Биотехнология на страже урожая

На о-ве Рота, расположенном в Тихом океане, восточную фруктовую муху удалось искоренить путем приманивания самцов с помощью аттрактанта метилевгенола на поверхность, покрытую инсектицидом.

Таких примеров эффективного применения сексоловушек можно привести немало. Наряду с сексоловушками для создания «самцового вакуума» применяется рассеивание феромона. В этом случае происходит дезориентация самцов. Эффективность этого приема повышается по мере снижения численности популяции вредителя-мишени. При большой плотности популяции самцы могут находить самок случайно. Для дезориентации самцов непар-ного шелкопряда -- опасного вредителя лесных, декоративных и фруктовых деревьев -- используют препарат диспарлюр. Он сохраняет свою активность в полевых условиях в течение продол-жительного времени. В дозе 20 г/га диспарлюр существенно подавляет численность непарного шелкопряда. Это вещество не оказывает ощутимого воздействия на окружающую среду или другие любые организмы, кроме вредителя.

Применение феромонов позволяет не только дезориентировать насекомых и благодаря этому снижать численность вредителей, но и предотвращать расселение их из очагов заражения. Экспери-менты, проведенные в Пермской области, показали, что внесение феромона непосредственно в уже имеющиеся очаги высокой численности короеда-гипографа прекращает разлет жуков из этих очагов в другие места.

Первый отечественный феромон восточной плодожорки был синтезирован в середине 70-х годов. В 1975--1980 гг. в нашей стране были проведены испытания ловушек и феромонов отечест-венного и американского производства. Оказалось, что улавли-вающая способность ловушек, изготовленных в нашей стране, в 2 раза выше американских.

Расчеты ученых показывают, что для подавления популяции вредителя при высокой ее исходной численности требуется около 4,5 тыс. ловушек на 1 га или 50 -- на одно дерево. Но при неболь-шой численности для защиты сада достаточно использовать 30--50 ловушек на 1га.

Для развития нового направления борьбы с вредителями полей и садов необходимо создать высокоэффективные препара-тивные формы феромонов. Стоимость феромонов высока, поэтому учёные разработали такие методы их использования, когда испарение действующего вещества происходит медленно, в течение длительного времени. Так, например, для борьбы с непарным шелкопрядом применяются микрокапсулы, содержащие диспар-люр -- половой аттрактант этого насекомого. Он широко исполь-зуется в США в качестве средства прямой борьбы с этим чрезвы-чайно опасным вредителем. Диспарлюр вызывает дезориентацию самцов, которые становятся половозрелыми раньше, чем самки. Микрокапсулы аттрактанта представляют соббй шарики из желатина или полиамида диаметром от 3 до 40 мкм, внутри которых заключен медленно испаряющийся феромон. С помощью таких микрокапсул удается снизить численность непарного шелко-пряда за четыре недели на 98 %.

Ученые интенсивно работают над совершенствованием поли-мерных диспенсеров (носителей) и способов их разбрасывания. В США используются два типа диспенсеров -- фиброволокна фирмы Конрел и трехслойные полимерные пластинки фирмы Геркон. Норма расхода феромона обычно составляет несколько граммов на 1 га в течение сезона. По мнению специалистов, в ближайшие годы феромоны будут широко использоваться для борьбы с вредителями плодовых культур, хлопчатника, кукурузы и некоторых технических культур. Применение физиологически активных веществ для борьбы с вредными насекомыми представ-ляется чрезвычайно перспективным.

Наряду с феромонами в целях защиты растений могут быть использованы другие физиологически активные вещества насеко-мых. Железы внутренней секреции продуцируют различные гор-моны. Наиболее изученными являются ювенильный (или личиноч-ный) гормон и гормон линьки (экдизон). Они играют важную роль в гормональной регуляции развития насекомых. Вместе с тем специалисты в области защиты растения могут использовать эти гормоны для нарушения нормального хода развития и размноже-ния насекомых.

Использование гормональных препаратов для борьбы с вред-ными насекомыми имеет специфические особенности. Применение их не обеспечивает моментальную гибель насекомых, поэтому вредители в случае массового распространения могут нанести растениям существенный вред. Кроме того, критический период действия гормонов ограничен во времени, что также затрудняет их использование. Однако определенные преимущества гормональ-ных препаратов (они не накапливаются в организме, мало-токсичны для позвоночных животных, к ним невозможно привыка-ние насекомых) побуждают ученых вести дальнейшие исследования в направлении практического использования этих веществ в борьбе с вредными насекомыми. Эти исследования окажутся еще более продуктивными, если будут" проводиться с использованием методов биотехнологии и генетической инженерии. Установлено, что вещества, аналогичные гормонам насекомых, продуцируются рядом растений. Эти вещества, например, фитозкдизоны, могут производиться в ферментерах методом культуры растительных тканей.

Важный аспект защиты растений -- борьба с сорной раститель-ностью. В настоящее время для борьбы с сорной растительностью широко применяется химический метод, основанный на использо-вании гербицидов. Повсеместное использование гербицидов в со-временном растениеводстве обусловлено тем, что это рентабельный способ повышения урожайности сельскохозяйственных культур, высокоэффективный метод повышения производительности труда в сельском хозяйстве. Существенным недостатком гербицидов является их более или менее выраженная токсичность для животных и человека. Вместе с ливневыми водами, а также в результате сноса аэрозолей они могут попадать в водоемы, отравляя там все живое, делая воду непригодной для потребления животными и человеком. Кроме того, они могут накапливаться в растительных кормах и животноводческих продуктах.

В связи с этим ученые интенсивно работают над повышением, роли так называемого биологического метода борьбы с сорной растительностью, включающего использование для этой цели живых организмов или продуктов их жизнедеятельности. И здесь открывается широкое поле для применения достижений биотехно-логии генетической инженерии. С помощью биотехнологических приемов можно быстро размножить организмы, уничтожающие сорные растения, производить пригодные для той же цели веще-ства.

К настоящему времени получены гербициды нового поколения, более перспективные как с точки зрения эффективности, так и с позиций экотоксикологии. Их получают, в частности, из микро-организмов. Одно из преимуществ производства микробных гербицидов -- универсальность оборудования (ферментеров), необходимых для культивирования гербицидсинтезирующих микроорганизмов. Второе существенное преимущество микро-биологического производства пестицидов -- значительно меньшее отрицательное воздействие посредством отходов и выбросов на окружающую среду. В-третьих, гербициды микробного проис-хождения, не являются чужеродными для природной среды. Актиномицеты, обитающие в почве, постоянно вырабатывают их и выделяют в окружающую среду. Вполне естественно, в почвен-ном биоценозе в ходе эволюции возникли системы, направленные на деградацию веществ, выделяемых актиномицетами. Эти системы будут функционировать и в том случае, если мы обрабо-таем растения гербицидами, полученными при участии актиномицетов в ферментере. Благодаря этому в природной среде не будет происходить накопления токсичных веществ. Кстати, это обстоя-тельство должно учитываться при разработке методов использова-ния микробных гербицидов: многие из них будут обладать низкой эффективностью при внесении в почву.

В настоящее время известен ряд микроорганизмов, которые уже являются или могут быть значимыми продуцентами гербици-дов. Их использование в практике предполагает проведение более глубоких исследований в области главным образом генетической инженерии, что обеспечит интенсивное использование микроорга-низмов в многотоннажных биотехнологических производствах.

В Японии для борьбы с сорной растительностью предполагается использовать гербицид биалафос, продуцируемый актиномицетами Streptomyces hygrosporicus и S. viridochromogenes. Этот гербицид обладает широким спектром действия на такие сорняки, как ежовник обыкновенный, марь белая, сыть круглая при послевсходовом его применении на всуех фазах роста растений. При внесении в почву биалафос практически неэффективен по причине, указан-ной выше. После опрыскивания растений раствором гербицид быстро, перемещается в корни, затем растение гибнет. В этом отношении биалафос сходен с гербицидом глифосатом (фосфоно-метилглй1дином), однако его действие на сорные растения прояв-ляется более сильно. Рекомендуемая доза составляет 1 кг/га. В настоящее время в Японии налаживается, производство этого препарата. Предполагается, что он найдет широкое применение. Ученые не без оснований считают его чрезвычайно перспективным с точки зрения механизма действия. Он, очевидно, окажется в поле зрения физиологов растений, биохимиков, специалистов в области генетической инженерии.

Некоторые штаммы актиномицетов продуцируют вещество, называемое анисомицином, которое характеризуется тем, что замедляет рост корешков у проростков таких растений, как ежовник, люцерна, томаты, пальчатка и др. Это вещество стало исходным в получении целого ряда производных. Результатом исследования структуры и биологической активности этих произ-водных явилось создание нового гербицида под названием «метоксифенон». Это вещество обладает высокой эффективностью против многих однолетних видов сорняков. Применяют его перед появлением всходов. Появляющиеся всходы поглощают гербицид, в результате чего возникает хлороз, приводящий к отмиранию сорняков. Гербицид предназначен для использования в посевах риса.

Первоначально в фильтрате S. saganonensis 4075 были обнару-жены два метаболита с гербицидной активностью, так называемые гербицидины А и В, а позднее еще три -- С, Д, Е. Они оказывают избирательное контактное гербицидное действие на двудольные сорняки, подавляют прорастание семян. Вопрос об их практиче-ском использовании пока не решен.

Известны и другие гербицидоподобные вещества микроорганизмов, такие; как нарамицин, тойокамицин, пиолютерион, цитобарицин, формицин А и В. Перспективными продуцентами гербицидоподобных веществ рас-сматриваются S. toyocaensis, гриб ирпекс (Irpex pacyodon). Как эффективный гербицид действует ризобитоксин в дозе 0,2 кг/га, синтезируемый некоторыми штаммами Rhizobium japonicum.

Результаты практического использования препаратов микроб-ного происхождения для защиты растений от сорняков пока несравненно более скромные по сравнению с масштабами применения классических гербицидов. Однако микробные препа-раты открывают принципиально новые возможности с точки зрения охраны окружающей человека среды. Специалисты в области защиты растений считают, что в ближайшие годы производство гербицидов микробного происхождения, вырабатываемых на био-технологических предприятиях, резко возрастет. Ожидается, что свой вклад в развитие их производства внесет генетическая инженерия.

Источником получения гербицидов могут быть не только микроорганизмы, но и высшие растения. Дело в том, что они синтезируют самые разнообразные вещества, часть из которых через корни выделяется в почву. Среди корневых выделений растений имеются соединения, губительно влияющие на другие растения. Весьма интенсивным гербицидным, бактерицидным и фунгицидным действием обладает, например, агропирен, выделяе-мый в среду сорняком пыреем ползучим. Если из корневищ пырея отогнать эфирное масло, то оно будет содержать около 95 % агропирена. Установлено, что агропирен проникает в корни и листья растений и вызывает сначала повреждение кончиков корней, а затем отмирание корневой системы. Проникая в сосуды, он перемещается по растению и отравляет наиболее молодые части растений.

В настоящее время ученые исследуют коллекции сортов различных культур в отношении выделения ими веществ, угнетаю-щих сорную растительность. Сорта, обладающие такой способ-ностью, при выращивании не требуют внесения гербицидов.

В настоящее время методы генетической и клеточной инжене-рии все чаще начинают применяться для создания растений, устойчивых к болезням, вредителям и токсическим веществам. Так, например, с помощью плазмид опухолеобразующей бактерии Agrobacterium tumefaciens были получены устойчивые к антибиотику канамицину растения табака и томатов. Путем перенесения в клетки табака, сои, хлопчатника и томатов гена устойчивости к гербициду глифосату удалось повысить их резистентность к обра-ботке гербицидами. В растения табака был перенесен ген, контро-лирующий синтез токсичного для личинок насекомых белка В. thuringiensis. Ген, контролирующий образование токсичного для личинок белка, предварительно был клонирован и введен в кишеч-ную палочку. Благодаря повышению устойчивости табака по отно-шению к вредным насекомым удалось снизить уровень химической защиты его от насекомых.

Получение растений-регенерантов, устойчивых к абиотическим и биотическим стрессовым факторам методами клеточной инжене-рии

Засуха. Недостаток воды в почве наносит значительно больший урон растениеводству, чем все остальные стрессовые факторы, вместе взятые. Засуха приводит к возникновению водного дефицита в почве и соответственно в растениях, вызывая у них водный стресс. Хотя термин «засуха» относится главным образом к почвенному водному стрессу, он включает также воздействие жары на растения. Стресс, вызванный вод-ным дефицитом, может быть первичным в случае засухи, а также вторич-ным при низкотемпературном, тепловом или солевом стрессах. Стресс, вызванный засухой, ведет к прямым или непрямым повреждениям расте-ний, которые обусловлены инактивацией ферментов, нарушением биохи-мических путей, накоплением токсических веществ, утечкой ионов, де-фицитом питания и другими причинами.

С целью имитации in vitro стрессового эффекта засухи могут приме-няться питательные среды, которые дополнены осмотически активными веществами, понижающими внешний водный потенциал. В качестве та-кого селективного агента, для селекции на устойчивость к засухе были использованы полиэтиленгликоль (ПЭГ), представляющий собой непро-никающее в клетку осмотически активное вещество. Первое сообщение о выделении клеточных линий табака, устойчивых к стрессу, индуцирован-ному ПЭГ, появилось в 1979 г. (Heyser, Nabors, 1979). Позже для селекции на засухоустойчивость Р. Брессан с соавт. использовал клеточные линии томата, которые подвергались водному стрессу при культивировании каллусной ткани в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 15 %. В резуль-тате опытов были отобраны устойчивые каллусные линии, однако устой-чивость быстро терялась при культивировании каллуса на среде без осмотика, что указывает на физиологическую природу адаптации. Тестирова-ние каллусных линий на рост в присутствии ПЭГ предложено для иденти-фикации выносливых к засухе генотипов сои. Анализ роста каллусных тканей десяти сортов сои на средах с 0,15, 20 % ПЭГ 8000 свидетельство-вал о корреляции засухоустойчивости у растений и толерантности к ПЭГ культивируемых клеток. Для получения адаптированных к водному стрессу клеточных линий также применялись среды, содержащие в каче-стве осмотика 99--880 мМ маннитол. Как и в предыдущем случае, осмо-тически адаптированные клетки обладали повышенной выносливостью к солевому стрессу.

Засоление. Одним из лимитирующих факторов сельскохозяй-ственной продуктивности является засоление почв. Около 900 млн. га всех земель нашей планеты имеют повышенное содержание солей, а ко-личество засоленных почв с каждым годом возрастает. Особую тревогу вызывает увеличение в почвах содержания солей, которое происходит в результате их искусственного орошения. Решение данной проблемы во многом зависит от разработки рациональных агротехнических приемов, правильной методологии орошения, использования для полива частично или полностью обессоленной воды. С развитием биотехнологии растений потенциально возможным является получение солевыносливых геноти-пов у важных сельскохозяйственных культур путем селекции на уровне соматических клеток, слияния протопластов или переноса генов при ис-пользовании техники рекомбинантных молекул ДНК.

Вредное действие засоления имеет комплексный характер и обуслов-лено как нарушением осмотического баланса клетки, так и прямым ток-сическим влиянием ионов натрия, хлора на физиологические и биохими-ческие процессы в клетке. Результатом такого действия может быть уменьшение тургора клетки, ингибирование функции мембран и актив-ности ферментов, подавление фотосинтеза, нехватки отдельных ионов из-за нарушения селективного транспорта ионов, использование значи-тельного количества энергии для поддержания толерантности. Основные типы реакций растений, возникающие в ответ на повышение концентра-ции солей во внешней среде.

Экспериментальные данные, полученные многими учеными, показы-вают, что клеточные механизмы выносливости к засолению являются сходными для культивируемых in vitro клеток и целых растений и что се-лекция на клеточном уровне представляет реальную перспективу получе-ния устойчивых к засолению форм растений.

Большинство селекционных программ направлены на выделение in vitro клеточных линий, толерантных к присутствию в среде для культиви-рования клеток хлорида натрия. Так, показано, что выращивая гаплоид-ные каллусные клетки табака на среде с постоянно увеличивающейся концентрацией солей, получены клеточные линии, способные к росту в присутствии 1 % NaCl. M. Наборе с соав. предварительно обработав сус-пензионную культуру табака мутагеном (0,15 % ЭМС, 60 мин), путем од-ноступенчатой селекции выделили клеточные линии, устойчивые к 0,5 % NaCl. Отмечено, что выносливость, полученных регенерантов к засоле-нию, проявлялась на уровне целых растений.

На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сель-скохозяйственной академии им. К.А. Тимирязева проводились исследо-вания по получению солеустойчивых растений на примере яровых твер-дых и мягких пшениц. Первичным эксплантом служили как изолирован-ные незрелые зародыши, так и гаплоиды. Клеточную селекцию проводили на каллусной ткани, культивируемой на питательной среде, содержащей 0,3 %NaCI или Na2SO₄ в течение 5--6 пассажей. В результа-те исследований были получены устойчивые клеточные линии, а также растения-регенеранты. Тестирование на солеустойчивость первого се-менного поколения растении-регенерантов методом регистрации замед-ленной флоуроесценции показало, что фотосинтетический аппарат неко-торых растении-регенерантов по устойчивости к засолению превосходит исходный сорт (Никифорова И.Д., 1993, 1994).

Солевыносливость растений удается также повысить в результате се-лекции к одному фактору засоления осмотическому стрессу. Например, клетки томата, адаптированные к водному стрессу, индуцированному полиэтиленгликолем, обладали повышенной устойчивостью к NaС1. Повы-шенная толерантность к соли обнаружена у клеточных линий моркови, отобранных на среде, содержащей в качестве осмотика маннитол в высо-кой концентрации (99--870 мМ). Из этих результатов следует, что адап-тация клеток к осмотическому стрессу применима для отбора солевынос-ливых вариантов, а исследования подобного рода представляют интерес для изучения как во взаимодействии, так и независимо друг от друга.

Металлы. Присутствие в почве в большом количестве ионов ме-таллов, токсически влияющих на растения, или недостаток ионов, ис-пользуемых растениями в качестве питательных веществ, могут быть причиной ионного (минерального) стресса у растений. Особое внимание ученых привлекает изучение стрессов, обусловленных наличием в почве ионов тяжелых металлов, многие из которых токсически влияют как на растительные, так и на животные организмы. Стрессовое состояние у рас-тений может быть индуцировано ионами таких тяжелых металлов, как цинк, кадмий, медь, ртуть; они также довольно часто встречаются и в почвах, механизмы устойчивости к токсическим ионам могут исключать уменьшение проницаемости плазмалеммы, детоксикацию ионов в ре-зультате связывания с органическими веществами, компартментализацию в вакуолях, а также изменения структуры ферментов, которые явля-ются их мишенями.

Работы по клеточной селекции растений на устойчивость к ионным стрессам начаты недавно, но уже имеют положительный результат. Во всех экспериментах используется метод прямой селекции, при котором в качестве селективного агента применяли токсические концентрации со-лей. Однако создание стрессовых селективных условий in vitro, идентич-ных таковым в природе, крайне затруднительно. В природных условиях помимо токсического действия ионов накладываются другие факторы, в частности наличие различных веществ, кислотность почвы и т. д. Для се-лекции на клеточном уровне используют питательные среды, которые хотя не полностью соответствовали естественным стрессовым условиям, все же обеспечивали экспрессию признака устойчивости и давали воз-можность отбирать нужные варианты.

Путем прямой селекции in vitro отобраны клеточные линии петунии, устойчивые к ртути, сорго--к алюминию, моркови -- к алюминию и марганцу одновременно; суспензионные клеточные культуры дурма-на -- к кадмию. На кафедре сельскохозяйственной биотехнологии МСХА также проводились работы по получению клеточных линий и рас-тений-регенерантов льна-долгунца, устойчивых к соли нитрата кадмия и изучалось действие этой соли на интактные растения. Экспериментально показано, что присутствие ионов кадмия в почве приводит к торможению роста стеблевой и корневой частей растения, к сокращению на 7--9 дней онтогенетических фаз развития, следующих за фазой «елочки» по сравне-нию с контролем, культурные виды накапливают ионы кадмия в вегета-тивной массе, в то время как дикие -- нет. Мезо- и ультраструктурный анализ стеблей льна-долгунца показал, что присутствие кадмия в суб-страте приводило к уменьшению количества клеток элементарных воло-конец в пучке, к некомпактному расположению клеток элементарных во-локонец в лубяных пучках, а также к формированию клеток элементар-ных волоконец неодинаковых размеров в пределах одного пучка и к раз-личным срокам формирования вторичной клеточной стенки. В результате клеточной селекции были получены растения-регенеранты, обладающие устойчивостью к соли кадмия (Гончарук Е.А., 2000).

Экстремальные температуры. Причиной стрессово-го фактора у растений могут быть относительно высокие или низкие тем-пературы. Работ по клеточной селекции на устойчивость к этим стрессам немного. В изученной нами литературе сведений о клеточной селекции к тепловому шоку не обнаружено, хотя белки теплового шока являются предметом пристального изучения биологов различного профиля. Что касается работ по клеточной селекции к низкотемпературным факторам, то они имеют место.

Холодовой стресс у растений может быть вызван температурами большого диапазона: от 10--15° до 0°С. Такому стрессу наиболее подвер-жены растения тропических и субтропических зон. Стойкость растений к охлаждению обусловлена способностью липидов мембран оставаться в жидком состоянии благодаря наличию большой пропорции ненасыщен-ных жирных кислот и/или повышенного содержания стеролов. Повреж-дения, вызванные промораживанием растений (температура ниже 0°С) связаны прежде всего с формированием внеклеточного льда. При этом отток воды во внеклеточное пространство приводит к вторичному эффек-ту, вызванному водным стрессом. Нарушения, вызываемые отрицатель-ными температурами, могут быть предотвращены аккумуляцией антифризных веществ, уменьшением количества несвязанной воды при обез-воживании и увеличением способности переохлаждаться. Большинство авторов отмечают, что у растений происходят глубокие превращения за-пасных питательных веществ, в частности, у морозоустойчивых древес-ных растений накопление большого количества жиров, а у менее устой-чивых -- Сахаров.

Первые эксперименты, в которых описана возможность использова-ния культивируемых растительных клеток для отбора выносливых к низ-ким температурам клеточных линий, опубликованы в 1976 г. (Dix, Street, 1976). Работы проводились на суспензионных культурах табака и перца, которые после высева на агаризованные среды подвергались в течение 21 дня соответственно температурам -- 3° и 4°С. Среди отобранных кло-нов обнаружены линии, стабильно сохраняющие повышенную холодо-устойчивость.

Основываясь на имеющихся в этой области исследований данных, од-нозначный ответ о применимости прямой селекции in vitro растений, вы-носливых к низкой температуре, давать пока рано. Несомненно, однако, что индукция in vitro генетического разнообразия найдет применение для отбора более выносливых вариантов.

Список литературы

1. Биотехнология - агропромышленному комплексу // В.И.Артамонов. - М.:Наука, 1989г. - 160 с.

2. Сельскохозяйственная биотехнология: Учеб/В.С.Шевелуха, Калашникова Е.А. и др.; Под ред. В.С.Шевелухи - 2-е изд. перераб. и доп. - М.: Высш. шк., 2003. -496.