Вегетативное размножение хризантем связано с существенным накоплением в их искусственных популяциях различных заболеваний. Основной урон цветочной продукции наносят в этом случае вирусные заболевания, которые не поддаются химическому контролю. Наибольшее распространение в растениях хризантем получил В вирус хризантем (ВВХ), который приводит к снижению качества товарной продукции и привлекательности для покупателя. По прогнозам ученых в XXI веке роль вирусных заболеваний будет возрастать, поэтому обнаружение, идентификация, изучение строения и экспрессии генома вирусов, а также получение оздоровленного посадочного материала является актуальной проблемой не только для цветоводства, но и для всего растениеводства.

Оптимизирована методика диагностики ВВХ, включающая протокол выделения РНК, набор праймеров и условия метода PCR. Выявлены сорта (Помпон сиреневый и Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем. Установлена степень гомологии между штаммом ВВХ, распространенным на территории Главного Ботанического сада, и штаммами Chail и Bangalore, которая составила 94%-95% соответственно. В результате проведенных экспериментов усовершенствована технология клонального микроразмножения хризантем, позволяющая получать до 100 тыс. растений в год с одного узла независимо от сроков введения в культуру in vitro. Выявлено, что распространение В вируса хризантем в пробирочных растениях неравномерное, причем максимальная его концентрация отмечается в нижних ярусах растений.

Проведенные исследования показали, что использование в качестве транспланта при клональном микроразмножении хризантем только верхней части пробирочных растений (максимально 2 междоузлия) возможно получать более качественный посадочный материал за счет снижения нагрузки вируса на целое растение или осуществлять оздоровление посадочного материала.

Практическая ценность исследований. Полученные данные свидетельствуют о том, что подобранная методика по идентификации ВВХ может быть применена для тестирования различных сортов хризантем на наличие вируса у растений разного происхождения. Обнаружены два сорта (Помпон сиреневый, Лучистая), способные подавлять влияние В вируса хризантем, которые являются перспективными для дальнейшего их применения в селекционном процессе. Усовершенствованная технология клонального микроразмножения хризантем направлена на повышение эффективности их производства. Разработанная схема получения оздоровленных растений хризантем может быть применена для производства качественного посадочного материала, а также при проведении селекционных работ (Гранда, 2009).

Исследования культуры тканей хризантемы были впервые проведены Морелем и Мартином в 1952 году. После этих опытов метод верхушечной меристемы стали применять с целью оздоровления растений, зараженных вирусами. В настоящее время метод культуры изолированных тканей растений нашел широкое применение не только для получения безвирусных растений, но и для быстрого размножения сортов, у которых при семенном размножении не получается стабильного по декоративным качествам потомства, а также с целью получения от исходных сортов растений с сортовыми отклонениями. Возникновение сортов при этом обусловлено мутагенным действием регуляторов роста, которые могут вызывать поли-плоидизацию растущих каллусных клеток. Для этого используют не только апикальную меристему растений, но и части листьев, цветоносов, цветков (пыльники, цветоложе).

Для выращивания изолированных тканей требуется определенный микроклимат в культивационных помещениях, стерильность всех инструментов и питательных сред, система контроля за качеством получаемого материала (вирусная стерильность, сохранение сорта).

Выращивание изолированных тканей делят на четыре этапа:

1) эксплантация (вычленение) исходной ткани растения; на этом этапе необходимо получить свободную от видимой инфекции ткань, добиться ее выживания и быстрого роста;

2) собственно микроразмножение, при котором нужно обеспечить увеличение количества микрочеренков;

3) укоренение полученных микропобегов и сохранение их в прохладном помещении;

4) закаливание растений, повышение их устойчивости к внешней среде.

Метод выращивания изолированных тканей включает:

- приготовление и стерилизацию питательной среды;

- подготовку и стерилизацию растительного материала и оборудования на этапе вычленения тканей;

- изоляцию и посадку кусочков тканей на питательную среду;

- выращивание ткани в термостатированных условиях (получение растений-регенератов, или vitro-растений);

- пересадку растений в оранжерейные субстраты и выращивание из них маточных растений в условиях, исключающих возможность вирусного инфицирования;

- проверку растений на наличие вирусных заболеваний и отбор здоровых растений;

- получение здорового посадочного материала от здоровых маточников.

Развитие кусочка ткани на среде может происходить двумя путями:

1)непосредственно образуется проросток и из него растеньице;

2)образуется каллус, который затем пересаживают (пассируют) на другую среду, где он дает начало побегам.

Развитие растительной ткани в пробирках зависит от разных причин: размеров выделенной апикальной меристемы, соотношения в питательной среде регуляторов роста и условий, в которых находятся растения.

Для получения растений-регенератов важно обеспечить последовательность прохождения фаз органогенеза. Первая фаза органогенеза -- переход недифференцированной растущей ткани к образованию регенерационной меристемы и закладке стеблевых точек роста. Эта фаза обеспечивается преобладанием в среде цитокининов над соединениями с ауксиновой активностью. Вторая фаза органогенеза -- переход возникших образований к активному формированию побегов и корней. Для этой фазы необходима среда с относительно низким количеством (по сравнению со средой Мурасиге-Скуга) минеральных солей и содержанием веществ к ауксиновой активностью. Отбор соответствующей питательной среды для прохождения первой и второй фаз органогенеза -- наиболее сложная и важная задача. Для каждого вида, а иногда и сорта эту задачу решают отдельно, что служит причиной многообразия питательных сред.

В основном работы по микроклональному размножению хризантемы проводятся с использованием в качестве эксплантов листовых пластинок и стеблей. Для образования каллуса фрагменты листовых пластинок и стеблей сажают на питательную среду Мурасиге - Скуга в присутствии гормонов 2,4-Д и кинетина. Через 5-10 дней наблюдается видимая пролиферация на поверхности эксплантов. А через 2 недели образуется темно-коричневый, непрозрачный, компактный каллус. При перенесении этого каллуса на среду Мурасиге-Скуга с содержанием гормонов 2 мг / л Кинетина и 0,2 мг / л 2,4-Д начинают прорастать побеги. Через 30 дней на среде образуются зеленые побеги и корни.

Было замечено, что через несколько недель у каллусной культуры замедляется рост и наблюдаются признаки старения. Старение является результатом истощения питательных веществ, торможения питательных диффузии, испарение сопровождается увеличением концентрации некоторых компонентов среды, накопление метаболитов, некоторые из которых могут быть токсичными. Поэтому необходимо пересаживать каллус и образующиеся проростки через каждые 4 недели.

Таким образом, необходимо эмпирически подбирать оптимальные условия для процесса каллусогенеза и органогенеза хризантем из-за множества индуцирующих факторов, подбирая их под сортовые особенности растения и характер экспланта (Микроклональное… 2012).

3. Материалы и методы исследования