Изучение свойств и методик определения витамина Р

"Прием изофлавонов существенно уменьшал жесткость артериальной стенки, общее периферическое сопротивление и скорость пульсовой волны", пишут авторы. "Возможно, этим частично объясняется снижение риска сердечно-сосудистых заболеваний в популяциях, употребляющих богатую изофлавонами пищу", предполагают д-р Teede и ее коллеги.

Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; 23:1066-71.

Cardiosite.ru

1 июля 2003 г. Регулярный прием капсул, содержащих флавоноиды черного и зеленого чая, приводит к существенному снижению уровня общего холестерина и холестерина липопротеинов низкой плотности.

Ранее было показано, что флавоноиды обладают гиполипидемическим эффектом у лабораторных животных. По данным эпидемиологических исследований, потребление чая ассоциируется сболее низкими уровнями холестерина и меньшей частотой инфаркта миокарда. Данное исследование впервые изучало гиполипидемический эффект компонентов чая у человека.

"Мы ожидали, что эффект будет небольшим, однако на самом деле уровень холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) снизился на 16%", пишут д-р David J. Maron и его коллеги (Университет Vanderbilt, Nashville, Теннеси) в номере Archives of Internal Medicine за 23 июня.

В течение 12 недель 240 человек с "мягкой" и умеренной гиперхолестеринемией рандомизированно поучали капсулы с теафлавинами и катехинами либо плацебо. Все участники соблюдали диету с низким содержанием жиров.

В группе активного вмешательства уровни общего холестерина снизились на 11.3%, холестерина ЛПНП - на 16.4%, по сравнению с исходными значениями (р=0.01). Кроме того, отмечалось статистически недостоверное повышению уровней холестерина липопротеинов высокой плотности и триглицеридов. В группе плацебо показатели липидного обмена оставались неизменными.

Частота побочных явлений была одинаковой в обеих группах. Ни в одной из групп не отмечалось тяжелых нежелательных явлений.

"Мы считаем целесообразным проведение крупных и длительных рандомизированных контролируемых клинических испытаний в различных популяциях с целью изучения влияния компонентов чая на другие факторы риска атеросклероза", заключают авторы.

Arch Intern Med. 2003;163:1448-53.

Cardiosite.ru

29 апреля 2003 г. Антиоксиданты-полифенолы, содержащиеся в оливковом масле и красном вине, ингибируют экспрессию молекул эндотелиальной адгезии. Именно с эти может быть связан их антиатерогенный протективный эффект, сообщается в апрельском номере Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology.

Как известно, средиземноморская диета ассоциируется с меньшей частотой развития атеросклероза. Тем не менее, до сих пор было неизвестно точно, какие именно компоненты этой диеты оказывают специфическое протективное действие.

Д-р Raffaele De Caterina и его коллеги (Университет Габриэле Д'Аннунцио, Chieti, Италия) изучали влияние полифенолов оливкового масла и красного вина на экспрессию эндотелиальных молекул адгезии моно- и лейкоцитов на культуре клеток эндотелия умбиликальной вены человека.

Три полифенола - с антиоксидантной активностью - олеуропеин, гидрокситирозол и резвератрол - достоверно подавляли экспрессию молекул адгезии (vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1). Два других изучавшихся полифенольных соединения на экспрессию VCAM-1 не влияли.

Оказалось, что три антиоксиданта-полифенола подавляют транскрипцию VCAM-1, действуя на такие факторы транскрипции, как ядерный фактор каппа-В и протеин-активатор-1.

"Нам удалось установить новые молекулярные механизмы, за счет которых компоненты средиземноморской диеты могут предотвращать атеросклероз", полагают итальянские ученые. "Вместе с жирными кислотами, полифенолы являются примером того, как нутриенты могут непосредственно влиять на экспрессию провоспалительных/проатерогенных генов".

Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003;23:622-9.

Cardiosite.ru

3 апреля 2003 г. Исследователи из университета Scranton (Пенсильвания) сообщают, что клюквенный сок содержит больше фенольных антиоксидантов, чем остальные, более "популярные" соки. У больных с гиперхолестеринемией клюквенный сок существенно повышает концентрацию липопротеинов высокой плотности.

На 225-ом ежегодном заседании Американского Химического Общества в Нью-Орлеане д-р Joe A. Vinson сообщил о результатах исследования влияния клюквенного сока на липидный обмен при гиперхолестеринемии.

Он и его коллеги после "отмывочного" периода назначали 10 пациентам до 3 порций клюквенного сока (с искусственным подсластителем) в день. Другие 10 участников получали клюквенный сок с сахаром. Прием сока продолжался 1 месяц. Каждая порция (8 унций) содержала около 27% чистого сока.

Спустя месяц уровень общего холестерина остался прежним. Однако концентрация холестерина липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) несколько снижалась на фоне 2 порций сока. Уровень холестерина липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) достоверно повышался на фоне приема 3 порций сока. Концентрация триглицеридов не менялась при приеме сока с искусственным подсластителем, но возрастала у тех участников, кто принимал до 3 порций сока с сахаром.

"Повышение уровня холестерина ЛПВП на 10%, которое мы наблюдали, соответствует снижению сердечно-сосудистого риска на 40% по Фрамингамской шкале", пояснил д-р Vinson.

Он также отметил, что масса тела участников снижалась в среднем на 2 фунта, независимо от того, какой сок они пили - с сахаром или без. "Вероятно, потеря веса связана с действием полифенолов, влияющих на метаболизм", предположил он, добавив, что "свободно-радикальное повреждение уменьшается уже на фоне одной порции сока в день".

По материалам Cardiosite.ru

19 февраля 2003 г. Ягоды - например, клюква и черная смородина - являются ценными источниками антиоксидантов, предупреждающих рак и заболевания сердца, установили финские ученые.

Оказалось, что употребление в пищу самых обычных ягод (клюква, черника, черная смородина и др.) повышает сывороточные уровни флавоноида кверцетина. Флавоноиды, как известно, обладают антиоксидантым действием, защищая организм от свободных радикалов.

«Ягоды - это великолепный источник клетчатки, витамина С, различных флавоноидов и других фенольных соединений», поясняет д-р Iris Erlund в новом выпуске European Journal of Clinical Nutrition. «При этом в них мало калорий и жира. Кроме того, они делают нашу диету более разнообразной и «разноцветной», что тоже немаловажно. Ягоды, безусловно, очень полезны практически всем».

Кверцетин является одним из наиболее мощных антиоксидантов, согласно экспериментальным данным. Доказано, что он предупреждает развитие сердечно-сосудистых заболеваний. В экспериментах на животных он также предупреждал развитие рака; надежных доказательств аналогичного эффекта у людей пока не получено.

В выполненное д-ром Erlund исследование вошли 40 60-летних мужчин, в течение 8 недель рандомизированно получавших обычную или дополнительно содержащую 100 г ягод диету. В «ягодной» группе ежедневное потребление кверцетина составляло 12 мг, в группе контроля - 5.8 мг. На фоне «ягодной» диеты уровень кверцетина увеличился приблизительно на 50% по сравнению с обычной диетой.

Самыми лучшим источником кверцетина считается желтый или красный репчатый лук. В ягодах кверцетина несколько меньше, но все равно больше, чем в чае или красном вине, чаще всего называемых в качестве источников этого вещества.

Термическая обработка и замораживание разрушают многие антиоксиданты, поэтому лучше всего есть ягоды свежими. «Все-таки даже после замораживания или приготовления варенья в ягодах сохраняется достаточное количество полезных веществ», успокаивает д-р Erlund. «С другой стороны, в соках полезных веществ относительно мало, потому что последние не полностью освобождаются из ягод в процесс приготовления сока», добавляет она.

Eur J Clin Nutr 2003;57:37-42.

Cardiosite.ru

24 декабря 2002 г. Новое японское исследование показало, что употребление зеленого чая способно уменьшить риск инфаркта миокарда, хотя и не влияет на риск ИБС.

«По нашим данным, среди любителей зеленого чая инфаркт миокарда (ИМ) встречается реже… Вероятно, употребление этого напитка японцами оказывает выраженный протективный эффект», полагает д-р Yukihiko Momiyama (Медицинский Колледж национальной обороны, Saitama, Япония).

В проведенное им и его коллегами исследование вошло 393 больных, проходивших диагностическую коронарографию. У большинства участников имелись такие факторы риска ИБС, как гипертония, гиперхолестеринемия, диабет. Анализ полученных данных представлен в ноябрьском выпуске American Journal of Cardiology.

Не удалось обнаружить связи между числом ежедневно выпиваемых чашек зеленого чая, с одной стороны, и риском или тяжестью ИБС, с другой стороны. Тем не менее, среди лиц, выпивавших как минимум одну чашку в день, риск ИМ был на 42% меньше, чем среди тех, кто вообще не употреблял этот напиток.

Десятилетиями ученые пытались определить, почему в Японии распространенность ИБС гораздо ниже, чем на Западе. По всей видимости, существует множество факторов, обусловливающих это различие. Однако ряд исследователей ведущую роль отводит именно употреблению зеленого чая.

Как известно, зеленый чай богат флавоноидами, нейтрализующими свободные радикалы и тем самым уменьшающими риск ИБС и инсульта. Ранее было установлено, что при достаточном потреблении флавоноидов меньше риск смерти от ИБС, а также риск ИМ.

Am J Cardiol 2002;90:1150-3.

Cardiosite.ru

2. Материалы и методы

2.1 Первичное исследование растительного сырья

Работу с любым новым растением целесообразно начинать на небольшой навеске сырья с подбора оптимального экстрагента и предварительной оценки состава БАВ из извлечений капельным или экспресс-хроматографическим методом с использованием специфических реакций на основные группы природных соединений.

Для этого берут навески измельченного растительного сырья, просеянного сквозь сито, заливают разнополярными экстрагентами в соотношении 1:10 (вода, 10 %, 30 %, 50 %, 70 %, 96 % спирт, ацетон и 50 % водный ацетон, этилацетат, хлороформ, бензол (пентан, гексан, гептан, толуол)) и оставляют настаиваться (с перемешиванием или без) в течение 1-3 дней при комнатной температуре.

Перечисленные экстрагенты являются оптимальными для определения "возможных" групп извлекаемых соединений растений (гликозиды, агликоны, сложные эфиры, соединения, содержащие группы ОН, С=О, СООН, NH(NH2) жирного и ароматического ряда, неполярные и высокомолекулярные вещества). Вместо этилового спирта или в дополнение к нему можно использовать метиловый или другие спирты, диоксан, этиленгликоль, формамид, кислоты, основания, что расширяет информацию о составе групп веществ в растении.

Извлечения, полученные при комнатной температуре, оценивают по качественному составу групп БАВ и количественному содержанию экстрактивных веществ. Для этого из каждого извлечения на фильтровальную бумагу наносят пятна извлечений (не менее 10 точек каждого извлечения на расстоянии 1-1.5 см друг от друга,d = 0.5 см). Отбирают аликвоту каждого извлечения, испаряют в предварительно взвешенной фарфоровой чашке, доводят до постоянного веса и определяют количество экстрактивных веществ, извлекаемых каждым растворителем без нагревания.

Затем все извлечения одновременно нагревают на кипящей водяной бане в течение одного часа и повторяют описанную выше процедуру нанесения проб на бумагу и определения количества экстрактивных веществ после нагревания, т. е. оценивают изменения в интенсивности окраски пятен и количестве экстрактивных веществ, получаемых во всех вариантах извлечений при нагревании.

После проведения обязательных реакций на основные группы БАВ (таблица 1.1) и оценки группового состава БАВ в полученных извлечениях, изучают компонентный состав, используя метод восходящей одномерной бумажной хроматографии в присутствии веществ-стандартов на разные обнаруженные группы БАВ, сравнивая их в видимом и УФ-свете, по величинам Rf и цвету пятен от действия специфических проявителей [8].

Таблица 1.1 - Обязательные реакции на основные группы БАВ

№ п/п	Реактив	Основные группы БАВ
1	NH3 (в парах или растворе)	С=О содержащие соединения (флавоноиды, пигменты, антоцианы, антрахиноны, халконы, ауроны, ксантоны и др.)
2	NaOH (КОН)	Антрацены, халконы, ауроны
3	FeCl3 (1-5 % водные или спиртовые)	Фенольные соединения
4	А1С13, (1-5 % водные или спиртовые)	Флавоноиды и другие фенольные соединения с рядовым расположением ОН-групп или сочетание рядом стоящих С=О и ОН-групп
5	Железоаммониевые квасцы (1 % водный раствор)	Дубильные вещества (гидролизуемого и конденсированного типов)
6	Ванилин в концентрированной соляной или серной кислоте	Катехины, конденсированные дубильные вещества, антоцианы
7	о-Толуидин	Альдозы (углеводы)
8	Нингидрин	Аминокислоты, аминосахара, алкалоиды с NH2 и NH-rpyппами
9	Реактив Драгендорфа (или фосфорно-вольфрамовая кислота)	Алкалоиды
10	"Лактонная" проба	Кумарины
11	Проба на "пенообразование" (делается в растворе)	Сапонины

В результате при небольшом расходе сырья и экстрагентов решается несколько задач:

-подбор оптимального экстрагента (по качественному составу извлекаемых групп БАВ и количеству экстрактивных веществ);

-подбор режима экстракции (без температуры или с нагреванием) по результатам изменений в интенсивности окраски, по качественным реакциям на основные группы БАВ и степени их извлечения. Рекомендуется использовать не менее 10 реакций, поскольку в извлечениях могут присутствовать вещества, мешающие друг другу при их качественном определении в составе одного извлечения;

-суммарная информация может служить основой для разработки технологической схемы выделения целевых веществ

2.2 Хроматографические методы идентификации флавоноидов

Избирательная экстракция для флавоноидов имеет важное значение, в связи с широким использованием для их разделения и очистки различных вариантов хроматографического метода.

В настоящее время используют различные варианты хроматографического метода. Наиболее важной в качественном анализе является распределительная хроматография на бумаге. Тонкослойный вариант удобен для разделения ароматических оксикислот и метилированных флавоноидов, которые с трудом делят на бумаге.

Метод жидкостно-жидкостной хроматографии и, особенно, ВЭЖХ позволяет осуществлять качественный и количественный анализ всех видов флавоноидов.

Для разделения флавоноидов между собой и отделения от сопутствующих веществ используется адсорбционно-хроматографический метод [10].

2.2.1 Тонкослойная хроматография

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) очень удобен для сравнительного анализа с использованием стандартных веществ.

Пятна флавоноидов на хроматограмме зачастую могут быть обнаружены просто при облучении пластинки УФ-светом. Широко используются методы обработки хроматограмм такими проявляющими (детектирующими) реагентами, как спиртовый раствор АlCl3, пары иода и концентрированная серная кислота (для силикагелевых слоев), а также нагревание (только для силикагелевых пластинок).

Метод ТСХ позволяет широко варьировать сочетание сорбента и подвижной фазы, подбирая наиболее оптимальный вариант для конкретного объекта (таблица 1.2).

Специфическим для хроматографии флавоноидов является полиамидный сорбент. Полиамидный сорбент (стационарная фаза), в зависимости от состава подвижной фазы, может проявлять двойственный характер, а именно выступать в роли полярной или неполярной фазы.

Соответственно разделение веществ может протекать либо как обычный распределительный (в водно-спиртовых элюентных системах), либо как обращенно-фазный распределительный (в элюентной системе метанол - хлороформ) процессы.

Таблица 1.2 - Типичные условия ТСХ анализа флавоноидов

Группа флавоноидов	Неподвижная фаза (сорбент)	Подвижная фаза (элюентная система растворителей)
Флавоноидные гликозиды	Целлюлоза	Бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1) трет-Бутиловый спирт - уксусная кислота - вода
	Силикагель	Уксусная кислота (5 - 40%-я) Этилацетат - метилэтилкетон - метанол (5:3:1)
	Полиамид	Метанол - вода (8:2) Хлороформ - метанол (1: 1)
Полярные гликоны (флавоны, флавонолы)	Целлюлоза	трет-Бутиловый спирт - уксусная кислота - вода Бутанол - уксусная кислота - вода (3:1:1) 50%-я уксусная кислота
	Силикагель	Бензол - уксусная кислота - вода (125:72:5) Толуол - ацетон - хлороформ (8:7:5) Хлороформ - ацетон - муравьиная кислота (9:2:1)
	Полиамид	Хлороформ - метанол - уксусная кислота (9:1:0,1) Метанол - уксусная кислота - вода (18:1:1)
Неполярные агликоны (дигидрофлавоны, изофлавоны, полиметилированные флавоны)	Целлюлоза	Уксусная кислота (10 - 30%-я) Хлороформ - метанол (15:1 или 3:1)
	Силикагель	Хлороформ - метанол (3:2)
	Полиамид	Метанол - вода (1:1)

Центром сорбции является амидная группировка полиамидной макромолекулы, например капрона. Хроматографируемые вещества образуют обратимые водородные связи между протонодонорной гидроксильной группой флавоноидного соединения и карбонильной группой амидного фрагмента.

Агликоны сорбируются на полиамиде прочнее, чем их гликозиды. Сорбция агликонов находится в пропорциональной зависимости от числа гидроксильных групп в молекуле, а также от их местоположения в молекуле [11, 12].

2.2.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) является быстрым, хорошо воспроизводимым методом, который требует малого количества анализируемого вещества и используется для количественного, качественного анализа и препаративного выделения [13].

Для флавоноидов более употребительны колонки с обращенно-фазными сорбентами (RP-8; RP-18) и детектирование с помощью УФ-видимого детектора с переменной длиной волны. В настоящее время широко используется фотодиодный детектор, позволяющий одновременно с выделением пика на хроматограмме получать УФ-видимый спектр вещества, соответствующего этому пику. Такой экспериментальный прием значительно облегчает задачу идентификации веществ.

Подвижные фазы (элюентные системы), как правило, бывают бинарными и содержат подкисленный полярный компонент (водные растворы уксусной, перхлорной, фосфорной или муравьиной кислот) и менее полярный органический растворитель (метанол или ацетонитрил). Подвижная фаза может поступать в колонку как в изократическом, так и в градиентном режиме, когда в ходе процесса хроматографирования происходит во времени изменение соотношения компонентов подвижной фазы [13,14].

Градиентный режим наиболее подходит для разделения сложных смесей флавоноидов. Для колонок с обращенно-фазными сорбентами типичные градиентные программы основаны на использовании подвижных фаз с преобладанием на старте доли полярного растворителя с дальнейшим постепенным возрастанием доли менее полярного растворителя.

Соотнесение пика на хроматограмме с «принадлежащим» ему веществом является наиболее трудной задачей. Удобным приемом является использование параллельного хроматографирования хорошо известных, так называемых стандартных образцов и сравнение с ними хроматограммы исследуемого объекта. Стандартное вещество в идеале должно быть наиболее родственно флавоноидам и иметь подобные хроматографические свойства. В тех случаях, когда стандартное вещество хроматографируется в равных условиях, но параллельно, его называют внешним стандартом. Внутренний стандарт (добавляется в исследуемую пробу перед вводом в хроматограф) должен отвечать следующим условиям: в исследуемой смеси не должно содержаться аналогичное вещество и пик стандарта не должен перекрываться с каким-либо соединением в смеси. Такие ограничения отсутствуют в случае применения внешнего стандарта.

Преимуществами внутреннего стандарта является подтверждение достоверности экстракции, подготовки образца, хроматографической процедуры. В качестве стандартного вещества для флавоноидов часто используется рутин, являющийся коммерческим доступным продуктом. Он хорошо подходит для количественного анализа флавоноловых гликозидов. Для содержащихся в смеси других флавоноидов могут быть использованы такие коммерчески доступные стандарты, как апигенин-7-глюкозид - для флавоновых гликозидов, катехин - для флаван-3-олов, нарингенин - для дигидрофлавонов, дигидрокверцетин - для дигидрофлавонолов, даидзеин - для изофлавонов [13,14].

Для количественного анализа строится кривая зависимости концентрации флавоноида от площади пика для каждого стандарта в тех же самых хроматографических условиях (длина волны, растворитель), которые применяются по отношению к исследуемой смеси. Соответствующие калибровочные кривые могут быть использованы для расчета количества флавоноида, представляемого каждым пиком ВЭЖХ хроматограммы. В настоящее время практически исчезла надобность в построении калибровочных кривых в связи с обеспечением хроматографов компьютерной системой обсчета площадей пиков [13,14].

На примере хроматографирования смеси флавонов и флавонолов в обращенно-фазном варианте (рисунок 1.5) показано, что порядок выхода флавоноидов коррелирует с числом гидроксильных групп, а именно: время удерживания возрастает по мере снижения числа гидроксильных групп в молекуле.

Хроматографические условия: колонка Sep-PakC-18, градиентный режим: метанол - 5 мМ, H3PO4.

Рисунок 1.5 - Хроматограмма смеси флавоноидов

Описание пиков и времени удерживания представлены в таблице 1.3.

Таблица 1.3 - Время удерживания различных флавоноидов

Пики	Число ОН-групп	Время удерживания, мин
1 - мирицетин	1	11.5
2 - кверцетин	2	19.5
3 - лютеолин	3	23.0
4 - кемпферол	4	31.0
5 - апигенин	5	33.5

2.3 Количественное и качественное определение флавоноидов

2.3.1 Химические методы исследования флавоноидов

Методы качественной идентификации флавоноидов

Для обнаружения различных видов флавоноидов используются качественные реакции. Они необходимы для подтверждения нахождения той или иной структуры на этапе идентификации флавоноидов. Наиболее характерными реакциями являются следующие:

-Цианидиновая проба (проба Шинода)

Общей реакцией на флавоноидные соединения является цианидиновая проба (рисунок 1.6), проводимая с помощью концентрированной соляной кислоты и металлического магния. Действие водорода в момент выделения приводит к восстановлению карбонильной группы и образованию ненасыщенного пиранового цикла, который под действием соляной кислоты превращается в оксониевое соединение, имеющее окраску от оранжевой (флавоны) до красно-фиолетовой (флаваноны, флавонолы, флаванонолы) [4].

Рисунок 1.6 - Цианидиновая проба

Изменение условий восстановления путем замены магния на цинк приводит к изменению окраски. При использовании цинка положительную реакцию дают флавонолы и флавонол-3-гликозиды, а флаваноны не обнаруживают ее.

Цианидиновую реакцию не обнаруживают халконы, ауроны, но при добавлении концентрированной соляной кислоты (без магния) образуют красное окрашивание за счет образования оксониевых солей.

Для постановки реакции 1 г порошка сырья заливают 10 мл 95% этанола, нагревают на водяной бане до кипения и настаивают 3 - 4 ч. Спиртовое извлечение фильтруют, упаривают до объема 2 мл, делят пополам и разливают в 2 пробирки; в каждую пробирку прибавляют по 3 капли концентрированной хлористоводородной кислоты. В 1-ю пробирку добавляют 0.03 - 0.05 г цинковой пыли и нагревают на водяной бане до кипения. Жидкость окрашивается в красный цвет. Во 2-й пробирке окрашивание отсутствует [4].

-Борно-лимонная реакция (реакция Вильсона-Таубека)

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с борной кислотой в присутствии лимонной (реактив Вильсона), образуют желтую окраску с красноватой флюоресценцией в УФ-свете. При замене лимонной кислоты на щавелевую (реактив Таубека) в УФ-свете отмечается зеленая или желтая флюоресценция (рисунок 1.7).

Рисунок 1.7 - Реакция Вильсона-Таубека

-Реакция с треххлористой сурьмой

5-оксифлавоны и 5-оксифлавонолы, взаимодействуя с треххлористой сурьмой, образуют комплексные соединения, окрашенные в желтый или желто-оранжевый цвет - флавоны, в красный или красно-фиолетовый - халконы (рисунок 1.8).

Рисунок 1.8 - Реакция с треххлористой сурьмой

Реакцией по Брианту (которая является модификацией пробы Шинода) можно отличить гликозиды от агликонов. Суть метода заключается в следующем: после проведения цианидиновой пробы к раствору добавляют октанол и взбалтывают. При наличии агликонов окраска переходит в органический слой.

-Образование фенолятов

Так как в своей структуре флавоноиды имеют фенольные гидроксилы, то им присущи химические свойства, соответствующие данной функциональной группе. Так, фенольные ОН-группы способны проявлять слабокислые свойства, образуя феноляты с основаниями.

-Взаимодействие со щелочами

Характерной реакцией на флавоноиды считается также их взаимодействие с щелочами. Флавоны, флавонолы, флаваноны и флаванонолы растворяются в щелочах с образованием жёлтой окраски, которая при нагревании изменяется до оранжевой или коричневой. Халконы и ауроны при взаимодействии со щелочами обычно дают красное или ярко-жёлтое окрашивание.

-Образование комплексов с солями металлов

Присутствие фенольных гидроксилов и карбонильной группы позволяет флавоноидам образовывать комплексы различной степени устойчивости с солями металлов (Аl3+, Fe3+, Pb2+ и так далее), вступать в реакции с диазосоединениями с образованием азокрасителей.

-Диазотирование

При проведении реакции диазотирования азосочетание проходит по 6 или 8 положениям. Если положения 5 и 7 замещены, то реакция не идёт (можно доказать присутствие в 7 положении углеводного компонента). В качестве диазосоставляющего часто используют кислоту сульфаниловую или п-нитроанилин.

- При использовании хроматографических методов определения флавоноидов их можно обнаружить на хроматограммах по флуоресценции или в виде окрашенных пятен при сканировании в УФ-свете или/и проявлении одним из реактивов (пары аммиака, 5 %-ный спиртовой раствор алюминия хлорида, 10 % раствор щёлочи, реактив Вильсона, раствор диазотированного сульфаниламида и другие) [4].

2.3.2 Объемные методы количественного определения флавоноидов

Объёмный анализ - это совокупность методов химического количественного анализа, основанного на измерении объёмов для установления концентрации (содержания) определяемого вещества. К объёмным методам анализа относят распространённые в лабораторной практике различные варианты титриметрического анализа, основанного на измерении объёма израсходованного раствора реагента известной концентрации, необходимого для достижения точки эквивалентности.

Комплексонометрия - метод титриметрического анализа, который основан на образовании прочных комплексных соединений ионов металлов (всех, кроме одновалентных) с комплексоном III (двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты), при этом изменяются концентрации ионов металлов в титруемом растворе.

Метод комплексонометрического титрования избытка ацетата свинца, не вступившего в реакцию осаждения с флавонолами, обладает достаточной избирательностью по отношению к флавоноидам и позволяет проводить определение флавонолов в присутствии ацетилсалициловой кислоты, антрахинонов, кумаринов.

К титриметрическому методу анализа также относится метод окисления флавоноидов ферроцианидом калия по n-фенил-аптрониловой кислоте. Однако метод длителен и не обладает избирательностью [10].

2.3.3. Оптические методы определения флавоноидов.

Спектрофотометрический и фотоколориметрический анализы являются разновидностями молекулярно-абсорбционного спектрального анализа. Сущность молекулярно-абсорбционного спектрального анализа заключается в качественном и количественном определении веществ по их спектрам поглощения. Физической основой спектрального анализа является взаимодействие электромагнитного излучения с веществом.

Основной закон спектрофотометрии - закон Бугера-Ламберта-Бера. Применительно к растворам его запись выглядит следующим образом:

, (1.4)

где, 10 - начальная интенсивность светового потока,

I - интенсивность светового пучка после прохождения раствора,

е - коэффициент поглощения (экстинкции) светового потока,

С - концентрация вещества в растворе в моль/л,

l - толщина слоя светопоглощающего раствора.

Из уравнения (1.4) следует:

, (1.5)

Величина lg (I0/I) называется оптической плотностью раствора и обозначается символом D. Из (1.5) имеем:

(1.6)

Из уравнения (1.6) следует, что оптическая плотность раствора прямо пропорциональна концентрации светопоглощающего вещества в растворе и толщине слоя раствора. То есть при определённой толщине слоя раствора, оптическая плотность будет тем больше, чем больше концентрация вещества в растворе. Отсюда следует, что, определяя оптическую плотность раствора, мы можем напрямую определять концентрацию вещества в растворе. Увеличивая толщину слоя l можно измерять очень малые концентрации веществ [10,19].

Количественное определение исследуемых флавоноидных соединении в УФ- и видимой области спектров основано на измерении оптической плотности при длине волны в максимумах поглощения как растворов анализируемых веществ, так и растворов их окрашенных комплексов.

Спектрофотометрическое определение по максимумам собственного поглощения в разновидности прямой спектрофотомерии или дифференциальной спектрофотомерии является одним из наиболее распространенных методов анализа флавоноидов. При этом рабочими диапазонами длин волн служат как длинноволновые максимумы для флавоноидов - 330-370 нм, так и коротковолновые. Коротковолновые максимумы, хотя и более интенсивны, но в ряде случаев менее пригодны для аналитических целей из-за малой «площади» вершины пика, что приводит к большим ошибкам определения. Относительная ошибка прямого спектрофотометрического определения составляет± 2-5 % и может быть снижена при дифференциальной методике анализа до 0.5-1.0 %. Рабочий интервал концентраций спиртовых, спиртоводных растворов составляет от 5 до 20 мкг вещества в 1 мл раствора. Обладая высокой чувствительностью, метод не селективен, так как не контролирует содержание каждого из веществ одного класса соединений и не позволяет судить о их количестве.

Спектрофотометрические или фотометрические определения по реакции диазотирования ранее были широко распространены в анализе. Реакция чувствительна, но не избирательна, так как наряду с флавоноидами эту реакцию дают фенольные соединения, пиразолоны и другие классы соединений. Применение данного метода ограничено неспецифичностью его и внутри каждого из классов соединении из-за прохождения реакции у флавоноидов только по кольцу А при наличии свободного ортоположения по отношению к фенольному гидроксилу у 7-го углеродного атома. Поэтому даже суммарные определения с данным реактивом не показывают истинногосодержания исследуемых веществ как в суммарных фитохимических препаратах, так и в растительном сырье.

Большей специфичностью обладают, хотя и не лишены недостатков, методики определения флавонолов по цветным комплексным соединениям с хлоридом алюминия, хлорокисью циркония (хлористым цирконилом), азотнокислым галлием. Окрашенные растворы имеют максимумы в интервалах: 385-460 нм с хлористым алюминием, 385-500 нм с хлористым цирконилом, 400-455 нм с азотнокислым галлием. Наибольшей чувствительностью обладает методика с применением азотнокислого галлия, позволяющая количественно определять 0.5 мкг в 1 мл раствора, затем с хлорокисью циркония - 0.9-1.0 мкг и с хлористым алюминием - 1-2 мкг.

Описаны методики анализа флавоноидов с нитритом кобальта в среде уксусной кислоты при длине волны 575 нм, а также с цинком и мышьяком. Получить истинное суммарное содержание флавоноидов по образованию цветных комплексов с металлами возможно лишь при наличии у соединений одинакового количества комплексообразующих центров. Отсутствие таковых у целого ряда соединений приводит к отрицательной реакции с данными реактивами.

Несмотря на указанные недостатки, метод нашел широкое применение при установлении суммарного содержания флавоноидов в сырье и суммарных фитохимических препаратах. В качестве стандарта используют кверцетин, кемпферол или их гликозиды.

Широко распространена при определении общего количества флавоноидных соединений в растениях методика фотометрического определения по реакции комплексобразования с борной кислотой при длине волны 470 нм. Методика обладает теми же недостатками, что и методика комплексобразования с солями металлов, и дает завышенные результаты, но простота проведения и доступность реактива дают возможность использовать их для ориентировочных определений. В качестве образцов используют как агликоны, так и гликозиды флавонов, флавонолов, халконов. Рабочая концентрация растворов 1-10 мкг/мл. Относительная ошибка определения ± 3.35 %.

Одним из методов определения флавоноидных соединений по оптической плотности является также анализ продуктов взаимодействия с 4-аминоантипириновым реактивом. Однако, данный анализ требует соблюдения ряда условий, как и при реакции диазотировання, и не является избирательным.

В ряду спектрофотометрических методов анализа флаванонов наиболее чувствителен боргидридный метод (до 0.5-1 мкг/мл при длинах воли 535-560 нм). Несмотря на значительную селективность, он не имеет широкого применения из-за малого времени устойчивости окрашенного комплекса и плохой воспроизводимости результатов.

Комплексонообразующие свойства флавоноидов положены в основу флуорометрического метода, являющегося на порядок более чувствительным, чем спектрофотометрический. Количественно оценить флавоноиды этим методом возможно при наличии 0.05-1 мкг вещества в 1 мл раствора. Высокая чувствительность флуорометрического метода раскрывает широкие возможности его применения для предварительной идентификации биологически активных веществ в тканях растений. Однако получить объективные результаты при анализе сырья и фитохимических препаратов можно только после разделения веществ с помощью различных видов хроматографии [19].

3. Метод определения витамина Р

Метод основан на окислении дубильных веществ KMnO4. Комплекс флавоноидов экстрагируется из объектов дис. H2O.

Водные растворы титруют 0.1 НKMnO4 в присутствии индикатора индигокармина. Результаты титрования сравнивают со стандартом.

3.1 Ход работы

Навеску объекта заливают 100 мл. нагретой до кипения Н2О и кипятят в течении 5 мин. В колбе с обратным холодильком. Полученный экстракт охлаждают и отбирают 2 мл, перенеся в колбу с 45 мл. Н2О дист.. так же в колбу капают пару капель индигокармина, в результате чего содержимое колбы окрашивается в интенсивнй синий цвет.

Исследуемый раствор титруют 0,1 Н раствором KMnO4 до появления желтой окраски,через переходные тона; от синего до зеленовато-желтого.

Для контроля титруют пробирку с 47 мл. Н2О, с добавленным в нее индигокармином.

Разница между опытом и контролем представляет: количество мл. 0,1 Н KMnO4 идущего на окисление катехинов. Расчет производят по формуле:

3.1.2 Результаты исследования

Для моего исследование был взят, витаминно-минеральный препарат «Комплевит»-ОАО «Фармстандарт-УфаВИТА» в котором содержание витамина Р= 25,00 мг на 1 таблетку.

При практическом применении методики определения витамина Р получились результаты:

флавоноид окисление витамин

Такое содержание витамина рассчитано на 100 мл.раствора.

3.1.3 Примечание

Переводной коэфициент был взят 2,41, т.к. концентрация KMnO4 ,была не 0,1 Н, а меньше.

3.2 Вывод

Применение различных методик определения витамина, должна быть сконцентрирова на высокую точность. В моем случае высокая погрешность измерения была определена тем, что:

- Была нарушена исходящая концентрация KMnO4.

- Не достаточное количество раз проделывания опыта.

- Погрешность при приливании, переливании растворов.

- Погрешность при экстрагировании.

- Нарушения при установлении внешних условий проделывания опыта.

Несмотря на то, что результаты получились намного завышены. Методы определения количественных и качественных показателей витамина Р являются достаточно точными, и дают 90%информации.

Список использованных источников

1. Яковлева, Г.П. Лекарственное сырье животного и растительного происхождения. Фармакогнозия./ Г.П. Яковлева - Спб.: Спецлит, 2006. - 845с.

2. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия / Д.А. Муравьева, И.А. Самылина, Г.П. Яковлев. - М.: Медицина, 2002

3. Биологически активные вещества растительного происхождения / Б.Н. Головкин, Р.Н. Руденская, И.А. Трофимова, А.И. Шретер. - М.: Наука, 2002

4. Химия растительного сырья №4. - 2007. - 73-77 с.

5. Беликов, В.Г. Фармацевтическая химия: учебник для высш. шк. / В.Г.Беликов - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 624 с.

6. "Технология сушки: Учебно-методический комплекс", Киселева Т.Ф. - /Кемеровский технологический институт пищевой промышленности. - Кемерово, 2007. - 117 с.

7. Кузнецова М.А. Лекарственное растительное сырье./М.А Кузнецова. - М.: Высш. шк., 1984. - 207с.

8. Корулькин, Д.Ю. Природные флаваноиды /Д.Ю. Корулькин, Ж.А. Абилов, Г.А. Толстиков. - Новосибирск: Наука, 2007. - 296с.

9. Каухова, И. Е. Особенности экстрагирования биологически активных веществ двухфазной системой экстрагентов при комплексной переработке лекарственного растительного сырья / И. Е. Каухова // Растительные ресурсы. - 2006. - Т. 42. - Вып. 1. - С. 82-91.

10. Георгиевский, В. П. Биологически активные вещества лекарственных растений / В. П. Георгиевский, Н.Ф. Комиссаренко, С.Е. Дмитрук. - Новосибирск: Наука, 1990. - 144с.

11. Дегтярев, Е. В. Применение тонкослойной хроматографии в анализе БАВ / Е. В. Дегтярев, Б. В. Тяглов, В. Д. Красиков, А. В. Гаевский // 100 лет хроматографии. - М.: Наука, 2003. - 124с.

12. Кирхнер, Ю. В. Тонкослойная хроматография / Ю. В. Кирхнер. - М.: Мир, 1981. - 542с.

13. Органическая химия: учебник для вузов: В 2 кн. Кн.2: Специальный курс/ Н.А. Тюкавкина, С.Э. Зурабян, В.Л. Белобородов и др.; под ред. Н.А. Тюкавкиной. - М.: Дрофа, 2008. - 592с.

14. Сычев, С.Н. Высокоэффективная жидкостная хроматография на микроколоночных хроматографах серии «Милихром»: Монография/ С.Н. Сычев, К.С. Сычев, В.А. Гаврилина. - Орел: ОрелГТУ, 2002. - 134с.

15. Васильев, В. П. Аналитическая химия. Физико-химические методы анализа: учеб.для студ. вузов, обучающихся по химико-технол. спец. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Дрофа, 2002. - 384 с.

16. Лебедева, М.И. Аналитическая химия и физико-химические методы анализа: учеб.пособие/ М.И. Лебедева. - Тамбов: ТГТУ, 2005. - 216с.

17. Абдуллабекова, В.Н. Идентификация рутина в растительном сырье методом капиллярного электрофореза/ В.Н. Абдуллабекова// Вестник фармации. - 2009. - №3. - С.23-28.

18. Духин, С.С. Электрофорез/ С.С. Духин, Б.В. Дерягин. - М.: Наука,1976

19. Основы аналитической химии. В 2 кн. Кн. 2. Методы химического анализа/ Ю.А. Золотов, Е.Н. Дорохова, В.И. Фадеева и др. Под ред. Ю.А. Золотова. - М.: Высшая школа, 2002. - 494 с.

20. Карасек Ф., Клемент Р. Введение в хроматомасспектрометрию: Пер. с англ. - М.: Мир, 1993. - 237 с.

21. www.goodhealth.ru/articles/properties-vitamins-next

22. http://obad.ru/registrbad/flavopektin-21967.html

Размещено на Allbest.ru