medic. Chem. Lett. 5: 1383-1388.

46. Cos O., Ramon R., Montesinos J.L., Valero F. (2006) Operational strategies, monitoring and control of heterologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters: A review. Microb. Cell Fact. 5: 17.

47. De Boer L., Grobben G., Vrijbloed J.W., Dijkhuisen L. (1990) Biosynthesis of aromatic amino acids in Nocardia sp. 239: effects of amino acid analogues on growth and regulatory enzymes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 33: 183-189.

48. Eisenberg A., Seip J.E., Gavagan J.E., Payne M.S., Anton D.L., DiCosimo R. (1997) Pyruvic acid production using methylotrophic yeast transformants as catalyst. J. Mol. Catalysis B: Enzymatic 2: 223-232.

49. Flanagan W.P. (1998) Biodegradation of dichloromethane in a granular activated carbon fluidizedbed reactor. Water Environ. Res. 70: 60-66.

50. Hall E.A.H., Preuss M., Gooding J.J. (1998) Exploring sensors to monitor some environmental discharges. In: Nikolelis D.P., Krull U.J., Wang J., Mascini M. (Eds.) Biosensors for direct monitoring of environmental pollutants in field. London: Kluwer Acad. Publ., p. 227-237.

51. Hammer G., Harrison D.E.F. (1980) Single cell protein: the technology, economics and future potential. In: Harrison D.E.F., Higgins I.J., Watkinson R. (Eds.) Hydrocarbons in biotechnology. London: Heyden, p. 59-73.

52. Hartner F.S., Glieder A. (2006) Regulation of methanol utilisation pathway genes in yeasts. Microb. Cell Fact. 5: 39.

53. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C. (1980) New findings in methane-utilizing bacteria highlight their importance in the biosphere and their commercial potential. Nature. 286: 561-564.

54. Hou C.T., Laskin A.I., Patel R.N. (1978) Growth and polysaccharide production by Methylocystis parvus OBBP on methanol. Appl. Environ. Microbiol. 37: 800-804.

55. Ishikawa K., Toda-Murakoshi Y., Ohnishi F., Kondo K., Osumi T., Asano K. (2008) Medium composition suitable for L-lysine production by Methylophilusmethylotrophus in fed-batch cultivation. J. Biosci. Bioeng. 106: 574-579.

56. Izumi Y., Yoshida T., Miyazaki S.S., Mitsunaga T., Ohshiro T., Shimao M., Miyata A., Tanabe T. (1993) L-serine production by a methylotroph and its related enzymes. Appl. Microbiol. Biotechnol. 39: 427-432.

57. Kanamaru K., Iwamura Y., Mikami Y., Obi Y., Kisaki T. (1982) 2-O-Methyl-D-mannose in an extracellular polysaccharide from Hyphomicrobium sp. Agric. Biol. Chem. 46: 2419-2424.

58. Kato N., Kobayashi H., Shimao M., Sakazawa C. (1986) Dihydroxyacetone production from methanol by a dihydroxyacetone kinase deficient mutant of Hansenulapolymorpha. Appl. Microbiol. Biotechnol. 23: 180-186.

59. Keppler F., Hamilton J.T.G., Brass M., Roeckmann T. (2006) Methane emissions from terrestrial plants under aerobic conditions. Nature. 439: 187-191.

60. Khmelenina V.N., Kalyuzhnaya M., Sakharovsky V.G., Suzina N.E., Trotsenko Y.A., Gottschalk G. (1999) Osmoadaptation in halophilic and alkaliphilicmethanotrophs. Arch. Microbiol. 172: 321-329.

61. Lacava P.T., Silva-Stenico M.E., Araujo W.L. Simionato A.V.C., Carrilho E., Tsai S.M., Azevedo J.L. (2008) Detection of siderophores in endophytic bacteria Methylobacterium spp. associated with Xilellafastidiosa subsp. pauca. Pesq. Agropec. Bras. 43: 521-528.

62. Madhaiyan M., Poonguzhali S., Senthilkumar M., Seshadri S., Chung H., Yang J., Sundaram S., Sa T. (2004) Growth promotion and induction of systemic resistance in rice cultivar Co-47 (Oryza sativa L.) by Methylobacterium sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 45: 315-324.

63. Nichols P.D., White D.C. (1989) Accumulation of polyhydroxybutirate in a methane-enriched, halogenated hydrocarbon-degrading soil column: implications for microbial community structure and nutritional status. Hydrobiologia. 176/177: 369-377.

64. Odac D., Timur S., Telefoncu A. (2004) Carboxyl esterase-alcohol oxidase based biosensor for the aspartame determination. Food Chemistry. 84: 493-496.

65. Odom J.M. (2006) Antioxidant activity from methanotrophic biomass. US Patent № 20060045871.

66. Oh D.B., Park J.S., Kim M.W., Cheon S.A., Kim E.J., Moon H.Y., Kwon O., Rhee S.K., Kang H.A. (2008) Glycoengineering of the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha for the production of glycoproteins with trimannosyl core N-glycan by blocking core oligosaccharide assembly. Biotechnol. J. 3: 659-668.