Исследование эксцизионной репарации оснований ДНК в эмбриональном развитии морского ежа Strongylocentrotus intermedius

В литературе имеется множество данных, указывающих на повышенный уровень экспрессии и активности различных гликозилаз и других ферментов эксцизионной репарации нуклеотидов в активно делящихся и дифференцирующихся клетках эмбрионов различных животных. Для отработки методики измерения активности ферментов репарации в полученных экстрактах на первом этапе были выбраны три 23-звенных ОДН-субстрата, содержащие в позиции 10 одно из повреждений: 8-oxoGua, Ura и THF - аналог AP-сайта, устойчивый к AP-лиазной активности, но расщепляемый AP-эндонуклеазами. Последовательности нуклеотидов в субстрате за исключением повреждения были одинаковы. Субстрат инкубировали с клеточным экстрактом и через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для анализа. В случае субстратов, содержащих Ura или 8-oxoGua, анализируемые образцы прогревали в присутствии щелочи. Это связано с тем что урацил-ДНК гликозилаза является монофункциональной, то есть катализирует только стадию выщепления азотистого основания, и ее продуктом является AP-сайт. Олигонуклеотид, содержащий АР-сайт нельзя электрофоретически отделить от интактного субстрата. Однако в щелочных условиях при высокой температуре AP-сайт быстро подвергается ?-элиминированию, что приводит к разрыву цепи ДНК. 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза является бифункциональной, то есть катализирует помимо стадии выщепления основания еще и стадию ?-элиминирования, однако ее AP-лиазная активность намного ниже гликозилазной, поэтому в случае 8-oxoGua-субстрата образцы также обрабатывали щелочью. В качестве контроля был взят олигонуклеотид с той же последовательностью, что и в поврежденных субстратах, однако содержащий вместо повреждения основание Cyt (для Ura-субстрата) или Gua (для 8-oxoGua-субстрата). Для соблюдения одинаковых условий эксперимента контрольные пробы также инкубировали со щелочью при нагревании.

3.4.1 Активность урацил-ДНК-гликозилазы

Первая серия экспериментов была направлена на выявление активности урацил-ДНК-гликозилазы, которая удаляет остатки Ura как из двуцепочечной, так и из одноцеплчечной ДНК, причем одноцепочечная ДНК является более предпочтительным субстратом. Поэтому в качестве субстрата был использован 23-звенный одноцепочечный ОДН ^*23U, содержащий один остаток Ura в положении 10 с 5'-конца. Поскольку в клеточных экстрактах присутствуют различные ферменты, в том числе нуклеазы, неспецифически разрушающие нуклеиновые кислоты, перед каждым экспериментом в реакционную смесь добавляли ЭДТА -- соединение, хелатирующее дивалентные катионы и ингибирующее многие нуклеазы, но не влияющее на активность ДНК-гликозилаз. На рис. 6 представлен результат типичного эксперимента.

Рис. 6. А - радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23U и контрольного ОДН *23C экстрактом эмбрионов S. intermedius (стадия 10). Дорожки 1-7 - субстрат ^*23U после 5, 10, 20, 30, 60, 90 и 120 мин. инкубации с экстрактом, дорожки 8-10 - субстрат *23C после 2, 20 и 120 мин. инкубации с экстрактом. S - субстрат, P - продукт реакции. Б - график зависимости накопления продуктов реакции от времени, () - субстрат ^*23U, () - субстрат *23C.

Из рисунка видно, что со временем происходит накопление продукта расщепления ОДН-субстрата. Для каждой стадии развития были подобраны оптимальное время, за которое расщеплялось хорошо детектируемое количество субстрата и зависимость количества расщепленного продукта от времени была линейной. Если активность в экстракте была слишком высокой, его разводили в 5-10 раз добавлением буфера, использовавшегося для диализа. Типичная картина радиоавтографа представлена на рис. 7

Рис. 7. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23U и контрольного ОДН *23C экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки: 1 - контроль подвижности - субстрат ^*23U после 5 мин. инкубации с АР-эндонуклеазой, (3 мкг) 2 - субстрат *23U после 5 минут инкубации без экстракта, 3 - субстрат *23C после 5 минут инкубации без экстракта 4,5 - субстраты *23U и *23C после 20 минут инкубации с экстрактом стадии 12, 6,7 - то же со ст.15, 8,9 - то же ст.18, 10,11 - то же ст 20, 12,14 - то же ст.24, 15,16 - то же ст. 25, 17,18 - то же ст. 26., S - субстрат, P - продукт реакции.

Скорость реакции определяли как количество расщепленного субстрата в минуту. Относительная скорость, нормированная на содержание общего белка в пробе, была взята в качестве показателя активности урацил-ДНК-гликозилазы. Полученные для трех серий экспериментов данные представлены на рис. 8. Видно что активность урацил-ДНК гликозилазы резко возрастает после вылупления бластулы и достигает максимума на стадии 52 часа развития. Такой же профиль активности наблюдался ранее для нуклеаз S. intermedius [35].

Рис. 8 Удельная активность урацил-ДНК-гликозилазы на разных стадиях эмбрионального развития S. intermedius. А - линейная шкала по оси ординат, Б - логарифмическая шкала по оси ординат (для сравнения активности на ранних стадиях развития).

3.4.2 Активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы

Вторая серия экспериментов была направлена на выявление активности оксогуанин-ДНК-гликозилазы. Так как этот фермент выщепляет модифицированные основания только из двуцепоченой ДНК, использовался 23-звенный двуцепочечный субстрат ^*23oG/23comp. На рис. 9 представлен типичный радиоавтограф геля для экстракта стадии 3 в присутствии 5 мМ ЭДТА.

Рис. 9. А. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН ^*23oG/23comp и ^*23G/23comp экстрактом эмбрионов на стадии 3 S. intermedius в присутствии 5 мМ ЭДТА. Дорожки 1-4 - субстрат ^*23oG/23comp после 2, 5, 10, 20 мин. инкубации с экстрактом; дорожка 5 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации с белком Fpg (3мкг); дорожка 6 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта; дорожки 7-8 - субстрат ^*23G/23comp после 2 и 20 мин. инкубации с экстрактом. S - субстрат, P - продукт.

Как видно из рис. 9, в присутствии 5 мМ ЭДТА активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы не наблюдалось. Такая же картина была и в случае экстрактов на всех имеющихся стадиях развития. Такой результат имеет два возможных объяснения. Во-первых, в эмбрионах морского ежа экспрессия гена данного фермента может находиться на очень низком уровне или отсутствовать вообще. Во-вторых, 8-оксогуанин-ДНК-гликозилаза обладает большим сродством к ДНК и после выщепления поврежденного основания очень медленно диссоциирует из комплекса с продуктом реакции, поэтому низкие концентрации фермента могут плохо выявляться при исследовании его активности. Показано, что активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы человека OGG1 стимулируется AP-эндонуклеазой - следующим участником пути ЭРО. В присутствии AP-эндонуклеазы скорость диссоциации OGG1 из комплекса с ДНК возрастает. Однако AP-эндонуклеза, как и другие нуклеазы, нуждается в ионах Mg²⁺, а ЭДТА в реакционной смеси хелатирует двухвалентные ионы металлов, ингибируя таким образом активность нуклеаз. Поэтому эксперимент повторяли без добавления ЭДТА, но в присутствии 1 мМ Mg²⁺. На рис. 10 представлен радиоавтограф такого геля:

Рис. 10 Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ^*23oG/23comp и ^*23G/23comp экстрактом эмбриона S. Intermedius на стадии 3 в присутствии ионов магния. Дорожки 1,6 - субстрат ^*23oG/23comp после 5 мин. инкубации с белком Fpg (3мкг), 2-5 - субстрат ^*23oG/23comp после 2, 5, 10, 20 мин. инкубации с экстрактом; дорожка 7 - субстрат ^*23оG/23comp после 5 мин инкубации без экстракта; дорожка 8 - субстрат ^*23G/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта. S - субстрат, P - продукт.

На начальной стадии реакции наблюдается быстрое накопление продукта, по подвижности соответствующего продукту расщепления поврежденного ОДН ферментом Fpg. То, что продукт инкубации с экстрактом обладает большей электрофоретической подвижностью, чем контроль с чистым ферментом, объясняется тем, что после выщепления остатка оксогуанина гликозилазой, ее продукт подвергается гидролизу АР-эндонуклеазой. Поэтому для построения графиков накопления продукта от времени был выбран временной промежуток от 2 до 20 минут. На рис.11 приведен пример графика, использовавшегося для вычисления скорости реакции, и график удельной активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы по стадиям развития.

Рис. 11 А. - График накопления продукта реакции от времени, стадия 3, () - субстрат ^*23oG/23comp, () - субстрат *23C/23comp. Б - удельная активность 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы на разных стадиях развития эмбрионов S. intermedius.

Из графика Б видно, что 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазная активность падает по мере развития эмбриона.

Помимо ферментативных активностей, выщепляющих из ДНК основания Ura и 8-oxoGua, была исследована способность экстрактов эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития удалять поврежденные основания дигидроурацила (из пар с Gua), 8-оксоаденина (из пар с Cyt), гипоксантина (из пар с Thy) и Ade (из пар с 8-oxoGua). Первый из этих субстратов специфичен для ДНК-гликозилаз NTHL1 и NEIL1, второй -- для OGG1 и NEIL1, третий -- для MPG, четвертый -- для MUTYH ($). Однако ни в одном из случаев расщепления на уровне выше неспецифического фонового обнаружено не было (данные не приведены), что говорит об отсутствии или низкой удельной активности соответствующих ферментов.

3.4.3Активность AP-эндонуклеазы

AP-эндонуклеаза расщепляет двуцепочечную ДНК с 5'-стороны от AP-сайта, оставляя ОН-группу на 3'-конце разрыва и dRP-остаток на 5'конце. Для измерения ее активности часто используют олигонуклеотиды, содержащие стабильный аналог AP-сайта - тетрагидрофуран, который не подвергается ?-элиминированию, как спонтанному, так и катализируемому AP-лиазами. Такой субстрат использовали для анализа активности AP-эндонуклеазы в экстрактах икры и сперматозоидов морского ежа. Так как продуктом действия AP-эндонуклеаз является ДНК с одноцепочечным разрывом, анализируемые образцы не требовалось инкубировать со щелочью перед электрофорезом. Как уже упоминалось, AP-эндонуклеаза является Mg²⁺-зависимой, поэтому реакция проводилась в отсутствие ЭДТА и в присутствии ионов Mg²⁺ в концентрации 1 мМ. Для учета неспецифической деградации субстрата экстракт инкубировали с контрольным дуплексом ^*23G/23comp, последовательность которого была такой же, за исключением поврежденного звена.

Рис. 12. Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции расщепления ОДН-субстратов ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки 1, 2 - субстрат ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp соответственно после 20 мин инкубации с экстрактом стадии 5. Дорожки 3, 4 -- то же для стадии 7. Дорожки 5, 6 -- то же для стадии 10. Дорожки 7, 8 - то же для стадии 11. Дорожка 9 -- субстрат ^*23THF/23comp после 5 мин инкубации с AP-эндонуклеазой APEX1 человека (3 мкг). Дорожка 10 -- субстрат ^*23THF/23comp после 5 мин инкубации без экстракта. Дорожка 11 -- субстрат ^*23G/23comp после 5 мин. инкубации без экстракта. Дорожки 12, 13 - субстрат ^*23THF/23comp и ^*23G/23comp соответственно после 20 мин инкубации с экстрактом стадии 12. Дорожки 14, 15 -- то же для стадии 15. Дорожки 16, 17 -- то же для стадии 18. Дорожки 18, 19 -- то же для стадии 20. Дорожки 20, 21 -- то же для стадии 24. S - субстрат, P - продукт расщепления ОДН по остатку THF.

Как видно из рис. 12, за 20 минут инкубации происходило накопление продукта, по подвижности соответствующего продукту AP-эндонуклеазы. Для расчета удельной активности, скорость в молях расщепленного субстрата в минуту нормировалась на концентрацию белка в экстракте. Полученные данные для трех серий экспериментов приведены на рис. 13

Из рис. 13 видно, что активность AP-эндонуклеазы постепенно возрастает с развитием. Это характерно также для общей нуклеазной активности экстаракта - на поздних стадиях она значительно выше, чем на ранних.

Рис. 13 Удельная активность АР-эндонуклеазы на разных стадиях развития эмбрионов S. intermedius.

3.4.4 Активность ДНК-полимераз

На третьем этапе ЭРО происходит заполнение однонуклеотидной бреши, образовавшейся в результате действия ДНК-гликозилаз и AP-эндонуклеаз. С 3'-ОН концом разрыва связывается репаративная полимераза (ДНК-полимераза ? в случае высших эукариот) и включает один дезоксинуклеотид, а далее происходит либо лигирование ДНК, либо переключение на длиннозаплаточный путь ЭРО со сменой ДНК-полимераз. Для исследования ДНК-полимеразной активности экстрактов был сконструирован субстрат, содержащий 23-звенную матрицу, основной праймер (длиной в 10 нуклеотидов) и запирающий праймер (12 нуклеотидов), между которыми находилась однонуклеотидная брешь (*Primer1*Primer2/Template). Подобные структуры свляются оптимальными субстратами для реакции, катализируемой ДНК-полимеразой ?. В реакционную смесь добавляли dATP в концентрации, насыщающей ДНК-полимеразу, который использовался полимеразой для встройки в брешь напротив основания Thy в матрице. Пробы анализировали электрофорезом в денатурирующих условиях, что позволило отделить удлиненный основной праймер от исходного. На рис. 14 представлен типичный радиоавтограф такого геля.

Рис. 14 Радиоавтограф геля после электрофоретического разделения продуктов реакции встраивания dAMP в субстрат ^*Primer1*Primer2/Template экстрактами эмбрионов S. intermedius. Дорожки 1-8 -- субстрат после 5 мин инкубации с экстрактами стадий 3, 5, 7, 10, 11, 12, 15 и 18 соответственно. Дорожка 9 -- субстрат после 5 мин инкубации без экстракта. Дорожка 10 -- субстрат после 2 мин инкубации с 500 нМ ДНК-полимеразой ? человека. S -- субстрат, P1 -- продукт включения dAMP, Р2, Р3, Р4 -- продукты неспецифической деградации нуклеазами.

Из рис. 14 видно, что на ранних стадиях развития полимеразная активность значительно выше, чем на поздних. Однако на стадии 12, соответствующей вылуплению бластулы, наблюдается всплеск активности, после чего она снова падает. Тем не менее, даже на этих стадиях нельзя однозначно говорить об отсутствии ДНК-полимеразной активности, так как в реакционном буфере содержался 10 мМ МgCl₂, который используют в качестве кофактора нуклеазы, и наблюдается частичная деградация субстрата. Поэтому эксперимент отражает сочетание полимеразной и нуклеазной активностей экстрактов. Данные по удельной активности полимеразы на всех стадиях развития представлены на рис. 15

Рис. 15 Удельная полимеразная активность на разных стадиях развития эмбрионов S. Intermedius

Таким образом, в работе показано изменение активности ключевых ферментов эксцизионной репарации оснований в эмбриональном развитии морского ежа. S. intermedius. Согласно полученным данным, активность урацил-ДНК-гликозилазы резко возрастает после стадии вылупления бластулы. Это может быть связано с тем, после вылупления из оболочки оплодотворения эмбрион находится в непосредственном контакте с окружающей средой, содержащей множество агентов, способных повредить ДНК. Однако активность 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы напротив, убывает с развитием, что говорит о сниженной способности клеток репарировать окислительные повреждения ДНК на поздних стадиях эмбрионального развития.

Активность AP-эндонуклеазы, следующего участника пути ЭРО, находится на относительно высоком уровне в течение всего эмбриогенеза. Это показывает важность репарации апурин-апиримидиновых сайтов, которые являются серьезным нарушением структуры ДНК и приводят к остановке репликативной вилки, что очень существенно для активно делящихся клеток эмбриона. AP-эндонуклеаза расщепляет как спонтанно возникающие AP-сайты, так и AP-сайты, появляющиеся в результате действия ДНК-гликозилаз. На фоне возрастающей активности урацил-ДНК-гликозилазы последняя функция AP-эндонуклеаз может играть существенную роль, хотя статистически достоверной корреляции между этими двумя активностями не наблюдается (r = 0,132, p > 0,05).

Полимеразная активность экстрактов характеризуется нестандартным профилем - высокая активность на ранних стадиях развития, которая затем падает, но на стадии вылупления бластулы происходит значительный всплеск. Возможно, падение обусловлено тем, что в первые часы развития активная репликация ДНК в эмбрионе происходит за счет фонда ДНК-полимераз, запасенного в яйцеклетке. Постепенно этот фонд расходуется, что приводит к падению удельной активности. На стадии же вылупления бластулы всплеск может быть обусловлен началом экспрессии собственных генов полимераз эмбриона. Дальнейшее определение полимеразной активности затруднено ввиду возрастания общей нуклеазной активности в экстрактах.

ВЫВОДЫ

1. Показано наличие активности урацил-ДНК-гликозилазы в экстрактах эмбрионов Strongylocentrotus intermedius на ранних стадиях развития. Показано, что удельная активность этого фермента резко возрастает после стадии вылупления бластулы и достигает максимума к стадии формирования личинки (плутеуса).

2. Показано наличие активности 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазы на ранних стадиях развития эмбрионов S. intermedius. Измерена удельная активность этого фермента, показано ее существенное снижение с развитием эмбриона.

3. Показано наличие активности апурин-апиримидиновой эндонуклеазы экстрактах эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития. Показано, что удельная активность этого фермента в целом возрастает с развитием, однако на поздних стадиях становится трудно детектируемой за счет возрастания общей нуклеазной активности.

4. Измерена общая активность ДНК-полимераз в клеточных экстрактах эмбрионов S. intermedius на разных стадиях развития. Показано, что удельная ДНК-полимеразная активность максимальна в первые три часа развития, после чего происходит существенный спад, однако на стадии вылупления бластулы имеет место заметный всплеск активности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. von Sonntag C. Free-Radical-Induced DNA Damage and Its Repair: A Chemical Perspective. - Berlin-Heidelberg: Springer, 2006. - 523 pp.

2. Nathan C., Shiloh M. U. Reactive oxygen and nitrogen intermediates in the relationship between mammalian hosts and microbial pathogens. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. - 2000. - Vol. 97. - № 16. - p. 8841-8848.

3. Schrader C. E., Linehan E. K., Mochegova S. N., Woodland R. T., Stavnezer J. Inducible DNA breaks in Ig S regions are dependent on AID and UNG. // J. Exp. Med. - 2005. - Vol. 202. - № 4. - p. 561-568.

4. Cadet J., Douki T., Gasparutto D., Ravanat J.-L. Oxidative damage to DNA: Formation, measurement and biochemical features. // Mutat. Res. - 2003. - Vol. 531. - № 1-2. - p. 5-23.

5. Zharkov D. O. Base excision DNA repair. // Cell. Mol. Life Sci. - 2008. - Vol. 65. - № 10. - p. 1544-1565.

6. Wood M. L., Dizdaroglu M., Gajewski E., Essigmann J. M. Mechanistic studies of ionizing radiation and oxidative mutagenesis: Genetic effects of a single 8-hydroxyguanine (7-hydro-8-oxoguanine) residue inserted at a unique site in a viral genome. // Biochemistry. - 1990. - Vol. 29. - № 30. - p. 7024-7032.

7. Turk P. W., Laayoun A., Smith S. S., Weitzman S. A. DNA adduct 8-hydroxyl-2'-deoxyguanosine (8-hydroxyguanine) affects function of human DNA methyltransferase. // Carcinogenesis. - 1995. - Vol. 16. - № 5. - p. 1253-1255.

8. Shapiro R., Klein R. S. The deamination of cytidine and cytosine by acidic buffer solutions. Mutagenic implications. // Biochemistry. - 1966. - Vol. 5. - № 7. - p. 2358-2362.

9. Hill-Perkins M., Jones M. D., Karran P. Site-specific mutagenesis in vivo by single methylated or deaminated purine bases. // Mutat. Res. - 1986. - Vol. 162. - № 2. - p. 153-163.

10. Wuenschell G. E., O'Connor T. R., Termini J. Stability, miscoding potential, and repair of 2'-deoxyxanthosine in DNA: Implications for nitric oxide-induced mutagenesis. // Biochemistry. - 2003. - Vol. 42. - № 12. - p. 3608-3616.

11. Greer S., Zamenhof S. Studies on depurination of DNA by heat. // J. Mol. Biol. - 1962. - Vol. 4. - - p. 123-141.

12. Lindahl T., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. // Biochemistry. - 1972. - Vol. 11. - № 19. - p. 3610-3618.

13. Chen Y.-H., Bogenhagen D. F. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. // J. Biol. Chem. - 1993. - Vol. 268. - № 8. - p. 5849-5855.

14. Sun B., Latham K. A., Dodson M. L., Lloyd R. S. Studies of the catalytic mechanism of five DNA glycosylases: Probing for enzyme-DNA imino intermediates. // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. - № 33. - p. 19501-19508.

15. Fortini P., Dogliotti E. Base damage and single-strand break repair: Mechanisms and functional significance of short- and long-patch repair subpathways. // DNA Repair. - 2007. - Vol. 6. - № 4. - p. 398-409.

16. Lee H.-M., Hu Z., Ma H., Greeley G. H., Jr, Wang C., Englander E. W. Developmental changes in expression and subcellular localization of the DNA repair glycosylase, MYH, in the rat brain. // J. Neurochem. - 2004. - Vol. 88. - № 2. - p. 394-400.

17. Dengg M., Garcia-Muse T., Gill S. G. Abrogation of the CLK-2 checkpoint leads to tolerance to base-excision repair intermediates. // EMBO J. - 2006. - Vol. 10. - - p. 1046-51.

18. Hildrestrand G. A., Diep D. B., Kunke D., Bolstad N., Bjшrеs M., Krauss S., Luna L. The capacity to remove 8-oxoG is enhanced in newborn neural stem/progenitor cells and decreases in juvenile mice and upon cell differentiation. // DNA Repair. - 2007. - Vol. 6. - № 6. - p. 723-732.

19. Kim N. K., Lee S. H., Sohn T. J., Roy R., Mitra S., Chung H. M., Ko J. J., Cha K. Y. Spatial expression of a DNA repair gene, N-methylpurine-DNA glycosylase (MPG) during development in mice. // Anticancer Res. - 2000. - Vol. 20. - № 5A. - p. 3037-43.

20. Shi L., Kent R., Bence N., Britt A. B. Developmental expression of a DNA repair gene in Arabidopsis. // Mutat. Res. - 1997. - Vol. 384. - № 3. - p. 145-156.

21. Meyer-Siegler K., Rahman-Mansur N., Wurzer J. C., Sirover M. A. Proliferative dependent regulation of the glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase/uracil DNA glycosylase gene in human cells. // Carcinogenesis. - 1992. - Vol. 13. - № 11. - p. 2127-32.

22. Choi Y., Gehring M., Johnson L., Hannon M., Harada J. J., Goldber R. B., Jacobsen S. E., Fischer R. L. DEMETER, a DNA glycosylase domain protein, is required for endosperm gene imprinting and seed viability in Arabidopsis. // Cell. - 2002 -Vol. 110. - № 1. - p. 33-42.

23. Rai K., Huggins I. J., James S. R., Karpf A. R., Jones D. A., Cairns B. R. DNA demethylation in zebrafish involves the coupling of a deaminase, a glycosylase, and Gadd45. // Cell. - 2008. - Vol. 135. - № 7. - p. 1201-1212.

24. Zhu B., Zheng Y., Angliker H., Schwarz S., Thiry S., Siegmann M., Jost J.-P. 5-Methylcytosine DNA glycosylase activity is also present in the human MBD4 (G/T mismatch glycosylase) and in a related avian sequence. // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - № 21. - p. 4157-4165.

25. Zhu B., Zheng Y., Hess D., Angliker H., Schwarz S., Siegmann M., Thiry S., Jost J. P. 5-methylcytosine-DNA glycosylase activity is present in a cloned G/T mismatch DNA glycosylase associated with the chicken embryo DNA demethylation complex. // Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. - 2000. - Vol. 97. - № 10. - p. 5135-9.

26. Jost J. P., Fremont M., Siegmann M., Hofsteenge J. The RNA moiety of chick embryo 5-methylcytosine- DNA glycosylase targets DNA demethylation. // Nucleic Acids Res. - 1997. - Vol. 25. - № 22. - p. 4545-4550.

27. Jost J. P., Schwarz S., Hess D., Angliker H., Fuller-Pace F. V., Stahl H., Thiry S., Siegmann M. A chicken embryo protein related to the mammalian DEAD box protein p68 is tightly associated with the highly purified protein-RNA complex of 5-MeC-DNA glycosylase. // Nucleic Acids Res. - 1999. - Vol. 27. - № 16. - p. 3245-52.

28. Gilbert S.F. Developmental Biology. - Sunderland: Sinauer Associates, 2010. - 711 pp.

29. Masuda M., Sato H. Asynchronization of cell divisions is concurrently related with ciliogenesis in sea urchin blastulae. // Dev. Growth. Diff. - 1984. - Vol. 26. - № 3. - p. 281-294.

30. Lepage T., Sardet C., Gache C. Spatial expression of the hatching enzyme gene in the sea urchin embryo. // Dev. Biol. - 1992. - Vol. 150. - № 1. - p. 23-32.

31. Brooks J. M., Wessel G. M. The major yolk protein in sea urchins is a transferrin-like, iron binding protein. // Dev. Biol. - 2002. - Vol. 245. - № 1. - p. 1-12.

32. Yokota Y., Unuma T., Moriyama A., Yamano K. Cleavage site of a major yolk protein (MYP) determined by cDNA isolation and amino acid sequencing in sea urchin, Hemicentrotus pulcherrimus. // Comp. Biochem. Physiol. - 2003. - Vol. 135. - № 1. - p. 71-81.

33. Астауров Б.Л. Объекты биологии развития. - М.: Наука, 1975. - 216 pp.

34. Shastina V.V., Menzorova N.I., Sibirtsev Y.T., Rasskazov V.A. Purification and characteristics of Ca²⁺,Mg²⁺- and Ca²⁺,Mn²⁺-dependent and acid DNases from spermatozoa of the sea urchin Strongylocentrotus intermedius. // Biochemistry (Mosc.). - 2003. - Vol. 68. - № 5. - p. 582-592.

35. Сибирцев Ю.Т., Мензорова Н.И., Шастина В.В., Рассказов В.А. Множественность ДНКаз в спермиях морского ежа Strongylocentrotus intefmedius. // Докл. РАН. - 2001. - Vol. 367. - № 1. - p. 117-119.

Размещено на Allbest.ru