Биологическая активность гуминового комплекса различного происхождения и его влияние на рост и развитие растений

Содержание ароматических фракций может служить в какой-то мере показателем степени гумификации вермикомпостов при их качественной оценке. Однако, в настоящее время не разработан однозначный параметр для оценки приемлемых уровней стабильности и зрелости компоста. Для компетентного заключения о степени гумификации необходимо рассмотреть как можно больше возможных показателей стабильности вермикомпоста.

5. Термодинамические свойства гуминовых веществ

Для оценки степени завершенности процесса гумификации вермикомпостов был использован метод дифференциальной сканирующей микрокалориметрии. На рисунке 9 приведены термограммы для растворов комплекса гуминовых веществ, выделенных из вермикомпостов различного периода созревания. Термограммы имеют общий вид. Температурные зависимости теплоемкостей (С_р) на участках А-В термограмм возрастают с ростом температуры до ~60°С. Начиная с точки В, температурные зависимости теплоемкостей меняют наклон (участок В-С), то есть, температурные зависимости теплоемкости на участке А-В имеют больший положительный температурный инкремент (?С/?T > 0), чем на участке В-С. Таким образом, при температуре ~60°С наблюдается некоторое изменение в состоянии гуминовых веществ.

Рисунок 9. Термограммы растворов гуминовых веществ выделенных из вермикомпостов различного периода созревания:

1 - образец-0, 2 - зимний образец, 3 - летний образец.

T_m - температура средины перехода при разрушении мицелл,

?T- интервал перехода,

?C_р- скачок теплоемкости.

После точки В при температуре 60С температурный инкремент теплоемкости (?С/?T) уменьшается.

Возможно, излом температурной зависимости теплоемкости связан с возрастанием силы гидрофобных взаимодействий до температуры ~70°С, а при более высокой температуре она начинают ослабевать, что проявляется на участке В-С в более низком температурным инкременте. На участке С-Д теплоемкости всех образцов гуминовых веществ скачкообразно возрастают в узком температурном интервале.

Учитывая этот факт и то, что гуминовые вещества в растворах образуют мицеллы, наблюдаемый термический переход можно отнести к разрушению мицелл, а скачок теплоемкости (ДС_р) связать с площадью гидрофобных групп, экспонированных в водный растворитель при разрушении мицелл.

Установление корреляционной зависимости между термодинамическими параметрами разрушения мицелл гуминовых веществ и спектральными параметрами, полученными из хроматографических данных, показало, что возрастание относительной степени ароматичности приводит к линейному росту ДС_р (RІ=0,998). Как было отмечено выше, разрушение мицелл сопровождается экспонированием в воду гидрофобных групп гуминовых веществ ранее не доступных растворителю. Так как ароматические группы гуминовых веществ являются гидрофобными, то наблюдалось увеличение скачка теплоемкости с ростом ароматичности. Другими словами, мицеллы гуминовых веществ, полученные из вермикомпоста более высокой степени зрелости, содержат большее количество гидрофобных групп не доступных растворителю, которые при разрушении мицелл экспонируются в воду и дают большее значение ДС_р.

Рост степени ароматичности гуминовых веществ приводит к линейному росту ДТ (RІ = 0,941). Возрастание температурного интервала разрушения мицелл, вероятно, связано с ростом их гетерогенности.

Возрастание суммарной степени ароматичности гуминовых веществ приводит к линейному снижению температуры средины перехода (Т_m) (RІ= 0,967).

На основании проведенных исследований можно рассматривать возможность использования термического анализа для контроля степени гумификации и характеристики химических изменений в органическом веществе компоста.

Методом прецизионной дифференциальной сканирующей микроколориметрии и методом ВЭЖХ в обращенных фазах исследовали гуминовые кислоты, выделенных из вермикомпостов различного периода созревания. Концентрация гуминовых кислот в растворах составляла 6 мг/мл.

Термограммы трех образцов гуминовых кислот (1-образец-0 (компост); 2-зимний образец; 3- летний образец) сходны (рис. 10).

Теплоемкости (Ср) на участках А-В термограмм возрастают с ростом температуры до 58С. Начиная с точки В теплоемкости снижаются (участок В-С), то есть температурные зависимости теплоемкости на участке А-В имеют положительный температурный инкремент (?С/?T>0), а на участке В-С - отрицательный (?С/?T<0). По видимому, при температуре 58С наблюдается изменение в состоянии гуминовых кислот, которое соответствует термодинамическому переходу 3-го рода (?С/?T- меняет знак). На участке С-Д теплоемкости для образцов гуминовых кислот скачкообразно возрастают в узком температурном интервале. Определены термодинамические характеристики этого перехода: ширина перехода - ДТ, средина перехода -Т_с и разность теплоемкостей - ДС_р.



Рисунок 10. Термограммы растворов гуминовых кислот, выделенных из вермикомпостов различной степени зрелости:

1 - образец-0, 2 - зимний образец, 3 - летний образец.

T_c - температура расстекловывания,

?T- интервал перехода расстекловывания,

?C_р- скачок теплоемкости при расстекловывании ГК.

В точке В при температуре 58°С температурный инкремент теплоемкости (рС/рT) меняет знак с "+" на "-".

В таблице 8 приведены термодинамические характеристики переходов, а также данные для процессов расстекловывания синтетических полимеров. Учитывая этот факт и то, что гуминовые кислоты в растворах образуют ассоциаты, можно предположить, что эти надмолекулярные структуры находятся в растворах в стеклообразном состоянии. В ходе сравнения термодинамических параметров расстекловывания гуминовых кислот выявлено, что значения ДС_р для образцов практически одинаковы, однако значения ДТ и Т_с различаются.

Таблица 8 Термодинамические параметры расстекловывания гуминовых кислот, полученных из вермикомпостов различной степени зрелости

Наименование образца	TC,єC	ДT,єC	ДCP, Дж/гК	*Синтетические полимеры
				ДT,єC	ДCP, Дж/гК
контроль	86,1 ±0,2	8,5 ±0,5	0,28 ±0,02	7 - 10	0,3 - 0,5
зимний	87,2 ±0,2	7,3 ±0,4	0,32 ±0,03
летний	90,2 ±0,2	4,2 ±0,6	0,28 ±0,02

*Данные взяты из монографии: Дифференциальная сканирующая калориметрия в физикохимии полимеров, Бернштейн В.А., Егоров В.М., - Ленинград, изд. Химия, 1990 г, стр. 248.

Данные хроматографического анализа растворов гуминовых кислот показали наличие двух фракций - гидрофильной и гидрофобной. Выявлено, что процентное содержание фракции-2 возрастает в соответствии с ростом зрелости вермикомпоста в ряду: образец - летний > образец - зимний > контроль. Содержание фракции-2 (%) определено как отношение площади хроматографического пика-2 к сумме площадей под пиками 1 и 2 при детектировании пиков 220 нм (S₂²²⁰/ УS²²⁰). Содержание фракции-2 в образцах в 2 раза превышает ее содержание в компосте.

Относительная алифатичность определена как отношение площади под пиком при детектировании при 220 нм к площади при детектировании при 280 нм (S₂²²⁰/S₂²⁸⁰). Показано, что с ростом зрелости вермикомпоста относительная алифатичность фракции-2 в 2 раза возрастает. В то же время, процентное содержание фракции-1 падает и ее относительная алифатичность снижается. Суммарная алифатичность определена как отношение суммы площадей под пиками хроматограмм фракций-1 и 2 при детектировании 220 нм к сумме площадей этих фракций при детектировании 280 нм (УS²²⁰/УS²⁸⁰). Отмечено, что она возрастает с ростом зрелости вермикомпоста.

В настоящее время наиболее объективным критерием зрелости и стабильности компостов считается критерий относительного содержания фракции ядра (core) в общей сумме гуминовых кислот (Adani F., Genevini P.L., 1997; Chefetz B, Adani F., 1998). Эта фракция представляет собой высокомолекулярную алифатическую (гидрофобную) фракцию гуминовых кислот и накапливается в процессе компостирования. В качестве критерия зрелости компостов предложен индекс стабильности компоста, представляющий собой отношение углерода суммарных гуминовых кислот к углероду фракции ядра. В нашем случае фракцией ядра является хроматографическая фракция-2 (алифатическая), рост содержания которой в гуминовых кислотах отражает степень зрелости или степень гумификации вермикомпоста. Однако, наиболее подходящим критерием степени зрелости вермикомпоста является критерий роста относительной суммарной алифатичности гуминовых кислот, так как в нем учтены спектральные свойства, как фракции-1, так и фракции-2, кроме того относительная суммарная алифатичность линейно связана с температурой расстекловывания гуминовых кислот. Увеличение содержания фракции-2 приводит к экспоненциальному росту Т_с, в то же время, температурный интервал расстекловывания - ДT уменьшается. Эти данные свидетельствуют о росте кооперативности процесса расстекловывания гуминовых кислот, что связанно с количественным возрастанием фракции-2, которая является более высокомолекулярной и алифатичной по-сравнению с фракцией-1.

На основании экспериментальных данных можно заключить, что степень гумификации вермикомпостов можно контролировать:

1. методом ВЭЖХ в обращенных фазах, используя как критерий: относительную суммарную алифатичность гуминовых кислот;

2. методом сканирующей микроколориметрии, используя как критерий температуру расстекловывания и температурные интервалы расстекловывания гуминовых кислот.

Результаты, полученные методом сканирующей микроколориметрии, подтверждаются данными ЯМР-спектроскопии.

Анализ молекулярной структуры препаратов ГК показал, что с увеличением периода вермикомпостирования увеличивается содержание О-алкильных функциональных групп (с 15% до 33%) и уменьшается доля ароматических молекулярных фрагментов (с 34% до 20%).

6. Испытание биологической активности гуминового комплекса вермикомпоста

Для выявления особенностей ферментативной активности вермикомпоста были отобраны и проанализированы образцы почвы компоста и вермикомпоста. В исследуемых образцах изучали ферменты класса оксидоредуктаз. В контрольных образцах (неферментативная активность) ферменты инактивировали стерилизацией сухим жаром при температуре 180 °С в течение двух часов. За единицу активности (Е) принимали величину оптической плотности, отнесенную к сухой массе навески. Анализ диаграммы (рис. 11-а) показал, что самая высокая каталазная активность наблюдалась в варианте с вермикомпостом. Следует отметить что, активность фермента возрастает по мере созревания вермикомпоста.

а)

 б)

Рисунок 11. Активность каталазы (а), пероксидазы (б) в образцах почвы, биогумуса и компоста.

Пероксидазам присущи процессы окисления органического вещества или косвенного распада гумуса, в то время как полифенолоксидазы участвуют в превращениях органических соединений ароматического ряда в компоненты гумуса. Оба процесса взаимосвязаны. Активность пероксидазы в контроле составила 5,5, в почве в воздушно-сухом состоянии 7, в компосте 8,5 условных единиц (рис. 11-б). В образцах биогумуса активность пероксидазы возросла почти в 2 раза и составила 10,5 условных единиц.

Повышенная оксидазная активность вермикомпоста объясняется, вероятно, тем, что копролиты являются центрами микробиологической активности в почве. В каждом грамме биогумуса содержится более 50 млрд. микробных клеток. Поглощая почву и органические вещества, черви выделяют с копролитами большое количество собственной кишечной микрофлоры, ферментов, витаминов, которые в свою очередь обладают стимулирующим действием на активность и биомассу микроорганизмов, являющихся продуцентами различных биологически активных веществ.

Изучение влияния гуминового комплекса, выделенного из вермикомпостов, на активность пероксидазы и каталазы на начальных стадиях развития гороха проводили на контрастных по устойчивости сортах: сорт "Норд", не устойчивый к вредителям и болезням и сорт "Орпела", обладающий комплексной устойчивостью к неблагоприятным факторам. Ранее установлено, что биологически активную основу гуминового комплекса составляют гуминовые кислоты, фульвокислоты и гиматомелановые кислоты, оказывающие стимулирующее воздействие на растения.

Активность ферментов исследовали в проростках на третий, пятый и пятнадцатый день после замачивания. Контрольные семена замачивались в воде, препаратами сравнения служили - раствор вытяжки из компоста и промышленный препарат "Гумистар".

Исследование пероксидазной активности на проростках гороха "Норд" (3-и сутки) показало, что в контроле активность самая низкая (84 у.е.). В образцах, обработанных препаратом "Гумистар" и раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,510^-4%, активность пероксидазы высокая (245 и 216,46 у.е. соответственно). В варианте с вытяжкой из компоста активность повысилась незначительно по сравнению с контрольным вариантом (134,44 у.е.). Активность пероксидазы в проростках гороха в варианте с раствором препарата "Гумистар" была несколько выше, чем в варианте с раствором гуминового комплекса.

Самая низкая активность пероксидазы у сорта Норд наблюдалась в контроле и в варианте с вытяжкой из компоста. При обработке семян раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,5•10^-3 %, отмечено значительное возрастание активности пероксидазы до 4500 у.е. Раствор гуминового комплекса с концентрацией 1,5•10^-4 % показал близкие результаты. Это свидетельствует о том, что растворы с низкой концентрацией активного вещества действует так же эффективно при меньшем расходе препарата.

Активность пероксидазы проростков у сорта "Орпела" различается незначительно по вариантам. Причем, в контрольном варианте эти показатели были самыми низкими. Более высокая активность наблюдалась в варианте с раствором "Гумистар". Растворы гуминового комплекса с концентрациями 1,510^-4% и 1,510^-3% показали аналогичные результаты. Тенденция по закономерностям аналогична сорту "Норд".

Активность каталазы в проростках неустойчивого сорта "Норд" (3-и сутки) по вариантам изменялась от 0,81 до 2,1 у. е. У сорта "Орпела" наиболее низкая активность фермента выявлена в контроле (7,3 у.е.). Относительно высокая - в варианте с вытяжкой из компоста (10,5 у.е.). Активность образцов, обработанных растворами гуминового комплекса и препаратом "Гумистар", различалась незначительно.

Таким образом, у сорта "Норд" активность пероксидазы во всех вариантах на несколько порядков больше, чем у сорта "Орпела". А активность каталазы, напротив, во всех вариантах ниже по сравнению с пероксидазой. Снижение активности каталазы, возможно, связано с накоплением активных форм кислорода в форме перекисей и конкурентным действием пероксидазы, активность которой возросла.

В 5-ти суточных проростках прослеживались те же закономерности - у устойчивого сорта активность пероксидазы на несколько порядков выше, чем у неустойчивого.

Активность каталазы в корешках у неустойчивого сорта "Норд" по вариантам исследования изменялась от 2 до 3,62 у.е. У сорта "Орпела" активность фермента во всех вариантах выше, чем у сорта "Норд".

В 15-суточных проростках у сорта "Норд" активность пероксидазы низкая в контроле и в варианте с вытяжкой из компоста. При обработке семян растворами гуминового комплекса отмечено значительное возрастание активности пероксидазы до 2423 у.е. для раствора с концентрацией 1,5•10^-4 %. В варианте с препаратом "Гумистар" активность фермента была ниже, чем в вариантах с растворами гуминового комплекса. У сорта "Орпела" наблюдалась та же закономерность. Самая низкая активность в контрольном варианте и варианте с вытяжкой из компоста, а самая высокая для раствора гуминового комплекса с концентрацией 1,5•10^-4 %. Активность при обработке препаратом "Гумистар" ниже, чем при обработке растворами гуминового комплекса.

Анализ полученных результатов показал, что при обработке растений раствором гуминового комплекса удаётся индуцировать иммунитет у растений; поскольку обработка семян вызывает биохимические изменения в тканях; в обработанных гуминовым комплексом растениях активность пероксидазы увеличивается, а поскольку возрастание пероксидазной активности свидетельствует о повышении иммунного статуса, можно предположить, что гуминовый комплекс выступает элиситором индуцированного иммунитета. Обработка гуминовым комплексом сохраняет уровень пероксидазы в проростках на достаточно высоком уровне, что позволяет растению защититься от болезней на этапе развития, когда иммунитет понижен. Пероксидасомы растительных клеток играют фундаментальную роль в защите от патогенов, усиление их функции с помощью гуминового комплекса может явиться новой формой биологической защиты растений.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) исследована на среднеустойчивом сорте гороха "Батрак". Активность ферментов измеряли в побегах и корешках проростков на третий, пятый, седьмой и десятый день после замачивания семян.

На основании проведенных исследований выявлено, что активность СОД во всех вариантах увеличивается на седьмой день развития побега и составляет около 15000 у.е. (рис. 12-а). На третий день прорастания самая высокая активность отмечена в варианте с раствором гуминового комплекса. На десятый день развития проростка активность СОД падает во всех вариантах. Стимуляция гуминовым комплексом активности СОД, вероятно, связана с его высокой способностью к детоксикации активных форм кислорода. Исследования активности СОД в корешках проростков гороха "Батрак" подтвердили полученную закономерность, выражающуюся в повышении активности антиоксидантных ферментов под влиянием гуминового комплекса (рис. 12-б).

 а)

б)

Рисунок 12. Влияние гуминового комплекса на активность СОД: a) в побегах, б) в корешках проростков гороха сорта "Батрак". Варианты: 1 - контроль (вода), 2 - препарат "Нарцисс", 3 - препарат "Винцит, СК", 4 - препарат гуминового комплекса, 1,5·10^-4%.

Применение гуминового комплекса способствует повышению активности пероксидазы и каталазы, как индикаторов увеличения устойчивости к неспецифическим патогенам, а также усиливает ростовые процессы на стадии проростков. При обработке гуминовым комплексом индукционный эффект был более выражен, что делает возможным использование его для создания препарата широкого спектра действия. Одним из наиболее многообещающих способов защиты растений является индуцирование их устойчивости.

Гуминовый комплекс является одним из препаратов природного происхождения, биоактивные вещества которого, попадая в клетку, подают сигнал растению, для активации антиоксидантных ферментов, помогающим растению бороться с негативным действием биотических факторов.

Подобное усиление иммунитета гороха под влиянием гуминового комплекса не могло не сказаться на устойчивости растений при испытании в полевых условиях. Устойчивость растений к болезням и вредителям один из важных факторов, определяющих высокие урожаи сельскохозяйственных культур и его стабильность. Разработка путей эффективного решения этой проблемы имеет большое народнохозяйственное значение.

В ходе эксперимента исследовано влияние препарата гуминового комплекса на зараженность семян, развитие корневых гнилей, аскохитоза, а также устойчивость к поражению вредителями. Эксперимент проводился в трех вариантах: обработка вытяжкой из компоста, препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,510^-4 %, препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,510^-3 %, контроль - вариант без обработки.

Сорт "Вега" овощного использования, в начале вегетации растёт медленно, поэтому сильнее зарастает сорняками, поражается болезнями и повреждается вредителями, не устойчив к корневым гнилям, средне устойчив к аскохитозу, не устойчив к тле. Результаты лабораторного опыта на бактериальную заражённость показали, что заражённость семян во всех вариантах ниже, чем в контроле (табл. 9).

Таблица 9 Влияние обработки препаратом гуминового комплекса гороха сорта "Вега" на заражённость семян, развитие корневых гнилей, развитие аскохитоза

Вариант	Заражённость семян, %	Корневые гнили, % развития	Развитие аскохитоза, %
		Фаза цветения	Фаза плодообразования
Контроль (без обработки)	35,0	32,9	45,4	51,0
Предпосевная обработка семян
Вытяжка из компоста	22,5	27,5	42,1	46,4
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -4 %	18,5	25,4	40,8	48,0
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -3 %	20,0	25,4	43,0	55,1
Предпосевная обработка семян + 2- кратным опрыскивание
Вытяжка из компоста	22,0	0,0	0,0	0,0
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -4 %	21,5	0,0	0,0	0,0
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -3 %	28,0	0,0	0,0	0,0
НСР 05	2,3	12,0	1,8	7,1

Под влиянием предпосевной обработки семян испытуемыми растворами снижается процент развития корневых гнилей как в фазу цветения, так и в фазу плодообразования, по сравнению с контролем (без обработки). Предпосевная обработка семян в сочетании с 2- кратным опрыскиванием привела к полному подавлению болезни в вариантах с препаратом гуминового комплекса и вытяжкой из компоста (табл. 9).

Развитие аскохитоза на горохе сорта "Вега" при предпосевной обработке семян по вариантам незначительно отличается от контроля. Это можно объяснить тем, что аскохитоз развивается на всходах и надземных органах взрослых растений. В вариантах с предпосевной обработкой семян и 2-кратным опрыскиванием растений наблюдалось полное подавление болезни (табл. 9).

Развитие тли в культуре гороха сорта "Вега" (на 10 взмахов сачка) в вариантах с препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,510^-3 % и вытяжкой из компоста составило 245 и 252 шт. соответственно. А в варианте с препаратом гуминового комплекса с концентрацией раствора 1,510^-4 % всего 84 шт. Меньшая концентрация раствора препарата гуминового комплекса оказалось более эффективной в вариантах с предпосевной обработкой семян сочетающейся с двукратным опрыскиванием растений. В этом случае наблюдалось полное подавление развития тли.

При анализе биологической эффективности применения препарата гуминового комплекса на горохе сорта "Норд" рассмотрен показатель развития корневых гнилей в фазу бутонизации и в фазу плодообразования. Сорт имеет среднюю устойчивость к поражению болезнями и вредителями. Наименьший процент развития корневых гнилей в фазу бутонизации, был отмечен в варианте с препаратом гуминового комплекса (концентрация 1,510^-4 %) (табл. 10).

Таблица 10 Влияние обработки препаратом гуминового комплекса гороха сорта "Норд" на поражаемость болезнями

№ п/п	Варианты	Развитие корневых гнилей,% фаза бутонизации	Развитие корневых гнилей,% фаза плодообразования.	Ржавчина, % фаза развития	Аскохитоз, % фаза развития
1	Контроль (без обработки).	41,8	70,6	57,8	27,5
Предпосевная обработка семян
2	Препарат гуминового комплекса, 1,510-3%	38,1	46,8	50,5	20,0
3	Препарат гуминового комплекса, 1,510 -4%	35,2	46,2	51,8	20,2
Предпосевная обработка семян + 2-кратное опрыскивание
4	Препарат гуминового комплекса, 1,5 10-4%	41,5	0,0	51,2	22,0
5	Препарат гуминового комплекса, 1,5 10-5%	39,8	0,0	51,8	20,0
6	Контроль (без обработки).	45,8	0,0	57,8	27,5
7	НСР05	13,08	13,01	10,11	7,11

У варианта без обработки семян развитие корневых гнилей составило 41,8%. Низкий процент развития корневых гнилей наблюдался и при обработке препаратом более низкой концентрации. Заметно повышается процент развития корневых гнилей в фазу плодообразования, но во всех вариантах он ниже по сравнению с контролем (70,6%), у варианта с обработкой семян раствором гуминового комплекса с концентрацией 1,510^-4 %, развитие болезни составляет 46,2 %. Предпосевная обработка семян в сочетании с двукратным опрыскиванием позволяют снизить заболеваемость растений в фазу бутонизации, и полностью подавить развитие корневых гнилей в фазу плодообразования. Во всех вариантах с применением обработки препаратом гуминового комплекса отмечено снижение развития ржавчины и аскохитоза по сравнению с контролем.

Обработка семян гороха сорта "Норд" препаратом гуминового комплекса отразилась на урожайности культуры. Как и в предыдущих исследованиях, наиболее эффективным оказалось сочетание предпосевной обработки семян с 2-х разовым опрыскиванием растений растворами гуминового комплекса. В варианте с раствором 1,510^-3 % концентрации прибавка урожайности составила 30,6%, а в варианте с раствором 1,510^-4 % концентрации она увеличилась почти в два раза (на 91,9 %) и составила 2,63 т/га, что превышает среднюю урожайность данного сорта по области.

В полевом эксперименте, поставленном в 2004 - 2007 годах было исследовано влияние гуминового комплекса на развитие и урожай гороха (сорт "Норд"), картофеля (сорт "Жуковский ранний"), пшеницы (сорт "Крестьянка").

Из данных таблицы 11 следует, что препарат гуминового комплекса оказал положительное влияние на картофель сорта "Жуковский". Так, количество клубней и их вес увеличились, а урожайность повысилась на 30-40% (от 18 т/га в контроле - до 25-28 т/га при обработке раствором гуминового комплекса с концентрациями 1,510^-3 % и 1,510^-4 % соответственно).

Таблица 11 Влияние препарата гуминового комплекса на урожай сельскохозяйственных культур

Вариант	Картофель "Жуковский ранний"	Пшеница яровая "Крестьянка"	Горох "Норд"
	Кол-во клубней на один куст, шт.	Масса клубней 10 смежных кустов, кг	Урожайность, т/га	Всходы, шт./м2	Масса 1000 семян, г.	Урожай, т/га.	Масса 1000 семян, г.	Урожайность, т/га
Контроль	5,0	3,78	18,0	160,0	19,0	1,70	120,7	1,5
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -2 %	6,0	4,20	20,0	194,0	36,0	2,1 5	130,8	1,8
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -3 %	8,0	5,25	25,0	170,0	26,0	1,95	151,3	2,2
Препарат гуминового комплекса, 1,510 -4 %	7,0	5,88	28,0	184,0	24,0	1,98	180,8	2,9
Вытяжка из компоста	6,0	3,99	19,0	149,0	20,0	1,75	111,5	1,7
НСР 05	1,67	0,4	0,70	1,38	0,52	0,12	0,49	0,09

Испытание влияния препарата гуминового комплекса на урожайность проводили на яровой пшенице сорта "Крестьянка". В таблице 11 показано, что под влиянием препарата гуминового комплекса с концентрациями 1,510^-3 % и 1,510^-4 % количество семян на 1м² увеличивается от 160,0-в контроле (вода) до 194,0 и 184,0 шт. соответственно по вариантам. Под влиянием вытяжки из компоста произошло угнетение развития семян.

Масса тысячи семян возросла в большей степени под влиянием раствора гуминового комплекса с более высокой концентрацией (с 19,0 до 36,0 г.), что отразилось на урожае зерна 1,7 т/га - в контроле и 2,15 т/га в варианте с концентрацией гуминового комплекса 1,510^-2 %. Однако, более низкие концентрации растворов (1,510^-3 % и 1,510^-4 %) также сказались на увеличении урожайности пшеницы до 1,95 и 1,98 т/га соответственно.

Следует отметить, что под влиянием препарата гуминового комплекса происходит увеличение всхожести семян пшеницы на 20%, наблюдается увеличение высоты растений.

Обработка гороха препаратом гуминового комплекса проводилось на сорте "Норд" (табл. 11). Из данных следует, что под влиянием растворов препарата с концентрациями 1,510^-2 %, 1,5 10^-3 %, 1,510^-4 % масса тысячи семян возросла во всех случаях. Лучший результат отмечен в варианте с раствором меньшей концентрации 1,510^-4 %. Масса тысячи семян в этом случае возросла со 120,7 (контроль) до 180,8. Этот вариант показал наибольшую урожайность - 2,9 т/га (в контроле 1,5 т/га).

Под влиянием препарата гуминового комплекса, в частности, при замачивании клубней картофеля в растворе препарата наблюдалось увеличение высоты растений, увеличение площади листьев до 200 см², а при опрыскивании растения в стадии цветения до 126,4 см² по сравнению с контролем 117,5 см².

Данный показатель у пшеницы и гороха в случае замачивания семян и опрыскивания растений также превышает контроль на 30 и 29% соответственно. Замачивание посевного материала в вытяжке из компоста и опрыскивание этой же вытяжкой показало результат несколько ниже контроля, этот показатель у картофеля составляет 96 см² и 114,3 см²; у пшеницы 129,0 см² и 146,2 см², а у гороха 108,0 см² и 111,8 см² соответственно.

Химический состав клубней картофеля в вариантах с использованием растворов препарата гуминового комплекса характеризовался повышением содержания азота. Кроме того, повысилось содержание крахмала. Обработка растений раствором препарата гуминового комплекса положительно повлияла на сохранность картофеля при хранении. Количество клубней, пораженных бактериальной гнилью снизилось в 2 раза относительно контроля. Поражение фитофторозом снизилось на 15%, а фузариозом на 10%.

Таким образом, полученные данные убедительно показывают положительное влияние препарата гуминового комплекса на рост, развитие и урожайность таких культур как картофель, пшеница, а также горох.

Применение созданных на основе вермикомпоста препаратов для обработки сельскохозяйственных растений способствует улучшению экологической обстановки за счет таких факторов как снижение использования высокотоксичных и дорогостоящих химических средств защиты; исключение их негативного воздействия на окружающую среду, человека и животных, полезных организмов составляющих почвенную фауну.

Полученные данные говорят о широком спектре действия препарата гуминового комплекса, в том числе участии в защитных механизмах растений, иммуностимулирующем и координирующем действии на рост и развитие растений. Препараты, созданные на основе вермикомпоста - биологические аналоги естественных факторов, поэтому они не могут вызвать отрицательных явлений в процессе роста и развития растений при научно-обоснованном применении.

Основные выводы

1. Получен вермикомпост (биогумус) на основе отечественного гибрида дождевого червя "Старатель" из разных видов компостов;

2. Освоена методика выделения гумусовых кислот. Разработана и применена одноступенчатая оптимизированная методика выделения гумусовых кислот. Разработан и применен метод ВЭЖХ в обращенных фазах для хроматографической характеристики ГК, ФК, ГМК.

3. Определен ключевой показатель оценки скорости биоконверсии органических субстратов и степени зрелости вермикомпостов - соотношение C/N, оно снижается от 22,1 - в компосте до 13,7, 17,8 в зимнем и летнем образцах биогумуса соответственно.

4. На основании систематических исследований установлены закономерности изменения микробиологической и ферментативной активности компостов и вермикомпостов:

- в процессе созревания вермикомпост обогащается грибами-антагонистами (Trichoderma), приобретая свойства оздоравливающего действия;

- аммонифицирующая активность в образцах вермикомпостов значительно повышается по сравнению с компостом в 2,6 и 1,8 раз соответственно для летнего и зимнего образцов;

- нитрифицирующая активность снижается: от 19,2 мг в компосте до 17,8 и 17,6 - в летнем и зимнем образцах вермикомпостов;

- препараты зимних образцов биогумуса обладают более высокой протеолитической активностью, чем препараты летнего, образцы компоста, не обработанного червями, не обладают протеолитической активностью;

- амилолитической активности обнаружить не удалось ни в одном из образцов.

5. Методом гель-хроматографии определены молекулярные массы белков биогумуса (27 кДа) и жирнокислотный состав в исследованных препаратах. Показано, что содержание жирных кислот в препаратах биогумуса выше, чем в препарате, не обработанном червями (контроль).

6. На основании исследований и анализа экспериментальных данных можно заключить, что

- влагоудерживающая способность вермикомпостов по сравнению с компостами возрастает;

- с ростом степени гумификации экстрагируемость гумусовых веществ снижается;

- удельная ароматичность суммарных фракций ГК (гидрофильной и гидрофобной) возрастет;

- удельная ароматичность суммарных фракций ФК возрастет, наблюдается существенный рост ароматичности гидрофильной фракции ФК, содержащей малополярные заместители в молекулах;

- предпочтительным спиртом для экстракции ГМК является этанол; - в исследованных образцах гумусовых кислот содержится около 20%(w/w) ГМК;

- относительная степень ароматичности ГМК в процессе гумификации не изменяется;

- с ростом степени гумификации наблюдается снижение содержания карбоксильных, карбонильных и фенольных групп в ГМК.

7. Исследования вермикомпостов, полученных из разных субстратов показали, что процессы вермикомпостирования для различных компостов различаются как по интенсивности гумификации (различия в приросте удельной ароматичности суммарных фракций), так и по механизмам гумификации (различия в приросте гидрофильной и гидрофобной фракций);

8. Исследования методом сканирующей микрокалориметрии показали, что ГК в разбавленных водных растворах находятся в виде "мицелл" и содержат две фракции гидрофильную и гидрофобную; в процессе вермикомпостирования содержание гидрофобной фракции увеличивается и возрастает ее алифатичность.

9. Метод ¹³С ЯМР-спектроскопии показал, что исследованные препараты ГК, разного срока созревания различаются по соотношению ароматических и углеводных фрагментов, входящих в состав углеродного скелета. Были идентифицированы и количественно определены следующие функциональные группы и молекулярные фрагменты: ароматические (- Ar), карбоксильные (-СООН), карбонильные (-С=О), алкильные (Alk), О-замещенные алифатические атомы углерода (Alk-O).

10. Разработана общая методология контроля степени гумификации с помощью:

а) метода ВЭЖХ, используя как критерий относительную суммарную ароматичность ГВ;

б) метода сканирующей микроколориметрии используя как критерий разность теплоемкостей, температуру и температурные интервалы перехода разрушения мицелл ГВ.

11. Разработана методика выделения экстрактов и вытяжек из биогумуса, получения препарата гуминового комплекса. Показано положительное влияние гуминового комплекса на иммунную систему с/х растений, что значительно усиливает устойчивость растений к биотическим факторам и повышает урожайность.

12. На основании систематических исследований в полевых и лабораторных условиях выявлена биологическая активность и сортоспецифичность препарата гуминового комплекса, что дает возможность разработки биологически активных фитоиммуномодуляторов.

Предложения по практическому использованию результатов исследований

1. На основе водорастворимой фракции гумусовых соединений, полученных из вермикомпоста на основе червя "Старатель", перспективно создание нового класса иммуномодуляторов, стимуляторов роста и развития растений.

2. Гуминовый комплекс, полученный путем щелочной экстракции из вермикомпостов, может быть рекомендован в качестве компонента питательных сред для культивирования зародышей с целью селекции новых сортов.

Экономическая оценка результатов исследований

Широкое использование в сельскохозяйственном производстве вермикомпостов (биогумуса), несомненно, будет способствовать оздоровлению окружающей среды, снижению применения химических средств защиты растений, повышению урожайности и устойчивости к болезням и вредителей сельскохозяйственных культур и получению экологически безопасной пищевой продукции.

Предварительные расчеты показали, что производство биогумуса, приготовление на его основе раствора, обработка семян, опрыскивание посевов экономически выгодно в связи с повышением урожайности сельскохозяйственных культур и исключением химических средств защиты.

В качестве контрольного варианта была взята технология возделывания гороха без обработки против болезней и вредителей и технология возделывания гороха с использованием предпосевной обработки семян и двукратной внекорневой обработки растений гороха биопрепаратом гуминового комплекса на основе копролитов дождевого червя "Старатель" в концентрации 1,510 ^-4 %. Прибавка к урожайности составила 12,6 ц/га по сравнению с контролем. Валовой сбор основной продукции в контрольном варианте составил 137 т., в опытном - 263т., что дает возможность снижения себестоимости на 1442,1 руб. на 1т. основной продукции (в ценах 2007 года).

Прибыль от внедрения подобной разработки в сельскохозяйственное производство может составить 12323,07 рублей на гектар посевов бобовых культур (в ценах 2007 года).

Из проведенного выше анализа экономической эффективности контроля и исследуемых вариантов можно сделать вывод, что обработка семян и опрыскивание посевов вытяжкой из биогумуса экономически выгодно.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И., Полозова Е.Ю., Борзенкова Г.А. Физико-химическая характеристика и биологическая активность биогумуса. - Орел: Издательство ОРАНС, 2007. - 140 с. (монография).

2. Юшкова Е.И., Таканаев А.А., Павловская Н.Е., Яроватая М.А. Разработка биологически - активных веществ на базе вермикультуры // Экология и жизнь: Сборник материалов VII Международной научно-практической конференции. - Пенза, 2004. - С. 149-151.

3. Юшкова Е.И., Таканаев А.А., Павловская Н.Е., Яроватая М.А. Выделение и функциональная характеристика некоторых белков и пептидов из Eisenia Fetida // Материалы Второго съезда Общества биотехнологов России. / Под ред. Василова Р.Г. - М.: МАКС Пресс, 2004. - С. 196.

4. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И. Физико-химические свойства экстрактов из биогумуса разной степени зрелости. // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2006.- т.6.- № 1. - С.70-79.

5. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И. Выделение и исследование некоторых физико-химических свойств гиматомелановых кислот методом ВЭЖХ. // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2006.- т.6.- № 5. - С. 807-816.

6. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И. Сравнительные исследования гуминовых кислот выделенных из компостов и вермикомпостов различного происхождения методом ВЭЖХ. // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2006.- т.6.- № 6. - С. 1358-1364.

7. Юшкова Е.И., Яроватая М.А. Выделение и исследование некоторых физико-химических свойств фульвокислот методом ВЭЖХ. // Фундаментальные и прикладные проблемы современной химии в исследованиях молодых ученых: Материалы Международной научной конференции. - Астрахань, 2006. - С. 151-152.

8. Юшкова Е.И. Изучение связывающих и детоксицирующих свойств гуминовых кислот по отношению к различным классам экотоксикантов. // Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания: Сборник материалов межрегиональной научно-методической конференции. - Нижний Новгород, 2006. - С. 193-195.

9. Юшкова Е.И. Применение метода ВЭЖХ для определения степени созревания гуминовых веществ в процессе вермикомпостирования. // Аналитика России: Материалы II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием. - Краснодар, 2007. - С. 68.

10. Юшкова Е.И. Выделение, фракционирование и исследование некоторых физико-химических свойств методом ВЭЖХ гумусовых кислот полученных на основе вермикомпоста. // Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях: Всероссийский симпозиум (К юбилею проф. О.Г. Ларионова). - Москва, 2007.- С. 95.

11. Юшкова Е.И. Перспективы использования вермикультуры для утилизации осадков сточных вод. // Инновационные технологии обеспечения безопасности питания и окружающей среды: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Оренбург, 2007.- С.460-461.

12. Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н., Ботуз Н.И. Выделение и сравнительное исследование протеолитической активности экстрактов биогумуса. // Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы, достижения: Сборник научных трудов международной научно-практической конференции ведущих специалистов, ученых предпринимателей и производственников. - Минск, 2007. - С. 71-72.

13. Юшкова Е.И. Определение средней молекулярной массы белков биогумуса. Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования: Материалы 55 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием. - С-Пб, Изд. РПГУ им. А.И. Герцена, 2008. - С.282-283.

14. *Юшкова Е.И., Даниленко А.Н., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Исследования методом ВЭЖХ физико-химических свойств фульвокислот компостов и вермикомпостов различного происхождения. // Агрохимия, 2008. - №3. - с. 67-71.

15. Юшкова Е.И. Использование метода ¹³С ЯМР-спектроскопии в исследовании гуминовых кислот полученных из вермикомпостов различного срока созревания. // Современные проблемы науки и образования, 2008. - № 6. - С. 134-136.

16. Юшкова Е.И. Зависимость термодинамических свойств разбавленных растворов гуминовых веществ от их относительной степени ароматичности. ГОУ ВПО Орловский государственный университет.- Орел, 2008. Деп. в ВИНИТИ 28.11.08. № 908-В2008.

17. *Даниленко А.Н., Браудо Е.Е., Павловская Н.Е., Юшкова Е.И. Взаимосвязь межу гидрофобностью гуминовых кислот и термодинамическими свойствами их разбавленных растворов. // Биофизика, 2010. - № . - С.

18. Юшкова Е.И. Хроматографическое исследование жирнокислотного состава экстрактов биогумуса. // Экоаналитика - 2009: VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды. - Йошкар-Ола, 2009. - С. 239-240.

19. Юшкова Е.И., Даниленко А.Н. Оптимизация выделения гумусовых кислот методом экстракции. // Экоаналитика - 2009: VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды. - Йошкар-Ола, 2009. - С.240-241.

20. Юшкова Е.И. Химический состав и агрохимическая характеристика биогумуса полученного на основе червя "Старатель". // С-Петербург. Актуальные проблемы модернизации химического и естественнонаучного образования: Материалы 56 Всероссийской научно-практической конференции химиков с международным участием. - С-Пб, Изд. РПГУ им. А.И. Герцена, 2009. - С. 344-345.

21. Юшкова Е.И., Таканаев А.А. Использование целлюлолитических и легнинолитических ферментов вермикультуры для утилизации отходов с/х производства. // Биотехнология. Биомедицинская инженерная и технология современных социальных практик: Сборник трудов Всероссийской научно-практической конференции. - Курск: ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, 2009.- С.98-99.

22. Юшкова Е.И., Таканаев А.А. Вермикультура как источник биологически активных соединений для фармакологии и медицины. // Ученые записки Орловского государственного университета. Серия "Естественные, технические и медицинские науки", 2009. - №2 (32). - С.109-112.

23. Юшкова Е.И., Таканаев А.А. Препараты биологической защиты растений на основе вытяжек из биогумуса. - Ученые записки Орловского государственного университета. Серия "Естественные, технические и медицинские науки", 2009. - № 2 (32). - С.112-115.

24. Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И.Влияние активного вещества биогумуса на урожай сельскохозяйственных культур. // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Выпуск 11. - ВГУ, 2009. - С. 254-258.

25. Юшкова Е.И., Даниленко А.Н., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И.Исследование некоторых физико-химических свойств фульвокислот, выделенных из образцов биогумуса разного времени созревания. // Актуальные проблемы химии и методики ее преподавания. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: Нижний Новгород: НПГУ, 2009. - С.177-180.

26. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е. Сравнительное исследование микробиологического состава компостов и вермикомпостов. // Естественные и технические науки, 2010. - № 1. - С.133-135.

27. *Юшкова Е.И., Борзенкова Г.А., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Испытание активного вещества биогумуса на болезнеустойчивость и урожай гороха. // Хранение и переработка сельхозсырья, 2010. - № .- С.

28. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Влияние биологически активного вещества биогумуса на рост, развитие и урожай картофеля. // Сельскохозяйственная биология, 2010. - № . - С.

29. *Павловская Н.Е., Бородин Д.Б., Юшкова Е.И. Исследование влияния гуминового комплекса вермикомпоста на ферменты антиоксидантной системы гороха. - Агрохимия, 2010. - № 10. - С.

30. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Даниленко А.Н. Исследования методом ВЭЖХ физико-химических свойств гуминовых кислот компостов и вермикомпостов разного периода созревания. // Сорбционные и хроматографические процессы, 2010. - № 3. - С. 409-418.

31. Юшкова Е.И., Павловская Н.Е. Получение препарата гуминового комплекса и его влияние на развитие и продуктивность некоторых сельскохозяйственных культур. // Вермикомпостирование и вермикультивирование как основа экологического земледелия в XXI веке: проблемы, перспективы, достижения: Сборник научных трудов 2-ой международной научно-практической конференции ведущих специалистов, ученых предпринимателей и производственников. - Минск, 2010 г.- С. 180-183.

32. *Юшкова Е.И., Павловская Н.Е., Ботуз Н.И. Изучение влияния активного вещества биогумуса на антиоксидантную систему проростков гороха. // Вестник ВГУ. Серия: Химия. Биология. Фармация.- 2010. - № 2. - С.

33. Юшкова Е.И., Даниленко А.Н. Количественное определение гумусовых кислот методом экстракции как показатель степени зрелости вермикомпостов. // Экстракция органических соединений: Материалы IV Международной конференции, Воронеж, 2010 г.

34. Юшкова Е.И., Таканаев А.А. Исследование ферментативной активности некоторых белков и пептидов, выделенных из биомассы дождевого червя Владимирский гибрид "Старатель". // Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов: Межрегиональный сборник научных работ. - Выпуск 12. - ВГУ, 2010. - С. .

35. *Юшкова Е.И., Таканаев А.А. Влияние белков и пептидов, выделенных из биомассы дождевого червя Владимирский гибрид "Старатель" на структурную организацию мембран. // Ученые записки Орловского государственного университета. Серия "Естественные, технические и медицинские науки", 2010. - № 2(36).- С.102-106.

* - работы, опубликованные в изданиях, рекомендуемых ВАК (4-6, 14, 17, 26-30, 32, 35).

Выражаю глубокую и искреннюю признательность научному консультанту профессору, д.б.н. Павловской Н.Е., за неоценимый вклад в формировании теоретического фундамента данной тематики; профессору, д.б.н. Таканаеву А.А. за участие в обсуждении и рецензировании глав диссертации; ст. научному сотруднику института биохимической физики РАН им. Н.М. Эммануэля Даниленко А.Н. за помощь в проведении экспериментальных исследований химического состава биогумуса; к.с.х.н. Ботуз Н.И. за сотрудничество и помощь в работе; к.с.х.н., зав. лабораторией иммунитета и защиты растений ГНУ ВНИИЗБК Борзенковой Г.А. за помощь в проведении полевых исследований.