Исследование системы гомеостаза железа и развития окислительного стресса методами математического моделирования

Рисунок 9. Динамика физиологических параметров при развитии асцитной гипатомы Зайделя.

Для оценки динамики развития окислительного стресса во время роста асцитной опухоли была измерена АФК генерирующая активность ПМЯЛ в крови и скорость наработки АФК в асцитной жидкости хемилюминесцентным методом. На Рис.9 показано, что АФК генерирующая активность ПМЯЛ к 12-м суткам увеличивается в 7-8 раз, что в совокупности с увеличением количества ПМЯЛ говорит о развитии окислительного стресса в крови животных. В то же время, с развитием гепатомы, скорость наработки АФК в зоне роста опухоли постепенно снижается.

В плазме крови большая часть ионов железа находится в комплексе с белком трансферрином, защищающим организм от образования высокотоксичных радикалов по реакции Фентона. Для понимания роли системы гомеостаза железа в процессе развития асцитной гепатомы Зайделя была изучена динамика трансферрина в плазме крови и асцитной жидкости иммунноферментным методом. На Рис.9 показано, что уровень трансферрина в плазме крови животных в процессе развития опухоли снижается в 2.5-3 раза, тогда как в асцитной жидкости наблюдается рост концентрации трансферрина.

В совокупности эти данные указывают на противоположность процессов, происходящих в крови и асците животных. В крови наблюдается усиление процессов генерации АФК за счет активации и увеличения количества ПМЯЛ и уменьшение концентрации белка антиоксидантной защиты организма - трансферрина, в предыдущих работах также было зафиксировано уменьшение концентраций низкомолекулярных антиоксидантов, таких как б-токоферол и мочевая кислота. В противоположность этому, в зоне роста опухоли наблюдается снижение скорости наработки АФК, падение концентрации макрофагов и усиление антиоксидантной защиты. Такая разнонаправленность отчасти может быть объяснена перераспределением жидкости и пассивным транспортом веществ из крови в асцит.

Для проверки этой гипотезы была создана математическая модель пассивного переноса веществ из крови в асцит с током жидкости. Схема модели представлена на Рис.10. Она состоит из двух компартментов: плазма крови и асцит, между которыми осуществляется ток жидкости с тем, чтобы объем асцита соответствовал наблюдаемым значениям. Вместе с током жидкости из плазмы крови в асцит осуществляется перенос веществ, предсказание концентраций которых является одной из подзадач данной работы.

Рисунок 10. Схема модели пассивного переноса веществ-антиоксидантов из плазмы крови в асцитную жидкость (ОС - окислительный стресс).

Следующие два дифференциальных уравнения описывают изменение концентрации веществ в плазме крови и асцитной жидкости, предполагая механизм пассивного переноса:

,

,

где F(t) есть поток жидкости из плазмы крови в асцит, S(t) - скорость образования вещества в крови, V_p - объем плазмы крови, V_a(t) - объем асцитной жидкости. Основная идея этой модели состоит в том, что антиоксиданты плазмы крови, вырабатывающиеся в большом количестве в ответ на развивающийся окислительный стресс, с током жидкости переносятся в асцит, и, таким образом, защищают опухоль. Несмотря на то, что осуществляется пассивный перенос веществ, и их концентрации в асците, как правило, меньше чем в плазме крови, количество антиоксидантных веществ в асците значительно превышает соответствующие показатели плазмы крови (за счет большого объёма асцита). На Рис.11 представлено сравнение предсказанных концентраций трансферрина в плазме крови и асците с экспериментом. Сплошными линиями показаны рассчитанные концентрации трансферрина в плазме крови и асците, а точками - результаты экспериментов. Модель пассивного переноса хорошо описывает динамику трансферрина. Стоит отметить, что, несмотря на пассивный механизм переноса, заложенный в модели, к концу развития опухоли количество трансферрина в асците составляет примерно 250мг, в то время как в плазме крови это значение не превышает 100мг.

Рисунок 11. Сравнение предсказанных концентраций трансферрина в плазме крови и асцитной жидкости с помощью модели пассивного переноса с экспериментальными значениями.

3.4 Идентификация генов, участвующих в гомеостазе железа

Анализ микрочиповых данных был проведен с использованием языка программирования R [38]. Коррекция фона каждого чипа в отдельности осуществлялась методом normexp [39, 40]. Затем чипы платформы Affymetrix и одноканальные чипы платформы Agilent были нормализованы методом quantile [41] в логарифмической шкале. “Двухцветные” чипы были нормализованы методом loess [42]. Для идентификации дифференциально экспрессирующихся генов сначала был применен t-test для каждой пробы (набора проб) предложенным в [43] на основе аннотации проб в базе данных

Таблица 1. Краткое описание микрочиповых экспериментов, использованных для поиска генов, участвующих в гомеостазе железа.

Ensembl (http://www.ensembl.org/) [54], гены со значением гипергеометрического скора более 3.0 считались значимо дифференциально экспрессирующимися. Анализ представленности Gene Ontology (http://www.geneontology.org/) [55] категорий в списке отобранных генов осуществлялся с помощью гипергеометрического теста. Категории с p-value меньше чем 0.01 считались значимо перепредставленными. Десять наиболее представленных категорий приведены в таблице 2.

В список выявленных дифференциально экспрессирующихся генов входят ранее известные участники гомеостаза железа, такие как, TfR1, Dmt1, цитохром b редуктаза, ферропортин, Hfe, Cp, Hp, Slc11a2, Steap3, Slc25a37 (категории "iron ion transport", "response to iron ion" и " cellular iron ion homeostasis").

А также группы генов ранее не замеченных в регуляции гомеостаза железа, из которых следует отметить группу генов, участвующих в гомеостазе ионов меди, представленные в таблице 3 и участники липидного гомеостаза таблица 4.

Таблица 2. Список категорий Gene Ontology, наиболее представленных среди генов с измененной экспрессией.

Таблица 3. Гены, регулирующие гомеостаз меди, экспрессия которых значимо коррелирует с уровнем железа в ткани.

Таблица 4. Гены, регулирующие гомеостаз липидов, экспрессия которых значимо коррелирует с уровнем железа ткани

В дальнейшем, результаты анализа экспрессии генов, регулирующих метаболизм железа, меди и липидов, будут использованы для уточнения, расширения и интеграции созданных в ходе выполнения данной дипломной работы моделей.

Актуальность проведенной работы по исследованию и моделированию процессов, происходящих в асцитной опухоли у крысы и в плазме крови при развитии окислительного стресса на фоне дисбаланса метаболизма железа, видится несомненной. Помимо того, что был сделан очередной шаг к полному пониманию данной патологии и разработке методов эффективного лечения пациентов в будущем, также был расширен набор моделей системы метаболизма железа, что в дальнейшем позволит создать комплексную интеграционную модель для проведения экспериментов in silico. В настоящее время в мировой науке прослеживается сильная тенденция в направлении минимизации использования лабораторных животных и экспериментов с участием добровольцев засчет разработок в области моделирования биологических процессов, отдельных типов клеток, тканей и органов животных и человека. Эти тенденции подчеркивают важность и в достаточной степени новизну проведенной работы.

Выводы

1. Согласно результатам моделирования, стабилизация рецептора TfR2 холотрансферрином обусловлена различием в эндосомальной сортировке комплексов данного рецептора с лигандом, помимо этого наблюдается бифазный режим захвата трансферрина клетками, экспрессирующими данный рецептор, что хорошо согласуется с экспериментальными данными других авторов.

3. Во время развития асцитной гепатомы Зайделя:

а). в крови крыс наработка АФК увеличивается в 7-8 раз, тогда как в зоне роста опухоли она непрерывно снижается, что свидетельствует о работе защитных механизмов асцита;

б). в крови крыс происходит непрерывный рост числа ПМЯЛ, в то время как концентрация макрофагов в асците достигает максимума на 3 сутки и в дальнейшем падает, что свидетельствует о недостаточности средств иммунной системы для подавления опухоли;

в). в плазме крови концентрация трансферрина падает, а в асцитной жидкости растет, при этом к концу развития опухоли большая часть трансферрина переходит из крови в асцит.

4. На основе экспериментальных данных и результатов моделирования показано, что перераспределение трансферрина и низкомолекулярных антиоксидантов между кровью и асцитом обусловлено их пассивным транспортом в опухоль.

5. В результате анализа микрочиповых данных показана значимая корреляция экспрессии ряда генов, регулирующих метаболизм липидов и меди, с уровнем железа в ткани. В дальнейшем эти гены и их белки будут учтены при моделировании системы метаболизма железа и ее роли в развитии окислительного стресса.

Список литературы

1. Kruszewski, M. Labile iron pool: the main determinant of cellular response to oxidative stress // Mutation Research. - 2003. - N 531. - P. 81-92.

2. Kakhlon, O., Cabantchik, Z.I. The labile iron pool: characterization, measurement, and participation in cellular processes // Free Radic. Biol. Med. - 2002. - N 33. - P. 1037-1046.

3. Petrat, F., Groot, H.D., Sustmann, R., Rauen, U. The chelatable iron pool in living cells: a methodically defined quantity // Biol. Chem. - 2002. - N 383. - P. 489-502.

4. Delanghe, J.R., Langlois, M.R. Hemopexin: a review of biological aspects and the role in laboratory medicine // Clinica Chimica Acta. - 2001. - V. 312. - P. 13-23.

5. Chua, C.G., Graham, R.M., Trinder, D., Olynyk, J.K. The regulation of cellular iron metabolism // Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. - 2007. - V. 44. - P. 413-459.

6. Kaplan, J. Mechanisms of cellular iron acquisition: another iron in the fire // Cell. - 2002. - V. 111. - P. 603-606.

7. Richardson, D.R., Ponka, P. The molecular mechanisms of the metabolism and transport of iron in normal and neoplastic cells // Biochimica et Biophysica Acta. - 1997. - V. 1331. - P. 1-40.

8. Calzolari, A., Oliviero, I., Testa, U. Transferrin receptor 2 is emerging as a major player in the control of iron metabolism. // CEJB. - 2007. - V. 2. - N 1. - P. 34-55.

9. Smythe, E., Warren, G. The mechanism of receptor-mediated endocytosis // Eur. J. Biochem. - 1991. - V. 202. - P. 689-699.

10. Ohgami, R.S., Campagna, D.R., Greer, E.L., Antiochos, B., McDonald, A., Chen, J., Sharp, J.J., Fujiwara, Y., Barker, J.E., Fleming, M.D. Identification of a ferrireductase required for efficient transferrin-dependent iron uptake in erythroid cells // Nat. Genet. - 2005. - V. 37. - N 11. - P. 1264-1269.

11. West, A.P., Bennett, M.J., Sellers, V.M., Andrews, N.C., Enns, C.A., Bjorkman, P.J. Comparison of the interactions of transferrin receptor and transferrin receptor 2 with transferrin and the hereditary hemochromatosis protein HFE // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. - N 49. - P. 38135-38138.

12. Robb, A.D., Ericsson, M., Wessling-Resnick, M. Transferrin receptor 2 mediates a biphasic pattern of transferrin uptake associated with ligand delivery to multivesicular bodies // Am. J. Physiol. Cell Physiol. - 2004. - V. 287. - P. 1769-1775.

13. Johnson, M.B., Chen, J., Murchison, N., Green, F.A., Enns, C.A. Transferrin receptor 2: evidence for ligand-induced stabilization and redirection to a recycling pathway // Molecular Biology of the Cell. - 2007. - V. 18. - P. 743-754.

14. Johnson, M.B., Enns, C.A. Diferric transferrin regulates transferrin receptor 2 protein stability // Blood. - 2004. - V. 104. - N 13. - P. 4287-4293.

15. Ganz, T. Is TfR2 the iron sensor? // Blood. - 2004. V. 104. - N 13. - P. 3839-3840.

16. Wallander, M.L., Leibold, E.A., Eisenstein, R.S. Molecular control of vertebrate iron homeostasis by iron regulatory proteins // Biochim. Biophys. Acta. - 2006. - V. 1763. - N 7. - C. 668-689.

17. Hentze, M.W., Muckenthaler, M.U., Andrews, N.C. Balancing acts: molecular control of mammalian iron metabolism // Cell. - 2004. - V. 117. - P. 285-297.

18. Schalinske, K.L., Eisenstein, R.S. Phosphorylation and activation of both iron regulatory protein 1 (IRP1) and IRP2 in HL60 cells // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 7168-7176.

19. Kang, D.K., Jeong, J., Drake, S.K., Wehr, N.B., Rouault, T.A., Levine, R.L. Iron regulatory protein 2 as iron sensor. Iron- dependent oxidative modification of cysteine. // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 14857-14864.

20. Knutson, M.D., Oukka, M., Koss, L.M., Aydemir, F., Wessling-Resnick, M. Iron release from macrophages after erythrophagocytosis is up-regulated by ferroportin 1 overexpression and down-regulated by hepcidin // PNAS. - 2005. - V. 102. - N 5. - P. 1324-1328.

21. Johnson, M.B., Chen, J., Murchison, N., Green, F.A., Enns, C.A. Transferrin receptor 2: evidence for ligand-induced stabilization and redirection to a recycling pathway // Molecular Biology of the Cell. -2005 - V. 18. - P. 743-754.

22. Johnson, M.B., Enns, C.A. Diferric transferrin regulates transferrin receptor 2 protein stability // Blood. - 2004. - V. 104. - N 13. - P. 4287-4293.

23. Anderson, G.J., Darshan, D., Wilkins, S.J., Frazer, D.M. Regulation of systemic iron homeostasis: how the body responds to changes in iron demand // Biometals. - 2007. - V. 20. - P. 665-674.

24. Nemeth, E., Tuttle, M.S., Powelson, J., Vaughn, M.B., Donovan, A., Ward, D.M., Ganz, T., Kaplan, J. Hepcidin regulates cellular iron efflux by binding to ferroportin and inducing its internalization // Science. - 2004. - V. 306. - P. 2090-2093.

25. Goswami, T., Andrews, N.C. Hereditary hemochromatosis protein, HFE, interaction with transferrin receptor 2 suggests a molecular mechanism for mammalian iron sensing // Journal of Biological Chemistry. - 2006. - V. 281. - N 39. - P. 28494-28498.

26. Erwin, H.J., Kemna, M., Tjalsma, H., Willems, H.L., Swinkels, D.W. Hepcidin: from discovery to differential diagnosis // Haematologica. - 2008. - V. 93. - N 1. - P. 90-97.

27. West, A.P., Bennett, M.J., Sellers, V.M., Andrews, N.C., Enns, C.A., Bjorkman, P.J. Comparison of the interactions of transferrin receptor and transferrin receptor 2 with transferrin and the hereditary hemochromatosis protein HFE // J. Biol. Chem. - 2000. - V. 275. - N 49. - P. 38135-38138.

28. Falzacappa, M.V., Spasic, M.V., Kessler, R., Stolte, J., Hentze, M.W., Muckenthaler, M.U. STAT3 mediates hepatic hepcidin expression and its inflammatory stimulation // Blood. - 2007. - V. 109. - N 1. - P. 353-358.

29. Лобашевский, А.Л. Выделение полиморфно-ядерных лейкоцитов из малых объемов крови после осаждения декстраном // Лаб. дело. - 1983. - Т. 11. - С. 28-31.

30. French, A.R., Lauffenburger, D.A. Controlling receptor/ligand trafficking: effects of cellular and molecular properties on endosomal sorting // Annals of Biomedical Engineering. - 1997. - V. 25. - P. 690-707.

31. Lao, B.J., Tsai, W.P., Mashayekhi, F., Pham, E.A., Mason, A.B., Kamei, D.T. Inhibition of transferrin iron release increases in vitro drug carrier efficacy // Journal of Controlled Release. - 2007. - V. 117. - P. 403-412.

32. Omholt, S.W., Kefang, X., Andersen, O., Plahte, E. Description and analysis of switchlike regulatory networks exemplied by a model of cellular iron homeostasis // J. Theor. Biol. - 1998. - V. 195. - P. 339-350.

33. Plahte, E., Mestl, T., Omholt, S.W. A methodological basis for description and analysis of systems with complex switch-like interactions // J. Math. Biol. - 1998. - V. 36. - P. 321-348.

34. Nathanson, M.H., Mclaren, G.D. Computer simulation of iron absorption: regulation of

mucosal and systemic iron kinetics in dogs // The Journal of Nutrition. - 1986. - V. 117 - N 6. - P. 1067-1075.

35. Lao, B.J., Kamei, D.T. A compartmental model of iron regulation in the mouse // Journal of Theoretical Biology. - 2007. - V. 243. - C. 542-554.

36. Sackmann, A., Formanowicz, D., Formanowicz, P., Koch, I., Blazewicz, J. An analysis of the Petri net based model of the human body iron homeostasis process // Computational Biology and Chemistry. - 2007. - V. 31. - C. 1-10.

37. Franzone, P.C., Paganuzzi, A., Stefanelli, M. A mathematical model of iron metabolism // J. Math. Biology. - 1982. - V. 15. - C. 173-201.

38. R: A language and environment for statistical computing, Vienna, 2008. - 1667 p.

39. Smyth, G.K. Limma: linear models for microarray data // Bioinformatics. - 2005. - V. 23. - P. 397-420.

40. Gautier, L., Cope, L., Bolstad, B.M., Irizarry, R.A. Affy - analysis of affymetrix genechip data at the probe level // Bioinformatics. - 2004. - V. 20. - P. 307-315.

41. Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M., Speed, T.P. A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on bias and variance // Bioinformatics. - 2003. V. 19. - P. 185-193.

42. Yang, Y.H., Dudoit, S., Luu, P., Lin, D.M., Peng, V., Ngai, J., Speed, T.P. Normalization for cDNA microarray data: a robust composite method addressing single and multiple slide systematic variation // Nucleic Acids Research. - 2002. - V. 30. - P. 15-19.

43. Kondrakhin, Y.V., Sharipov, R.N., Kel, A.E., Kolpakov, F.A. Identification of differentially expressed genes by meta-analysis of microarray data on breast cancer // In Silico Biology. - 2008. - V. 8. - P. 5-23.

44. Kautz, L., Meynard, D., Monnier, A., Darnaud, V., Bouvet, R., Wang, R.H., Deng, C., Vaulont, S., Mosser, J., Coppin, H., Roth, M.P. Iron regulates phosphorylation of Smad1/5/8 and gene expression of Bmp6, Smad7, Id1, and Atoh8 in the mouse liver // Blood. - 2008. - V. 112. - P. 1503-1509.

45. Rodriguez, A., Hilvo, M., Kytomaki, L., Fleming, R.E., Britton, R.S., Bacon, B.R., Parkkila, S. Effects of iron loading on muscle: genome-wide mRNA expression profiling in the mouse // BMC Genomics. - 2007. - V. 8. - P. 379.

46. Chicault, C., Toutain, B., Monnier, A., Aubry, M., Fergelot, P., Treut, A., Galibert, M.D., Mosser, J. Iron-related transcriptomic variations in CaCo-2 cells, an in vitro model of intestinal absorptive cells // Physiol. Genomics. - 2006. - V. 26. - P. 55-67.

47. Collins, J.F. Gene chip analyses reveal differential genetic responses to iron deficiency in rat duodenum and jejunum // Biol. Res. - 2006. - V. 39. - P. 25-37.

48. Collins, J.F., Franck, C.A., Kowdley, K.V., Ghishan, F.K. Identification of differentially expressed genes in response to dietary iron deprivation in rat duodenum // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. - 2005. - V. 288. - P. 964-971.

49. Collins, J.F., Hu, Z., Ranganathan, P.N., Feng, D., Garrick, L.M., Garrick, M.D., Browne, R.W. Induction of arachidonate 12-lipoxygenase (Alox15) in intestine of iron-deficient rats correlates with the production of biologically active lipid mediators // Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver. Physiol. - 2008. - V. 294. - P. 948-962.

50. Du, X., She, E., Gelbart, T., Truksa, J., Lee, P., Xia, Y., Khovananth, K., Mudd, S., Mann, N., Moresco, E.M., Beutler, E., Beutler, B. The serine protease TMPRSS6 is required to sense iron deficiency // Science. - 2008. - V. 320. - P. 1088-1092.

51. Folgueras, A.R., Lara, F.M., Pendas, A.M., Garabaya, C., Rodriguez, F., Astudillo, A., Bernal, T., Cabanillas, R., Lopez-Otin, C., Velasco, G. Membrane-bound serine protease matriptase-2 (Tmprss6) is an essential regulator of iron homeostasis // Blood. - 2008. - V. 112. - P. 2539-2545.

52. Coppin, H., Darnaud, V., Kautz, L., Meynard, D., Aubry, M., Mosser, J., Martinez, M., Roth, M.P. Gene expression profiling of Hfe-/- liver and duodenum in mouse strains with differing susceptibilities to iron loading: identification of transcriptional regulatory targets of Hfe and potential hemochromatosis modifiers // Genome Biol. - 2007. - V. 8. - C. 221.

53. Dunn, L.L., Sekyere, E.O., Rahmanto, Y.S., Richardson, D.R. The function of melanotransferrin: a role in melanoma cell proliferation and tumorigenesis // Carcinogenesis. - 2006. - V. 27. - P. 2157-2169.

54. Hubbard, T.J., Aken, B.L., Ayling, S., Ballester, B., Beal, K., Bragin, E., Brent, S., Chen, Y., Clapham, P., Clarke, L., Coates, G., Fairley, S., Fitzgerald, S., Fernandez-Banet, J., Gordon, L., Graf, S., Haider, S., Hammond, M., Holland, R., Howe, K., Jenkinson, A., Johnson, N., Kahari, A., Keefe, D., Keenan, S., Kinsella, R., Kokocinski, F., Kulesha, E., Lawson, D., Longden, I., Megy, K., Meidl, P., Overduin, B., Parker, A., Pritchard, B., Rios, D., Schuster, M., Slater, G., Smedley, D., Spooner, W., Spudich, G., Trevanion, S., Vilella, A., Vogel, J., White, S., Wilder, S., Zadissa, A., Birney, E., Cunningham, F., Curwen, V., Durbin, R., Fernandez-Suarez, X.M., Herrero, J., Kasprzyk, A., Proctor, G., Smith, J., Searle, S., Flicek, P. Ensembl 2009 // Nucleic Acids Res. - 2009. - V. 37. - P. 690-697.

55. Ashburner, M., Ball, C.A., Blake, J.A., Botstein, D., Butler, H., Cherry, J.M., Davis, A.P., Dolinski, K., Dwight, S.S., Eppig, J.T., Harris, M.A., Hill, D.P., Issel-Tarver, L., Kasarskis, A., Lewis, S., Matese, J.C., Richardson, J.E., Ringwald, M., Rubin, G.M., Sherlock, G. Gene ontology: tool for the unification of biology // Nat. Genet. - 2000. - V. 25. - P. 25-29.

Размещено на Allbest.ru