Фотодинамический эффект и фотодинамическая терапия

Как показывают данные таблицы 3, фотодинамическое воздействие не только повреждает разнообразные клеточные белки, но также вызывает активацию и повышение экспрессии некоторых из них. К таким белкам относятся некоторые белки общего метаболизма, например, гликолитические, поддерживающие производство АТФ, когда нарушается окислительное фосфорилирование в митохондриях. Другой класс активируемых белков - защитные белки: разнообразные шапероны, супероксиддисмутаза, гемоксигеназа-1. Фотодинамическое воздействие также активирует белки, участвующие в апоптозе: каспазы, белки семейства Bcl-2, PARP и т.д. Наконец, самый интересный класс белков - сигнальные белки, контролирующие практически все внутриклеточные процессы. Это разнообразные протеинкиназы и факторы транскрипции, управляющие работой генома. Рассмотрим участие некоторых важнейших сигнальных белков в реакциях клеток на фотодинамическое повреждение.

Таблица 3. Белки, активирующиеся или экспрессирующиеся при фотодинамическом воздействии

17. Протеинкиназа С

Протеинкиназа С - один из центральных регуляторов в сигнальной системе клетки. После активации ионами Ca²⁺ и диацилглицеролом она фосфорилирует и регулирует множество белков, контролирующих жизнедеятельность и выживаемость клеток, включая ферменты, факторы транскрипции, ионные каналы и белки цитоскелета.

Есть ряд примеров об участии протеинкиназы С в фотоиндуцированной смерти клеток CHO и апоптозе глиальных клеток, сенсибилизированных алюмофталоцианином. Но в большинстве работ ингибиторы протеинкиназы С: гиперицин, стауроспорин, тамоксифен или Н7 усиливали фотоиндуцированный апоптоз этих клеток, что указывает на защитную роль этого фермента, причем она защищала клетки не только от апоптоза, но и от некроза. Одним из механизмов ее противоапоптозной активности может являться фосфорилирование и активация противоапоптозного белка Bcl-2.

18. cAMP-зависимый сигнальный путь

Циклический аденозинмонофосфат, синтезируемый аденилатциклазой в ответ на связывание межклеточных молекулярных сигналов (гормонов, нейромедиаторов) рецепторами, связанными с G-белками, активирует протеинкиназу А, которая, в свою очередь, фосфорилирует и активирует разнообразные исполнительные белки в клетке. Этот путь обычно участвует в защите клеток от повреждений, индуцированных внешними воздействиями. Действительно, в ряде работ было показано, что аденилатциклазный путь участвует в защите различных клеток от фотодинамического повреждения.

19. Тирозинкиназы

Рецепторные тирозинкиназы, распознающие внеклеточные сигнальные молекулы, такие как цитокины и факторы роста, инициируют сигнальные пути, связанные с МАР киназами, фосфолипазой С, и фосфатидилинозитол 3-киназой, которые регулируют клеточные реакции на стресс, выживаемость клеток и поддерживают целостность тканей (Рис.4.9).

Фотодинамическое воздействие может повреждать рецепторы клеточной поверхности. Экспериментально показано, что фотосенсибилизация клеток может ингибировать связывание различных цитокинов (например, TNF-б, IL-8, EGF) с рецепторами или связывание моноклональных антител - с поверхностными антигенами. Этот эффект специфичен для разных рецепторов, цитокинов или антител. Например, в эпителиальных клетках FaDu фотодинамическое воздействие протопорфирина IX, синтезированного из экзогенного ALA, вызывало структурные модификации и потерю рецепторов EGF, поперечные сшивки некоторых белков, дефосфорилирование фосфотирозинов в белках, ингибирование протеинфосфатаз и стимуляцию сигнального пути, опосредованного МАР киназой JNK (Liu et al., 2004). В результате нарушались межклеточные взаимодействия. Клетки теряли чувствительность к внеклеточным молекулярным сигналам, регулирующим их функции и выживаемость.

20. MAP киназы

MAP киназы (mitogen-activated protein kinase, MAPK) участвуют в реакциях клеток на разные физико-химические воздействия, включая гормоны, цитокины, окислительный стресс, ультрафиолетовое и ионизирующее излучение. Это семейство серин/треонин протеинкиназ, регулирующих экспрессию генов, метаболизм, подвижность, деление и смерть клеток. Их функции и структура эволюционно консервативны. В состав этого семейства входят три протеинкиназы: ERK, JNK и p38 (Рис.4.9). Протеинкиназа ERK, стимулируемая факторами роста, цитокинами и другими химическими сигналами, регулирует постмитотические процессы и пролиферацию клеток. JNK и p38, активируются в ответ на стрессовые воздействия, а также на факторы роста и воспалительные цитокины. JNK фосфорилирует белок c-Jun, который вместе с белком c-Fos образуют фактор транскрипции AP-1, контролирующий экспрессию многих генов, участвующих в реакциях клеток на стресс, в апоптозе и канцерогенезе.

Фотоиндуцированные изменения ERK зависят от дозы воздействия: сравнительно слабое фотодинамическое воздействие активирует этот фермент, но при повышении дозы - угнетает. Разумеется, эти изменения зависят также от использованного фотосенсибилизатора и изучаемого типа клеток. Предполагается, что активация сигнального пути с участием ERK играет защитную роль, но пока неясно, каким образом фотодинамическое воздействие активирует этот сигнальный путь, и не известны субстраты этого фермента в фотосенсибилизированных клетках.

В экспериментах на разных клеточных линиях, подвергнутых фотодинамическому воздействию различных фотосенсибилизаторов, также наблюдалась время- и дозозависимая активация других МАР киназ, JNK and p38. В ряде работ фотодинамическое воздействие не влияло на их исходный уровень, но быстро, в пределах 30 мин повышало содержание их фосфорилированных, т.е. активированных форм. Активация JNK и p38 была временной. Она длилась около получаса, а затем за несколько часов их активность возвращалась к исходному уровню.

Полученные к настоящему времени данные показывают, что JNK и p38 играют значительную роль в регуляции выживаемости и смерти клеток при фотодинамическом воздействии. Но установить однозначную связь с этими процессами пока не удалось, так данные экспериментов на разных видах клеток, фотосенсибилизированных различными красителями, не дают однородную картину. В некоторых случаях фотоактивация JNK или p38 вела к апоптозу, в других эти MAP киназы играли защитную роль. Очень часто эти ферменты действовали по-разному. Например, при фотосенсибилизации клеток гидрофобным гиперицином, локализующимся преимущественно в ЭР и аппарате Гольджи, активация JNK и p38 приводила к защите клеток от фотоиндуцированного апоптоза. Напротив, в клетках, сенсибилизированных гидрофильными фотосенсибилизаторами, локализующимися в плазматической мембране и лизосомах, их активация вызывала апоптоз. Каким образом фотоиндуцированный синглетный кислород и другие АФК активируют JNK и p38, и какие процессы, направленные на выживание или смерть клеток, активируются этими белками, пока не выяснено

21. Фосфатидилинозитол 3-киназа и протеинкиназа В/Akt

Фосфатидилинозитол 3-киназа (PI3K) участвует в клеточных реакциях на стрессовые воздействия и регулируют выживаемость клеток, их устойчивость к апоптозу путем активации протеинкиназы В/Akt и нижележащих сигнальных путей. В работе Xue et al. (1999) продемонстрировано участие PI3K в защите клеток карциномы простаты от апоптоза, вызванного фотодинамическим воздействием фталоцианина Pc 4. Фотодинамическое воздействие бенгальского розового вызывало значительную и продолжительную активацию протеинкиназ Akt и p38 в фибробластах мыши, за которой следовал апоптоз этих клеток. В этом случае активация Akt рассматривалась как сигнал жизни, а одновременная активация p38 - как сигнал смерти. Это показывает участие Akt в выживаемости клеток.

22. AP-1

Фактор транскрипции АР-1 (activating protein-1) контролирует экспрессию разных генов, участвующих в апоптозе, пролиферации клеток, дифференцировке, опухолевом росте и других клеточных функциях. Это гомо- или гетеродимер, состоящий из белков семейств Fos и Jun. АР-1 активируется факторами роста, цитокинами, гипоксией, ультрафиолетовой и ионизирующей радиацией. В активации АР-1 принимают участие разные сигнальные пути, в частности, путь с участием МАР киназы JNK. АР-1 - редокс-чувствительный белковый комплекс, хотя сенсоры кислорода, активирующие АР-1, пока не обнаружены.

В опытах Luna et al. (1994) фотодинамическое воздействие Фотофрина вызывало повышение уровня мРНК белков c-Fos и c-Jun в клетках фибросаркомы мыши. Было показано фотодинамическая активация АР-1 и генов раннего ответа c-fos и c-jun была опосредована протеинкиназой С и фосфолипазой PLA2. В эпителиальных клетках HeLa фотосенсибилизация Фотофрином также вызывала быструю, сильную и продолжительную стимуляцию c-jun и особенно c-foc, а также связывание АР-1 с ДНК, но это не требовало активации протеинкиназы С (Kick et al., 1996).

23. NF-кB

Фактор транскрипции NF-кB служит центральным интегратором сигнальных путей, направленных на поддержание выживаемости клеток. Он связывается с особой последовательностью нуклеотидов в ДНК и контролирует более 150 генов, ответственных за отдельные стадии апоптоза, пролиферацию, иммунные реакции, канцерогенез, разные сердечно-сосудистые, нейродегенеративные и другие болезни. В цитоплазме NF-кB образует неактивный комплекс с ингибиторным белком IкB, который предотвращает его проникновение в ядро. Под влиянием специального белка IKK этот комплекс распадается и высвобождает NF-кB, который затем направляется в ядро, где стимулирует экспрессию генов. Разные стимулы - ультрафиолетовое или ионизирующее излучение, фармакологические агенты, гормоны, цитокины, гипоксия могут стимулировать NF-кB. Многие из этих факторов генерируют АФК и вызывают окислительный стресс. Поэтому NF-кB известен как редокс-чувствительный фактор транскрипции. Активация NF-кB обычно предотвращает апоптоз. Он вызывает экспрессию генов, кодирующих противоапоптозные белки Bcl-2, Bcl-xL, c-Myc, сурвивин, XIAP, COX-2, MnSOD, и одновременно подавляет синтез про-апоптозных белков..

NF-кB играет важную роль в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие. Его активация в клетках разных видов наблюдалась при фотосенсибилизации различными красителями. При этом NF-кB исчезает из цитоплазмы и появляется в клеточном ядре. Фотодинамическое воздействие также усиливает связывание NF-кB с ДНК. В ряде случаев отмечена двухфазная активация NF-кB: кратковременная активация в первые 30 мин и затем продолжительная стимуляция (до 24 часов). Фотодинамическое воздействие, активирующее NF-кB, также запускает апоптоз. Но механизмы фотоактивации NF-кB и стимуляции апоптоза, вероятно, различны. Как показали эксперименты, первый не зависел от генерации АФК, но требовал интернализации интерлейкина IL-1 и участия соответствующих сигнальных каскадов, в которых IKK фосфорилирует IкB и запускает распад его комплекса с NF-кB. Индукция апоптоза не зависела от IL-1. Каким образом фотогенерируемые АФК стимулируют IKK, который активирует NF-кB, пока неизвестно.

24. Белок р53

Белок р53 координирует репарацию ДНК, клеточный цикл и апоптоз, индуцированный повреждением ДНК. Он регулирует экспрессию по меньшей мере 100 генов, участвующих в этих процессах. Важной физиологической функцией белка р53 является индукция апоптоза поврежденных клеток. Потеря или мутации гена р53 ведут к росту опухоли. Он также играет центральную роль в клеточных реакциях на окислительный стресс. Обычно его экспрессия поддерживается на низком уровне благодаря быстрому протеолизу. После клеточного стресса и обширного повреждения ДНК, вызванного АФК, ультрафиолетовой или ионизирующей радиацией, уровень белка р53 возрастает, хотя пока не очень понятно, как окислительный стресс индуцирует экспрессию р53 и последующие реакции. Сигнальные пути, регулирующие уровень р53, и нижележащие пути, контролируемые этим белком, очень сложны.

Повреждение ДНК не характерно для фотодинамического воздействия, так как большинство фотосенсибилизаторов не попадает в клеточное ядро. Тем не менее, белок р53 участвует в фотодинамическом повреждении различных (но не всех) клеток, сенсибилизированных разными фотосенсибилизаторами. В некоторых работах показано, что фотоиндуцированная активация р53 усиливала потерю клоногенности клеток и некроз. В других - то, что фотодинамическое воздействие может вызывать апоптоз независимо от белка p53. Но в большинстве исследований сообщалось об участии р53 в фотоиндуцированном апоптозе. Что могло индуцировать экспрессию р53 в фотосенсибилизированных клетках? Возможны два пути: (а) через активацию JNK и другие сигнальные пути и (б) через индукцию множественных разрывов ДНК на начальных стадиях апоптоза. Активированный р53 может индуцировать транскрипцию генов, кодирующих проапоптозные белки, которые остаются неповрежденными. Так может создаться цепь с положительной обратной связью, ускоряющая фрагментацию ДНК и развитие апоптоза. Оба механизма, в принципе, могут действовать совместно или по-отдельности ы разных типах клеток. Нужно помнить, что примерно в 50 % всех случаев рака опухолевые клетки несут мутации гена p53, что позволяет им избежать апоптоза и неконтролируемо делиться. Соответственно, многие из используемых в экспериментах опухолевых клеток являлись мутантами по гену p53.

25. Белок p21

Ингибитор циклин-зависимой протеинкиназы p21 вызывает остановку клеточного цикла и поэтому он играет важную роль в предотвращении неконтролируемого деления клеток и развития опухоли. Кроме этого, р21 ингибирует апоптоз и участвует в репарации ДНК. Благодаря своей центральной роли, р21, как и р53, считается одним из основных регуляторов выживаемости и смерти клеток . При окислительном стрессе экспрессия р21 может вызываться как р53-зависимым, так и р53-независимым путем.

Фотодинамическое воздействие вызывало остановку клеточного цикла и апоптоз культивируемых раковых клеток, связанную экспрессией белка р21 и остановкой клеточного цикла в фазе G0-G1. В отсутствие активности р53 в раковых клетках эти процессы могли быть связана с опосредованной белком р21 разрегуляцией клеточного цикла и предотвращением перехода клеток к фазе G1.

26. Участие защитных белков в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие

Антиоксидантная защита клетки включает низкомолекулярные антиоксиданты (каротиноиды, глутатион, аскорбат и др.) и ферменты детоксикации АФК (супероксиддисмутаза, каталаза и различные пероксидазы). Хотя большинство фотосенсибилизаторов генерируют в основном синглетный кислород, при фотодинамическом воздействии повышается уровень марганец-зависимой супероксиддисмутазы (MnSOD). MnSOD локализуется в митохондриальном матриксе и, в отличие от конститутивной цитоплазматической Cu,Zn-SOD, является индуцибельной изоформой SOD. Ее основная функция - детоксикация супероксида и других митохондриальных АФК, интенсивно генерируемых в митохондриях во время и после фотодинамического воздействия.

В опытах с фотосенсибилизацией различных клеток отмечено повышение активности и экспрессии митохондриальной MnSOD, но не цитоплазматической Cu,Zn-SOD. В фотосенсибилизированных эритроцитах человека наблюдалась активация не только SOD, но и каталазы и глутатионпероксидаза. Сверхэкспрессия MnSOD защищала клетки от фотоиндуцированного апоптоза, а ее ингибирование усиливало цитотоксический и противоопухолевый эффект фотодинамического воздействия. Сигнальные механизмы, вызывающие сверхэкспрессию SOD в фотосенсибилизированных клетках пока не установлены.

Белки теплового шока и белки, регулируемые глюкозой

Белки теплового шока (Hsp - heat shock protein), или стресс-белки, или шапероны вырабатываются в клетках в ответ на стресс, вызванный разнообразными физико-химическими воздействиями. Они восстанавливают пространственную структуру денатурированных или неправильно свернутых белков, у которых неполярные аминокислотные остатки экспонированы наружу. Связываясь с таким белком, Hsp за счет энергии АТР меняет свою конформацию и вместе с ним изменяется конформация связанного белка. После серии конформационных изменений белок сворачивается правильным образом так, что все гидрофобные аминокислоты оказываются внутри глобулы. Hsp выполняет защитную, противоапоптозную роль.

Фотодинамическое воздействие на разные виды клеток повышало в них экспрессию различных стресс-белков (Табл. 3): Hsp27, Hsp47, Hsp60, Hsp70, Hsp72, Hsp73, Hsp90, Hsp110 и белков, регулируемых глюкозой (ЭР шаперонов): GRP78, Grp80, Grp94 и Grp100, что способствовало исправлению конформации денатурированных и неправильно свернутых белков и защищало клетки от фотоповреждения.

фотосенсибилизатор митохондрия клетка

Заключение

Таким образом, в реакциях клеток на фотодинамическое воздействие участвуют практически все сигнальные пути клеток. Некоторые из них направлены на защиту клеток, а другие участвуют в процессах клеточной смерти. Пока наши знания о молекулярных механизмах клеточных реакций очень фрагментарны. Не известны сенсоры активных форм кислорода, Не известны все участвующие в них сигнальные пути и основные их компоненты в клетках разных видов. Еще меньше информации о том, какие именно исполнительные белки контролируются сигнальными системами при фотодинамическом воздействии, направленном на разные клеточные структуры. Из-за большой сложности сигнальной системы клетки, взаимодействий разных сигнальных путей между собой, различий между разными видами клеток пока трудно понять реальную цепь событий, ведущих к смерти данной клетки в данных условиях.

Тем не менее, можно надеяться, что модификация различных сигнальных путей может модулировать интегральный ответ клетки и привести либо к повреждению клетки, либо к ее защите. Оба эти результаты важны для медицинских приложений.

Литература

1. Владимиров Ю., Рощупкин Д. И., Потапенко А. Я., Деев А. И. Биофизика; Медицина - Москва, 1983. - 272 c.

2. Волькенштейн, М.В. Биофизика; М.: Наука - Москва, 1981. - 576 c.

3. Плутахин Г.А., Кощаев А.Г. Биофизика; Лань - Москва, 2012. - 240 c.

4. Под редакцией Артюхова В.Г. Биофизика; Академический Проект, Деловая книга - Москва, 2009. - 304 c.

5. Рубин А.Б. Биофизика. Биофизика клеточных процессов; М.: Университет; Издание 2-е, испр. и доп. - Москва, 2000. - 468 c

6. Антонов В.Ф. Биофизика: Учебник для студентов высших учебных заведений / В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, В.И. Пасечник. - М.: ВЛАДОС, 2006. - 287 c.

7. Плутахин Г.А. Биофизика: Учебное пособие / Г.А. Плутахин, А.Г. Кощаев. - СПб.: Лань, 2012. - 240 c.

8. Сердюк И. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика. В 2-х т. Методы в молекулярной биофизике: структура, функция, динамика: Учебное пособие / И. Сердюк. - М.: КДУ, 2010. - 1304 c.

9. Черныш А.М. Физика и биофизика: Учебник / В.Ф. Антонов, А.М. Черныш, Е.К. Козлова. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2013. - 472 c.

10. Штыков В.В. Квантовая радиофизика: Учебное пособие для студентов вузов / В.В. Штыков. - М.: ИЦ Академия, 2009. - 336 c.

Размещено на Allbest.ru