Из биохимических тестов диагностическое значение имеет определение сывороточного витамина В₁₂. В настоящее время для определения содержания витамина В₁₂ повсеместно используется радиоиммунологический метод. Обычно исследуют одновременно уровень витамина В₁₂ и фолиевой кислоты в сыворотке крови. Нормальное содержание витамина В₁₂ в сыворотке 200-1000 пг/мл, при заболевании - снижается до 10 - 150 пг/мл [Руководство по гематологии, 2005].

Но следует помнить, что уровень витамина В₁₂ в плазме крови не отражает потенциально существующей недостаточности данного витамина в тканях. Примерно треть пациентов, у которых уровень витамина В₁₂ находился на нижней границе нормы, страдают анемией и неврологическими симптомами. Более надежным индикатором наличия недостаточности витамина В₁₂ являются уровни метилмалоновой кислоты и гомоцистеина в сыворотке крови. Витамин В₁₂ является кофактором в метаболизме этих веществ. Поэтому при его недостаточности уровень этих соединений в крови повышен. При этом нормальная концентрация метилмалоновой кислоты и гомоцистеина практически исключают недостаточность витамина В₁₂.

В отличие от недостаточности витамина В12, недостаточность фолиевой кислоты обычно является результатом ее неадекватного потребления в пищевом рационе. У 90 процентов пациентов с недостаточностью фолиевой кислоты наблюдается повышенный уровень гомоцистеина. При этом уровень метилмалоновой кислоты остается нормальным, что является существенным фактором в дифференциальной диагностике с анемией, вызванной недостаточностью витамина В12 [Руководство по гематологии, 2005; Гринфельд, 2008]. В диагностике апластической анемии при биохимическом анализе крови выявляется повышенное содержание сывороточного железа, увеличение насыщения трансферрина. Повышение активности печеночных ферментов и содержания билирубина может наблюдаться при апластических анемиях, связанных с наличием у больного острого или хронического гепатита. Серповидно-клеточная анемия, одна из форм гемоглобинопатий, специфических биохимических маркеров не имеет, отмечается лишь умеренное содержание непрямого билирубина.

В настоящее время считается, что в основе анемии хронических заболеваний лежит иммуно-опосредованный механизм: цитокины и клетки ретикулоэндотелиальной системы вызывают изменения в гомеостазе железа, пролиферации эритроидных предшественников, продукции эритропоэтина и продолжительности жизни эритроцитов [Копылов, Щекочихин, 2011].

Открытие гепсидина (hepcidin) - железорегулирующего острофазового белка - позволило во многом прояснить связь между иммунным механизмом нарушения гомеостаза железа и развитием анемии хронических заболеваний: именно через усиление синтеза в печени гепсидина под влиянием воспалительных стимулов происходят снижение всасывания железа в кишечнике и блокирование высвобождения железа из макрофагов.

В этих случаях спектр биохимических исследований будет включать и функциональные характеристики соответствующих систем организма. При подозрении на патологию почек - необходимо исследование сыворотки крови на мочевину и креатинин.

2. Материал и методы исследований

2.1 Характеристика материала исследования

Планируется исследование пациентов в условиях лаборатории городской поликлиники, планируется определение показателей, характеризующих различные анемические состояния.

Для анализа будет использоваться периферическая кровь человека, которую берут путем прокола пальца стерильным скарификатором. Кровь с поверхности пальца набирается индивидуальным стерильным капилляром Панченкова. Под общим анализом крови подразумевается совокупность тестов по определению количества эритроцитов и лейкоцитов, а также характеристика эритроцитов и их распределения в соответствии с размером. Дополнительно исследуются количество тромбоцитов и ретикулоцитов.

В диагностике анемий исследование мазка периферической крови имеет решающее значение. Особенно, если удается выявить специфические нарушения морфологии эритроцитов, а также изменения структуры и количества лейкоцитов и тромбоцитов. Исследование мазка периферической крови нередко позволяет установить окончательный диагноз или значительно сузить выбор из возможных нозологических форм, для разграничения которых надо использовать дополнительные исследования. Для этого на предметном стекле готовится тонкий мазок крови, в котором, после соответствующей окраски, осуществляется подсчет лейкоцитарной формулы.

Для исследования биохимических параметров необходима кровь, взятая посредством венепункции (обычно локтевой вены).

При проведении исследования особые требования предъявляются к технике взятия крови, поскольку неизбежное при этом разрушение эритроцитов и увеличение содержания в сыворотке свободного гемоглобина может оказать существенное влияние на результаты.

2.2 Методы исследований

2.2.1 Определение СОЭ

Обработка крови начинается с разведения для определения СОЭ, так как для этого исследования требуется небольшое количество крови. Измеряется скорость оседания клеток крови в калиброванном капилляре в течение часа.

Для определения СОЭ в капилляр, промытый в реактиве (пятипроцентный раствор трехзамещенного цитрата натрия), набирается кровь до метки "0" (100 делений) и выдувается в пробирку с раствором цитрата натрия (соотношения крови и реактива 4:1).

При повышении уровней фибриногена и глобулинов сыворотки крови способствует соединению эритроцитов в виде монетных столбиков и их быстрому осаждению.

2.2.2 Подсчет числа эритроцитов

Количественно анемия выражается снижением числа эритроцитов в единице объема.

Для подсчета эритроцитов кровь объемом 20 мкл выдувается на дно пробирки с 4 мл изотонического раствора (0,9 процентный раствор NaCl), и пипетка несколько раз промывается в верхнем слое жидкости (разведение 1:200). Эритроциты подсчитываются унифицированным методом под микроскопом в камере Горяева. Трактовка пониженного количества эритроцитов служат основой для дифференцировки разных видов анемий.

2.2.3 Определение уровня гемоглобина

Унифицированная гемоглобин-цианидная методика определения гемоглобина основана на окислении Hb в метгемоглобин железосинеродистым калием. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию Hb.

Ход определения: в пробирку к 5 мл трансформирующего раствора (ацетон-циангидрин - 0,5 мг, калий железосинеродистый - 0,2 г, натрия гидрокарбонат - 1 г, дистиллированная вода - до 1 л) добавляется 20 мкл крови (разведение 1:251); содержимое пробирки тщательно перемешивается и оставляется стоять на 10 мин.

Степень снижения концентрации гемоглобина - железосодержащего пигмента эритроцитов, придающего крови красный цвет, характеризует выраженность анемии.

2.2.4 Определение цветового показателя

Среднее содержание гемоглобина в эритроците обозначается величиной МСН, которая рассчитывается по формуле:

МСН = [Нв] : эритроциты,

где МСН - среднее содержание гемоглобина в эритроцитах, пг (пикограмм), 10^-12 г,

[Нв] - содержание гемоглобина, г/л,

Эритроциты - содержание эритроцитов в 10¹²/л.

Величина MCH отражает среднее содержание гемоглобина в эритроците, и по ней можно судить о характере анемии, но все же учитывая и другие показатели. Нормы этого показателя являются одинаковыми, как для мужчин, так и для женщин и составляют 27-34 пг.

Цветовой показатель (ЦП) - рассчитывается по формуле

ЦП = (Нв х 3) : эритроциты 10^-10,

где Нв - содержание гемоглобина, г/л,

эритроциты - содержание эритроцитов в 10¹²/л.

Для пересчета цветового показателя в МСН цветовой показатель должен быть умножен на коэффициент 33,3.

MCV - средний объем эритроцитов. Рассчитывается по формуле:

MCV = (Ht х 10) : эритроциты

По цветовому показателю анемии делят:

- Нормохромные;

- Гипохромные;

- Гиперхромные.

2.2.5 Определение гематокрита

Гематокрит - это соотношение объёмов форменных элементов и плазмы крови.

Для определения гематокрита гематокритная трубочка заполняется кровью и центрифугируется, после чего отмечается, какую её часть занимают форменные элементы крови (эритроциты, лейкоциты, тромбоциты).

Гематокрит (Ht) выражается в процентах к общему объему крови (тогда он обозначается в процентах), или в литрах на литр (л/л) -- тогда он обозначается десятичной дробью (с точностью до сотых), соответствующей доле форменных элементов в 1 литре крови (450 мл клеток в 1 литре крови равняется 0,45 л/л равняется 45 процентам). В норме величина гематокрита для мужчин составляет 41-51 процентов, для женщин 35-45 процентов.

2.2.6 Подсчет количества лейкоцитов

Для подсчета количества лейкоцитов кровь объемом 20 мкл выдувается на дно пробирки с реактивом (раствор уксусной кислоты 3-5%-ный, 0,4 мл), и капилляр несколько раз промывается в верхнем слое жидкости (разведение 1:200). Далее лейкоциты подсчитываются в камере Горяева.

Трактовка пониженного или повышенного количества клеток служат основой для дифференцировки заболеваний крови, в том числе анемий.

2.2.7 Исследование мазка крови

Просмотр мазка крови используется на предмет поиска клеток (эритроцитов, лейкоцитов) с аномальными размерами, цветом, формой, включениями.

Для подсчета лейкоцитарной формулы, исследования морфологии эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов готовятся препараты. Капля крови наносится на сухое обезжиренное предметное стекло и готовятся тонкие мазки с помощью шлифовального стекла. При приготовлении мазков не должно возникать артефактов. Морфологию эритроцитов лучше изучать в той части мазка, где они расположены в один слой и лишь соприкасаются друг с другом. Просмотр мазков ведется под микроскопом (марка "Ломо микмед 6")

Результат интерпретации просмотренных мазков крови подводит к объяснению причин анемии: дефицит, гемолиз, воспаление и прочее.

2.2.8 Подсчет ретикулоцитов

Метод основан на РНК-специфической окраске мазка крови метиленовым синим.

Подсчет ретикулоцитов имеет особенно важное значение при диагностике гемолитических анемий, а также в оценке эффективности проводимой терапии при В₁₂-дефицитной анемии.

2.2.9 Определение среднего объема клетки (эритроцита)

По среднему объему эритроцита (СОК) также можно с определенной вероятностью судить о характере анемии. Этот параметр особенно важен для оценки гипопролиферативных анемий (т.е. с низким содержанием ретикулоцитов).

Если: СОК меньше 80 мкм³ - микроцитарная анемия,

80 мкм³ меньше либо равно СОК меньше 100 мкм³ - нормоцитарная анемия,

СОК больше либо равно 100 мкм³ - макроцитарная анемия.

Для правильной интерпретации среднего объема клетки (то есть эритроцита) необходимо исследование мазка периферической крови, поскольку:

- одновременное наличие клеток малого и большого объема создает представление о нормальном размере эритроцитов;

- включение в подсчет ретикулоцитов, имеющих большие размеры, чем зрелые эритроциты, ведет к завышению СОК;

- эритроидные клетки аномальных размеров могут присутствовать в столь малом количестве, что не влияют на вычисляемый СОК.

В гематологических анализаторах количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, гематокрита, MCV и MCH определяются автоматически.

2.2.10 Определение метаболизма железа

Диагноз ЖДА предварительно устанавливают при сниженном уровне гемоглобина и низком цветовом показателе, на фоне типичных для железодефицитных симптомов (слабость, головокружение, повышенная утомляемость, трофические нарушения).

Но важнейшим показателем ЖДА является снижение уровня железа сыворотки (норма - 13-28 ммоль/л для мужчин; 11-26 ммоль/л для женщин), снижение концентрации ферритина, а также повышении уровня общей железосвязывающей способности сыворотки. ОЖСС -- биохимический лабораторный показатель, характеризующий общее количество железа, которое может связаться с имеющимся в плазме трансферрином. Косвенно отражает количество трансферрина в плазме. Нормальные значения общей железосвязывающей способности сыворотки - 40,6-62,5 мкмоль/л.

Норма ферритина в крови для взрослых мужчин - 20-250 мкг/л. Для женщин норма анализа крови на ферритин - 10-120 мкг/л.

Информативным показателем оценки метаболизма железа является коэффициент насыщения трансферрина железом, который рассчитывается по формуле:

Насыщение трансферрина железом (%) = Железо (мкг/дл) : [Трансферрин (мг/дл) х 1,41] х 100 %

При железодефицитной анемии этот показатель снижается (менее 15 процентов), а при перегрузке железом значительно повышается (более 50 процентов).

Предпочтительнее для анализа использовать утренний образец крови, поскольку уровень железа в крови колеблется в течение суток. Пункция вены должна быть проведена с минимальным застоем крови, кровь должна свободно поступать в пробирку. Кровь для определения железа необходимо собирать в герметично закрытые пробирки.

Из многочисленных методов количественной оценки содержания железа в сыворотке крови наибольшее распространение получили методы определения железа по цветной реакции с батофенантролином. В основе этих методов лежит свойство двухвалентного восстановленного железа (Fe²⁺) образовывать яркоокрашенный комплекс с батофенантролином. Интенсивность окраски комплекса, соответствующую концентрации Fe²⁺ в сыворотке, определяют фотометрически. Предварительно белки сыворотки крови осаждают трихлоруксусной кислотой и восстанавливают сывороточное железо в двухвалентную его форму (Fe³⁺ в Fe²⁺) с помощью гидразина или тиогликолевой кислоты.

2.2.11 Определение уровня билирубина

Большинство используемых биохимических методов определения билирубина в крови основаны на реакции диазосочетания [Лабораторная диагностика анемий, 2001; Клиническое руководство … , 2003]. В этой реакции диазотированная сульфаниловая кислота реагирует с билирубином с образованием двух азопигментов - с красновато-фиолетовой окраской при нейтральном pH, и синей - при высоких значениях pH. Диазотирующий метод обеспечивает получение воспроизводимых и надежных результатов. В этой процедуре "акселераторами" служат водный раствор кофеина и бензойнокислого натрия.

Билирубин в сыворотке обычно определяют в виде общего и прямого билирубина (Билирубин конъюгированный, связанный; Bilirubin direct).

Путем вычитания прямого из общего количества определяют концентрацию непрямого билирубина (или неконъюгированного, или свободного билирубина).

При определении прямого билирубина реагирует с диазореактивом большая часть д-билирубина и конъюгированного билирубина и небольшая часть неконъюгированного билирубина. Высокое значение рН ускоряет вступление в реакцию неконъюгированного билирубина при определении прямого билирубина; реактив для прямого билирубина должен содержать, по крайней мере, 50 ммоль/л HCI, чтобы предотвратить вступление в реакцию неконъюгированного билирубина.

Добавление в реакционную среду соединений, разрушающих водородные связи в молекуле билирубина (кофеина, метанола, этанола, мочевины или поверхностно активных соединений), необходимо для реакции неконъюгированного билирубина с диазотирующим реактивом.

С помощью реакции Ван-ден-Берга можно отличить прямой билирубин от непрямого. Если реакцию проводят в водной среде, с диазореактивом Эрлиха соединяется только растворимый прямой билирубин (положительная прямая реакция). При обработке метанолом происходит разрыв водородных связей в молекуле непрямого билирубина, и в реакцию вступают как прямой, так и непрямой билирубин, что позволяет определить их суммарную концентрацию, то есть общий билирубин. Уровень непрямого билирубина определяют так же, как разность между концентрациями общего и прямого билирубина. Однако результаты исследования зависят от времени, в течение которого ставится прямая реакция. Если оно превышает одну минуту, небольшая часть непрямого билирубина связывается с реактивом и уровень прямого билирубина оказывается завышенным. Поэтому реакцию Ван-ден-Берга можно использовать лишь для приблизительного определения уровня прямого и непрямого билирубина.

При гипербилирубинемии прямой билирубин накапливается в эластической ткани, глазном яблоке, мукозных мембранах и коже, что вызывает характерное желтушное окрашивание.

Оптимальным для исследования параметров, характеризующих метаболизм железа, пигментный обмен, а также других биохимические процессы, является выполнение его с использованием биохимического анализатора. Биохимический анализатор - прибор, использующий для клинических и химических исследований различные механические и компьютерные технологии. С их помощью возможно определение наличия и концентрации электролитов, ферментов, липидов, специфических белков, гормонов и пр. в практически любых видах биологического материала.

Заключение

Анемия стала насущной проблемой для большого числа людей по всему миру. Она поражает особенно уязвимые слои населения - детей младшего возраста, беременных женщин, пожилых людей и лиц, страдающих серьезными хроническими заболеваниями.

Анемии - группа заболеваний (или состояний), характеризующихся снижением содержания гемоглобина в единице объема крови, чаще при одновременном уменьшении количества эритроцитов. Наличие клинических симптомов анемии требует тщательного разностороннего лабораторного обследования.

Для диагностики анемий используются как рутинные лабораторные исследования, доступных к выполнению в условиях любой лаборатории, так и более трудоемкие методики.

Начальный этап диагностического поиска (определение гемоглобина, общего числа эритроцитов и изучение их морфологии) нацеливает на патогенетический вариант анемии, то есть основной механизм, который обусловил снижение уровня гемоглобина. Для выявления причины и дифференциальной диагностики требуются дополнительные исследования, важнейшими из которых являются биохимические методы.

Следующий этап диагностики и дифференциального диагноза - прерогатива лечащего врача.

По результатам проделанной работы сделаны следующие выводы:

1. Была изучена литература по теме: "Биохимические показатели при острых и хронических анемиях". Изложена классификация анемий, выделены причины развития тех или иных анемических состояний.

2. Лабораторные исследования являются непременным условием диагностики анемий и должны включать в себя, помимо изучения параметров гемограммы, дополнительные биохимические методы.

3. Число определяемых показателей является очень важным критерием. Чем больше число определяемых показателей, тем больше диагностической информации получает врач и, следовательно, выше эффективность лечебно-диагностического процесса.

4. В части случаев определение патогенетического варианта анемии возможно на основании комплекса рутинных лабораторных исследований, доступных к выполнению в условиях любой лаборатории.

Библиографический список

1. Антонов В.С., Богомолова Н.В., Волков А.С. Автоматизация гематологического анализа. Интерпретация показателей гемограммы. Саратов, 2008.

2. Аркадьева Г.В. Диагностика и лечение железодефицитных анемий. М., 1999. 59 с.

3. Афанасьев Ю.И.. Гистология, цитология и эмбриология. М., 2002. 744 с.

4. Воробьев А.И. Руководство по гематологии: В 2 т. М., 1985.

5. Воробъев П.А. Анемический синдром в клинической практике. М., 2001. 217 с.

6. Внутренние болезни / под. ред. Г. И. Бурчинского. Киев, 2000. 656 с.

7. Гемолитическая анемия. /Румянцева Ю.В. и др. Терапевтический архив. 2003, № 7. С.78 - 81.

8. Глушен С.В. Цитология и гистология. Курс лекций. Минск, 2003. 232 с.

9. Гольдберг Е.Д. Справочник по гематологии. М., 2000. 287 с.

10. Городецкий В.В., Годулян О.В. Железодефицитные состояния и железодефицитная анемия: лечение и диагностика. М., 2004. С. 1 - 28.

11. Гринфельд Е.С. Анемия у людей пожилого возраста / Рус. Мед. журнал. 2008, № 29. С. 1944 - 1949.

12. Дворецкий Л.И. Гипохромные анемии / Гематология. 2001. Т.3. N9.

13. Дворецкий Л.И. Анемии: стратегия и тактика диагностического поиска. Справочник поликлинического врача, т.2. 2002, №6. С.65 - 78.

14. Дворецкий Л.И. Алгоритмы диагностики и лечения анемий / Рус. Мед. журнал. 2003, № 11 (8). С. 427 - 433.

15. Дворецкий Л.И. Железодефицитная анемия в практике терапевта / Рус. Мед. журнал. 2009, № 23. С. 1517 - 1522.

16. Дворецкий Л.И., Воробьев П.А. Дифференциальный диагноз и лечение при анемическом синдроме. М., 1994. 24 с.

17. Ершова А.К. Этиология, патогенез и лечение железодефицитной анемии. Рус. Мед. журнал. 2011, № 12. С. 790 - 795.

18. Железодефицитная анемия беременных /Н.М. Подзолкова и др. Рус. Мед. Журнал. 2003; № 11(5). С. 326 - 331.

19. Клиническое руководство по лабораторным тестам / под ред. проф. Н Тица. М., 2003.

20. Копылов Ф.Ю., Щекочихин Д.Ю. Анемии при хронической сердечной недостаточности / Рус. Мед. журнал. 2011, № 7. С. 440-445.

21. Коровина Н.А. Железодефицитные анемии у детей / Н.А. Коровина, А.Л. Заплатников, И.Н. Захарова. - М., 1998. 210 с.

22. Лабораторная гематология / С.А. Луговская и др. М., 2006. 216 с.

23. Лабораторная диагностика анемий (пособие для врачей) / В.В.Долгов и др. Изд-во "Губернская медицина", 2001. 82 с.

24. Методики клинических лабораторных исследований в 3 т. / под ред. В.В. Меньшикова. Т. 1. М., 2008. 312 с.

25. Митерев Ю.Г. Воронина Л.Н. Железодефицитные анемии и состояния (диагностика, лечение, профилактика). Клиническая медицина. 1992. №7-8. С. 19 - 25.

26. Михайлова Е. Апластическая анемия / Врач. 2001, № 12. С. 18-21.

27. Назаренко Г.И., Кишкун А.А. Клиническая оценка результатов лабораторных исследований. М., 2002. 298 с.

28. Постникова С.Л., Малышева Н.В., Касатова Т.Б. Клинические рекомендации по коррекции железодефицита у различных групп пациентов / Рус. Мед. журнал. 2010, № 30 (18). С. 1843-1848.

29. Птушкин В.В. Дискуссионные вопросы применения эритропоэтинов в лечении анемии у пациентов с опухолевыми заболеваниями / Онкогематология. 2007, № 2. С. 31-36.

30. Российские Национальные Рекомендации по диагностике и лечению анемии при хронической болезни почек / Анемия. 2006, № 3. С. 3-18.

31. Руководство по гематологии: В 3 т. Т.3/Под ред. А.И.Воробьева. М., 2005. 416 с.

32. Румянцев А.Г., Тарасова И.С., Чернов В.М. Эпидемиологические аспекты анемий у детей и подростков / Анемия. Журнал Рабочей Группы по Анемии. 2006, № 1 - 2. С. 3 - 6.

33. Садовникова И.И. Железодефицитная анемия: патогенез, диагностический алгоритм и лечение / Рус. Мед. журнал. 2010, № 9. С. 940 - 944.

34. "Старые" и "новые" опухоли лимфатической системы / Воробьев А.И. и др. Терапевтический архив. 2001, № 7, С. 9 - 13.

35. Тайпурова А.М Серия: "Ex Libris". Журнал акушерства и женских болезней. М., 2008. 36 с.

36. Хоффбранд В., Петтит Дж. Гематология. Атлас-справочник / пер.с англ. М., 2007. 408 с.

37. Цветкова О.А. Медико-социальные аспекты железодефицитной анемии / Рус. Мед. журнал. 2009, № 5. С. 387-393.

38. Цветной атлас клеток системы крови. Один источник и четыре составные части миелопоэза. / И.М.Погорелов, Г.И. Козинец и др. М., 2007. 175 с.

39. Шиффман Ф.Д. Патофизиология крови / пер. с англ. М, 2007. 448 с.

40. Шулутко Б. И., Макаренко С.В. Стандарты диагностики и лечения внутренних болезней. СПб., 2005. 584 с.

41. WHO/NHD. Iron Deficiency Anaemia. Assessment, Prevention and Control: A guide for programme managers, 2001. WHO/NHD. Iron Deficiency Anaemia. Assessment, Prevention and Control: A guide for programme managers, 2001.

Размещено на Allbest.ru