Масс-спектрометрический метод анализа
Основы масс-спектрометрии. Принципиальное устройство масс-спектрометра. Механизмы и способы ионизации. Лазерная десорбция/ионизация при помощи матрицы (MALDI), преимущества и недостатки метода. Рабочие характеристики и принцип работы анализаторов.
| Рубрика | Химия |
| Вид | курсовая работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 04.10.2008 |
| Размер файла | 4,8 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Квадрупольный
Сканирование по частотам электромагнитного излучения
Квадрупольная ионная ловушка
Сканирование по частотам электромагнитного излучения
Времяпролётный (TOF)
Время пролёт прямо связано с m/z иона
Времяпролётный рефлектрон
Время пролёт прямо связано с m/z иона
Квадрупольный-TOF
Сканирование по частотам электромагнитного излучения и определение времени полёта
Магнитный сектор
Магнитное поле влияет на радиус траектории иона
Фурье-резонансный ионный
циклотронный MS
Переводит движение иона в циклотроне в m/z (FTMS)
Рабочие характеристики анализаторов
Масс анализатор обычно оценивается по следующим характеристикам: точность, разрешение, диапазон масс, способность к тандемному анализу, скорость сканирования.
Точность
Точность - способность анализатора давать точную информацию о m/z. Точность в большой степени зависит от устойчивости прибора и от разрешения. Например, прибор с точностью 0.01% даёт информацию о 1000 Да пептиде с точностью ±0.1 Да, а для 10000 Да белка - ±1.0 Да. Точность серьёзно меняется от анализатора к анализатору в зависимости от типа анализатора и разрешения. Альтернативным способом описания точности является использование терминологии «части на миллион» (ppm), в которой 1000 Да пептид с точностью ±0.1 Да может быть также описан как 1000.00 Да пептид ±100 ppm.
Разрешение (разрешающая сила)
Разрешение - способность масс-спектрометра различать ионы с различными отношениями массы к заряду. Поэтому большее разрешение связано с прямым увеличением способности различать ионы. Стандартным определением разрешения является следующее уравнение:
Разрешение = M/?M (2.1)
где M соответствует m/z, а ?M является шириной на половине максимума (FWHM или «полушириной»).
Пример измерения разрешения показан на рис. 2.2, где пик имеет m/z 500 и полуширину 1. Получается разрешение M/?M = 500/1 = 500.
Разрешающая сила анализатора, в некоторой степени, определяет точность конкретного прибора, как показано на рис. 2.2. Средняя масса молекулы высчитывается с использованием эффективной массы всех изотопов каждого составляющего молекулу элемента. Моноизотопная масса рассчитывается с использованием массы изотопа элемента, имеющего наибольшую распространённость, для каждого из составляющих элементов. Если прибор не разрешает изотопы, он будет давать широкий пик, центр которого соответствует средней массе. Более высокое разрешение может даже разделить индивидуальные изотопы или же сузить пики, позволяя более точно определить их положение.
Диапазон масс
Это диапазон m/z анализатора масс. Например, квадрупольные анализаторы обычно определяют m/z до 3000. Анализатор магнитного сектора обычно определяет m/z до 10000, а времяпролётные анализаторы имеют практически неограниченный диапазон масс.
Тандемный анализ масс (MS/MS или MSn)
Это способность анализатора разделять различные молекулярные ионы, генерировать фрагментарные ионы от выбранного и измерять массы фрагментированных ионов. Фрагментированные ионы обычно используются для определения структуры исходных молекулярных ионов.
Обычно тандемная масс-спектрометрия проводится столкновением выбранного иона с молекулами инертного газа, такого как аргон или гелий, и последующим анализом образовавшихся фрагментов. Тандемный анализ масс используется для определения последовательности пептидов, структурных характеристик углеводов, малых олигонуклеотидов и липидов.
Термин «тандемный» анализ масс применяется для событий, последовательных в пространстве или во времени. Тандемный анализ масс в пространстве проводится последовательно расположенными анализаторами, тогда как тандемный во времени анализ масс осуществляется в одном и том же анализаторе, который отделяет нужный ион, фрагментирует его и анализирует фрагментарные ионы. Характеристики тандемного анализа для различных анализаторов приведены в таблице 2.2.
Скорость сканирования
Эта характеристика показывает скорость, с которой анализатор сканирует конкретный диапазон масс. Большинству приборов необходимо несколько секунд для полного сканирования, однако это время может сильно разниться в зависимости от анализатора. Времяпролётные анализаторы, например, совершают анализ в миллисекунды и даже быстрее. [12]
Конкретные виды анализаторов
Как известно, ESI и MALDI, например, генерируют ионы довольно различными способами. ESI Создаёт ионы в непрерывном потоке заряженных капель при атмосферном давлении, и ионы также создаются непрерывным потоком, по этим причинам квадрупольные анализаторы являются наиболее подходящими для ESI, так как они оба устойчивы к довольно высоким давлениям (~10-5 Торр) а и способны к непрерывному сканированию потока ионов из ESI. MALDI, с другой стороны, образует ионы посредством коротких, наносекундных, импульсов и хорошо совместимо с времяпролётным анализатором, который измеряет точно синхронизированные пакеты ионов, такие, как, например, полученные при помощи лазерного импульса.
Квадрупольный анализатор
Квадрупольный анализатор масс (рис. 2.3) используется с EI-устройствами с 1950-х и до сих пор является самым распространённым анализатором. Интересно, что квадрупольные анализаторы оказались очень удобными для совмещения с ESI и APCI. Квадруполи имеют три основных достоинства. Они устойчивы к относительно высоким давлениям.
Во-вторых, квадруполи имеют значительный диапазон масс - они способны к анализу до m/z порядка 4000, что удобно, так как ионизация электроспрея белков и других биомолекул обычно дают такое распределение заряда, что m/z лежит в пределах от 1000 до 3500. Наконец, квадрупольные масс-спектрометры являются относительно дешёвыми приборами. Учитывая взаимно дополняющие особенности ESI и квадруполей, неудивительно, что первый успешный коммерческий прибор электроспрея был оснащён квадрупольным анализатором масс.
Квадрупольные анализаторы параллельно соединены с радиочастотным (RF) генератором и постоянной разностью потенциалов (DC). При определённой частоте RF, только ионы с соответствующим m/z могут пройти через квадруполь, как показано на рис. 2.3, где только ионы с m/z 100 детектируются. Во всех трёх случаях на рис. 2.3 DC и RF поля одинаковы. Поэтому сканированием RF поля может быть анализирован широкий m/z - диапазон (обычно от 100 до 4000) приблизительно за одну секунду.
Для проведения тандемного анализа масс с квадрупольным прибором,
необходимо разместить три квадруполя в ряд. Каждый квадруполь иг
рает отдельную роль: первый квадруполь (Q1) используется для сканирова
ния определённого m/z диапазона и выбора нужного иона; второй квадруполь
(Q2), также известный как ячейка столкновения, фокусирует и пропускает
ионы через подаваемый на путь пролёта вспомогательный газ (аргон или ге
лий); третий квадруполь (Q3) служит для анализа фрагментарных ионов, ге
нерированных в ячейке столкновения (Q2) (рис. 2.4). Последовательная схе
ма вызванной столк
новением ионизации (CID) показана на схеме 2.1.
Квадрупольная ионная ловушка
Анализатор ионной ловушки показан на рис. 2.5 (реальным размером примерно с теннисный мяч) был придуман в то же время, что и квадрупольный анализатор масс, тем же человеком, Вольфгангом Паулом. Кстати, физика в основе обоих этих анализаторов сходна. Однако в ионной ловушке, вместо того, чтобы проходить через квадрупольный анализатор с наложенным радиочастотным полем, ионы ловятся в такое квадрупольное поле. Один из методов использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов непосредственно внутри при помощи EI, с последующим анализом масс. Другой, более популярный, метод использования ионной ловушки для масс-спектрометрии включает в себя генерацию ионов во внешнем устройстве при помощи ESI или MALDI и использование ионной оптики для введения образца в объём ловушки. Квадрупольная ионная ловушка обычно состоит из кольцевого электрода и двух гиперболических закрывающих электродов (рис. 2.5). Движение ионов, вызванное электрическим полем этих электродов, позволяет поймать или выпустить ионы из ловушки. В нормальном состоянии, радиочастота сканируется, чтобы резонансно возбудить и, вследствие этого, выпустить ионы через маленькие отверстия в «крышках» детектора. По мере того, как сканирование RF достигает более высоких частот, ионы с более высоким m/z возбуждаются, выпускаются и детектируются.
Очень полезной особенностью ионных ловушек является то, что они способны изолировать один вид ионов, выпустив все остальные из ловушки. Изолированные ионы могут быть, затем фрагментированы посредством столкновений, а фрагменты проанализированы. Основное преимущество квадрупольных ионных ловушек - то, что эксперимент с диссоциацией, вызванной многократными столкновениями, может быть проведён быстро без использования дополнительных анализаторов, так, что LC-MS/MS в реальном времени сейчас является обычным делом. Другими важными преимуществами квадрупольных ионных ловушек являются малые размеры и их способность ловить и накапливать ионы для обеспечения лучшего ионного сигнала. Квадрупольные ионные ловушки были приспособлены для ряда различных целей: от EI-MSn (рис. 2.5) биомолекул до их более современных совмещений с MALDI. MSn позволяет многократным MS/MS экспериментам проводиться с последовательными фрагментарными ионами, давая дополнительную фрагментарную информацию. Но главнейшим применением ионных ловушек является определение белков. LC-MS/MS эксперименты проводятся для белковых гидролизатов, давая информацию одновременно по MS и MS/MS. Эта информация позволяет идентифицировать белки и характеризовать пост-трансляционную модификацию. Диапазон масс (~4000 m/z) коммерческих LC-ловушек хорошо соответствует значениям m/z, генерируемым ионизацией электроспрея пептидов, а разрешение позволяет идентифицировать зарядное состояние многозарядных ионов пептидов. Масс-спектрометры квадрупольной ионной ловушки могут анализировать пептиды из трипсинового гидролизата при их содержании порядка 20-100 фмоль. Другим ценным качеством техники ионной ловушки для анализа пептидов является её способность проводить несколько стадий масс-спектрометрии, которые значительно увеличивают количество структурной информации. [13]
Линейная ионная ловушка
Линейная ионная ловушка отличается от трёхмерной (рис. 2.6) тем, что она запирает ионы вдоль оси квадрупольного анализатора масс, используя двумерное (2D) радиочастотное (RF) поле с потенциалами, приложенными к концевым электродам. Основное преимущество линейной ловушки перед 3D - больший объём анализатора, который сам по себе значительно увеличивает динамический диапазон и улучшает диапазон количественного анализа.
Ограничения ионной ловушки: сканирование иона-предшественника, «правило одной трети» и динамический диапазон.
Главными ограничениями данных возможностей ионной ловушки, которые удерживают её от того, чтобы быть совершенным средством для фармакокинетики и протеомики, являются следующие: 1) способность давать высокую чувствительность одновременно для тройного квадрупольного сканирования иона-предшественника, и для экспериментов со средним затуханием невозможна для ионных ловушек. 2) Верхний предел соотношения между m/z предшественника и самого мелкого пойманного фрагмента составляет приблизительно 0.3 (также известно как «правило одной трети»). Иллюстрацией правила одной трети является то, что фрагментарные ионы от m/z 900 не будут детектироваться при m/z меньше 300, накладывая значительные ограничения на очередное секвенирование пептидов. 3) Динамический диапазон ионных ловушек ограничен тем, что при слишком большом числе ионов внутри ловушки пространственные влияние зарядов ограничит представительность анализатора. Чтобы обойти это, автоматические сканеры быстро пересчитывают ионы перед тем, как те попадут в ловушку, тем самым ограничивая число вошедших ионов. Но такой подход составляет проблему, если нужный ион сопровождается большим фоном других ионов.
Двуфокусирующий магнитный сектор
Первые анализаторы масс разделяли ионы при помощи магнитного поля. В магнитом анализе ионы ускоряются в магнитном поле при помощи электрического. Заряженные частицы, движущиеся в магнитно поле, будут двигаться по дуге, радиус которой зависит от скорости ион, силы магнитного поля и m/z иона. Масс-спектр получается сканированием магнитного поля и наблюдением того, как ионы попадают фиксированный точечный детектор. Ограничением магнитных анализаторов является относительно малое разрешение. Чтобы улучшить его, магнитные приборы были модифицированы с добавлением электростатического анализатора, чтобы сфокусировать ионы. Такие приборы называются двухсекторными. Электрический сектор служит как элемент фокусировки кинетической энергии, позволяя только ионам с определённой кинетической энергией проходить через поле, независимо от их m/z отношения. То есть, добавление электрического сектора позволяет только ионам с одинаковой энергией достигать детектора, тем самым уменьшая разброс кинетической энергии, что, в свою очередь, увеличивает разрешение. Нужно отметить, что увеличение разрешения вызывает соответствующее уменьшение чувствительности. Такие двуфокусирующие (рис. 2.7) анализаторы масс используются совместно с ESI, FAB и EI, однако они нешироко используются сейчас, в основном, из-за их больших размеров и успешности времяпролётных, квадрупольных и FTMS анализаторов с ESI и
MALDI. [14]
Квадрупольная-времяпролётная тандемная масс-спектрометрия
Линейный времяпролётный (TOF) анализатор масс (рис. 2.7) является простейшим анализатором масс. Он пережил возрождение с изобретением MALDI и его текущее применения для электроспрея и даже газовой хроматографии с масс-спектрометрией электронной ионизацией (GC/MS). Времяпролётный анализ основан на ускорении группы ионов по направлению к детектору, при котором всем ионам сообщается одинаковая энергия при помощи ускоряющего потенциала. Так как ионы имеют одинаковую энергию, но разную массу, лёгкие ионы достигают детектора первыми из-за их большей скорости, в то время как тяжёлые ионы летят дольше из-за их большей массы и, соответственно, более низкой скорости. Поэтому анализатор был назван времяпролётным, потому что масса в нём определяется по времени прибытия ионов. Масса, заряд и кинетическая энергия - всё это вносит свой в клад в время прибытия иона к детектору. Так как кинетическая энергия (KE) иона равна ? mv2, скорость иона может быть представлена как v = d/t = (2KE/m) ?. Ионы проходят расстояние d за время t, а t зависит от m/z. В этом уравнении v = d/t = (2KE/m) ?, принимая z = 1. Другим представлением этого уравнения, более чётко показывающим, как определяется масса, является m=2t2 KE/d2, где KE=const.
Времяпролётный рефлектрон (рис. 2.8) сейчас широко используется для ESI, MALDI, а в последнее время и для приложения электронной ионизации для ГХ/МС. Он комбинирует времяпролётную технологию и электростатическое зеркало. Рефлектрон служит для увеличения времени (t), которое нужно ионам, чтобы достичь детектора, при этом уменьшая распределение кинетической энергии, тем самым уменьшая временное распределение ?t. Так как разрешение определяется как масса пика, делённая на его ширину или m/?m (или t/?t, так как m пропорциональна t), увеличение t и уменьшение ?t приводит к росту разрешения. Поэтому TOF рефлектрон даёт более высокое разрешение по сравнению с простым прибором TOF посредством увеличения длины пути и фокусировки энергии посредством рефлектрона. Нужно отметить, что увеличенное разрешение (обычно выше 5000) и чувствительность на TOF рефлектроне значительно уменьшается при высоких массах (обычно при m/z свыше 5000).
Другим типом тандемного анализа масс, MS/MS, является также возможное комбинирование MALDI и TOF рефлектрона. MS/MS осуществляется с особенности MALDI - фрагментации, которая происходит после ионизации, или распадом после источника (PSD). Времяпролётные приборы сами по себе не разделяют пост-ионизационные фрагментарные ионы от одного и того же иона-прекурсора, потому что и прекурсор, и фрагментарные ионы имеют одинаковую скорость и поэтому достигают детектора в одно и то же время. Рефлектрон даёт преимущество в том, что фрагментарные ионы имеют разную кинетические энергии и разделяются на основании того, как глубоко ионы проникают в поле рефлектрона, тем самым давая спектр фрагментарных ионов (рис. 2.9 и 2.10).
Нужно заметить, что электроспрей также был адаптирован под TOF рефлектронные анализаторы, в которых ионы из непрерывного ESI-источника накапливаются в гексаполярном (или октаполярном) ионопроводе, а затем выталкиваются в TOF анализатор. Тем самым, необходимая электростатическая импульсность создаёт точку отсчёта, с которой можно начинать измерения TOF.
MALDI и времяпролётный анализ
На начальных этапах развития MALDI-TOF, эти приборы имели относительно низкое разрешение, которое серьёзно ограничивало их точность. Нововведением, которое оказало существенный эффект на увеличение разрешающей силы MALDI времяпролётных приборов было отложенное извлечение (DE), как показано на рис. 2.11. В теории, отложенное извлечение означает просто охлаждение и фокусировку ионов сразу после акта MALDI, но на практике сначала было проблемой включать и выключать импульсы в 10000 вольт за наносекунды.
В традиционных приборах MALDI, ионы ускоряются из устройства ионизации сразу после образования. Однако, отложенное извлечение ионов позволяет им «остыть» в течение ~150 наносекунд перед ускорением в анализатор. Этот период охлаждения генерирует набор ионов с гораздо меньшим распределением кинетической энергии, значительно уменьшая временной разброс ионов, когда они входят в TOF анализатор. В общем, это приводит к увеличению разрешения и точности. Выгоды отложенного извлечения значительно сокращаются для больших макромолекул, таких как белки (>30000 Да). [3]
Квадрупольная времяпролётная масс-спектрометрия
Квадрупольные времяпролётные анализаторы масс обычно совмещаются с устройствами ионизации электроспрея, а в последнее время успешно совмещаются с MALDI. ESI quad-TOF (рис. 2.12) комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой эффективностью, чувствительностью и точностью времяпролётного рефлектронного анализатора масс. Квадруполь может выступать как простой квадрупольный анализатор, чтобы сканировать определённый диапазон m/z. Однако он может быть также использован, чтобы селективно выделить ион-прекурсор и направить его в ячейку столкновения. Получившиеся фрагментарные ионы затем анализируются TOF рефлектронным анализатором масс. Квадрупольный TOF использует способность квадруполя выделять отдельный ион и способность TOF-MS совершать одновременное и точное измерение ионов по всему диапазону масс за короткий период времени. Квадрупольные TOF анализаторы выдают большую чувствительность и точность, нежели тандемные квадрупольные приборы при получении полных фрагментарных масс-спектров.
Квадрупольный TOF прибор может использовать квадрупольный или TOF анализаторы независимо или совместно для тандемных MS экспериментов. TOF компонент прибора имеет больший m/z предел, превышающий 10000. Высокая разрешающая сила (~10000) TOF также обеспечивает хорошую точность измерения массы - порядка 10 ppm. Из-за своей высокой точности и чувствительности, ESI quad-TOF масс-спектрометр внедряются в решение проблем протеомики и фармакокинетики.
Масс-спектрометрия с Фурье-преобразованием (FTMS)
FTMS основана на принципе наблюдения за орбитальным движением заряженных частиц в магнитном поле (рис. 2.13-14). Пока ионы движутся по орбитам, импульсный радиочастотный (RF) сигнал используется для их возбуждения. Это RF возбуждение позволяет ионам продуцировать заметный экранирующий ток, вводя их в когерентное движение и увеличивая радиус орбиты. Экранирующий ток, генерируемый всеми ионами, может быть затем Фурье-преобразован, чтобы получить составляющие частоты различных ионов, которые соотносятся с их m/z. Так как частоты могут быть определены с высокой точностью, соответствующие им m/z также могут быть вычислены с высокой точностью. Важно отметить, что сигнал генерируется только когерентным движением ионов в условиях ультравысокого вакуума (10-11-10-9 Торр). Этот сигнал должен быть измерен за минимальное время (обычно от 500 мс до 1 секунды), чтобы обеспечить высокое разрешение. По мере увеличения давления, сигнал затухает быстрее, вследствие потери когерентности движения из-за столкновений (например, меньше чем за 150 мс) и не позволяет провести измерения с высоким разрешением (рис. 2.14). [15]
Ионы, находящиеся в когерентном циклотронном движении между двумя электродами изображено на рис. 2.13. По мере того, как положительно заряженные ионы двигаются от верхнего электрона и приближаются к нижнему, электрическое поле ионов вынуждает электроны внешней цепи течь и накапливаться на нижнем электроде. На другой половине циклотронной орбиты электроны покидают нижний электрод и накапливаются на верхнем электроде, когда ионы приближаются. Колебательное движение электронов внешней цепи называется экранирующим током. Когда смесь ионов с различными значениями m/z одновременно ускоряется, сигнал экранирующего тока на выходе усилителя представляет собой составной установившийся сигнал с составляющими частотам, соответствующими каждому значению m/z. Проще говоря, все ионы, запертые в ячейке анализатора, возбуждаются до высоких циклотронных орбит при помощи радиочастотного импульса. Составной установившийся сигнал экранирующего тока ионов по мере их релаксации обрабатывается компьютером, и используется преобразование Фурье для выделения индивидуальных циклотронных частот. Влияние давления на сигнал и разрешение продемонстрировано на рис. 2.14.
Вдобавок к высокому разрешению, FTMS также обладает способностью обеспечивать эксперименты с многократными столкновениями (MSn). FTMS способна к исключению всех ионов, кроме нужного. Выделенный ион затем подвергается столкновению с газом (или другой форме возбуждения: лазерному облучению или электронному захвату) для вызывания фрагментации. Анализ масс может быть затем проведён для фрагментов, чтобы получить спектр фрагментации. Высокое разрешение FTMS/MS также даёт точные измерения масс фрагментов.
FTMS является довольно новым методом для биомолекулярного анализа, но множество её преимуществ делают её всё более и более интересной. Сейчас становится всё более обычным объединение ультравысокого разрешения (>105) FTMS с большим разнообразием способов ионизации, включая MALDI, ESI, APCI и EI. Результатом высокой разрешающей способности FTMS анализатора является высокая точность (часто порядка долей ppm) как показано для белка на рис. 2.16, где можно видеть отдельные пики изотопов. Фурье преобразование сигнала ICR значительно увеличивает удобство ICR за счёт одновременного измерения перекрывающихся частот, произведённых внутри ячейки ICR. Индивидуальные частоты могут быть затем легко и точно переведены в m/z ионов.
В общем, увеличение магнитного поля (B) оказывает благоприятный эффект на характеристики. Фурье преобразование IRC сигнала, измеряя перекрывающиеся частоты одновременно, позволяет достичь высокого разрешения и большой точности определения масс без соответствующего уменьшения чувствительности. Это - чёткое отличие от двухсекторными приборами, которые подвержены потерям чувствительности при высочайших разрешении и точности. Высокие возможности разрешения FTMS прямо связаны с полем FTMS сверхпроводящего магнита, так как увеличение разрешения прямо пропорционально полю. Ионная вместимость, так же как MS/MS эксперименты по кинетической скорости увеличиваются пропорционально квадрату величины поля, тем самым увеличивая динамический диапазон и фрагментарную информацию. Одним из препятствий в увеличении B является эффект магнитного зеркала, когда перенос ионов внутрь магнитного поля становится всё более трудным из-за магнитных силовых линий. Также, изготовление высокопольных магнитов с большими отверстиями превосходной гомогенностью поля (для IRC) становится технически всё более сложным. [16]
Магнитное поле влияет на FTMS оборудование следующими путями:
FTMS
|
|
|
|
Так как частота иона = K*B*z/m, большее магнитное поле обеспечивает большую частоту для того же m/z, поэтому генерируется больше опорных точек для более точного определения частоты, что ещё больше увеличивает точность (рис. 2.17).
Квадрупольная FTMS и квадрупольной ионной ловушки FTMS анализаторы масс, которые в последнее время стали использоваться, обычно объединяются с ESI устройствами. Квадрупольная FTMS комбинирует стабильность квадрупольного анализатора с высокой точностью FTMS. Квадруполь может действовать как любой простой квадрупольный анализатор для сканирования по диапазону m/z. Однако он также может быть использован для селективного избирания иона-прекурсора и направления этого иона в ячейку столкновений или на FTMS. Полученные прекурсор и фрагментарные ионы могут быть затем анализированы при помощи FTMS.
Проведение MS/MS экспериментов вне магнитного поля предоставляет некоторые преимущества, так как высокое разрешение в FTMS зависит от высокого вакуума. MS/MS эксперименты включают в себя столкновения при установившемся высоком давлении (10-6 - 10-7 Торр), которое затем необходимо уменьшить, чтобы добиться высокого разрешения (10-10 - 10-9 Торр). Проведение MS/MS экспериментов вне ячейки, тем самым, оказывается быстрее, так как в IRC ячейке может поддерживаться ультравысокий вакуум. Это делает более новую гибридную компоновку прибора оптимальной по сравнению с комбинацией FTMS/MS с методами разделения, такими как ЖХ.
Таблица 2.2. Общее сравнение анализаторов масс, обычно используемых совместно с ESI. Эти значения могут меняться в зависимости от производителя прибора.
|
|
Квадрупольный |
Ионная |
Времяпролётный |
Времяпролётный рефлектрон |
Магнитный сектор |
FTMS |
Квадрупольный TOF |
|
|
Точность |
0.01% (100 ppm) |
0.01% (100 ppm) |
0.02 to 0.2% (200 ppm) |
0.001% (10 ppm) |
<0.0005% (<5 ppm) |
<0.0005% (<5 ppm) |
0.001% (10 ppm) |
|
|
Разрешение |
4,000 |
4,000 |
8,000 |
15,000 |
30,000 |
100,000 |
10,000 |
|
|
Диапазон m/z |
4,000 |
4,000 |
>300,000 |
10,000 |
10,000 |
10,000 |
10,000 |
|
|
Скорость сканирования |
~ секунда |
~ секунда |
миллисекунды |
миллисекунды |
~ секунда |
~ секунда |
~ секунда |
|
|
Тандемная MS |
MS2 (тройной квадруполь) |
MSn |
MS |
MS2 |
MS2 |
MSn |
MS2 |
|
|
Комментарии к тандемной MS |
Хорошая точность |
Хорошая точность |
Практически неприменима |
Выбор иона-прекурсора ограничен широким диапазоном масс;Растущее число приложений |
Ограниченное разрешение |
Отличная точность и разрешение ионов продуктов |
Превосходная точность
|
|
|
Общие комментарии |
Малая стоимость |
Малая стоимость |
Малая стоимость |
Хорошая точностьХорошее разрешение |
Прибор громоздкий |
Высокое разрешение, MSn,Высокий вакуум,сверхпроводниковый магнит, дорогой |
Известен высокой чувствительность и точностью при использовании для MS2 |
Детекторы
После того, как ионы разделены анализатором масс, они достигают ионного детектора (рис. 2.1 и 2.18-21), где генерируют токовый сигнал падающих ионов. Самым распространённым детектором является электронный умножитель, который передаёт кинетическую энергию падающих ионов на поверхность, где она, в свою очередь, генерирует вторичные электроны. Однако, существует множество подходов, зависящих от типа масс-спектрометра.
Электронный умножитель
Пожалуй, большинство устройств детектирования ионов включают в себя электронный умножитель (рис. 3.1), который сделан из серии (от 12 до 24) динодов из оксида алюминия, поддерживаемых под увеличивающимся
потенциалом. Ионы ударяют в поверхность первого динода, вызывая испускание электронов. Эти электроны затем притягиваются к следующему диноду, имеющему больший потенциал, и поэтому генерируется больше вторичных электронов. В конце концов, после включения значительного числа динодов, образуется каскад электронов, который даёт общий ток больше в миллион раз и даже ещё больше.
Высокоэнергетический динод (HED) использует ускоряющее электростатическое поле для увеличения скорости ионов. Так как сигнал электронного умножителя сильно зависит от скорости иона, HED служит для увеличения интенсивности сигнала, а, следовательно, и чувствительности.
Цилиндр Фарадея
Включает в себя удар ионов по поверхности динода (BeO, GaP или CsSb), который вызывает выброс вторичных электронов. Этот временный выброс электронов вызывает положительный заряд на детекторе, и поэтому ток электронов по направлению к детектору. Такой детектор не особенно чувствителен, давая очень ограниченное усиление сигнала, но зато он устойчив к относительно высокому давлению.
Фотоумножитель с преобразующим динодом
Фотоумножитель с преобразующим динодом (рис. 3.3) не является обычно используемым электронным умножителем, хотя он похож на него по устройству: вторичные электроны ударяют в фосфоресцирующий экран вместо динода. Фосфоресцирующий экран высвобождает фотоны, которые детектируются фотоумножителем. Фотоумножители действуют так же, как электронные: в них падающий на сцинтилляционную поверхность фотон вызывает высвобождение электронов, которое усиливается по каскадному принципу. Преимуществом преобразующего динода является то, что трубка фотоумножителя герметично вакуумирована, не подвержена воздействию среды масс-спектрометра и, тем самым, исключена возможность её загрязнения. Это увеличивает срок службы таких детекторов по сравнению с обычными электронными умножителями. Обычно срок службы увеличивается на пять лет притом, что они имеют такую же чувствительность, что и электронные умножители.
Матричный детектор
Линейный детектор - группа индивидуальных детекторов, расположенных в матрицу. Матричный детектор, который пространственно определяет ионы в зависимости от их m/z, обычно используется с анализаторами масс магнитного сектора. Пространственно разделённые ионы могут быть детектированы одновременно матричным детектором. Основным преимуществом такого подхода является то, что при малом диапазоне масс, нет необходимости в сканировании, и поэтому увеличивается чувствительность. [1]
Зарядовый (индуктивный) детектор
Зарядовый детектор просто распознаёт движущуюся заряженную частицу (ион) по тому, как она индуцирует ток на электроде просто из-за своего быстрого движения. Обычный сигнал показан на рис. 3.4. Этот тип детектирования широко применяется в FTMS, чтобы генерировать экранирующий ток иона. Детектирование не зависит от размера иона и поэтому может применяться к таким частицам, как целые вирусы.
Таблица 3.1. Общее сравнение детекторов.
|
Детектор |
Преимущества |
Недостатки |
|
|
Цилиндр |
§ хорошо для проверки переноса ионов и измерений с низкой чувствительностью |
§ Слабое усиление (~10) |
|
|
Фотоумножитель с преобразующим динодом (сцинтилляционный счётчик) |
§ Устойчивый§ Большой срок службы (>5 лет)§ Чувствительный (достигает ?106) |
§ Не может быть выставлен на свет во время операции |
|
|
Электронный умножитель |
§ Устойчивый§ Быстрой распознавание§ Чувствительный (достигает ?106) |
§ Более короткий срок службы по сравнению со сцинтилляционным счётчиком (~3 лет) |
|
|
Высокоэнергетический диноды с электронным умножителем |
§ Увеличенная чувствительность к массе |
§ Может сокращать срок службы электронного умножителя |
|
|
Матрица |
§ Быстрый и чувствительный |
§ Уменьшает разрешение§ Дорог |
|
|
Детектирование заряда |
§ Detects ions independent of mass and velocity |
§ Ограниченная совместимость с большинством других существующих приборов |
Вакуум масс-спектрометра
Всем масс-спектрометры нужен вакуум, чтобы ионы могли достичь детектора без столкновений с другими газообразными молекулами или атомами. Если такие столкновения случаются, прибор подвержен уменьшению разрешения и чувствительности. Высокие давления также могут вызывать разряд напряжений в землю, что может повредить прибор, его электронику или компьютерную систему, обслуживающую масс-спектрометр. Мощная утечка, и основанный на ней прорыв атмосферы внутрь прибора, может серьёзно повредить масс-спектрометр, уничтожив электростатические линзы, забрызгав оптику насосным маслом или повредив детектор. В общем, поддержание хорошего вакуума является ключевым моментом в получении высококачественных спектров.
Одним из первых препятствий, встреченных изобретателями масс-спектрометрии, было совмещение источника образцов и масс-спектрометра. Образцы, находящиеся при атмосферном давлении (760 Торр) перед помещением в вакуум масс-спектрометра (~10-6 Торр), что является разностью в давлении приблизительно в миллиард раз. Одним из подходов является введение образца через капиллярную колонку (ГХ) или через малое входное отверстие непосредственно в прибор. Другим подходом является изолирование камеры ввода образца при помощи вакуумного клапана (MALDI) и, после достижения приемлемого вакуума над образцом (<10-2 Торр) образец может быть представлен в основную часть вакуумной камеры (<10-5 Торр).
Масс-спектрометр показан на рис. 4.1 с тремя альтернативными насосными системами. Все три системы способны давать высокий вакуум, и все заканчиваются механическими насосами. Механический насос служит «рабочей лошадкой» для большинства масс-спектрометров и служит для получения первоначального вакуума порядка 10-3 Торр. После получения вакуума в 10-3 Торр, могут быть активированы другие насосные системы, такие как диффузионные, криогенные или турбомолекулярные, которые позволяют достичь вакуума до 10-11 Торр. [1]
Выводы
Масс-спектрометрия становится важным методом анализа биологических и небиологических макромолекул. Она является одним из самых чувствительных и точных методов, способным определять всего лишь сотни молекул, уступая в этом только радиационным методам анализа. Разрешение некоторых методов достигает 30000, что означает точность порядка десятков ppm. Такая точность даёт возможность изотопного анализа макромолекул, таких, как белки, а также определения дефекта массы и расчёта брутто-формулы лёгких молекул и даже белков только по данным определения молекулярной массы и изотопного распределения.
Фрагментарная информация, особенно при использовании тандемной масс-спектрометрии даёт возможность определять структуру молекулы, а также, в ограниченных масштабах, механизмы газофазных реакций и реакционные центры исследуемых молекул.
Вместе с тем, масс-спектрометрия является одним из самых дорогих методов анализа, наряду с ЯМР-спектрометрией, уступая в этом только рентгеноструктурному анализу. Это обусловлено, главным образом, необходимостью организации высокого вакуума внутри прибора и связанных с этим трудностей при выборе оборудования.
Список использованной литературы
1. Dole M, Mack LL, Hines RL, Mobley RC, Ferguson LD, Alice MB. Molecular beams of macroions. Journal of Chemical Physics. 1968, 49:5, 2240.
2. Whitehouse CM, Dreyer RN, Yanashita M, Fenn JB. Electrospray interface for liquid chromatographs and mass spectrometers. Anal. Chem. 1985, 57, 675-679.
3. Tanaka K, Waki H, Ido Y, Akita S, Yoshida Y, Yoshida T. Protein and polymer analysis up to m/z 100,000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.
4. Karas M & Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with molecular mass exceeding 10,000 Daltons. Anal. Chem. 1988, 60, 2299.
5. Bruins AP. Mechanistic aspects of electrospray ionization. J. Chromatogr. A, 1998, 795, 345-357.
6. Fenn JB, Mann M, Meng CK, Wong SF, Whitehouse CM. Electrospray ionization - principles and practice. Mass Spectrometry Reviews. 1990, 9, 37.
7. McLafferty FW & Turecek F. Interpretation of Mass Spectra. 4th ed. Mill Valley, Calif. : University Science Books, 1993.
8. Cole R (Editor). Electrospray Ionization Mass Spectrometry: Fundamentals, Instrumentation, and Applications. New York: Wiley and Sons, 1997.
9. Cole RB. Some tenets pertaining to electrospray ionization mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 763-772.
10. Kebarle P. A brief overview of the present status of the mechanisms involved in electrospray mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 804-817.
11. Gaskell SJ. Electrospray: principles and practice. J. Mass Spectrom. 2000, 35, 677-688.
12. Cech NB and Enke CG. Practical implications of some recent studies in electrospray ionization fundamentals. Mass Spectrom. Rev. 2001, 20, 362-387.
13. Busch K.L., Glish G.L., McLuckey S.A. Mass Spectrometry/Mass Spectrometry: Techniques and Applications of Tandem. John Wiley & Sons, 1989.
14. Cotter R. Time-Of-Flight Mass Spectrometry: Instrumentation and Applications in Biological Research. Washington, D.C.: ACS, 1997.
15. McCloskey J.A. & Simon M.I. Methods in Enzymology: Mass Spectrometry. Academic Press, 1997.
16. Kinter M. & Sherman NE. Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass Spectrometry. Wiley-Interscience, 2000.
Подобные документы
Физические основы процесса масс-спетро-метрического распада. Определение элементного состава ионов на основании изотопных пиков. Квадрупольный масс-анализатор. Матричная лазерная десорбционная ионизация. Принцип действия молекулярных сепараторов.
реферат [2,5 M], добавлен 12.01.2012Масс-спектрометрия как метода исследования вещества, основанный на зависимости интенсивности ионного тока от отношения массы к заряду. Принцип действия ионизатора и детектора заряженных частиц. Применение метода в медицине, биохимии и криминалистике.
презентация [2,4 M], добавлен 30.05.2014Масс-спектрометрические методы в биомедицинских исследованиях. Анализ биоматериалов с помощью ядерно-магнитного резонанса, его преимущества и определяемые патологии. Методы обработки и интерпретации спектров. Способы реализации иммунохимического анализа.
курсовая работа [32,1 K], добавлен 26.01.2011Масс-спектрометрия с индуктивно связанной плазмой как наиболее универсальный метод анализа элементного состава вещества. Система ввода образца в виде раствора. Процессы, происходящие в индуктивно связанной плазме. Фильтрация и детектирование ионов.
презентация [320,0 K], добавлен 07.06.2015Определение объема воздуха необходимого для полного сгорания заданного количества пропана. Вычисление изменения энтальпии, энтропии и энергии Гиббса, при помощи следствий из закона Гесса. Определение молярных масс эквивалентов окислителя и восстановителя.
контрольная работа [23,1 K], добавлен 08.02.2012Общие сведения о гетерополисоединениях. Экспериментальный синтез капролактамовых гетерополисоединений, условия их получения. Изучение структурных особенностей соединений методами рентгеноструктурного анализа, масс-спектрометрии, ИК- и ЯМР-спектроскопии.
дипломная работа [501,6 K], добавлен 05.07.2017Литиевые источники тока (ЛИТ). Теоретическая основа процессов гранулирования активных масс и формования ленточных положительных электродов ЛИТ. Требования к положительным электродам в виде тонких лент, пластин и дисков, состояние производства сегодня.
автореферат [2,4 M], добавлен 22.03.2009Особенности, область применения хроматографических методов. Основные ее варианты: газо-адсорбционный, газо-жидкостный, капиллярный и реакционный. Принципиальная схема газового хроматографа и компьютеризированной хромато-масс-спектрометрической установки.
реферат [74,1 K], добавлен 15.04.2011Сущность рентгенофлуоресцентного метода анализ. Проблемы возникающие при определении концентраций с помощью рентгенофлуоресцентного анализа. Влияние состояния поверхности на интенсивность флуоресценции. Основные модули и принцип работы спектрометра.
дипломная работа [1,1 M], добавлен 15.06.2012Определение шихтового состава массы по химическому составу черепка и сырьевых материалов. Расчет молекулярного, рационального состава сырьевых материалов и масс. Расчет шихтового состава массы при расчетной (полной) замене одного из сырьевых материалов.
контрольная работа [68,5 K], добавлен 14.10.2012
