Разработка методов выделения рекомбинантного сосудистого эндотелиального фактора роста VEGF 165

Таблица 1

Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы E. coli ER2566/ pTTS- VEGF_165.

Получение гибридного белка Trx-hVEGF₁₆₅

На основании результатов ранее описанного эксперимента по получению hVEGF₁₆₅ с помощью «стоп старт» конструкции было решено осуществить получение hVEGF₁₆₅ в виде химерного белка. Так как уровень продукции тиоредоксина, несмотря на низкий выход hVEGF₁₆₅, был, достаточно, высокий.

В качестве экспрессионного вектора решили выбрать ранее полученный в лаборатории вектор pTVG производный вектора pET32 b(+). Вектор pTVG содержит ген тиоредоксина, последовательность кодирующую сайт TEV протеазы и удобный полилинкер. Ген hVEGF₁₆₅ был клонирован в плазмиду pTVG по сайтам Xho I и Nco I. В результате получили плазмиду pTVG-VEGF₁₆₅ (Рис. 16). В качестве штамма носителя взяли E. coli Origami (DE3).

За счёт делеций гена глутатион редуктазы (gor522) и тиоредоксин редуктазы (trxB) биосинтез hVEGF165 в штамме Origami (DE3) идёт с образованием внутри и межмолекуляных дисульфидных мостиков стабилизирующих молекулу белка и способствующие правильному фолдированию молекулы.

Рис. 16. Схема клонирования hVEGF₁₆₅ в pTVG

Данной плазмидой трансформировали клетки Origami (DE3) и осуществили наработку биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF₁₆₅. Полученную биомассу дезинтегрировали с помощью ультразвукового дезинтегратора. Осветленный лизат хроматографировали на колонке HiTrap Heparin Sepharose. За счёт наличия на С конце молекулы VEGF₁₆₅ 25 аминокислотных остатка, несущих сайты аффиности к гепарину (N. Ferrara, 2010) было решено фракционировать белки осветленного клеточного лизата на гепарин сефарозе.

Фракции анализировали методом ПААГ электрофореза в денатурирующих условиях. Объединяли фракции, в которых содержание ГБ превышало 90%. Фракции, содержащие ГБ концентрировали методом ультрафильтрации на мембране YM 30. К концентрату, содержащему гибридный белок, была добавленная TEV протеаза в соотношении субстрат - фермент 100:1 соответственно. Протеолитическое расщепление было не значительным, менее 40% (Рис. 17.).

Рис. 17. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Результаты протеолитического расщепления ГБ TEV протеазой. Где A- гибридный белок (Trx-hVEGF₁₆₅), B-тиоредоксин.

Вероятной причиной низкого уровня протеолитического расщепления были неспецифические взаимодействия hVEGF₁₆₅ с тиоредоксином, экранировавшие сайт TEV.

Таблица 2

Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы Origami (DE3)/pTVG-hVEGF₁₆₅

Получение гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅

Высокий уровень экспрессии гибридного белка Trx-hVEGF₁₆₅ подтвердил правильность выбранного способа продукции целевого белка. Однако, трудности возникшие на стадии сайт специфичного протеолитического расщепления TEV протеазой были, скорей всего, вызваны специфической природой тиоредоксина, влияющего на фолдинг молекулы гибридного белка. В результате снижалась доступность сайта TEV для TEV протеазы. Поэтому мы решили использовать в качестве лидерного полипептида белок с принципиально другой структурой, а также обладающего небольшой молекулярной массой в сравнении с молекулой тиоредоксина. Таким образом, было решено создать конструкцию, содержащую на N конце хитинсвязывающий домен (CBD) соединённый с hVEGF₁₆₅ через сайт TEV.

CBD фрагмент амплифицировали с pTWIN1 с помощью праймеров Т7-prim и CBD2, содержащими сайты рестриктаз Xba I и Bgl II соответственно. В качестве вектора была выбрана плазмида pET-32b(+). Данный вектор содержит в полилинкерной последовательности сайты рестрикции Xba I и Bgl II (Рис. 19), по которым и была произведена вставка амплифицированного фрагмента с учетом корректной рамки считывания (Рис. 18).

Рис. 18. Схема получения плазмиды pET-CBD

Рис. 19. Полилинкерная последовательность вектора pET-32b(+).

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Е.coli ER2566. Суспензию трансформированных клеток рассевали на чашки с селективной средой. Клоны, полученные при высевании трансформированных клеток на агаризованную среду пересевали в жидкую среду с добавлением ампициллина для выращивания и отбора клонов.

Отбор клонов осуществляли по результатам данный полученных при электрофорезе клеточных лизатов клонов в ПААГ. (Рис. 20).

Рис. 20. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/ pET-CBD

Из отобранных клонов выделили плазмидную ДНК для дальнейшей работы.

Получение экспрессионного вектора pCBD-VEGF₁₆₅.

Ранее полученный ген человеческого VEGF₁₆₅ был амплифицирован при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, содержащими сайты эндонуклеаз рестрикции Bgl II и Xho I, в качестве матрицы использовали плазмиду pTVG-VEGF₁₆₅.

Амплифицированый ген hVEGF₁₆₅ был клонирован по сайтам Xho I и Bgl II в ранее созданную для этого генетическую конструкцию pET-CBD. В результате получили плазмиду pCBD-VEGF₁₆₅ (Рис. 21).

Рис. 21. Схема получения плазмиды pCBD-hVEGF₁₆₅

Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки E. coli ER 2566, которые затем рассеивали на твёрдой питательной среде, с целью отбора клонов. В результате было проверенно 9 клонов на наличие экспрессии гибридного белка (Рис. 22).

Рис. 22. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) суммарных клеточных лизатов клонов E. coli ER2566/pCBD-hVEGF₁₆₅. Где А - гибридный белок CBD-hVEGF₁₆₅

Для подтверждения строения вставки гена рекомбинантного белка, полученные плазмиды были просеквенированы (в компании Евроген).

Из биомассы клона №4 была выделена плазмида pCBD-VEGF₁₆₅ для дальнейшей работы.

Получение штамма продуцента гибридного белка CBD-VEGF₁₆₅

Выделенной плазмидой pCBD-VEGF₁₆₅ трансформировали клетки E. coli Origami (DE3). Полученный штамм продуцент проверяли на наличие продукции гибридного белка. Элетрофорез проводили в восстанавливающих и в невосстанавливающих условиях с целью обнаружения димера гибридного белка. Электрофореграмма в невосстанавливающих условиях показала наличие димера химерного белка (Рис. 23). Целевой белок после ультразвуковой дезинтеграции биомассы клетки E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ в основном присутствовал в растворённой фракции. Таким образом, нам удалось избежать образования телец включения, характерных для гетерологической экспрессии многих белков в клетках E. coli.

Рис. 23.Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в восстанавливающих и невостанавливающих условиях. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B- мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Подбор условий культивирования штамма E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅

В ходе дальнейшей работы был проведен подбор оптимальных условий культивирования штамма-продуцента. Для этого в процессе культивирования клеток после добавления ИПТГ каждый час отбирались пробы биомассы. Культивирование проводили при 30^о С.

Результаты данного эксперимента представлены на рис. 24.

Рис. 24. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) образцов биомассы E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF₁₆₅после индукции ИПТГ. Где А - гибридный белок CBD-VEGF_165.

Из полученной электрофореграммы видно, что оптимальное время культивирования клеточной культуры E. coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ 15-16 часов после добавления ИПТГ.

Выделение и очистка гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅.

Полученный продуцент E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ культивировали при 37 ⁰С до оптической плотности 0,6-0,7, затем добавляли ИПТГ и выращивали при 30 ⁰С в течение 16 часов.

Биомассу штамма-продуцента E.coli Origami (DE3)/pCBD-VEGF₁₆₅ подвергали ультразвуковой дезинтеграции в буфере, содержащем 2 М мочевину. Центрифугированием отделили растворимую фракцию, содержащую гибридный белок, от нерастворимого осадка. Используя сродство VEGF₁₆₅ к гепарину, гибридный белок, содержащийся в осветлённом лизате, очищали от белков E. coli на колонке HiTrap HP Heparin-Sepharose. Полученные фракции анализировали на наличие димера гибридного белка с помощью SDS-ПААГ электрофореза в невосстанавливающих условиях.

Рис. 25. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) в невостанавливающих и восстанавливающих условиях фракций после элюции с гепарин сефарозы. Где A - димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅. B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF_165.

По результатом электрофореза в невостанавливающих условиях были отобраны фракции для дальнейшей работы.

Полученные фракции были объедены и сконцентрированы методом ультрафильтрацией на мембране YM 30 с целью дальнейшего протеолитического расщепления гибридного белка TEV-протеазой.

Протеолитическое расщепление гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅ TEV протеазой.

Концентрат нанесли на колонку, заполненную хитиновым сорбентом (New England Biolabs). Колонку заполнили буферным раствором, содержащим TEV протеазу, инкубировали при 37^оС на 15 часов. Продукты протеолитического расщепления элюировали буферным раствором А. Элюат и хитиновый сорбент анализировали методом SDS-электрофорезом.

Эффективность ферментативного гидролиза составила менее 50%. В качестве альтернативного пути осуществления протеолитического расщепления ГБ было решено отказаться от предварительной сорбции на хитиновый сорбент, а расщеплять, непосредственно, в растворе. К полученному концентрату добавили экстракт тел включения TEV в соотношении фермент-ГБ 1:100, а также добавили 1М раствор дитиотриэтола до концентрации последнего в реакционной среде 1 мм.

Рис 26. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ) результаты протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка на колонке заполненной хитиновым сорбентом. Где A- димер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C - hVEGF ₁₆₅.

Инкубировали в течение 15 часов при температуре 37^оС и слабом перемешивании. Гидролиз гибридного белка прошёл, практически, полностью (Рис. 27).

Рис. 27. Электрофореграмма (15% SDS-ПААГ). Кинетика протеолитического расщепления TEV протеазой гибридного белка в растворе. Где A - димер hVEGF₁₆₅, B - мономер гибридного белка CBD-hVEGF₁₆₅, C - мономер hVEGF₁₆₅.

Далее смесь, содержащую продукты ферментативного гидролиза, фракционировали, с помощью аффинной хроматографии на сорбенте гепарин сефароза по ранее описанной методики. Фракции содержащие целевой белок очищали с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С18 (Рис. 28).

Рис. 28 Профиль ВЭЖХ хроматографии на колонке Диасорб С18 фракций, содержащих hVEGF₁₆₅

hVEGF165 чистотой 98% элюировался с колонки начиная 18,6 мин по 19,1 минуту. Полученный элюат, содержащие чистый rhVEGF₁₆₅ был лиофилизирован. Итоговый выход целевого белка составил 22,4 мг с литра культуры.

Таблица 3

Содержание полипептидных продуктов на всех стадиях выделения и очистки рекомбинантного белка hVEGF₁₆₅ из биомассы E. coli Origami/pCBD-VEGF_165.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами было создано несколько генетических конструкций для бактериальной системы экспресии человеческого васкулярного эндотелиального фактора роста hVEGF₁₆₅ (pTrx-stop-hVEGF₁₆₅, pTrx-hVEGF₁₆₅, pCBD-hVEGF₁₆₅). Отобрана наиболее эффективная из них и подобран оптимально подходящий штамм E. coli. для гетерологической экспрессии данного ростового фактора. Отработана методика и схема выделения целевого белка.

ВЫВОДЫ

1. Получен высокопродуктивный штамм продуцент hVEGF₁₆₅ E. coli Origami (DE3)/pCBD-hVEGF₁₆₅.

2. Определены оптимальные условия культивирования.

3. Разработана схема выделения и очистки hVEGF₁₆₅.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Базин И., Гарин А. Таргентные антиангиогенные препараты в терапии солидных опухолей. Врач 2008, 11: 52-55.

2. Кузьмин А.Г., Липатов Д.В., Смирнова О.М., Шестакова М.В. Анти-VEGF препараты для лечения диабетической ретинопатии. Офтальмохирургия. 2009, 3: 15-19.

3. Парфенова Е.В., Ткачук В.А. Перспективы генной терапии сердечно-сосудистых заболеваний. Вопр. мед. хим. 2000, 46: 293-310.

4. Arora N., Masood R., Zheng T., J. Cai, D.L. Smith, P.S. Gill. Vascular endothelial growth factor chimeric toxin is highly active against endothelial cells. Cancer Res. 1999, 59: 183-188.

5. Baneyx F., Recombinant protein expression in Escherichia coli, Curr. Opin. Biotechnol. 1999, 10: 411-421

6. Barleon B, Sozzani S, Zhou D, Weich H A, Mantovani A, Marme D. Migration of human monocytesin response vascular endothelial growth factor (VEGF) is mediated via the VEGF receptor flt-1. Blood. 1996, 87: 3336-3343.

7. Bonnie J. Nieves, Patricia A. D'Amore, and Brad A. Bryan. The function of vascular endothelial growth factor International Union of Biochemistry and Molecular Biology, Inc.Volume 2007 35, 332-337

8. Cantell, K. The Story of Interferon, 1998.

9. Cao R, Brakenhielm E, Pawliuk R. Angiogenic synergism, vascular stability and improvement of hind-limb ischemia by a combination of PDGF-BB and FGF. NatMed. 2003, 9: 604-13.

10. Casella I, Feccia T, Chelucci C, Samoggia P, Castelli G, Guerriero R, Parolini I, Petrucci E, Pelosi E, Morsilli O, Gabbianelli M, Testa U, Peschle C. Autocrine-paracrine VEGF loops potentiate the maturation of megakaryocytic precursors through Flt1 receptor. Blood. 2003, 101(4):1316-23.

11. Christensen J.G. A preclinical review of sunitinib, a multitargeted receptor tyrosine kinase inhibitor with anti-angiogenic and antitumour activities. Annals of oncology. 2007, 18 1375-1381.

12. Clauss M., Weich H., Breier G., Knies U., Rockl W., Waltenberger J, Risau W. The vascular endothelial growth factor receptor Flt-1 mediates biological activities. Implications for a functional role of placenta growth factor in monocyte activation and chemotaxis. J BiolChem. 1996; 271(30): 17629-17634.

13. Compernolle V., Brusselmans K., Acker T., Hoet P., Tjwa M., Beck H, Plaisance S, Dor Y, Keshet E, Lupu F, Nemery B, Dewerchin M, Van Veldhoven P, Plate K., Moons L., Collen D., Carmeliet P. Loss of HIF-2alpha and inhibition of VEGF impair fetal lung maturation, whereas treatment with VEGF prevents fatal respiratory distress in premature mice. Nat Med. 2002, 8(7): 702-10.

14. Dikov M.M., Ohm J.E., Ray N, Tchekneva E.E., Burlison J., Moghanaki D., Nadaf S. Carbone D.P. Differential roles of vascular endothelial growth factor receptors 1 and 2 in dendritic cell differentiation. J Immunol. 2005, 174(1): 215-22.

15. Duyndam MC, Hilhorst MC, Schluper HM, Verheul HM, van Diest PJ, Kraal G, Pinedo HM, Boven E. Vascular endothelial growth factor-165 overexpression stimulates angiogenesis and induces cyst formation and macrophage infiltration in human ovarian cancer xenografts. Am J Pathol. 2002, 160 (2): 537-48.

16. Ellen C. Breen. VEGF in Biological Control. Journal of Cellular. Biochemistry. 2007, 102: 1358-1367.

17. Farahani M., Treweeke A.T., Toh C.H., Till K.J., Harris R.J., Cawley J.C., Zuzel M., Chen H. Autocrine VEGF mediates the antiapoptotic effect of CD154 on CLL cells. Leukemia. 2005, 19(4): 524-30.

18. Ferrara N. Binding to the extracellular matrix and proteolytic processing: two key mechanisms regulating vascular endothelial growth factor action, Mol. Biol. Cell. 2010, 21: 687-690.

19. Feistritzer C, Kaneider N.C., Sturn D.H., Mosheimer B.A., Kahler C.M., Wiedermann C.J. Expression and function of the vascular endothelial growth factor receptor FLT-1 in human eosinophils. Am JRespir Cell MolBiol. 2004, 30(5): 729-35.

20. Graumann K., Premstaller A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnol. J. 2006, 1: 164-186.

21. Gerber H.P., Malik A.K., Solar G.P., Sherman D., Liang X.H., Meng G., Hong K, Marsters J.C., Ferrara N. VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature. 2002, 417(6892): 954-958.

22. Geum Young Lee, Woon Won Jung, Chang Soo Kang, In Seok Bang. Expression and characterization of human vascular endothelial growth factor (VEGF 165 ) in insect cells Protein Expression and Purification. 2006, 46: 503-509.

23. Grunewald M, Avraham I, Dor Y, Bachar-Lustig E, Itin A, Yung S, Chimenti S, Landsman L, Abramovitch R, Keshet E. VEGF-induced adult neovascularization: recruitment, retention, and role of accessory cells. Cell. 2006, 124(1): 175-189.

24. Hyo Jin Ihm, Seung-Ju Yang, Jae-Wan Huh, Soo Young Choi Sung-Woo Cho. Soluble expression and purification of synthetic human bone morphogenetic protein-2 in Escherichia coli, BMP Rep. 2008, 31;41(5): 404-7.

25. I-Liang Lee, Pei-Shan Li, Wei-Lin Yu, Hsin-Hsin Shen. Prokaryotic expression, refolding, and puri?cation of functional human vascular endothelial growth factor isoform 165: Puri?cation procedures and refolding conditions revisited. Protein Expression and Puri?cation. 2011, 76: 54-58.

26. Ishida S., Usui T., Yamashiro K. VEGF165 as the pathophisiological isoform: differential leukocyte and endothelial responses through VEGFR1 and VEGFR2. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 2004, 45: 368-374.

27. Iwaguro H, Yamaguchi J, Kalka C, Murasawa S, Masuda H, Hayashi S, Silver M, Li T, Isner JM, Asahara T. Endothelial progenitor cell vascular endothelial growth factor gene transfer for vascular regeneration. Circulation. 2002, 105(6): 732-8.

28. Keck, P.J., Hauser, S.D., Krivi, G., Sanzo, K., Warren, T., Feder, J., and Connolly, D.T. Vascular permeability factor, an endothelial cell mitogen related to PDGF. Science. 1989, 246: 1309-1312.

29. Keck R.G., Berleau L., Harris R., Keyt B.A. Disul?de structure of the heparin binding domain in vascular endothelial growth factor: characterization of posttranslational modi?cations in VEGF. Arch. Biochem. Biophys. 1997, 344: 103-113

30. Kim S., Mohamedali K.A., Cheung L.H., Rosenblum M.G. Overexpression of biologically active VEG121 fusion proteins in Escherichia coli, J. Biotechnol. 2007, 128: 638-647

31. Lee Seong-Baek, Jeong Soo Park, Seunghee Lee, Junho Park. Overproduction of Recombinant Human VEGF in Chinese Hamster Ovary Cell, J. Microbiol. Biotechnol. 2008, 18 (1): 183-187.

32. Lissandra Dal Lago, Veronique D'hondt, Ahmad Awada. Selected Combination Therapy with Sorafenib: A Review of Clinical Data and Perspectives in Advanced Solid Tumors. The Oncologist. 2008, 13: 845-858.

33. Matsumoto Taro, Mugishima Hideo. Signal transduction via vascular endothelial growth factor (VEGF) receptors and their roles in atherogenesis. J. of atherosclerosis and thrombosis. 2006, 13 (3): 130-135.

34. Miquerol, L., Langille, B.L., and Nagy, A. Embryonic development is disrupted by modest increases in vascular endothelial growth factor gene expression. Development. 2000, 127: 3941-3946.

35. Morera Y., Lamdan H., Bequet M., Ayala M., Rojas G., Muсoz Y.,. Gavilondo J.V. Biologically active vascular endothelial growth factor as a bacterial recombinant glutathione S-transferase fusion protein, Biotechnol. Appl. Biochem. 2006, 44: 45-53.

36. Muller Y.A., Christinger H.W., Keyt B.A., de Vos A.M. The crystal structure of vascular endothelial growth factor (VEGF) refined to 1.93 A resolution: multiple copy flexibility and receptor binding. Structure. 1997, 15;5(10): 1325-38

37. Murayama T, Tepper O.M., Silver M, Ma H, Losordo D.W., Isner J.M., Asahara T., Kalka C. Determination of bone marrow-derived endothelial progenitor cell significance in angiogenic growth factor-induced neovascularization in vivo. Exp Hematol. 2002, 30(8): 967-72.

38. Norrby K. Mast cells and angiogenesis. Apmis. 2002, 110 (5): 355-71.

39. Oosthuyse B, Moons L, Storkebaum E, Beck H, Nuyens D, Brusselmans K, Van Dorpe J., Hellings P., Gorselink M., Heymans S, Theilmeier G, Dewerchin M, Laudenbach V., Vermylen P., Raat H., Acker T., Vleminckx V., Van Den Bosch L, Cashman N, Fujisawa H, Drost M.R., Sciot R, Bruyninckx F., Hicklin D.J., Ince C., Gressens P, Lupu F, Plate K.H., Robberecht W, Herbert J.M., Collen D, Carmeliet P. Deletion of the hypoxia-response element in the vascular endothelial growth factor promoter causes motor neuron degeneration. Nat Genet. 2001, 28(2): 131-8.

40. Otrock, Z.K., Makarem, J.A., and Shamseddine, A.I. Vascular endothelial growth factor family of ligands and receptors: review. Blood Cells Mol. Dis. 2007, 38: 258-268.

41. Peretz D., Gitay-Goren H., Safran M., Kimmel N., Gospodarowicz D., Neufeld G. Glycosylation of vascular endothelial growth factor is not required for its mitogenic activity, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992, 182: 1340-1347.

42. Rissanen TT, Yla-Herttuala S. Current status of cardiovascular gene therapy. MolTher. 2007, 15: 1233-47.

43. Robert J. Motzer, M. Dror Michaelson, Bruce G. Redman, Gary R. Hudes, George Wilding, Robert A. Figlin, Michelle S. Ginsberg, Sindy T. Kim, Charles M. Baum, Samuel E. DePrimo, Jim Z. Li, Carlo L. Bello, Charles P. Theuer, Daniel J. George, and Brian I. Activity of SU11248, a Multitargeted Inhibitor of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor and Platelet-Derived Growth Factor Receptor, in Patients With Metastatic Renal Cell Carcinoma. The Journal of Clinical Oncology. 2006, 24 (1): 16-24.

44. Rosana D. Meyer, David B. Sacks, and Nader Rahimi. IQGAP1-Dependent Signaling Pathway Regulates Endothelial Cell Proliferation and Angiogenesis. PLoS ONE. 2008, 3(12): e3848.

45. Scrofani S.D.B., Fabri L.J., Xu P., P. Maccarone, A.D. Nash. Puri?cation and refolding of vascular endothelial growth factor-B, Protein Sci. 2000, 9: 2018-2025.

46. Salvatore Grisatni, Fock Ziemssen. Bevacizumab: Off-label use on ophthalmology. Indian J Opthtalmol. 2007, 55 (6): 417-420.

47. Schanzer A, Wachs FP, Wilhelm D, Acker T, Cooper-Kuhn C, Beck H, Winkler J, Aigner L, Plate KH, Kuhn HG. Direct stimulation of adult neural stem cells in vitro and neurogenesis in vivo by vascular endothelial growth factor. Brain Pathol. 2004, 14(3): 237-248.

48. Senger, D.R., Galli, S.J., Dvorak, A. M., Perruzzi, C.A., Harvey, V.S., and Dvorak, H.F. Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid. Science. 1983, 219: 983-985.

49. Shalini Iyer and K. Ravi Acharya. Tying the knot. The cystine signature and molecular-recognition processes of the vascular endothelial growth factor family of angiogenic cytokines. FEBS Journal. 2011, 278: 4304-4322.

50. Shelly A. Pizarro, Jane Gunson, Matthew J. Field, Rachel Dinges, Stefanie Khoo, Milind Dalal, Michael Lee, Kimberly A. Kaleas, Kathryn Moiseff, Susan Garnick, Dorothea E. Reilly, Michael W. Laird, Charles H. Schmelzer. High-yield expression of human vascular endothelial growth factor VEGF 165 in Escherichia coli and puri?cation for therapeutic applications. Protein Expression and Puri?cation. 2010, 72: 184-193.

51. Shui YB, Wang X, Hu JS, Wang SP, Garcia CM, Potts JD, Sharma Y, Beebe DC.Vascular endothelial growth factor expression and signaling in the lens. Invest Ophthal mol VisSci. 2003, 44 (9): 3911-3919.

52. ShyuK-G, ChangH, IsnerJM. Synergistic effect of angiopoietin-1 and vascular endothelial growth factor on neoangiogenesis in hypercholesterolemic rabbit model with acute hind limb ischemia. Life Sciences. 2003, 73: 563-79.

53. Street John and Lenehan Brian. Vascular endothelial growth factor regulates osteoblast survival -evidence for an autocrine feedback mechanism, J. of Orthopaedic Surgery and Research. 2009, 4:19.

54. Swartz J.R. Advances in Escherichia coli production of therapeutic proteins. Curr. Opin. Biotechnol. 2001, 12: 195-201.

55. Wiesmann C., Fuh G., Christinger H.W., Eigenbrot C., Wells J.A., de Vos A.M. Crystal structure at 1.7 Е resolution of VEGF in complex with domain 2 of the Flt-1 receptor. Cell. 1997, 91: 695-704.

56. Whitlock PR, Hackett NR, Leopold P Letal. Adenovirus-mediated transfer of a minigene expressing multiple isoforms of VEGF is more effective at inducing angiogenesis than comparable vectors expressing individual VEGF cDNAs. MolTher. 2004, 9: 67-75.

57. Yla-Herttuala S, Rissanen TT, Vajanto I. Vascular endothelial growth factors: biology and current status of clinical application in cardiovascular medicine. JMCC. 2007, 49: 1015-26.

Размещено на Allbest.ru