Изменения транскрипционной активности синтаз оксида азота с возрастом и при развитии ретинопатии

Выделение сыворотки крови

Крыс декапитировали, кровь отбирали в центрифужные пробирки, затем центрифугировали для отделения клеток при 3000 об/мин 20 мин при +4⁰С. После центрифугирования верхняя фракция собирали, помещали в пластиковые пробирки, и хранили при температуре -70⁰С до момента использования.

Измерения содержания стабильных метаболитов оксида азота (нитратов и нитритов) в сыворотке крови методом Грисса.

В пробирку помещали по 2 гранулы кадмия (0.5 - 0.6 г.) на 240 мкл образца. Дважды последовательно промывали растворами (по 1 мл): ddH₂O, 0,1 М HCl, 0,1 М NH₄OH. Активацию проводили перед добавлением к кадмию растворов образцов. К каждому образцу (80 мкл) сыворотки крови добавляли 12 мкл 30% раствора ZnSO₄ и доводили общий объем до 240 мкл ddH₂O. Образцы смешивали встряхиванием, инкубировали 15 минут при комнатной температуре и центрифугировали 5 минут при 4 000 об/мин. Полученный супернатант переносили в пробирки с активированным кадмием и оставляли инкубироваться на ночь при комнатной температуре при постоянном перемешивании. После инкубации образцы центрифугировали при 5 000 об/мин. Образцы вместе со стандартом (500 мкМ NaNO₂ в разведениях от 1:5 до 1:1000) наносили на планшет по 100 мкл с повторами. В ячейки последовательно добавляли растворы 5 mМ сульфаниламида в 3 М HCl и 1 mМ нафтилэтилендиамина в деионизированной воде, инкубировали 5 минут при комнатной температуре. Интенсивность окраски считывали на длине волны 540 нм. По полученным данным строили калибровочную кривую и определяли суммарное содержание нитритов в сыворотке крови.

Статистический анализ

Полученные данные анализировались в программе StatSoft Statistica 6.0 с помощью однофакторного и двухфакторного дисперсионного анализа с post-hoc сравнением групповых средних в тесте Ньюмена-Кейлса. Как независимые факторы рассматривали генотип (Вистар или OXYS) и возраст (3 и 18 месяцев). Данные представлены как среднее ± ошибка среднего. Результаты считались значимыми при p < 0,05.

7. Результаты

Офтальмологическая характеристика сетчатки крыс OXYS в возрасте 3 и 18 месяцев

При офтальмологических осмотрах животных установлено, что в возрасте 3-х месяцев заболеваемость достигла 100%. Половина животных была подвержена 1-й стадии заболевания, которая характеризуется наличием «твердых» друз (мелкие очажки желтого цвета с четкими контурами), зоны атрофии клеток РПЭ и хориокапилляров. В некоторых случаях наблюдалась отслойка пигментного эпителия. У второй половины животных в этом возрасте регистрировались признаки второй стадии заболевания: большие «мягкие» и твердые друзы с тенденцией к сливанию, отек центральной зоны сетчатки, серозная отслойка пигментного эпителия и нейроретины. К возрасту 18 месяцев процент животных со второй стадией увеличился и достиг 78%. В этом возрасте клинические проявления, соответствующие 3-й стадии макулодистрофии (геморрагическая отслойка сетчатки, кровоизлияния в центральную область, формирование новых сосудов и признаки рубцевания на сетчатки) были выявлены у 6% крыс OXYS.

В противоположность крысам OXYS, у крыс Вистар первичные изменения сетчатки не обнаружены.

Анализа результатов офтальмологических осмотров позволяет выделить два критических периода развития ретинопатии сетчатки у крыс OXYS. Первый - возраст 3 месяца, в который наблюдается резкий подъем заболеваемости. В результате 100% крыс OXYS в возрасте 3 мес. имеют клинически выявляемые патологические изменения глазного дна, соответствующие 1 и 2 стадиям заболевания. Второй период - возраст 18 месяцев, в который регистрируется активное прогрессирование заболевания, увеличение количества животных с выраженными патологическими изменениями 2 и 3-й стадии. Эти возрастные периоды были выбраны для исследования молекулярных процессов ранних и поздних стадий дегенерации сетчатки.

Рис. 3. Доля глаз крыс OXYS с различными стадиями ретинопатии в зависимости от возраста. Данные представлены как % глаз с соответствующей стадией заболевания: 1 - сетчатка без изменений, 2, 3 и 4 - изменения аналогичны первой, второй и третьей стадиям ВМД в соответствии с международной классификацией AREDS

Транскрипционная активность генов nNOS, iNOS и eNOS в сетчатке крыс OXYS и Вистар

Анализ транскрипционной активности генов NOSs был проведен с помощью метода Real-time PCR. Данные представлены как отношение соответствующего уровня мРНК NOSs крыс OXYS к уровню РНК NOSs крыс Вистар.

Статистический анализ показал, что наиболее существенные межлинейные различия имеются в уровне транскрипционной активности гена iNOS. Независимо от возраста и выраженности патологических изменений уровень мРНК этого гена в сетчатке крыс OXYS был в семь раз ниже, чем у крыс Вистар (p<0,05). Межлинейные отличия в уровнях мРНК гена nNOS в возрасте 3 месяцев отсутствовали, а в возрасте 18 месяцев уровень мРНК nNOS у крыс OXYS был в 2,4 раза выше, чем у крыс Вистар (p<0,05). Достоверных различий в уровне экспрессии гена eNOS не выявлено. Эти данные подтвердили результаты прямого секвенирования транскриптома сетчатки, выполненного в нашем секторе.

Рис. 4. Отношение экспрессии мРНК генов nNOS iNOS и eNOS в сетчатке крыс Вистар и крыс OXYS в возрасте 3 и 18 месяцев. Данные получены метод real-time PCR. Пунктирной линией отмечен уровень экспрессии мРНК NOSs крыс Вистар, принятый за единицу. * - достоверные различия по сравнению с крысами Вистар. n=6

Исследование межвозрастных отличий транскрипционной активности генов NOSs не выявило достоверных изменений у обеих линий животных.

Рис. 5. Межвозрастные отличия экспрессии мРНК генов NOSs. Данные представлены как отношение уровня мРНК в 18 мес./уровню мРНК в 3 мес. Данные получены метод real-time PCR. n=6

Содержание белка iNOS в сетчатке в возрасте 3 и 18 месяцев крыс OXYS и Вистар

Поскольку наиболее яркие различия уровня мРНК были получены для гена iNOS, было оценено содержание белка iNOS в сетчатке методом иммуноферментного анализа (ELISA). В качестве положительного контроля использовались образцы печени.

Двухфакторный анализ (ANOVA) показал, что содержания белка iNOS в сетчатке не зависит от возраста (F_1.35=0, 39, p=0,53), но зависит от генотипа животных: достоверно выше у крыс OXYS (F_1.35=5,35, p=0,027). Однако значимые межлинейные развличия были выявлены только у трехмесячных животных. Post-hoc сравнения показали, что в этом возрасте у крыс OXYS удельное количество белка iNOS в 1,3 раза выше, чем у крыс Вистар: 39, 5 против 31 нг/мг (F_1.17=6,34, p=0,022). В другой возрастной группе, в возрасте 18 месяцев, достоверных отличий в содержании белка iNOS между крысами OXYS и Вистар не выявлено (F_1.18=0,75, p=0,4).

Рис. 6. Содержания белка iNOS в сетчатке крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 и 18 месяцев. Данные получены методом ELISA. * - достоверные различия по сравнению с крысами 3-месячными крысами Вистар. n=10

В печени содержание белка iNOS не зависело от возраста (F_1.10=0,018, p=0,9) и генотипа животных (F_1.10=1,04, p=0,33), но факторы «Возраст» и «генотип» взаимодействовали (F_1.9=5,66, p=0,04). Взаимодействие факторов определили различия в изменении с возрастом содержания белка iNOS в сетчатке крыс OXYS и Вистар. Post-hoc анализ, не выявил значимых межлинейных отличий в возрасте 3 месяцев (F_1.10=0,018, p=0,9), в то время как в возрасте 18 месяцев относительный уровень iNOS у крыс OXYS был в 1, 8 раза выше, чем у Вистар (F_1.10=85,39, p=0,0008). Такие различия определило снижение к возрасту 18 месяцев на 35% содержания белка iNOS в печени крыс Вистар. (F_1.10=44,87, p=0,03).

Рис. 7. Содержания белка iNOS в печени крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 и 18 месяцев. Данные получены методом ELISA. * - достоверные межлинейные отличия, # - достоверные межвозрастные отличия. n=6

Согласно условиям эксперимента, анализировалось одинаковое количество общего белка сетчатки и печени. Но уровень содержания белка iNOS в печени более чем в 30 раз выше, чем в сетчатке. Эти данные дают основания предполагать, что в сетчатки белок iNOS содержится в следовых количествах.

Содержание стабильных метаболитов оксида азота в сыворотке крови

Для оценки системных изменений продукции оксида азота в организме проведено исследование содержания его стабильных метаболитов - нитратов и нитритов - в сыворотке крови крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 и 18 месяцев методом Грисса. Как показал двухфакторный ANOVA-анализ результатов, уровень нитратов и нитритов не зависел ни от генотипа животных (F_1.36=2,13, p=0,153), ни от их возраста (F_1.36=0,085, p=0,772). Однофакторный дисперсионный анализ (One-way ANOVA) не выявил достоверных межлинейных отличий в уровне стабильных метаболитов NO в сыворотке крови крыс OXYS и Вистар как в возрасте 3 месяцев (F_1.18=0,26, p=0,61), так и в возрасте 15 месяцев (F_1.17=3,49, p=0,07). Межвозрастных различий также не обнаружено.

Рис. 8. Сравнение содержания белка iNOS в сетчатке и печени крыс OXYS и Вистар разного возраста. Данные получены методом ELISA. n=6-10

Рис. 9. Суммарная концентрация нитратов и нитритов в сыворотке крови крыс OXYS и Вистар в возрасте 3 и 18 месяцев. Данные получены методом Грисса. n=10

8. Обсуждение

Оксид азота является триггером множества сигнальных путей и вносит свой вклад в контроль многочисленных клеточных функций. Многочисленные исследования, выполненные как на различных моделях животных, так и на людях, показали, что изменения в генерации и биодоступности NO играют вносят существенный вклад в процесс старения и развитие ассоциированных с ним заболеваний, влияют на продолжительности жизни. Но привести накопленные на сегодня знания к общему знаменателю сложно: полученные результаты весьма противоречивы.

ВМД - многофакторное заболевание, в патогенезе которого участвуют сотни генов. На момент постановки задач настоящего исследования нам удалось найти только одну работу (Bhutto et al., 2009), в которой обсуждался вклад изменений с возрастом экспрессии синтаз оксида азота в развитие ВМД - существенное снижение иммунореактивности nNOS и eNOS в сетчатке и хориоидее с ВМД. Однако данные об изменении экспрессии генов NOSs с возрастом и при развитии ВМД малочисленны и противоречивы.

Исследовать у людей ранние доклинические стадии заболеваний невозможно, также как получать образцы сетчатки пациентов для масштабных исследований молекулярно-генетических механизмов развития ВМД. Закономерно, для таких исследований необходимы адекватные биологические модели. Настоящее исследование выполнено на уникальной модели ВМД - линии преждевременно стареющих крыс OXYS. Его основной целью явилось изучение изменения транскрипционной активности синтаз оксида азота с возрастом и при развитии ретинопатии. Для её оценки мы использовали животных в возрасте 3 месяцев, к которому заболеваемость крыс OXYS ретинопатией достигает 100%, но при этом преобладают изменения, соответствующие первой стадии ВМД, и в возрасте 18 месяцев, когда патологические изменения в сетчатке соответствуют выраженным стадиям ВМД у людей. В качестве контроля использовались одновозрастные крысы Вистар.

Оценка транскрипционной активности генов синтаз оксида азота не выявила межвозрастных изменений экспрессии мРНК NOSs у обеих линий животных, но были найдены межлинейные отличия: повышение транскрипционной активности мРНК nNOS у крыс OXYS в возрасте 18 месяцев - период, когда у этой линии крыс преобладают изменения, соответствующие выраженным стадиям ВМД у людей. При этом изменений в экспрессии мРНК eNOS выявлено не было. Известно, что оксид азота является мощным сосудорасширяющим агентом с различными физиологическими функциями и является основным регулятором кровотока хориоидеи. NO играет важную роль в ретинальной нейротрансмиссии. Продуцируется NO eNOS в клетках эндотелия, а также nNOS периваскулярных нейронов.

Ранее, Bhutto и соавторы показали, что у людей с ВМД снижена иммунореактивность nNOS практически во всех ретинальных структурах (артериях и венах сетчатки, ганглионарных клетках, нейроэпителии), в то время как различий в содержании iNOS и eNOS обнаружено не было. При оценке иммунореактивности в структурах хориоидеи было выявлено снижение содержания eNOS в артериях, лейкоцитах и клетках стромы, а nNOS - в клетках РПЭ, артериях, венах и лейкоцитах (Bhutto et al., 2009).

Несмотря на то, что eNOS локализована в основном в сосудах, Kiel предположил, что вклад в регуляцию кровотока хориоидеи вносит и nNOS (Kiel, 1999). Наблюдаемое нами повышение уровня мРНК nNOS в сетчатке крыс OXYS по сравнению с крысами Вистар, скорее всего, способствует вазодилатации в сосудистой оболочке и, вероятно, обеспечивает регуляцию кровотока на фоне характерного для крыс OXYS повышенного артериального давления (Bhutto et al., 2012). Следует подчеркнуть, что мы исследовали экспрессию генов в хориоретинальном комплексе, т.е. в образцах присутствовала и сосудистая оболочка глаза. Возможно, это стало причиной нивелирования результатов для eNOS.

Наши исследования показали, что независимо от возраста и патологических изменений транскрипционная активность гена iNOS существенно, в семь раз, у крыс OXYS ниже, чем у контрольных крыс Вистар. Известно, что снижение функциональных резервов иммунной системы вносит существенный вклад в процесс старения и развитие связанных с ним заболеваний. В наибольшей степени при старении изменяется тимусзависимое звено иммунитета, включающее сам тимус и популяцию развивающихся в нем Т-клеток. При этом фагоцитарная активность нейтрофилов и моноцитов / макрофагов с возрастом может даже усиливаться, однако бактерицидность, как правило, ослабевает за счёт снижения способности к «дыхательному взрыву» и генерации NO. Принципиально важно, что выработка клетками-эффекторами провоспалительных цитокинов при этом усиливается, а противовоспалительных, напротив, ослабевает, что приводит к хронизации воспалительных процессов у людей старшего возраста (Chung et al., 2006).Такая ситуация рассматривается как возможная причина развития паравоспаления при ВМД (Forrester, 2013).

Xu в 2009 году выдвинул гипотезу о вкладе паравоспаление в патогенез ВМД (Xu et al., 2009). Паравоспаление - это адаптивный ответ ткани на стресс или повреждение и имеет промежуточные характеристики между базальным состоянием и воспалительной реакцией. Паравоспаление направлено на поддержание гомеостаза, на восстановление тканевой функциональности, но если стресс или повреждение сохраняются в течение длительного времени, паравоспаление может стать хроническим и привести к повреждениям (Xu et al., 2009; Parmeggiani et al, 2012). Вклад паравоспаления в патогенез ВМД недавно был подтвержден исследованиями in vitro (Cao et al., 2013; Lin et al., 2013).

На следующем этапе было проведено исследование содержание белковых продуктов гена iNOS в сетчатке крыс OXYS и Вистар. Мы не только не выявили снижения содержания белка iNOS, напротив, в возрасте 3 месяцев его экспрессия в сетчатке крыс OXYS была повышена, а в 18 месяцев не отличалась от таковой у крыс Вистар. На фоне значительного снижения транскрипционной активности гена iNOS такие результаты представляются неожиданными. Для семейства ферментов NO-синтаз характерна сложная транскрипционная и посттранскрипционная регуляция экспрессии, а также наличие альтернативных транскриптов (Pautz et al., 2010). Мы предполагаем, что несоответствие уровня мРНК гена iNOS и содержание его белковых продуктов у крыс OXYS связано с различной активностью его альтернативных форм. Результаты, полученные нами при оценке содержания белкового продукта гена iNOS в печени, подтверждают точку зрения, согласно которой профиль NOSs может изменяться в зависимости от концентрации, окружающего напряжения кислорода и типа клеток.

Исследование маркеров воспаления в сетчатке крыс показали, что экспрессия iNOS в нейроретине и хориоидее различна и её изменения с возрастом вносят существенный вклад в старение (Steinle et al., 2009). При этом по данным авторов только к возрасту 32 месяцев происходит снижение уровней мРНК и белка гена iNOS в сетчатке, тогда как в сосудистой оболочке эти изменения незначительны и недостоверны (Steinle et al., 2009). Такие результаты указывают на то, что усиление экспрессии гена iNOS в сетчатке при так называемом физиологическом старении и отсутствии признаков характерных для него заболеваний может быть вызвано хронической инфекцией или травмой. При сравнении уровней мРНК и белка iNOS в сетчатке 3- и 18-месячных животных мы не выявили достоверных отличий. Результаты оценки уровня мРНК согласуются с данными Steinle et al., которые не выявили отличий в уровня мРНК iNOS между молодыми и 22-месячными крысами. Различия появились только к возрасту 32 мес., т.е. у очень старых крыс Фишер??? Для крыс Вистар, соответственно, возраст 18 месяцев не может рассматриваться как старческий. В то же время у крыс OXYS существенное снижается транскрипционная активности гена iNOS в 3 и 18 месяцев, а уровень белка iNOS повышен в возрасте 3 месяцев. Как показано в работе (Pautz et al., 2010), такой дисбаланс на уровне экспрессии мРНК и содержании белка мог быть следствием разной активности альтернативных транскриптов.

Снижение генерации и биодоступности NO рассматривается сегодня как проявление старения и, в то же время, как одна из причин изменений в сердечнососудистой, нервной и иммунной системах (Pacher et al., 2007). Нарушения в генерации NO могут приводить к нарушению в регуляции кровотока в хориоидеи, эндотелиальной дисфункции, которым отводится важная роль в развитии ВМД. Ранее двумя независимыми методами было установлено, что в организме крыс OXYS в период развития признаков преждевременного старения продукция NO снижена (исследовалась в возрасте 1,5). Основанием послужило непосредственное измерение его уровня в крови методом ЭПР-спектроскопии спиновых ловушек и содержания в ней стабильных метаболитов NO - нитратов и нитритов (Bobko et al., 2005). В нашем исследовании при оценке системных изменений продукции оксида азота в организме исследованных 3 и 18 месячных животных не было выявлено ни межлинейных различий, ни значимых изменений с возрастом. При сравнении наших результатов с полученными ранее данными оказалось, что межлинейные различия нивелировались за счет снижения показателей у крыс Вистар. Возможно, такие изменения в организме крыс Вистар отражают неблагополучное состояние этой линии в ЦКП «Генофонды лабораторных животных» Института цитологии и генетики СО РАН в настоящее время. При забое животных неоднократно приходилось наблюдать признаки воспалительных процессов в легких.

В целом выявленные нами отличия в экспрессии синтаз оксида азота между крысами OXYS и Вистар не укладываются в представление о существенном вкладе воспаления в патогенез ВМД. Возможно, это связано с характерным для крыс OXYS сужением функциональной активности иммунной системы. Результаты неоднозначны и для оценки вклада изменений транскрипционной активностью генов синтаз оксида азота в развитие ретинопатии у крыс OXYS необходимы дальнейшие исследования.

Результаты данной работы были представлены на 51-й Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс»: Биология, 12-18 апреля 2013 г. в Новосибирске. Тезисы опубликованы в материалах конференции.

Выводы

1. Анализ транскрипционной активности генов nNOS, iNOS и eNOS в сетчатке показал:

· Межвозрастные различия в уровнях мРНК генов NOS отсутствовали;

· уровень мРНК гена iNOS в возрасте 3 и 18 месяцев у крыс OXYS ниже, чем у крыс Вистар;

· межлинейные различия в уровнях мРНК гена nNOS в возрасте 3 месяцев отсутствовали, в 18 месяцев транскрипционная активность nNOS была выше у крыс OXYS;

· Различий в уровнях мРНК гена eNOS в сетчатке крыс OXYS и Вистар не выявлено.

2. В возрасте 3 месяцев содержание белка iNOS в сетчатке крыс OXYS достоверно выше, чем у крыс Вистар.

3. Различий в содержании стабильных метаболитов - нитратов и нитритов - в сыворотке крыс Вистар и OXYS в возрасте 3 и 18 месяцев не обнаружено.

Список литературы

ген азот крыса ретинопатия

1. Аветисова С.Э., Егорова Е.А., Мошетовой Л.К., Нероева В.В., Тахчиди Х.П. Офтальмология: национальное руководство. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2008. 1017 с.

2. Колосова Н., Лебедев П., Фурсова А., Морозкова Т., Гусаревич О. Преждевременно стареющие крысы OXYS как модель сенильной катаракты человека. // Успехи геронтологии. 2003. Т. 12.С. 143-148.

3. Осипов А.Н., Борисенко Г.Г., Владимиров Ю.А. Биологическая роль нитрозильных комплексов гемопротеинов. // Успехи биол. химии. 2007. Т. 47. С. 259-292.

4. Соловьева Н.А., Морозкова Т.С., Салганик Р.И. Получение сублинии крыс с признаками наследственной галактоземии и исследование их биохимических особенностей. // Генетика. 1975. Т.18. №5. С. 63-71.

5. Степанов Ю.М., Кононов И.Н., Журбина А.И. и др. Аргинин в медицинской практике (обзор литературы). // Журн. АМН Украины. 2004. Т. 10. Вып. 1. С. 340-352.

6. Adler A., Messina E., Sherman B. NAD(P) H oxidase-generated superoxide anion accounts for reduced control of myocardial O2 consumption by NO in old Fischer 344 rats. // Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2003. V. 285. P. H1015 - H1022.

7. AldertonW. K., CooperC. E., KnowlesR. G. Nitric oxide synthases: structure, function and inhibition. // Biochem. J. 2001. V. 357. P. 593-615.

8. Bhutto I.A., Baba T., Merges C., Scott McLeod D., Lutty G.A. Low Nitric Oxide Synthases (NOS) in Eyes with Age-related Macular Degeneration (AMD). // Exp. Eye Res. 2009. V. 90. P. 155-167.

9. Bhutto I., Lutty G. Understanding age-related macular degeneration (AMD): Relationships between the photoreceptor/retinal pigment epithelium/Bruch's membrane/choriocapillaris complex. // Mol. Asp. Med. 2012. V. 33. P. 295-317.

10. Bobko A.A., Sergeeva S.V., Bagryanskaya E.G., Markel A.L., Khramtsov V.V., Reznikov V.A., Kolosova N.G. 19F NMR measurements of NO production in hypertensive ISIAH and OXYS rats. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. V.330. P.367-370.

11. Bonilha V.L. Age and disease-related structural changes in the retinal pigment epithelium. // Clin. Ophthalmol. 2008. V. 2. P. 413-424.

12. Brune B., Zhou J. Nitric oxide and superoxide: Interference with hypoxic signaling. // Cardiovasc. Res. 2007.V. 75. P. 275-282.

13. Cau S.B., Carneiro F.S., Tostes R.C. (2012). Differential modulation of nitric oxide synthases in aging: therapeutic opportunities. In: Front. Physiol. DOI: 10.3389/fphys.2012.00218.

14. Cao S., Walker G.B., Wang X., Cui J.Z., Matsubara J.A. Altered cytokine profiles of human retinal pigment epithelium: Oxidant injury and replicative senescence. // Mol Vis. 2013. V. 19. P. 718-728.

15. Cernadas M.R., Sanchez de Miguel L., Garcia-Duran M., Gonzalez-Fernandez F., Millas I., Monton M., Rodrigo J., Rico L., Fernandez P., de Frutos T., Rodriguez-Feo J.A., Guerra J., Caramelo C., Casado S., Farre L. Expression of constitutive and inducible nitric oxide synthases in the vascular wall of young and aging rats. //Circ. Res. 1998. V.83. P. 279-286.

16. Challah M., Nadaud S., Philippe M., Battle T., Soubrier F., Corman B., Michel J.B. Circulating and cellular markers of endothelial dysfunction with aging in rats. // Am. J. Physiol. 1997. V. 273 (Pt 2). P. H1941-H1948.

17. Chen P.F., Wu K.K. Characterization of the roles of the 594-645 region in human endothelial nitricoxide synthase in regulating calmoduling binding and electron transfer. // J. Biol. Chem.2000. V. 275. P. 55-63.

18. Chiou G.C. Review: effects of nitric oxide on eye diseases and their treatment. // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2001. V.17. P. 189-198.

19. Chou T.C., Yen M.H., Li C.Y., Ding Y.A. Alterations of nitric oxide synthase expression with aging and Hypertension in rats. // Hypertension. 1998. V. 31. P. 643-648.

20. Chung H.Y., Sung B., Jung K.J., Zou Y., Y B.P. The molecular inflammatory process in aging. // Antioxid. Redox. Signal. 2006. V. 8. P. 572-581.

21. Chung H.Y., Cesari M., Anton S., Marzetti E., Giovannini S., Seo A.Y., Carter C., Yu B.P., Leeuwenburg C. Molecular inflammation: Underpinnings of aging and age-related diseases. // Ageing Research Rev. 2009. V. 8. P.18-30.

22. Corso-Diaz X, Krukoff T.L. nNOS-alpha and nNOS - beta localization to aggresome-like inclusions is dependent on HSP-90 activity. // J. Neurochem. 2010. V. 114. P. 864-887.

23. Csiszar A., Ungvari Z., Edwards J.G. Aging-induced phenotypic changes and oxidative stress impair coronary arteriolar function. // Circ. Res. 2002. V. 90. P. 1159-1166.

24. Csiszar A., Ungvari Z., Koller A., Edwards J.G., Kaley G. Proin?ammatory phenotype of coronary arteries promotes endothelial apoptosis in aging. // Physiol. Genomics. 2004. V. 17. P. 21-30.

25. Csiszar A., Podlutsky A., Wolin M.S., Losonczy G., Pacher P., Ungvari Z. Oxidative stress and accelerated vascular aging: implications for cigarette smoking. // Front Biosci. 2009. V. 14. P. 3128-3144.

26. Culotta V.C., Klomp L.W., Strain J., Casareno R.L., Krems B., Gitlin, J.D. The copper chaperone for superoxide dismutase. // J. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 23469-23472.

27. Delp M.D., Behnke B.J., Spier S.A., Wu G., Muller-Delp J.M. Aging diminishes endothelium-dependent vasodilatation and tetrahydrobiopterin content in rat skeletal muscle arterioles. // J. Physiol. 2008. V. 586. P. 1161-1168.

28. Denis M. Interferon-gamma-treateated murine macrophages inhibit growth of tuberclebacilli via the generation of reactive nitrogen intermediates. // Cell Immunol. 1991. V. 132. P. 150-157.

Размещено на Allbest.ru