Медицинские диагностические препараты

Аллергены, являясь диагностическими препаратами, также подвергаются исследованиям с целью определения их качественных и количественных показателей. Наиболее часто в качестве аллергенов используют для аллергической диагностики бруцеллеза -- бруцеллин, туберкулеза -- туберкулин, сапа -- маллеин. Каждую приготовленную серию аллергенов проверяют на отсутствие механических примесей, внешний вид препарата, правильность упаковки, стерильность, безвредность, специфичность и активность.

Стерильность указанных аллергенов проверяют высевами из трех ампул или флаконов на питательные среды, элективные для аэробов, анаэробов и грибов. Посевы должны оставаться стерильными в течение десяти суток.

Безвредность бруцеллина, туберкулина, маллеина проверяют на белых мышах массой 18--25 г, путем подкожного введения им препарата в области спины, иногда паха. Аллергены считаются безвредными, если все животные остаются клинически здоровыми и в течение десяти суток наблюдения у них на месте инъекции нет воспалительных реакций.

Технология определения специфичности и активности указанных аллергенов имеет свои особенности.

Специфичность каждой серии бруцеллина проверяют на здоровых морских свинках белой масти массой 350--400 г. Препарат вводят вкутрикожно в дозе 0,1 мл в выбритый участок боковой поверхности туловища. Одновременно вводят таким же способом референс-препарат в дозе 200 единиц активности (ЕА). Бруцеллин считают специфичным, если он не вызывает аллергической реакции у здоровых животных через 24 и 48 часов после введения.

Кроме того, на специфичность и отсутствие агглютинирующих свойств каждую десятую серию бруцеллина проверяют на здоровых, не привитых против бруцеллеза овцах. Им вводят аллерген под кожу нижнего века в дозе 0,5 мл и внутрикожно в подхвостовую складку в дозе 0,2 мл. Одновременно в другую подхвостовую складку вводят стандартный бруцеллин в дозе 400 ЕА. Реакцию учитывают через 48 часов. Препарат считается специфичным, если он не вызывает аллергических реакций на месте его введения. Через 10-- 15 суток после введения бруцеллина у овец берут кровь и с ее сывороткой ставят РА и РСК с бруцеллезным антигеном. Они должны быть отрицательными.

Активность бруцеллина определяют на 10--15 сенсибилизированных бруцеллами различных видов морских свинках весом 350-- 400 г. Через четыре недели после прививки морским свинкам вводят внутрикожно испытуемый бруцеллин и референс-препарат а дозе 200 ЕА в объеме 0,1 мл. Если бруцеллин активен, то через 24 часа после введения бруцеллинов на месте их введения появляется аллергическая реакция в виде отечного воспаления и гиперемии кожи (Шумилов К. В., Климанов А. И., Малахова Т. И., 1981). Активность туберкулинов на содержание международных единиц (ME) определяют в сравнении испытуемой серии с референс-препаратами на сенсибилизированных морских свинках. [9, 14]

7. Моноклональные антитела

Антитела строго специфичны и способны выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул. В результате сложной антигенной структуры многих микроорганизмов при иммунном ответе на них в организме образуются высокогетерогенные (неоднородные) антитела, то есть в сыворотке будет содержаться смесь антител. Последние продуцируются разными линиями В-лимфоцитов и направлены к различным детерминантам антигена. Если бы определенную линию лимфоцитов удалось выделить и культивировать вне организма, как культуры клеток, то полученный клон лимфоцитов продуцировал бы однородный тип антител -- моноклональные антитела. В иммунологии такая идея возникла давно. Но, к сожалению, антителобразующие лимфоциты плохо растут в культуре и зачастую отмирают. В то же время клетки злокачественной опухоли костного мозга, миеломы, обладая способностью к неограниченному росту, интенсивно продуцируют иммуноглобулины, идентичные между собой по структуре. То есть по сути это моноклональные антитела к неизвестному нам антигену.

Ученые давно стремились на основании гибридомной технологии получить такие клоны гибридных клеток, которые бы сочетали энергию размножения миолемных клеток с высокой продукцией антител лимфоцитов, то есть, чтобы они постоянно продуцировали моноклональные антитела.

Первые успехи в данном направлении были достигнуты английскими учеными: Келлером и Милстейном (1975). Они получили в результате слияния, клеток миеломы РЗ и лимфоцитов из селезенки мышей, иммунизированной эритроцитами в присутствии полиэтиленгликоля, гибридные клетки, которые при культивировании в селективной среде продуцировали, иммуноглобулины только к эритроцитам. Такие клетки-химеры или гибридомы будучи полученными путем слияния антителобразующих лимфоцитов и опухолевых клеток, наследовали способность к неограниченному росту в культуре клеток и в то же время к продукции антител определенной специфичности (моноклональных антител).

Но следует иметь в виду, что после слияния клеток двух личных линий образуется клон, антитела, которые он образует, необязательно сразу будут моноклональными в иммунологическом смысле, так как в каждой клетке гибридного клона вначале присутствуют хромосомы обеих родительских клеток. Экспрессия этих хромосом ведет к продукции как селезеночных, так и миеломных иммуноглобулинов. Однако на ранних стадиях размножения гибридных клеток они быстро утрачивают часть хромосом. Важным при этом является выделить клоны клеток, потерявших хромосомы, присущие миеломе, но сохранившие хромосомы иммунных лимфоцитов. То есть выделяют те клоны клеток, которые синтезируют только тяжелые и легкие цепи иммуноглобулинов к заданному антигену.

После открытия Келлера и Милстейна, признанного одним и важнейших за период с 1970 по 1980 годы, в мире стали, проводиться работы по получению моноклональных антител к различным по природе антигенам с помощью гибридомных клеток. Так, Л. П. Дьяконову с сотрудниками в течение 1982--1995 годов удалось получить новые мутантные клетки, осуществить их гибридизацию с лимфоцитами и другими не растущими в культуре ткани клетками (энтероцитами и др.). Получение культур клеток открывает широкую перспективу иммунологических исследований, по получению вида и типоспецифических моноклональных антител к различным возбудителям заболеваний. При мечении моноклокальных антител флуорохромами и ферментами появляется возможность широко использовать моноклональные антитела их при диагностике бактерийных, грибковых и вирусных заболеваний с применением РИФ и ИФА.

Например, сотрудниками Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных совместно с МНИИ фтизиатрии и пульмонологии Минздравмедпрома России получены моноклональные антитела, специфично взаимодействующие с поверхностными антигенами микобактерий туберкулеза бычьего вида. Ими разработана иммуноферментная тест-система для проведения идентификации микобактерий туберкулеза бычьего вида и дифференциация их от микобактерий человеческого вида и атипичных, медленно растущих микобактерий. Полученные данные свидетельствуют о высокой специфичности моноклональных антител и корреляции результатов, полученных методами ИФА и общепринятыми бактериологическими методами исследований. В то же время иммуноферментный, метод является высоковоспроизводимым, требует для обнаружения антигена малое количество микробной массы и, самое главное, он непродолжителен, что позволяет оперативно принимать меры по оздоровлению выявленных неблагополучных по туберкулезу пунктов.

В диагностике вирусных болезней животных весьма перспективным является получение моноклональных антител на основе гибридомной технологии. Ценность этого метода заключается в том, что гибридомные линии клеток можно хранить в замороженном состоянии, поэтому для научных и практических целей создаются гибридомные банки.

Кроме диагностических целей, моноклональные антитела могут использоваться для определения доз лекарственных препаратов, для выявления в пищевых продуктах аллергенов, для выявления у больных злокачественных опухолей. С помощью моноклональных антител возможно также выделение из сложных смесей биологически активных веществ (белков, гормонов, токсинов). [16, 19]

8. Молекулярная диагностика

Успехи современной медицины и сельского хозяйства часто зависят от того, удается ли обнаруживать специфические вирусы, бактерии, грибы, паразитические микроорганизмы, белки и низкомолекулярные соединения в организме человека или животных, в растениях, воде или почве. Например, профилактику и лечение любого инфекционного заболевания значительно облегчает ранняя и точная идентификация вызвавшего его патогенного микроорганизма. Для проведения многих диагностических процедур необходимо сначала вырастить культуру потенциально патогенного микроорганизма и лишь затем проанализировать спектр его физиологических свойств. Хотя подобные тесты весьма эффективны и обладают достаточно высокой специфичностью, они часто занимают много времени и являются дорогостоящими. Это относится к идентификации и бактерий, и паразитических микроорганизмов. Кроме того, весьма ограничена возможность выявления тех патогенных микроорганизмов, которые плохо растут в культуре либо вообще не поддаются культивированию. В качестве примера можно привести облигатных внутриклеточных паразитов Chlamydia trachomatis, которые вызывают хламидиоз, болезнь, передающуюся половым путем и распространенную в Северной Америке и Европе. Хламидиоз трудно диагностировать, поскольку для этого необходима перевиваемая культура клеток. При этом часто получают ложноотрицательные результаты (т. е. ошибочно диагностируют отсутствие микроорганизма), в результате чего не проводится адекватное лечение. Безусловно, если для выявления микроорганизма необходимо выращивать его в культуре, то рутинной может стать идентификация, лишь нескольких из всех известных патогенных микроорганизмов. Чтобы устранить это принципиальное ограничение, были разработаны методы молекулярной диагностики, в основе которых лежат иммунологические подходы или методы обнаружения специфической ДНК.

Любой метод выявления патогенных микроорганизмов должен быть достаточно простым и обладать высокой специфичностью и чувствительностью. Специфичный диагностический тест должен давать положительный ответ только на микроорганизм или молекулу-мишень, чувствительный -- обнаруживать очень малые количества такой мишени даже на фоне других микроорганизмов или молекул, загрязняющих образец. Простота метода подразумевает, что он является достаточно продуктивным, эффективным и недорогим для рутинного применения.

По оценкам специалистов, объем мирового рынка иммунодиагностических тестов в 1993 г. составил 3,4 млрд. долл. США и в ближайшие 10--15 лет будет возрастать на 5--10% ежегодно. В 1994 г. объем мирового рынка ДНК-диагностических тестов был равен примерно 80 млн. долл., к 2000 г. он, по-видимому, составит 600 млн. долл., а к 2004 г. -- 2 млрд. долл. [1, 7]

8.1 Методы иммунодиагностики

Многие иммунологические системы детекции обладают высокой чувствительностью и специфичностью, являясь в то же время достаточно простыми. Они широко используются для тестирования лекарственных препаратов, оценки и мониторинга различных онкологических заболеваний, определения специфических метаболитов, идентификации и контроля патогенных микроорганизмов, но имеют и свои ограничения. Если молекулой-мишенью является белок, то необходимо обеспечить экспрессию детерминирующих его генов и создать условия, в которых не происходит маскирование или блокирование сайта связывания с антителом. Традиционные процедуры диагностики возбудителей инфекции опираются либо на набор характеристик патогенного микроорганизма, либо, что предпочтительнее, на одну уникальную, легко различимую его особенность. Клинические микробиологи пытаются найти тот минимальный набор биологических характеристик, при помощи которого можно будет гарантированно обнаруживать и идентифицировать патогенные микроорганизмы. Например, некоторые возбудители вырабатывают специфические биохимические соединения, которые и необходимо обнаружить в биологическом образце. Часто подобную маркерную молекулу можно выявить непосредственно, проведя высокоспецифичный биохимический анализ. Но такой подход неизбежно приведет к увеличению числа индивидуализированных систем детекции патогенных микроорганизмов. Более предпочтительным был бы универсальный метод, позволяющий выявлять любую маркерную молекулу независимо от ее химической природы. Именно таким является метод, основанный на идентификации комплексов антиген-антитело.

Ферментный иммуносорбентный анализ. Существует целый ряд подходов, позволяющих определить, произошло ли связывание антитела с антигеном-мишенью. Один из них -- это ферментный иммуносорбентный анализ (ELISA), который часто используют для диагностики. Процедура включает следующие этапы (рис. 3).

1) Образец, в котором хотят обнаружить специфическую молекулу или микроорганизм, фиксируют на твердой подложке, например на пластиковой микротитровальной плашке, обычно имеющей 96 лунок

2) К фиксированному образцу добавляют антитело, специфичное к маркерной молекуле (первое антитело), затем промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы первого антитела

3) Добавляют второе антитело, которое специфически связывается с первым антителом и не взаимодействует с маркерной молекулой. К этому антителу присоединен фермент (например, щелочная фосфатаза, пероксидаза или уреаза), катализирующий превращение неокрашенного субстрата в окрашенный продукт. Промывают лунку, чтобы удалить несвязавшиеся молекулы конъюгата второе антитело-фермент.

Рисунок 3 - Обнаружение антигена-мишени с помощью ELISA. Е--фермент, присоединенный ко второму антителу.

Если первое антитело не связывается с мишенью образца, то оно удаляется при первом промывании. Поскольку при этом конъюгату второе антитело--фермент не с чем связываться, он удаляется при втором промывании, и образец остается неокрашенным. Если связывание с мишенью происходит, то второе антитело присоединяется к первому, и конъюгированный фермент катализирует образование легко регистрируемого окрашенного продукта.

Основной принцип ELISA -- специфическое связывание первого антитела с мишенью. Если молекула-мишень представляет собой белок, то его очищенный препарат обычно используют для получения антител, при помощи которых затем и выявляют данную мишень. Антитела, которые образуются в сыворотке (антисыворотке) крови иммунизированного животного (обычно кролика), связываются с разными антигенными детерминантами (эпитопами) молекулы-мишени. Такую смесь антител называют поликлональным препаратом. Использование поликлональных антител имеет два недостатка, существенных для некоторых методов диагностики: 1) содержание отдельных антител в поликлональном препарате может варьировать от одной партии к другой; 2) поликлональные антитела нельзя применять, если необходимо различить две сходные мишени, т. е. когда патогенная (мишень) и непатогенная (не-мишень) формы различаются единственной детерминантой. Однако эти проблемы вполне разрешимы, поскольку сейчас научились получать препараты антител, выработанных к одной антигенной детерминанте, т. е. препараты моноклональных антител. [8]

9. Системы ДНК-диагностики

Информация обо всем многообразии свойств организма заключена в его генетическом материале. Так, патогенность бактерий определяется наличием у них специфического гена или набора генов, а наследственное генетическое заболевание возникает в результате повреждения определенного гена. Сегмент ДНК, детерминирующий данный биологический признак, имеет строго определенную нуклеотидную последовательность и может служить диагностическим маркером.

В основе многих быстрых и надежных диагностических методов лежит гибридизация нуклеиновых кислот -- спаривание двух комплементарных сегментов разных молекул ДНК. Процедура в общих чертах состоит в следующем.

1) Фиксация одноцепочечной ДНК-мишени на мембранном фильтре.

2) Нанесение меченой одноцепочечной ДНК- зонда, которая при определенных условиях (температуре и ионной силе) спаривается с ДНК-мишенью.

3) Промывание фильтра для удаления избытка несвязавшейся меченой ДНК-зонда.

4) Детекция гибридных молекул зонд/мишень.

В диагностических тестах, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот, ключевыми являются три компонента: ДНК-зонд, ДНК- мишень и метод детекции гибридизационного сигнала. [5]

9.1 Гибридизационные зонды

Чтобы обеспечить адекватность диагностического теста, гибридизационные ДНК- и РНК- зонды должны быть высокоспецифичными. Другими словами, необходимо, чтобы зонд гибридизовался только с искомой нуклеотидной последовательностью. Если есть вероятность получения ложноположительного (наличие гибридизационного сигнала в отсутствие последовательности-мишени) или ложноотрицательного (отсутствие сигнала при наличии последовательности-мишени) результата, то целесообразность применения теста значительно снижается. Специфичность зондов может проявляться на разных уровнях: они могут «различать» два и более вида, отдельные штаммы в пределах одного вида или разные гены. В зависимости от ситуации зонды могут быть представлены молекулами ДНК или РНК; они могут быть длинными (более 100 нуклеотидов) или короткими (менее 50 нуклеотидов), представлять собой продукт химического синтеза, клонированные интактные гены или их фрагменты.

Зонды получают разными способами. Один из них состоит в следующем. ДНК патогенного микроорганизма расщепляют с помощью рестрицируюшей эндонуклеазы и клонируют в плазмидном векторе. Затем проводят скрининг рекомбинантных плазмид с использованием геномной ДНК как патогенного, так и непатогенного штаммов. Те плазмиды, которые содержат последовательности, гибридизующиеся только с ДНК патогенного штамма, составляют основу видоспецифичных зондов. После этого проводят ряд дополнительных гибридизаций с ДНК, выделенными из различных организмов, чтобы удостовериться, что потенциальные зонды не дают с ними перекрестной гибридизации. Для определения чувствительности метода каждый из зондов проверяют также на модельных образцах, в том числе и на смешанных культурах.

Весьма желательно, чтобы ДНК-диагностику можно было проводить на исходном материале, без дополнительного его культивирования или выделения нуклеиновых кислот, особенно в тех случаях, когда тестируются клинические образцы. Исследователи с успехом проводят гибридизацию с ДНК-мишенями, присутствующими в образцах кала, мочи, крови, смывах из зева и в тканях без предварительной их очистки. Если концентрация последовательности-мишени в исследуемом образце слишком мала, ее можно амплифицировать с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). [6]

9.2 Нерадиоактивные методы детекции

В большинстве лабораторий для гибридизации используют зонды, меченные каким-либо радиоактивным изотопом, чаще всего ³²Р. Такие зонды обладают высокой удельной радиоактивностью и обеспечивают хорошее отношение сигнал/шум. Радиоактивно меченный зонд наносят на фильтр с фиксированной на нем ДНК- мишенью, проводят гибридизацию, отмывают несвязавшуюся ДНК-зонд и детектируют метку с помощью радиоавтографии.

Однако ³²Р является короткоживущим изотопом, испускающим высокоэнергетическое излучение; при работе с ним необходимо использовать специальное оборудование и обеспечивать безопасную утилизацию отходов. Чтобы обойти эти трудности, были созданы нерадиоактивные системы детекции. Для усиления гибридизационного сигнала в этом случае используется ферментативное превращение хромогенного или хемилюминесцентного субстрата: первый из них под действием фермента изменяет окраску, а второй испускает свет. В большинстве подобных систем применяются ДНК-зонды, содержащие биотинилированные нуклеотиды. Гибридизация и детекция сигнала проводятся более или менее стандартным образом.

1) Зонд, меченный биотином, гибридизуют с ДНК-мишенью (рис. 4, А).

2) Промывают фильтр для удаления избытка несвязавшегося зонда.

3) Добавляют авидин (белок куриного яйца) или стрептавидин (бактериальный аналог авидина) (рис. 4, Б).

4) Добавляют биотинилированный фермент -- щелочную фосфатазу или пероксидазу хрена (рис. 4, В).

5) В зависимости от используемого фермента добавляют хромогенный или хемилюминесцентный субстрат и регистрируют изменение окраски либо люминесценцию, сопровождающую превращение субстрата в продукт (рис. 4, Г).

Нерадиоактивные системы детекции обладают и другими преимуществами: биотинилированная ДНК остается стабильной при комнатной температуре как минимум год; методы регистрации хемилюминесненции обладают такой же чувствительностью, как и методы регистрации радиоактивного сигнала; детекция испускаемого света при помощи рентгеновской пленки или люминометра, как и регистрация изменения цвета, занимают несколько часов. [6]

Рисунок 4 - Нерадиоактивные методы детекции.

10. Биосенсорные устройства для медицинской диагностики

В настоящее время основными методами определения маркеров инфекционных заболеваний являются иммуноферментный анализ и полимеразная цепная реакция. Эти методы зарекомендовали себя как высокоспецифичные и чувствительные. Однако они имеют ряд недостатков - длительность постановки, отсутствие жесткого контроля качества тест-систем, возможность загрязнения исследуемых образцов ДНК или РНК, высокая стоимость реактивов и приборов. Методы, основанные на использовании нанобиотехнологий, позволяют преодолеть эти недостатки.

С этой точки зрения, среди нанотехнологических устройств наибольший интерес представляют системы на основе быстродействующих оптических биосенсоров, позволяющие выявлять белковые маркеры заболеваний в реальном времени.

Современные оптические биосенсоры характеризуются быстротой анализа - нескольких минут, возможностью определять константы равновесия и кинетические константы формирования и распада комплексов, время жизни комплекса, обладают высокой чувствительностью и легко роботизируются. Обычно сенсор состоит из следующих частей (рис.5).

Рисунок 5 - Принцип действия биосенсора.

Распознающий элемент (он также может быть назван рецепторным слоем) представляет собой вещество, которое способно селективно взаимодействовать с аналитом.

Трансдьюсер (англ. Transducer - преобразователь, датчик) преобразует химическое или биологическое взаимодействие в электрический сигнал.

Система сбора и обработки данных служит для усиления и анализа сигнала и отображения результатов. Необходимо отметить, что разработка сенсоров является междисциплинарной задачей, которая требует участия широкого круга специалистов: физиков, инженеров, химиков, биологов, врачей, экологов. Кроме очевидных требований, предъявляемых к новым сенсорам, таких как простота эксплуатации, дешевизна, высокая точность, селективность и скорость анализа, добавляются еще требования миниатюризации (это связано с развитием нанотехнологий), иногда возможность работать в непрерывном режиме, а иногда даже - возможность внедрения в человеческий организм. [17]

Заключение

Ежегодно в нашей стране миллионы людей сельскохозяйственных животных болеют различными инфекциями, в том числе острыми кишечными заболеваниями. Экономический ущерб от этих заболеваний огромен.

Одним из важных этапов борьбы с инфекциями является их ранняя диагностика. Наиболее длительным и трудоемким этапом микробиологического исследования при проведении лабораторной диагностики того или иного инфекционного заболевания является изучение биохимических свойств патогенных микробов. Каждый микроорганизм характеризуется специфическим спектром ферментов. Поэтому изучение биохимической активности микроорганизмов играет важную роль в лабораторной практике при идентификации микроорганизмов. Биохимическая активность положена в основу их классификации и всегда используется для установления родовой и видовой принадлежности выделяемых возбудителей.

Бурный научно-технический прогресс во всех областях знаний, в том числе и в области микробиологических исследований, сопровождается разработкой и созданием быстрых, простых и экономичных методов биохимической экспресс-индикации микроорганизмов.

Список использованных источников

1) Биотехнология /Под ред. Н.Е.Егорова и Самуилова - М., Высш.шк., 1987. - с. 543

2) Виестур У.Э., Шмитс И.А., Жилевич А.В. Биотехнология: Биологические агенты, технология, аппаратура. - Рига, Зинатне, 1987 - с. 169.

3) Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. -- МИА, 2005. -- с. 154-156.

4) Иммунобиологические препараты для профилактики, лечения и диагностики инфекционных заболеваний: учебное пособие / Под ред. Е.П. Красноженова, Т.Л. Мирютовой. Томск: Из-во «Печатная мануфактура», 2007. -с. 175-192.

5) Медицинская вирусология /Под редакцией Д.К. Львова. М.: Медицинское информационное агентство, 2008.-с. 24-38.

6) Медицинская микробиология, вирусология. Учебник /Под ред. А. А. Воробьева,- М.,2004. - с. 158.

7) Медицинская и санитарная микробиология - Воробьев А.А. - Учебное пособие, Высш.шк., 2003. - с. 543.

8) Промышленная микробиология: Учебное пособие /Под ред. Н.С. Егорова, - М.: Высшая школа, 1989. - с. 192.

9) Петров В. Иммунология -- СПб: "Лань", 1999. -- с. 57-65.

10) Поздеев О.К. Медицинская микробиология. Учебник для вузов/ Под ред. В.И. Покровского. - М.,2001.-с. 233.

11) Покровский В.В. Вич - инфекция. (Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней. Т.2 ) М.,1993. -с. 278.

12) Руководство к практическим занятиям по медицинской микробиологии / Под ред. проф. Е.П. Красноженова.-Томск: Изд-во Том. ун-та, 2003.-260с.

13) Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии с основами асептики и биотехнологии /Учебное пособие /Под ред. Н.А.Заикиной, 2002. - с. 43.

14) Спирин А.С. Молекулярная биология. Структура рибосом и биосинтез белка.М.Наука.1986. - с. 245.

15) Теоретические основы биотехнологии. Методические указания к лабораторным занятиям. - Ленинград, 1989. - с. 92

16) Тутов И. К., Ситьков В. И. Основы биотехнологии ветеринарных препаратов // Учебное пособие для вузов. Ставрополь 1997. - с. 159-179.

17) Улавин В.П. и др. Задачи нанотехнологии - биосенсоры / В.П. Улавин, А.В.Степанов, П.Д.Дибилин, Ю.А.Соколинский // Российские нанотехнологии, 2010.- №3. - С.12-15.

18) Химическая энциклопедия / Под ред. Кнунянц.- М.:Советская энциклопедия, 1998. - т.2. - с. 232.

19) Ящур В.П. и др. Моноклональные антитела / В.П. Ящур, А.В.Юрин, П.Д.Самойлов, Ю.А.Попова // Биотехнология, 2006. - №4. - С.2-4.

20) www.chem.msu.su/rus/teaching/biotech/all.pdf

21) www.medi.ru

22) www.medkurs.ru