Процес біосинтезу аміноглікозидного антибіотика тобраміцину

Розмноження. Міцелій може бути стабільним або розпадатися на паличкоподібні та кокоподібні елементи. Якщо міцелій зберігається, то утворюються спори, за допомогою яких відбувається розмноження. Спори можуть утворюватися по одній, парами або ланцюжком з різної кількості клітин на повітряних чи субстратних гіфах (спороносцях), рідше - в спорангіях. Спороносці відрізняються довжиною (короткі, довгі), формою (прямі, зігнуті, спіральні), кількістю завитків, діаметром спіралей, розміщенням (рис.2.1).

Рис.5.2.1. Форми спороносців:

а - пряма, б - звивиста, в - пучковидна, г - первинні спіралі, д - відкриті спіралі, е - закриті спіралі, ж - міцелій актиноміцета [1].

Характерні морфологічні ознаки S. tenebrarius виявляють, продивляючись його при малому збільшенні безпосередньо на щільному середовищі в чашках Петрі. При цьому можна знайти субстратний міцелій, що розвивається в товщі агаризованого середовища, і повітряний, що розростається над поверхнею.

Для фіксації і фарбування міцелію використовують метод Грама. Здатність мікроорганізмів зафарбовуватись по методу Грама є важливою таксономічною ознакою, за якою всі бактерії ділять на дві групи: грампозитивні і грам негативні. S. tenebrarius належить до грампозитивних бактерій.

На агаризованих середовищах S. tenebrarius утворює щільні, компактні колонії різної структури і внутрішньої будови - гладкі, оксамитові, бугруваті, складчасті, плоскі, зморшкуваті. Колонії міцно вростають в середовище за допомогою субстратного міцелію. Колонії і особливо їх зрілий повітряний міцелій можуть бути не зафарбовані або пігментовані (сині, фіолетові, рожеві, помаранчеві, жовті), іноді з характерним землистим запахом [1].

5.3 Фізіолого-біохімічні ознаки біологічного агента

S.tenebrarius по відношенню до кисню облігатний аероб, характерний окислювальний тип метаболізму. Катаболізм глюкози, що міститься в поживному середовищі, здійснюється за гліколітичним шляхом. Ключовими ферментами в даному процесі є фосфофруктокіназа та піруваткіназа.

Росте на середовищі з концентрацією солей солей 5 % і може рости в діапазоні рН = 5,5 - 8,0, з оптимумом рН = 7,0. Типом живлення, характерний для даного актиноміцета ? хемоорганотрофія [15].

При вивченні даних ознак досліджують: ферментативну активність (розрідження желатини, казеїну, наявність целюлози, каталази, інвертази, реакцію побуріння, відновлення нітратів), асиміляцію джерел живлення (цукри, спирти, органічні кислоти), ріст на синтетичних середовищах з нітратами як єдиним джерелом азоту, потреба амонійного азоту, характер продуктів метаболізму і утворення антибіотичних речовин.

Йому властива природна множинна стійкість до антибіотиків. У більшості випадків детермінанти стійкості актиноміцетів до власного антибіотика та гени його біосинтезу зчеплені та координовано регулюються. Ідентифікація та клонування генів резистентності до власного антибіотика є, зазвичай, першим кроком у дослідженні генів біосинтезу антибіотиків. Одним із головних чинників, що лімітують біосинтез цих речовин, є ступінь резистентності штаму як до власного токсичного продукту, так і до інших антибіотиків. Встановлення закономірностей генетичного контролю стійкості актиноміцетів до антибіотиків та його ролі у біосинтезі має важливе значення для глибшого розуміння механізмів цих явищ, а також для розробки методів конструювання і селекції промислових продуцентів антибіотиків [1].

Однією з особливостей S. tenebrarius є його висока спонтанна мінливість. Гени стійкості до антибіотиків стали зручною моделлю для вивчення механізмів нестабільності генома актиноміцетів. Їх дослідження допомагає краще зрозуміти закономірності організації генома актиноміцетів та його мінливості. Воно має також важливе практичне значення, оскільки найчастіше нестабільними є ознаки, за якими проводиться селекція актиноміцетів [1].

Найважливішим продуцентом тобраміцину який володіє підвищеною продуктивною здатністю до синтезу даного антибіотика, є S. tenebrarius TD 507. Даний штам було отримано зі штаму S. tenebrarius ATCC 17920 дією на нього ультрафіолетового випромінення. Також, штам S. tenebrarius TD 507 можна отримати дією N-метил-N-нітро-нітрозогуанідину. Даний штам здатний синтезувати 1,75 ? 2 г/л даного антибіотика [15].

РОЗДІЛ 6. Опис технологічного процесу біосинтезу тобраміцину

6.1 Підрахунок кількості стадій підготовки посівного матеріалу

Загальний об'єм ферментера, в якому здійснюється культивування продуцента антибіотика тобраміцину - Streptomyces tenebrarius, 20 м3 Коефіцієнт заповнення Кзап. = 0,7. Звідси слідує, що робочий об'єм ферментера:

Vроб. = Vзаг. Ч Кзап = 20 Ч 0,7 = 14 м3 = 14000 л.

Визначаємо кількість стадій підготовки посівного матеріалу, для приготування 14000 л культуральної рідини. Кількість посівного матеріалу становить близько 10 % від загального об'єму поживного середовища.

- Для приготування 14000 л культуральної рідини, потрібно: 14000 Ч 0,1 = 1400 л посівного. Таку кількість посівного можна приготувати у ферментері об'ємом 2 м3.

- Щоб приготувати 1400 л культуральної рідини, потрібно мати: 1400 Ч 0,1 = 140 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного можна приготувати у ферментері об'ємом 250 л.

- 140 л культуральної рідини можна приготувати, засіявши поживне середовище 140 Ч 0,1 = 14 л посівного матеріалу (приготування здійснюють у ферментері об'ємом 30 л).

- Щоб приготувати 14 л культуральної рідини, потрібно мати: 14 Ч 0,1 = 1,4 л посівного матеріалу. Таку кількість посівного можна приготувати на качалочних колбах.

Тобто, процес підготування поживного середовища проходитиме в 4 етапи, п'ятим етапом буде сам процес біосинтезу.

6.2 Опис технологічного процесу

ДР-1.1. Підготовка персоналу до роботи

Персонал одягнений в технологічний одяг. Переміщення і ходіння персоналу обмежене. У виробничих приміщеннях забороняється прийом їжі.

Не рідше 1 разу на квартал персонал проходить технологічний інструктаж за вимогами, які висуваються до нього при роботі на даному виробництві з відповідним записом у журналі.

Особисті речі (пальто, плащі, головні убори, вуличне взуття) обслуговуючий персонал знімає в гардеробній, одягає перехідний одяг (халат, тапочки) й прямує до умивальної.

В умивальнії кімнаті миють руки під краном теплою водою до двох хвилин, використовуючи мило туалетне або дитяче, при необхідності використовують щітки для обробки білянігтевого простору. Для видалення мила руки ополоскують теплою водою і висушують електрорушником або стерильною серветкою і обробляють 76% етиловим спиртом.

Після обробки рук персонал одягає технологічний одяг.

ДР-1.2. Підготовка технологічного одягу

Перед пранням використаного одягу, необхідно провести його ретельний огляд. Це проводиться для того щоб запобігти нещасним випадкам.

Прання одягу проводиться після його огляду. Умови прання такі: температура 90 °С протягом 30 хв.

ДР-1.3. Підготовка миючих та дезінфікуючих розчинів

ДР-1.3.1. Підготовка перекису водню

Для обробки приміщень, повітроводів, обладнання використовують 0,5-6% розчин перекису водню з додаванням 0,5% миючого засобу.

ДР-1.3.2. Приготування хлораміну Б

Для знезараження підлоги застосовують також 1 або 2% розчин хлораміну Б. Для приготування 1 л робочого розчину хлораміну Б наливають відповідно 990 або 980 мл очищеної теплої води і розчиняють в ній відповідно 10 або 20 г хлораміну Б. Розчин готують для разового застосування.

ДР-1.3.3. Приготування розчину каустичної соди

Для миття та дезінфекції обладнання використовується 2% розчин каустичної соди. Для прикотування 1 л розчину беруть приблизно 20г сухої каустичної соди і додають близько 980мл води. Приготований розчин зберігають у герметично закритому скляному посуді в прохолодному місці.

ДР-1.4. Підготовка виробничих приміщень

ДР-1.4.1. Щоденне прибирання

Щодня проводять прибирання підлоги із застосуванням 3% розчину водню перекису і 0,5% миючого засобу з розрахунку 150-170 мл розчину на 1 м2. Для знезараження підлоги, поряд з розчином перекису водню і миючого засобу, використовують 1 або 2% розчин хлораміну Б.

Панелі, стіни, двері виробничих приміщень щодня протирають вологою хлопчасто-паперовою тканиною, змоченою в 3% розчині перекису водню з 0,5% миючого засобу. Особливо ретельно протирати ручки і нижні частини дверей.

Внутрішню скляну поверхню рам промивають і протирають у міру забруднення.

Для знезараження поверхні стін, підлоги, стелі, обладнання, а також повітря мікробіологічної лабораторії використовують бактерицидні лампи. Після проведення дезинфікуючою обробки приміщення звільняють від персоналу і включають настельні бактерицидні лампи не менше ніж на 2 години. Вимикачі для відкритих бактерицидних ламп розміщені поза опромінюваним приміщенням з сигнальним написом "Увімкнені бактерицидні лампи". Через кожні 2-3 години роботи ламп їх вимикають на 1,0-1,5 години. Встановлена потужність відкритих ламп не перевищує 2,0-2,5 Вт потужності на 1 м3 приміщення.

ДР-1.4.2. Генеральне прибирання

Генеральне прибирання виробничих приміщень проводять не рідше 1 разу на тиждень. Прибирають підлоги, стіни, стелі, повітроводи, підвіконня, поверхні всього обладнання, комунікації, всі виробничі меблі. В якості дезінфікуючих розчинів використовують 5% розчин водню перекису з додавання 0,5% миючого засобу, 1 або 2% розчин хлораміну Б (для обробки підлоги), нагрітий до температури 40-50 ° С.

Допоміжні приміщення (відділення водопідготовки і підготовки повітря, побутові приміщення) піддають обробці аналогічно виробничим приміщенням з періодичністю не рідше 1 разу на місяць.

Проводять обробку приміщень у гумових рукавичках, окулярах, респіраторі, гумових чоботях і фартуху.

Мікробіологічний контроль проводить мікробіолог за допомогою змивів стерильними тампонами не рідше 1 разу на тиждень під час виробничого процесу і за 1,5 год до початку роботи.

У змивах з 100 см2 поверхні допускається не більше 10 колоній неспороутворюючих мікроорганізмів на 2-х чашках Петрі.

У разі виявлення в повітрі і змивах приміщень грибів або спороутворюючої мікрофлори концентрацію водню перекису слід збільшити до 5%. Також необхідно чергувати дезінфікуючі засоби з метою уникнення утворення стійких форм мікроорганізмів.

ДР-1.5. Підготовка обладнання та комунікацій

ДР1.5.1. Зняття з'ємних частин обладнання та їх миття

З'ємні частини (вузли) обладнання, що безпосередньо стикаються з лікарськими речовинами або засобами, слід зняти, розібрати і ретельно вимити в розчині миючого засобу.

ДР1.5.2.Миття і дезінфікування обладнання

Через технологічне обладнання та комунікації пропускають миючий засіб. З'ємні частини (вузли) обладнання вимиваються в розчині миючого засобу при температурі 70-80 °С.

Один раз на місяць проводять обробку ферментеру 2% розчином каустичної соди. Для цього в ферментер по завантажувальній лінії з відділення приготування поживного середовища подають розчин каустичної соди за температури 20 °С, після чого ферментер заповнюють водою до необхідного рівня. Розчин каустичної соди в ферментері перемішують за допомогою мішалки чи подачею повітря через барботер упродовж 15 хв. Після дезинфекції обладнання ретельно промивають питною водою. В усіх цехах виробництва повинні бути розроблені графіки періодичного очищення та миття всього технологічного обладнання.

ДР1.5.3. Перевірка на герметичність

Перевірку обладнання на герметичність проводять після проведення всіх ремонтних та перевірочних робіт. Ємкісне обладнання на герметичність перевіряють при повітряному тиску 0,5-0,6 МПа. Якщо упродовж 30 хв тиск (за манометром) не знижується, обладнання вважають герметичним. Фланцеві з'єднання та зварні шви перевіряють на герметичність за допомогою мильної води при повітряному тиску від 0,5 до 0,6 МПа.

Герметичність парових вентилів перевіряють на дотик. Обов'язково раз на тиждень на герметичність перевіряють посівну лінію з усуненням усіх можливих пропусків. Під паровим тиском перевіряють всі матеріальні, посівні і конденсатні вентилі та трубопроводи.

ДР1.5.4.Стерилізація.

Після перевірки обладнання та комунікацій на герметичність, подають гостру пару Т=125-130°С, Р=0,2МПа.

По закінченні стерилізації зупиняють подачу гострої пари, ставлять всі вузли під паровий захист та знижують тиск. При зниженні тиску проводять охолодження до температури 90 єС.

ДР-2 Підготовка стерильного повітря

ДР-2.1. Забір атмосферного повітря

Атмосферне повітря забирають через забірну шахту на висоті 30 м.

ДР-2.2. Очищення на фільтрі грубої очистки

Попередню очистку повітря здійснюють у чарунковому фільтрі. При проходженні повітря через фільтр грубого очищення, пил та механічні частки з повітря осідають, а очищене повітря надходить у компресор. Ступінь очищення становить Е = 80 %.

ДР-2.3. Стабілізація термодинамічних показників повітря

При стисканні повітря у компресорі його температура підвищується з 15-25 єС на вході в повітродувку до 90 єС на виході з неї. Перед подачею в головний фільтр повітря охолоджують.

Після компресора повітря має наступні характеристики : Р = 0,35-0,5 МПа, t = 60 0С, W = 60 %.

ДР-2.4. Очищення повітря в фільтрі тонкої очистки

Попереднє очищення повітря від пилу та мікроорганізмів здійснюється в головному фільтрі. Головний фільтр представляє собою циліндричну ємність з сферичним дном та кришкою. В середині фільтру знаходяться дві решітки, між якими розміщають фільтруючий матеріал. Заміна фільтрувального матеріалу проводять 2 рази на рік. У разі забруднення, зволоження, інфікування фільтруючого матеріалу проводять позачергову його заміну.

Охолоджене повітря, проходячи крізь шар базальтового волокна, очищається від пилу та мікроорганізмів. Ступінь очищення становить Е = 99,5%.

ДР-2.5. Очищення повітря в індивідуальному фільтрі

Заключна стадія очищення повітря від контамінантів здійснюється в індивідуальному фільтрі.

Як фільтруючий матеріал використовують фторопластові втулки, товщиною 4 мм. Фільтр являє собою металевий циліндр з кришкою та конічним дном. Ступінь очищення становить Е = 99,99%.

ДР-3. Підготовка допоміжних речовин

ДР-3.1. Приготування розчину соляної кислоти

Для запобігання випаданню фосфорних солей в осад, при їх сумісній стерилізації із солями Mg i Ca, використовується 6 % розчин HCl.

ДР-3.2. Приготування розчину гідроксиду натрію

10 % розчин NaOH готується для подальшої стабілізації рН середовища.

ДР-3.2.1. Стерилізація розчину гідроксиду натрію

Стерилізацію здійснюють в автоклаві при температурі 131 °С протягом 40 хв.

ДР-4. Приготування компонентів поживного середовища

Перед приготуванням середовища усі компоненти стерилізуються. Режим стерилізації залежить від природи речовини.

ДР-4.1. Приготування компонентів поживного середовища для качалочних колб

Враховуючи склад поживного середовища, потрібно обрахувати кількість всіх компонентів для приготування 1,4 л.

Склад поживного середовища г/л:

Глюкоза - 8; розчин 1

(NH4)2SO4 - 2; розчин 2

КН2РО4 - 0,08;

MgSO4Ч7H2O - 0,5; розчин 3

CaCl2 - 2;

ZnSO4 Ч7H2O - 10 мг/л;

FeSO4Ч7H2O - 10 мг/л;

MnSO4ЧH2O - 0,2 мг/л; розчин 4

CuSO4Ч5H2O - 0,02 мг/л;

CoCl2Ч6H2O - 0,02 мг/л;

ДР-4.1.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Приготування розчину 1:

Глюкоза: 2 г - 1000л

х г - 1400мл; х = 11,2 г.

Готуємо 40 % розчин глюкози: 0,4 = 11,2 г/ х мл; х = 28 мл ? 30 мл.

Таким чином, 11,2 г глюкози розчиняємо в 30 мл дистильованої води. Стерилізуємо розчин в автоклаві при таких параметрах: Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.1.2. Приготування і стерилізація розчину 2

Приготування розчину 2.

(NH4)2SO4: 2 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 2,8 г.

КН2РО4: 0,08 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 0,112 г

Розчин 2 готуємо в 600 мл дистильованої води. Стерилізацію проводимо при температурі 131 °С, р = 1,5 атм, протягом 40 хв.

ДР-4.1.3. Приготування і стерилізація розчину 3

Приготування розчину 3:

MgSO4Ч7H2O: 0,5 г - 1000 мл

х г - 1400 мл; х = 0,7 г

CaCl2: 2 г - 1000 мл

х - 1400 мл; х = 2,8 г.

Наважки солей зважуємо і розчиняємо в 750 мл водопровідної води. Стерилізацію розчину солей проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.1.4. Приготування і стерилізація розчину 4

Приготування розчину 4:

Розчин 4 у своєму складі містить мікроелементи. На 100 мл поживного середовища вноситься приблизно 1 мл мікроелементів. Тобто, на 1400 мл поживного середовища потрібно внести близько 14 мл розчину 4. Для приготування потрібно:

ZnSO4 Ч7H2O: 10мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 14 мг.

FeSO4Ч7H2O: 10мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 14 мг.

MnSO4ЧH2O: 0,2 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,28 мг.

CuSO4Ч5H2O: 0,02 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,028 мг.

CoCl2Ч6H2O: 0,02 мг - 1000 мл

х мг - 1400 мл; х = 0,028 мг.

Розчин готуємо у 20 мл дистильваної води. Стерилізацію розчину 4 проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв .

ДР-4.2. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об'ємом 30 л.

Наступним етапом є приготування 14 л посівного матеріалу, для цього необхідно приготувати поживного середовища:

14 л - 1,4 л = 12,6 л, де 1,4 л - кількість посівного матеріалу із попереднього етапу.

Для приготування такої кількості поживного середовища потрібно:

Розчин 1: 1,4 л - 30 мл

12,6 л - х; х = 270 мл;

Розчин 2: 1,4 л - 600 мл

12,6 л - х ; х = 5400 мл = 5,4 л;

Розчин 3: 1,4 л - 750 мл

12,6 л - х ; х = 6750 мл = 6,75 л;

Розчин 4: 1,4 л - 20 мл

12,6 л - х; х = 180 мл;

ДР-4.2.1. Приготування і стерилізація розчину 1

Для приготування розчину 1 потрібна така кількість глюкози, аби отримати 40 % розчин: 30 мл - 11,2 г

270 мл - х; х = 100,8 г;

Тому, 100,8 г глюкози розчиняємо у 270 мл дистильованої води. Розчин стерилізуємо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.2.2. Приготування і стерилізація розчину 2

Для приготування розчину 2, потрібно:

(NH4)2SO4: 1 л - 2 г

12,6 л - х; х = 25,2 г.

КН2РО4: 1 л - 0,08 г

12,6 л - х; х = 1 г;

Солі розчиняємо у дистильованій воді і стерилізуємо в автоклаві при таких умовах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.2.3. Приготування і стерилізація розчину 3

Для приготування розчину 3 потрібно:

MgSO4Ч7H2O: 1 л - 0,5 г

12,6 л - х; х = 6,3 г;

CaCl2: 1 л - 2 г

12,6 л - х; х = 25,2 г;

Розчин готуємо на водопровідній воді. Стерилізацію проводимо в автоклаві: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.2.4. Приготування і стерилізація розчину 4

Для приготування розчину 4 потрібно:

ZnSO4 Ч7H2O: 1 л - 10 мг

12,6 л - х; х = 126 мг;

FeSO4Ч7H2O: 1 л - 10 мг

12,6 л - х; х = 126 мг;

MnSO4ЧH2O: 1 л - 0,2 мг

12,6 л - х; х = 2,52 мг;

CuSO4Ч5H2O: 1 л - 0,02 мг

12,6 л - х; х = 0,252 мг;

CoCl2Ч6H2O 1 л - 0,02 мг

12,6 л - х; х = 0,252 мг;

Стерилізацію розчину 4 проводимо в автоклаві при таких параметрах: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв.

ДР-4.3. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об'ємом 250 л

Далі потрібно приготувати 140 л посівного матеріалу, для цього потрібно поживного середовища: 140 л - 14 л = 126 л, де 14 л - кількість посівного матеріалу із попереднього етапу.

ДР-4.3.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Розчин глюкози: 12,6 л - 270 мл

126 л - х; х = 2,7 л ? 3 л;

108 г глюкози розчиняємо у 3 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо у автоклаві при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв.

ДР-4.3.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 126 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 ? 252 г;

КН2РО4 ? 10 г;

MgSO4Ч7H2O - 63 г;

CaCl2 ? 252 г;

ZnSO4 Ч7H2O - 1,26 г;

FeSO4Ч7H2O ? 1,26 г;

MnSO4ЧH2O ? 25,2 мг;

CuSO4Ч5H2O - 2,5 мг;

CoCl2Ч6H2O - 2,5 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 250л і заливаються 123 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-4.4. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об'ємом 2000 л

Далі потрібно приготувати 1400 л посівного матеріалу. Для цього потрібно поживного середовища: 1400 л - 140 л = 1260 л.

ДР-4.4.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Для приготування такої кількості поживного середовища потрібна така кількість глюкози:

126 л - 2,7 л

1260 л - х; х = 27 л;

1 кг глюкози розчиняємо у 27 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв. у окремому збірнику об'ємом 50 л, який має рубашку, для регулювання температури.

ДР-4.4.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 1260 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 ? 2,5 кг;

КН2РО4 ? 100 г;

MgSO4Ч7H2O - 630 г;

CaCl2 ? 2,5 кг.

ZnSO4 Ч7H2O - 12,6 г;

FeSO4Ч7H2O ? 12,6 г;

MnSO4ЧH2O ? 252 мг;

CuSO4Ч5H2O - 25 мг;

CoCl2Ч6H2O - 25 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 2000 л і заливаються 1233 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-4.5. Приготування компонентів поживного середовища для ферментера об'ємом 20000 л

Для процесу біосинтезу потрібна така кількість поживного середовища: 14000 л - 1400 л = 12600 л.

ДР-4.5.1. Приготування і стерилізація розчину глюкози

Потрібно приготувати глюкози:

1260 л - 27 л

12600 л - х; х = 270 л;

10 кг глюкози розчиняємо у 270 л дистильованої води. Стерилізацію проводимо при Т = 112 °С, р = 0,5 атм, t = 30 хв. у окремому збірнику об'ємом 500 л , який має рубашку, для регулювання температури.

ДР-4.5.2. Приготування і стерилізація солей поживного середовища

Для приготування 12600 л поживного середовища, потрібна така кількість солей:

(NH4)2SO4 ? 25 кг;

КН2РО4 ? 1 кг;

MgSO4Ч7H2O - 6,3 кг;

CaCl2 ? 25 кг;

ZnSO4 Ч7H2O - 126 г;

FeSO4Ч7H2O ? 126 г;

MnSO4ЧH2O ? 2,52 г;

CuSO4Ч5H2O - 250 мг;

CoCl2Ч6H2O - 250 мг;

Наважки солей завантажуються у ферментер місткістю 20000 л і заливаються 1233 л водопровідної води. Для запобігання випадання фосфорних солей в осад, рН середовища доводиться до значення 4,5 - 5 за допомогою 6 % HCl. Параметри стерилізації такі: Т = 131 °С, р = 1,5 атм, t = 40 хв . Після стерилізації розчин охолоджується і його рН доводиться до значення 7,0 за допомогою стерильного 10 % розчину NaOH.

ДР-5. Підготовка і стерилізація піногасника

ДР-5.1. Приготування піногасника

В якості піногасника використовується полімер плюронік. Завантажується необхідна кількість для стерилізації.

ДР-5.2. Стерилізація піногасника

Стерилізацію проводять при 120 єС протягом 30 хвилин, Р = 0,075 МПа.

ТП-6. Підготовка посівного матеріалу

Для засівання готують посівний матеріал глибинним способом.

ТП-6.1. Приготування 1,4 л інокуляту Streptomyces tenebrarius

В колбу місткістю 2 л зливаємо стерильні розчини 1, 2, 3, 4 від ДР-4.1.1., ДР-4.1.2., ДР-4.1.3., ДР-4.1.4.. Розливаємо дане поживне середовище по 100 мл в попередньо простерилізовані качалочні колби місткістю 750 мл. В стерильних умовах в кожну качалочку колбу вносимо посівну культуру зі скошеного агаризованого середовища в пробірках (14 пробірок з культурою). Колби ставимо на качалки з частотою обертання 120 об/хв. При температурі 37 °С протягом 2 діб. Значення рН = 6,8.

ТП-6.2. Приготування 14 л інокуляту

Стерильні розчини 1, 2, 3, 4 від ДР-4.2.1., ДР-4.2.2., ДР-4.2.3., ДР-4.2.4. зливаємо у попередньо простерилізований ферментер місткістю 30 л в стерильних умовах (зливаємо у зливний бачок при палаючому факелі). Потім вносимо 1,4 л посівного матеріалу, приготовленого на попередньому етапі. Культивування проводиться протягом 2 діб при Т = 37 °С, рН = 6,8 при постійному перемішуванні і аерація.

ТП-6.3. Приготування 140 л інокуляту

Даний етап проводять у ферментері об'ємом 250 л. Після змішування всіх компонентів середовища, додається посівний матеріал зі стадії ТП 6.2. Приготування посівного проводиться при Т = 37 єС, t = 48 год, рН = 6,8.

ТП-6.4. Приготування 1400 л інокуляту

Для приготування даної кількості посівного матеріалу, до простерилізованого розчину солей додається стерильний розчин глюкози, що стерилізувався в окремому збірнику, ферментер, об'єм якого 20000 л , далі дадається інокулят у кількості 140 л з попередньої стадії. Посівний готується при Т = 37 єС, t = 48 год, рН = 6,8.

ТП-7. Виробниче культивування

ТП-7.1. Виробниче культивування

До загального об'єму стерильного розчину солей подаємо розчин глюкози і засіваємо середовище приготовленим на попередньому етапі інокулятом (1400 л).

Культивування проводиться протягом 5 діб при Т = 37 °С, рН = 6,8 при постійному перемішуванні і подачі очищеного повітря.

6.3 Контроль виробництва

Згідно науково-технічної документації на підприємстві забезпечується контроль процесу виробництва антибіотика та контроль готової продукції. Це здійснюється для забезпечення відповідності готової продукції вимогам.

Упродовж всього процесу виробництва продукту, неюхідно проводити контроль санітарного стану цехів та робочих місць, відповідність сировини, допоміжних матеріалів, та ін.

Таблиця 6.3.1.

Карта постадійного контролю

Номер контрольної точки та назва стадії	Об'єкт контролю і показник, що визначається	Методи контролю	Періодичністьперевірки та порядок відбору проб	Нормативна характеристика показника, щовизначається
1	2	3	4	5
К1.1. Технологічний контроль приготування розчину перекису водню	Концентрація розчину перекису водню	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчинів	С = 3 % для щоденного прибирання та для генерального прибирання приміщень
К 1.2. Технологічний контроль приготування розчину хлораміну Б	Концентрація розчину хлораміну Б	Фізичні методи визначення концентрації	Після приготування розчинів	С = 2 %
К1.3. Технологічний контроль приготування розчину каустичної соди	Концентрація розчину	Фізичні методи визначення концентрації.	Після приготування розчинів.	С = 2 %
К 1.4., К 1.4.1. Мікробіологічний контроль виробничих приміщень	Мікробіологічна чистота поверхонь виробничихприміщень (стіни, підлога, двері),	Змиви тампонами або метод відбитків	Щоденне прибирання. 1 раз на тиждень.	В змивах з площею 10 х 10 см допускається ріст не більше 50 мікроорганізмів (бактерій і грибів сумарно);
К1.5. Технологічний контроль миття обладнань та комунікацій	Температура та час	Термометр технічний, годинник	Під час проведення миття	Т= 70 oC t = 10 хв
К1.6. Технологічний контроль герметичності обладнання	Тиск	датчик	Після миття та ополіскування обладнання	Р=0,5 - 0,6 МПа, t = 30 хв
К1.6. Мікробіологічний та технологічний контроль стерилізації обладнання та комунікацій	Режим стерилізації вузлів обладнання. Тиск. Температура. Мікробна контамінація.	Манометр технічний Термометр Мікробіологічний метод, висіви на чашки Петрі	Температура та тиск визначаються безперервнопід час виробничогопроцесу.	p = 0,2 МПа t = 130oC
К2.1. Технологічний контроль після фільтру грубої очистки	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Е = 80 %
К2.2.Технологічний контроль при стабілізації термодинамічних показників повітря	Температура	Темометр	Беспосере дньо під час нагрівання	T = 70 - 90 ?С
К2.3. Технологічний та мікробіологічний контроль стерильності повітря після тонкого очищення	Повітря, вміст мікроорганізмів та часток	Мікробна контамінаці; метод визначення (проба повітря КУО/м3) Седиментаційний (седиментація на пластинку КУО/м3)	Під час кожної зміни, під час виробничого біосинтезу	Не повинно бути життєздатних мікроорганізмів, та максимально допустиме число часток в 1м3 повітря 200. Е = 99,5%
К2.4. Технологічний контроль повітря після очищення в індивідуальному фільтрі	Ступінь чистоти	Часточки бруду; манометр	Пезперервно при подачі повітря	Е = 99,999 %
К3.1. Технологічний контроль при приготуванні соляної кислоти	Концентрація соляної кислоти	Фізико-хімічний метод	Після приготування розчину	С = 6 %
К3.2. Технологічний контроль приготування розчину гідроксиду натрію	Концентрація гідроксиду натрію	Фізико-хімічний метод	Після приготування емульсії	С = 10 %
К3.3.Мікробіологічний та технологічний контроль стерилізації розчину гідроксиду натрію	Режим стерилізації розчину. Температура. Час Мікробна контамінація.	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначаються безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	Т = 131?С, t = 30 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.1.Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 1	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	С = 40 % T = 112?С, t = 30 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.2.Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 2	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	T = 131?С, t = 40 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.3.Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 3	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	T = 131?С, t = 40 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К4.4.Мікробіологічний та технологічний контроль приготування та стерилізації розчину 4	Режим стерилізації розчину глюкози Температура Час Мікробна контамінація	Технічний термометр годинник чашки Петрі	Температура визначається безперервно під час стерилізації. Автоматичний регулятор температури Мікробіологічний метод, розведення та висів на МПА	T = 131?С, t = 40 хв Після стерилізації присутність м.о. не допускається.
К6.1. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в колбах на качалці	Температура Час рН Кількість обертів	Термометр технічний рН-метр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в колбах	T = 37 °С pH = 6,8 t = 48 год n = 120 об/хв
К6.2. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в ферментері об'ємом 30 л.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6,8, t = 48 год, Т = 37 ?С
К6.3. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в ферментері об'ємом 250 л.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6,8, t = 48 год, Т = 37 ?С
К6.4. Технологічний та мікробіологічний контроль вирощування посівного матеріалу в ферментері об'ємом 2000 л.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6,8, t = 48 год, Т = 37 ?С
К 6.1. Технологічний та мікробіологічний контроль при виробничому культивуванні.	Температура Час рН	рН-метр, Термометр Годинник	Під час вирощування посівного матеріалу в ферментері	рН =6,8, t = 120 год, Т = 37 ?С

Методики визначення основних параметрів

Концентрацію цільової речовини визначають методом високоефективної рідинної хроматографії, оскільки це найбільш ефективний метод аналізу. Суть методу полягає в розділенні складних сумішей засновуючись на відмінності в рівноважному розподілі їх між двома фазами, що не змішуються, одна з яких нерухома, а інша рухома. Суміші нерівно розподіляються між двома фазами завдяки своїх полярності, розміру або іншим властивостям. Відмінною особливістю ВЕРХ є використання високого тиску і дрібнозернистих сорбентів (зазвичай 3-5 мкм). Це дозволяє розділяти складні суміші речовин швидко і повно (від 3 до 30 хвилин). Даний метод проводиться з використанням карбоксильних катіонітів при ступінчастій елюції розчинами аміаку, гідролізом при 100 °С в (0,1?0,3) Н. розчині їдкого натру, з повторним хроматографічним очищенням, концентрацією у вакуумі, при підкисленні розчином сірчаної кислоти до pH 4,5 і осадженням метанолом у формі сульфату. Результати показав, що даний штам здатний продукувати тобраміцин в кількості ? 1,5 г/л [8].

СПИСОК ВИКОРИСТАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Бородина И.Н. Метаболический анализ Streptomyces tenebrarius. - Центр Микробной Биотехнологии / Пер.с англ. - М.: Мир, 2004. - с.17 - 56.

2. Валагурова Е.В., Козырицкая В.Е. Актиномицеты рода Streptomyces. Описание видов, их идентификация. - К.: Наукова думка, 2003. - c. 47

3. Винаров А.Ю., Кухаренко А.А., Панфилов В.И. Лабораторные и промышленные ферментеры. - М.: РХТУ, 2004. - 94 с.

4. Егоров Н.С. Биотехнология: проблемы и перспективы. - М.: Высшая школа, 1997. ? c. 82.

5. Ланчини Д., Паренти Ф. Антибиотики / Пер.с англ. - М.: Мир, 1985. ? c. 27.

6. Малежик І. Процеси та апарати харчових виробництв. - К.: НУХТ, 2003. - 400 с.

7. Сидоренко С. В., Яковлев С. В. Атибиотики и атибиотикотерапия. // Медицина. ? 2002. ? с. 16.

8. Синягина О.П., Лаврова-Балашова М.Ф., Нестерова Т.П. Получение мутантов, образующих тобрамицин, в культуре продуцента комплекса аминогликозидных антибиотиков Streptoalloteichus cremeus var. tobramycini var. nov. 2242 // Антибиотики. - 1980. ? T.45, ? №12. ? с.891 ? 894.

9. Тихонов А.И., Ярных Т.Г. Технология лекарств // БМЭ. ? 1979 - Т. 11. ? с. 78 ? 79.

10. Федоренко В.А. Генетические механизмы устойчивости актиномицетов к аминогликозидным антибиотикам. - Л.:Мир Науки и Культуры, 2009. - c. 213.

11. Федоренко В.О., Басілія Л.І., Заворотна С.А., Голець Л.М., Кириченко Н.В. Генетичний контроль біосинтезу антибіотиків та стійкості до антибіотиків у актиноміцетів. - К.:Логос, 2001. - Т.1 - c. 301.

12. Boxall A.B.. Kay A. P., Blackwell P.A.. Fate of veterinary medicines applied to soils. // Environment. ? 2004. ? Pp 166 ? 180.

13. Higgins C., Kastner K. Nebramycin, a new complex of an antibiotic of a wide spectrum. II Rescription Streptomyces tenebrarius // Antimicrob. ? 1997. - Vol.146. ? P. 208 ? 221c.

14. Hodgson D. A. Primary metabolism and its control is Streptomyces // Antimicrob. ? 2001. - Vol.134. ? 112 ? 115 c.

15. Borodina I., Schцller C., Eliasson A. Metabolic Network Analysis of Streptomyces tenebrarius // Appl. Environ Microbiol. ? 2005. ? 2 ? 10 c.

16. www.fermenter.ru/content/page_14_0.html Коммерческая биотехнология

17. www.springer.com/978-0-387-95041-9. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. -Vol. 3: The Firmicutes.

Размещено на Allbest.ru