Екстремальні гіпертермофільні археї

5. ЕНЕРГЕТИЧНИЙ МЕТАБОЛІЗМ ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ АРХЕЙ

Енергетичний метаболізм екстремальних архей досить своєрідний. Він облігатно чи факультативно зв'язаний з метаболізмом молекулярної сірки. Основні способи отримання енергії включають аеробне чи анаеробне (сірчане) дихання, а також бродіння[2]. Сучасні дослідження доводять, що для будь -якого типу метаболізму існують певні температурні обмеження., що пов'язані з термостабільністю і оптимумами дії ферментативних систем, мембран та інших макромолекул у екстремальних умовах довкілля. Так, граничним фототрофом вважають термофільну ціанобактерію Synechococcus lividus, хемоорганотрофами -- архебактерії Pyrodictium occultum та Acidianus infernus, хемолітотрофами - гіпертермофіли Ferroglobus placidus (донор електронів Fe2+ або S ), Pyrolobus fumarii (донор електронів H₂, темп. оптимум 113°C); а також архей роду Pyrodictium ( рисунок 9)[10].

Рисунок 9 -- Температурні ліміти типів метаболізму прокаріотичних організмів[10].

Хемоорганотрофи використовують органічні сполуки як джерело енергії для росту і розвитку. Катаболізм глюкози відбувається модифікованим шляхом Ентнера - Дудорова (КДФГ-шлях). Дані аналізу проміжних продуктів розщеплення глюкози в екстрактах клітин і кінцевих продуктів перетворення пірувату в інтактних клітинах досліджених гіпертермофільних прокаріот показують, що співвідношення шляхів розщеплення глюкози у представників архей і бактерій різняться[2]. У клітинах архебактерій Thermococcus celer і Thеrmососсus litoralis глюкоза перетворюється на ацетат і аланін через модифікований шлях Ембдена-Мейергофа-Парнаса, що включає АТФ-залежну гексокіназу, АДФ-залежну 6-фосфофруктокіназу і гліцеральдегід-3-фосфат:ферредоксин оксидоредуктазу. В архебактерії Desulfurococcus amylolyticus ацетат утворюється з глюкози модифікованим шляхом Ентнера - Дудорова (КДФГ-шлях), в якому функціонують гліцеральдегід-3-фосфатдегідрогеназа/фосфогліцераткіназа[49]. У клітинах Thermoproteus tenax глюкоза перетворюється на ацетат і аланін по шляху Ембдена-Мейергофа-Парнаса і шляху Ентнера-Дудорова одночасно у співвідношенні 85:15 відповідно[40]. В аеробної архебактерії Sulfololus acidocaldarius глюкоза розщеплюється лише по КДФГ-шляху з утворенням ацетату і аланіна[5]. На основі цих даних дослідник М. Селідж зробив висновок, що гіпертермофільні археї розщепляють глюкозу до пірувату або по модифікованому шляху Ембдена-Мейергофа-Парнаса, або по нефосфорилюючому шляху Ентнера-Дудорова, або їх комбінації[40] Група німецьких дослідників на чолі з Ахмедом при дослідженні метаболізму гіпертермофіла Thermoproteus tenax частково підтвердила висновки Селідж. Окрім цього вони висунули гіпотезу, що наявність таких двох паралельних шляхів катаболізму відіграє певну роль в термоадаптації. Адже проміжні інтермедіати метаболічних шляхів мали великий період напіврозпаду ( наприклад, дигідроксиацетон-фосфат - 79,4 хвилини, 1,3 - дифофогліцерат - 1,6 хвилини при температурі 60°C) і можуть слугувати крайнім ресурсом для термоадаптації[49]. Окислення ацетату до CO₂ проходить через цикл цикл трикарбонових кислот або Acetyl-CoA шляхом. Електрон-транспортні ланцюги містять цитохроми типу а, b і існують в деяких архей. Тому, електрони, відщеплюючись від органічних субстратів передаються через даний ланцюг до кінцевого акцептора з утворенням енергії АТФ шляхом генерації мембранного потенціалу і роботи водневих помп в ЦПМ[7].

Хемолітотрофи використовують в якості донорів електронів для енергетичних потреб різноманітні неорганічні сполуки ( Таблиця 5.1)[2].

Більшість поданих реакцій спрямовані на утилізацію молекулярного водню -- головного компонента магматичних газів. Крім того, такі перетворення характеризують метаногенезис, сульфатне, залізне, сірчане, нітратне дихання, властиві хемолітотрофним гіпертермофільним архебактеріям. Перераховані в таблиці 5.1 способи енергетичного існування цієї групи бактерій не вичерпують усіх, досліджених до нашого часу у окремих представників. Це засвідчує широке різноманіття використання неорганічних сполук для енергетичних потреб, що стало життєво необхідним пристосуванням в характерних гіпертермофільних біотопах.

Таблиця 5.1 - Енергозапасаючі реакції хемолітотрофних гіпертермофілів[28].

*) Факультативні гетеротрофи

6. МЕХАНІЗМИ ТЕРМОФІЛІЇ ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ АРХЕЙ

Очевидним є те, що різноманітні пристосування на всіх рівнях організації живого - від молекулярного до екосистемного - формуються за допомогою генотипічного і фенотипічного механізмів, які зазвичай тісно переплетені[9]. Генотипічні адаптації склалися впродовж безлічі поколінь і пов'язані з природним відбором - вони “записані” в геномі. При сезонних або більш короткочасних (декілька тижнів) коливаннях температури адаптаційні механізми мають фенотипічну природу, вони формуються впродовж одного покоління, оборотні і “не записані” в геномі. Для гіпертермофільних архей характерні пристосування обох типів, що отримали назву термофілії[10].

Її хімічні і біохімічні основи поки нез'ясовані, але для даної групи архей показана виключна термостабільність ряду ферментів і особлива будова клітинних стінок, мембран і ліпідів, а також виявлені механізми підтримання стабільності подвійної спіралі ДНК[2]. Це свідчить про те, що термофілія включає безліч молекулярних механізмів і не може бути пояснена лише якою-небудь однією властивістю організму. Розглянемо докладніше запропоновані гіпотези для пояснення природи термофілії.

6.1 Термостабільність ліпідів і мембран

У гіпертермофільних архей не знайдені звичайні для еубактерій ефіри гліцерину і жирних кислот, але присутні ефіри, утворені шляхом конденсації гліцерину з терпеноїдними спиртами: диефір складається з гліцерину, зв'язаного простими ефірними зв'язками з двома молекулами С₂₀ - спирту фітанолу (3,7,11,15-тетраметилгексадесіл); тетраефір утворений двома залишками гліцерину, з'єднаного двома однаковими парами С₄₀ - біфітанільних ланцюгів, що можуть бути ациклічними або містити від 1 до 5 п'ятичленних кілець циклопентану ( рисунок 6.1)[33]. Саме наявність таких кілець в структурі ліпідів гіпертермофілів сприяє стабілізації мембран, знижуючи її латеральну рухливість і забезпечуючи функціонування за високих температур[2]. При її підвищенні кількість ланцюгів з циклічними структурами зростає, з ациклічними - зменшується, крім того від температури залежить і кількість кілець в ланцюгу. Велику роль у підтримці текучості мембран відіграють, також, ліпіди з розгалудженими ланцюгами (наприклад, для Sulfolobus)[33].

1 - фітаніловий диефір гліцерину; 2 - біфітаніловий тетраефір дігліцерину; 3 - ізопреноїд із полярних ліпідів, що містить п'ятичленні циклічні групи; обведені полярні області; R - залишки фосфатів чи сахарів[2].

Рисунок 10 -- Ліпіди гіпертермофільних архебактерій.

Унікальні ліпіди - макроциклічний археол, трансмембранний калдархеол - знижують проникність мембран в 10-17 разів. Архебактеріальні мембрани in vitro утворюють везикули діаметром 20-150 мкм, для яких поверхневий натяг на кордоні повітря-вода становить 32-37 mN/m при 20-70 °C (для порівняння - поверхневий натяг мембранних ліпідів еубактерій - 54-56 mN/m при 20-70 °C )[50]. Організація клітинних мембран у вигляді ліпідного моношару значно підвищує їх жорсткість в порівнянні з бішаром, а також запобігає частим розривам і пошкодженням[2].

На основі таких даних можна зробити висновок, що ліпіди відіграють певну роль в молекулярних механізмах термофілії, сприяючи термостабільності мембран, і в тому, що нижня температура росту гіпертермофілів визначається температурою плавлення мембранних ліпідів[10].

6.2 Термостабільність білків і ферментів

Багато дослідників вважають, що визначальна роль в термофілії належить білкам, в першу чергу ферментним. Виділяють декілька основних факторів їх термостабільності :

1.Особливості амінокислотного складу.

При температурах вище 100°C, стабільність амінокислот знижується в ряду: (Val,Leu)>Ile>Tyr>Lys>His>Met>Thr>Ser> Trp>(Asp, Glu, Arg, Cys) [51]

Виходячи з відносно повільного росту гіпертермофільних архей, період напіврозпаду найбільш нестабільних амінокислот значно коротший ніж

період регенерації цих організмів. Тому деякі амінокислоти проходять прискорену ковалентну модифікацію, що включає дезамінування, ?-окислення, гідроліз, утворення дисульфідних містків та інші реакції, за максимальної температури, тиску і крайніх значень pH, які гіпертермофіли можуть витримувати[52]. Деякі амінокислоти більш стійкіші, знаходячись в гідрофобному ядрі протеїнів, ніж у водних розчинах. Незважаючи на це, Asp, Glu, Arg, Cys зустрічаються в термостабільних варіантах деяких загальних білків значно рідше[18]. Крім цього, додатковий захист архебактеріальних білків від денатурації в екстремальних умовах забезпечується збільшенням вмісту неполярних амінокислотних залишків (наприклад, для протеїнів Pyrococcus furiosus співвідношення неполярних і полярних амінокислотних залишків складає 3 : 1)[7]

2. Гідрофобні взаємодії.

Щільно, ефективно упаковане гідрофобне ядро є загальною особливістю термостійких глобулярних протеїнів гіпертермофілів[18]. Слід зазначити, що в даний час вплив температури на гідрофобні взаємодії активно вивчається, але однозначної відповіді все ще не знайдено. Є свідчення, що збирання субодиниць термостійкого ферменту глутаматдегідрогенази проходить лише за високих температур завдяки гідрофобним взаємодіям. Причому за відносно помірних умов частково зібрані ферменти знаходяться в „замороженому” стані, а включаються лише за оптимальної температури[53]. Ця система демонструє пристосованість гіпертермофілів до високотемпературних умов проживання.

3. Іонні взаємодії.

Кислотні чи основні бокові групи амінокислотних ланцюгів на поверхні субодиниць або доменів ферментів сприяють їх кооперативному зв'язуванню[18]. Іонні взаємодії за природою діють на значно більш довших радіусах ніж гідрофобні, і є відносно стійкішими до змін структури води за високих температур. Тому найбільш широко поширені мережі іонних взаємодій спостерігаються в протеїнах екстремальних гіпертермофілів (наприклад, глутаматдегідрогенази Pyrococcus furiosus) порівняно з відповідними в термофілах або мезофілах[53].

4. Кооперативна Асоціація.

Міжмолекулярні асоціації можуть попередити процес дисоціації мономерів олігомерних білків. Тому багато ферментів, які в мезофілах знаходять мономерними, в гіпертермофільних представників формують олігомери. (Наприклад, хорізматмутаза Methanococcus jannaschii в процесі термоадаптації набула тетрамерної організації)[54].

5.Фіксація білкових N-,C-кінців.

Доведено, що термінальні N-,C-кінці багатьох гіперстабільних білків зафіксовані для запобігання розплітанню і денатурації протеїнів ( Наприклад, кінцева карбоксильна група димерної гіпертермофільної цитратсинтази, знаходячись в місці з'єднання мономерів, захищена від негативних взаємодій і від самочинного вивільнення )[18].

6.Великий вклад в термостабільність вносять також координаційні,

водневі, дисульфідні та ароматичні зв'язки, а також додаткова стабілізація

Ь-спіралей глобулярних білків[10].

Для гіпертермофілів характерна наявність великої кількості шаперонів. Термостабільні білки теплового шоку (шаперони сімейств Hsp60 і Hsp70) при зв'язуванні з іншими протеїнами роблять їх стійкішими до нагрівання. Так, в гіпертермофільних архебактерій роду Pyrodictium 80 % цитоплазматичних білків - шапероніни, що складаються з декількох субодиниць - шаперонів сімейства Hsp60. Шапероніни архей близькі по будові еукаріотичним, складаються з 3 різних мономерів, утворюючи 8- і 9-членні кільця. Шаперони сімейства Hsp90 в архей поки не знайдені[55].

Слід додати, що основні температурні точки гіпертермофілів залежать від конформації одного або декількох ключових ферментів: при мінімальних температурах білкові молекули переходять до жорсткої неактивної конформації; оптимальна температура визначає найбільш сприятливий конформаційний стан ферментних білків; при максимальній температурі починаються порушення структури білків і зниження їх ферментативної активності, а за вищих температур ріст організмів припиняється унаслідок теплової денатурації білків[2].

6.3 Термостабільність ДНК та інших нуклеїнових кислот

Стійкість ДНК до денатурації в екстремальних умовах проживання гіпертермофільних архей може забезпечуватися ДНК-зв'язуючими білками - аналогами гістонів еукаріот, поліамінами, відносно високим вмістом нуклеотидних залишків G і C[7]. Зв'язування гістонів з еукаріотичними ДНК призводить до її негативної спіриалізації, тоді як для комплексів ДНК з білком HMf архей Methanobacteriales характерна позитивна суперспіриалізація[56]. Клітинні поліаміни, що стабілізують ДНК і вторинні структури РНК, в гіпертермофільних архей досить різноманітні: лінійні триаміни (спермідин, норспермідин і гомоспермідин), тетрааміни (спермін і норспермін), пента- і гексааміни, гуанідоамін (агматин), четвертинний пентаамін N4-біс(амінопропіл)спермідин та ацетильований пентаамін [57].

Крім цього, денатурація ДНК за високих температур зменшується завдяки присутності стабілізуючого фактора -- циклічного 2,3- дифосфогліцерата ( в присутності K⁺ ), але лише в деяких гіпертермофілах[10]. Незначна кількість ДНК-зв'язуючих білків, названих Sac7d, виявлена в членів роду Sulfolobus (Сrenarchaeotа ), вони підвищують температуру плавлення ДНК приблизно на 40°C [33] . Натомість Euryarchaeotа містять вищезгадані гістоноподібні протеїни, які зумовлюють компактну укладку ДНК в подібні до нуклеосоми структури, захищаючи її таким чином від теплової денатурації.

Серед гіпертермофільних архей діють ефективні механізми репарації та відновлення нативної структури ДНК. Так, американський мікробіолог Денніс Гроган виявив в Sulfolobus acidocaldarius особливий світлозалежний процес відновлення пошкоджених ділянок ДНК, відомий як „фотооживлення” [56]. Цікавим виявилось те, що даний механізм відмінно працював лише за кімнатних температур, які далекі від оптимальних для даної групи мікроорганізмів, а також те, що пошкодження ДНК, здійснені ультрафіолетовим випромінюванням, були більш відчутнішими, ніж здійснені високою температурою. Можливо, в термальних біотопах головним агресивним щодо ДНК фактором є короткохвильова частина сонячного спектра, ніж екстремально високі температури.

6.4 Межі термоадаптації

Лабораторні дослідження доводять, що межі високотемпературної витривалості екстремальних архей лежать в діапазоні від 140 до 150°C[33]. Такі умови в природі реалізуються лише в глибоководних гідротермальних джерелах ( типу „ чорних курців”). З'являються дані про ідентифікацію архей за температур більш ніж 250°C[2]. Це видається можливим завдяки високим тискам за яких вода не кипить, бо життєво необхідною умовою існування є наявність води саме в рідкому агрегатному стані[12]. Цікавим видається те, що в таких випадках АТФ не може слугувати енергетичним ресурсом, бо переходить в інші нестабільні форми[33]

Розібрані вище гіпотези, імовірно, вносять певний вклад в механізми термофілії, доповнюючи один одного, хоча не виключено, що молекулярні механізми цього явища можуть бути значно ширше і для їх розуміння необхідні додаткові дослідження.

7. КОРОТКА ХАРАКТЕРИСТИКА ОКРЕМИХ ПРЕДСТАВНИКІВ ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ АРХЕЙ

Тип: Nanoarchaeota. Рід: Nanoarchaeum. Вид: Nanoarchaeum equitans

Nanoarchaeum equitans (або наноархей) - унікальний вид гіпертермофільних архей, знайдений в 2002 році в гідротермальних джерелах біля узбережжя Ісландії німецьким мікробіологом Карлом Шеттером (Karl Stetter), єдиний відомий до теперішнього часу представник типу Nanoarchaeota [26]. Може розвиватися лише в кокультурі з археями роду Ignicoccus з царства Crenarchaeota, що є унікальним явищем серед екстремальних архей. На одній клітині Ignicoccus паразитує від 2 до 4 клітин Nanoarchaeum equitans, діаметр яких 0,35-0,50 мкм ( Рисунок 7.1) - це одні з найменших живих організмів [23]. Клітинна стінка наноархей складається з S-шару, який, здається, вкриває периплазматичний простір. У місці їх контакту прикріплювальних структур не виявлено [33]. Відділення Nanoarchaeum equitans від клітин Ignicoccus може бути викликане м'яким ультразвуковим опроміненням. При культивуванні кокультури в штучних умовах на пізній експоненціальній фазі росту спостерігалося самостійне відділення близько 80% клітин Nanoarchaeum equitans від Ignicoccus [58].

Метаболізм Nanoarchaeum equitans поки не відомий. Вони не розмножуються у відсутності живих клітин Ignicoccus. Nanoarchaeum equitans строгі анаероби. Оптимальна температура проживання цих архей складає 90°C[58].

Рисунок 11 -- Електронні мікрофотографії клітин Nanoarchaeum equitans (менші) на поверхні Ignicoccus штаму Kin 4M (більші) [23].

Їх геном повністю секвенований і складає 490 885 пар основ. Це найменший геном (менше лише у вірусів), який поки що вдалося зафіксувати. В Nanoarchaeum equitans залишилися лише гени, що відповідають за біосинтез білка, реплікацію, транскрипцію і трансляцію, 95 % генома кодують білки. Nanoarchaeum equitans не можуть синтезувати ліпіди, нуклеотиди і амінокислоти отримуючи їх від Ignicoccus, можливо вони також залежать від енергетичного метаболізму господаря[26]. Швидкість росту Ignicoccus в чистій культурі і кокультурі з Nanoarchaeum equitans не відрізняється, лише дуже велике число наноархей пригнічує розвиток Ignicoccus. У зв'язку з цим Nanoarchaeum equitans можна розглядати як паразитів, що робить їх єдиними відомими паразитами серед архей[10].

Nanoarchaeum equitans виділені з гарячих сірчаних джерел Серединно-атлантичного хребта на глибині 106 м. Пізніше 16s рРНК наноархей з послідовностями, схожими на Nanoarchaeum equitans, виявили в чорних курцях Тихого океану, у гейзерах Йеллоустона і Камчатки. Методом FISH встановлено, що всі Nanoarchaeota прикріпляються до клітин інших архей, тому паразитизм може бути характерною ознакою всього типу[58].

Тип: Euryarchaeota. Рід: Thermococcus.

Вид: Thermococcus kodakaraensis

Раніше відомий як представник роду Pyrococcus, Thermococcus kodakarensis - гіпертермофільний архей, метаболізм якого пов'язаний з молекулярною сіркою; зазвичай населяє морські гідротермальні джерела і наземні гарячі сірковмісні сольфатари. Вперше був виявлений в сольфатарах острова Кодакара (Японія), завдяки якому і отримав свою назву. Цей унікальний мікроорганізм представляє значний інтерес для науковців, оскільки розвинув особливі механізми адаптації до надзвичайно високотемпературних умов. Крім цього, він виробляє комерційно цінні термостійкі ДНК-полімерази та інші ферменти, які використовуються для реалізації ПЛР (Полімеразної Ланцюгової Реакції)[19]. Thermococcus kodakarensis росте за оптимальної температури 86°C, в діапазоні 60-100°C, і при pH 5-9. Клітини мають форму нерегулярних кокків (1-2 мкм в діаметрі) з єдиною ліпідною мембраною і рухливі завдяки полярним жгутикам ( Рисунок 7.2)[23]. Це строгі анаероби що окрім сірки, використовують як джерела вуглецю та енергії амінокислоти, пептиди, піруват та крохмаль. Метаболічні шляхи T. kodakarensis включають глюконеогенезис і гліколіз; продукти метаболізму - водень і сірководень[33].

Рисунок 12 --Мікрофотографія характерної клітини гіпертермофільної археї Thermococcus kodakarensis[23]

Нещодавно японські біохіміки виявили в Thermococcus kodakarensis незвичайний спосіб фіксації вуглекислого газу, що відрізняється від циклу Кальвіна безпосередньою участю в ньому рибонуклеотидов (АМФ).Можливо, цей спосіб фіксації неорганічного вуглецю найдревніший з тих, що були відомі до цих пір[59].Thermococcus kodakarensis відіграють важливу роль в екології гідротермальних систем і зустрічаються в багатьох гіпертермофільних мікробних співтовариствах.

Тип: Crenarchaeota. Рід: Pyrodictium. Вид: Pyrodictium occultum

Pyrodictium occultum - яскравий представник гіпертермофільних архей з оптимальною температурою росту приблизно в межах 80°C-105°C, метаболізм якого тісно пов'язаний з молекулярною сіркою. Має унікальну клітинну структуру, що включає мережу порожнистих канальців і плоских, дископодібних клітин -- 0.3 - 2.5 мікрон в діаметрі і аж до 3 мікрон в ширину ( Рисунок 13)[43].



Рисунок 13 -- Мікрофотографія дисків і канальців Pyrodictium occultum[43].

Поки точна причина такої морфології невідома, ймовірно, що діапазон рухливості, забезпечений порожнистими канальцями, дозволяє клітинам вільно переходити в найбільш сприятливі місця існування, дозволяючи Pyrodictium occultum населяти різноманітні щілини в глибоководних пористих стінках гідротермальних джерел „чорних.курців”[10].

Екологічна роль даних архей досі нез'ясована через труднощі виділення непошкоджених клітин мікроорганізмів і недослідженість природних біотопів Pyrodictium.

8. ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ І ВИКОРИСТАННЯ В БІОТЕХНОЛОГІЇ

Практичне використання гіпертермофільних архей перш за все пов'язане з комерційною цінністю їх термостабільних ферментів, до яких прикутий зростаючий інтерес з боку наукових та індустріальних кіл. З появою потужних сучасних інструментів молекулярної біології та значної кількості описаних і виділених гіпертермофільних ензимів, їх впровадження в нові технологічні процеси зростає з року в рік[43]. Але на даний час використовують лише невелику частину відомих термостабільних ферментів і тому доцільно розглянути й подальші перспективи на наступні роки.

8.1 Використання в молекулярній біології

Найбільш поширеного використання набули термостабільні ДНК-полімерази (Tfu-ДНК-полімерази) з гіпертермофільних архей Pyrococcus furiosus, оптимум роботи яких знаходиться в області 72°С; їх впровадження в метод ПЛР призвело до забезпечення як високої процесивності (протяжності ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в результаті швидкості синтезу), так і високої точності копіювання ДНК [19]. Крім того, що ця полімераза витримує високу (94--96°C) температуру, необхідну для денатурації ДНК, у неї присутній механізм корекції помилок у 3'>5' напрямку (3'>5' екзонуклеазна активність)[54].Такі полімерази дозволили значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в копійованій послідовності ДНК, якісно вдосконаливши метод ПЛР, що в наш час широко використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування, для створення генетично модифікованих організмів, діагностики захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК, встановлення батьківства.

Крім того комерційну цінність мають термостабільні ДНК-лігази (оптимум дії в межах 45 до 80°C; період напіврозпаду: 1 год. при 95°C), метіонін-амінопептидази ( опт. активність при 85-95°C, pH 7.0-8.0; стабільність: 1 год. при 75°C), серинові протеази (опт. при 85-95°C, pH 6.0-8.0; стабільність: 80% після 3 год. при 95°C), виділені з Pyrococcus furiosus, які використовують в методах ампліфікації ДНК, генної інженерії та деяких біохімічних процедурах[18].

8.2 Використання в промислових процесах гідролізу крохмалю

Технологічні процеси обробки крохмалю включають його гідроліз до глюкозних, мальтозних або інших олігосахаридних сиропів, які потім використовують як субстрати бродіння для отримання різноманітних органічних сполук (наприклад, етанолу лізину і лимонної кислоти. Біогідроліз крохмалю включає дві стадії, плавлення і сахарифікацію, які проходять за високих температур. Протягом першої крохмаль плавиться до гомогенної густої маси протягом 5 хвилин за температури від 105 до 110°C у водному розчині (pH 5.8 до 6.5) а потім частково гідролізується по Ь -1,4 зв'язках термостабільними Ь-амілазами при 95°C за 2 чи 3 години. Температура і pH строго контролюються ( якщо вона впаде нижче 105°C, відбудеться неповний розплав крохмалю, який може викликати проблеми при фільтрації; якщо ж збільшиться вище 105°C - то Ь-амілази інактивуються ). Протягом наступної стадії - сахарифікації -- pH знижують до 4.2 до 5.0, а температуру -- до 55 до 60°C; при цьому крохмаль перетворюється на низько-молекулярні полісахариди аж до глюкози чи мальтози. Сиропи глюкози (до 95 -- 96%) виробляються з використанням пуллуланази і глюкоамілази в комбінації, сиропи мальтози (до 80 до 85%) -- з використанням пуллуланази та в-амілази [60]. До нашого часу для даних потреб використовували ферменти термофілів (Bacillus licheniformis, Bacillus stearothermophilus та інших), але гіпертермофільні археї виробляють значно більш термостабільні ензими. Їх використання дозволяє підняти температуру технологічного процесу ( завдяки чому зменшується його час), здешевити його ( можна збільшувати концентрацію субстрату - крохмалю, менше використовувати ферменту - завдяки його тривалому періоду напіврозпаду ), знизити ризики бактеріального забруднення [18]. Впроваджуються Ь-амілази ( з оптимумом при 100°C, pH 5-6 ) отримані з Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei, Pyrodictium abyssi, Thermococcus profundus та ін.; амілопуллуланази з Pyrococcus furiosus ( опт. 105°C, pH 6.0; період напіврозпаду -- 44 години (90°C) в присутності 5 мM CaCl₂ ), Thermococcus hydrothermalis, Thermococcus litoralis, Thermococcus celer; глюкоамілази з Methanococcus jannaschii та деякі інші ферменти. Дані ензими можуть знайти практичне значення і в інших галузях промисловості [60].

8.3 Використання в інших промислових процесах

Слід відмітити, що на даний час в промисловості найчастіше використовують термостабільні ферменти гіпертермофільних бактерій, натомість архейні ензими значно менш поширені. З найбільш важливих можна відмітити естерази Pyrococcus furiosus ( опт. при 100°C, pH 7.6; період напіврозпаду - 2 години (120°C)), альдолази та цитохроми P450 з Sulfolobus solfataricus, що використовують в хімічному синтезі в реакціях трансестерефикації та стереоселективному гідроксилюванні[61]. В харчовій промисловості знаходять використання в-1,4-ендоглюканази з Pyrococcus furiosus ( опт. при 100°C, pH 6.0; період напіврозпаду - 1.6 години (105°C)), зокрема, для приготування кормів тварин [18]. Перспективним для використання є фермент цикломальтодекстрин глюканотрансфераза (опт. при 90-100°C, pH 5.0-5.5, період напіврозпаду - 40 хвилин (110°C)) отриманий з гіпертермофільних архей роду Thermococcus, що каталізує реакцію перетворення олігодекстринів до циклодекстринів, гідрофобні внутрішні області яких можуть захоплювати різні гідрофобні молекули [62]. Ця властивість циклодекстринів застосовується в харчовій, косметичній та фармацевтичній промисловостях, де вони використовуються для нейтралізації небажаних смаків або ароматів, стабілізують нестійкі суміші, збільшують водорозчинність гідрофобних субстанцій і захищають їх від небажаних перетворень [18]. Перспективи впровадження інших термостабільних ферментів дійсно вражають, адже велика кількість промислових процесів вимагає для ефективності високих температур, де ензими гіпертермофільних архей діють ідеально і можуть бути значно більш кориснішими за будь-які інші каталізатори.

ВИСНОВКИ

Дана робота засвідчує : гіпертермофільні археї представляють собою один з найсвоєрідніших класів живих істот. Поряд з доведеною древністю їх походження, висловлюється думка про те, що екстремофіли лежать біля витоків життя на планеті[28], тому можуть надати цінну інформацію про найзагальніші питання можливості самозародження життя на Землі чи будь-де в космосі. Виходячи з цього, в даній роботі була приділена увага саме тим аспектам їхньої природи, що відображали б основи життєдіяльності гіпертермофілів в термальних біотопах, без їх детального молекулярного розгляду в світлі порівняння з іншими типами живих істот. Беручи до уваги дане твердження, в цілому ціль роботи досягнута шляхом розв'язання поставлених задач :

1. Коротко викладена історія дослідження екстремальних архей засвідчила, що такі унікальні риси цих мікроорганізмів часто змушували вчених переглядати основні біологічні принципи : як правила Пастера, так і філогенетичні відносини, - для щоб знайти місце екстремалів в системі живого світу.

2. Вражаючі зайняті ними термальні біотопи, опису яких була приділена значна увага, засвідчили необхідність розуміння вироблених пристосувальних механізмів екстремалів протягом еволюційного розвитку.

3. Проблеми філогенетичного та таксономічного положення цієї групи мікроорганізмів, показані в світлі альтернативних класифікацій, наголосили на необхідності подальших досліджень архей.

4. Охарактеризовано загальні морфологічні та фізіологічні риси гіпертермофільних архей в умовах екстремальних факторів навколишнього середовища.

5. Широко розглянуто основні риси термоадапції молекулярних структур гіпертермофілів; висвітлено фактори, що впливають на їх стабільність.

6. Показані приклади успішного використання термостабільних ферментів з гіпертермофільних архей в різних галузях науки та народного господарства, їх переваги та перспективи.

Саме існування гіпертермофільних організмів засвідчує, що жива природа наділена неймовірною здатністю до пристосування в найбільш екстремальних системах Всесвіту. Їх вивчення - ключ до розгадки таємниці життя і походження людства.

ЛІТЕРАТУРА

1. Significant contribution of Archaea to extant biomass in marine subsurface sediments / J.S. Lipp, Y. Morono, F. Inagak, K.-U. Hinrichs // Nature. - 2008. - V. 454. - P. 991-994.

2. Гусев М.В., Минеева Л.В. Микробиология. - М.: Издательский центр «Академия», 2003. - С.408-436.

3. Лалаянц И. Микромир жизни: Ныряя под барьер!// Гены и история. - 1999. - №12. - 243 с.

4. Маркина Н. Жизнь на границе жизни // Наука и жизнь. -- 2002. -- №9. - С.20-24.

5. Hjort K., Bernander R. Cell cycle regulation in the hyperthermophilic crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius // Mol. Microbiol. - 2001. - V. 40. - Р. 225-234.

6. Extending the Sub-Sea-Floor Biosphere / Roussel E.G., С. Bonavita M.-A., Querellou J., Cragg B.A., Webster G., Prieur D., Parkes R.J. // Science. - 2008. -V. 320. - P. 1046.

7. Морозова О.В. Загадки архей и их фагов // Вестник ВОГиС. - 2005. - Т.9, №1 - С.55-66.

8. Несис К.Н. Микробы под дном океана и внеземная жизнь // Природа. - 2002. - №7. - 34 с.

9. Озернюк Н.Д. Температурние границы жизни // Природа. - 2003. - №2. - 68 с.

10. Brock T.D. Microbiology in Yellowstone at first focused on the basic scienceand ecology but gradually has expanded in scope // ASM News. - 1998. -V. 64, №3. - Р.137-140.

11. Stetter K.O. History of discovery of the first hyperthermophiles // Extremophiles. - 2006. - №10. - Р.357-362.

12. Рокова Н.Г. Жизнь в точке кипения //По материалам журнала Bild der Wissenschaft. - 1995. - № 7. - С. 55-67.

13. Castenholz R.W. Life in Thermal Habitats // Science.- 1979. - V. 203, №9. - Р.538 - 539.

14. Jongsareejit B. Hyperthermophilic Archaea // Silpakorn univercity International Journal. - 2008. - V. 8, №1 - Р.166-180.

15. Hurst L.D., Merchant A.R. High guanine-cytosine content is not an adaptation to high temperature: a comparative analysis amongst prokaryotes //

Proceedings. Biological sciences / The Royal Society. - 2001. - V.268, №1466. - Р.493-497.

16. Forterre P. A hot story from comparative genomics: reverse gyrase is the only hyperthermophile-specific protein // Trends Genetic.- 2002. - №18. - Р.236-237.

17. Atomi H., Matsumi R., Imanaka T. Reverse Gyrase Is Not a Prerequisite for Hyperthermophilic Life // Journal Bacteriol. - 2004. - V.186, №14. - Р.4829-4833.

18. Vieille C., Zeikus G.J. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 2001. - V.65, №.1. - Р.143-175.

19. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер. с англ. -- М.: Мир, 2002. -- 589 с.

20. Kashefi K., Lovley D.R. Extending the upper temperature limit for life // Science. - 2003. - V.301, №5635. - p. 934.

21. Cell proliferation at 122°C and isotopically heavy CH₄ production by a hyperthermophilic methanogen under high-pressure cultivation / Takai K., Nakamura K., Toki T., Tsunogai U., Miyazaki M., Miyazaki J., Hirayama H., Nakagawa S., Nunoura T., Horikoshi K. // Proceedings of the National Academy of Sciences.USA. - 2008. - V.105, №31. - Р.10949-10954.

22. Gold T. The deep, hot biosphere //. Proceedings of the National Academy of Sciences.USA. - 1992. - V.89. - P. 6045-6049.

23. Hyperthermophilic Microorganisms / Stetter K.O., Fiala G., Huber G., Huber R., Segerer A // FEMS Microbiology Letters. - 1999. - V.75, №3. - Р.170-184..

24. Biology of microorganisms / Brock T. D., Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J. - US.:Pearson Education, 2008. - Р.420-458.

25. Presence of Acetyl Coenzyme A (CoA) Carboxylase and Propionyl-CoA Carboxylase in Autotrophic Crenarchaeota and Indication for Operation of a 3-Hydroxypropionate Cycle in Autotrophic Carbon Fixation / Menendez C., Bayer Z., Huber H., Gad'on N., Stetter K.O., Fuchs G. // Journal of Bacteriology. - 1999. - №4. - Р.1088-1098.

26. The genome of Nanoarchaeum equitans: insights into early archaeal evolution and derived parasitism / Waters E., et al. - Proceedings of the National Academy of Sciences.USA. - 2003. V.100, №12984. - 8 р.

27. Hyperthermophily and the origin and earliest evolution of life / Islas S., Velasco A.M., Becerra A., Delaye L., Lazcano A. // Intеrnational Microbioljgy. - 2003. - №6. - Р.87-94.

28. Stetter K.O. Hyperthermophiles -Life in a Hot and Inorganic Environment // Nova Acta Leopoldina. - 2008. - V.96, №356. - Р.13-18.

29. A genome phylogeny for mitochondria among б-Proteobacteria and a predominantly eubacterial ancestry of yeast nuclear genes / Esser C., Ahmadinejad N., Wiegand C., Rotte C., Sebastiani F., Gelius-Dietrich G., Henze K., Kretschmann E., Richly E., Leister D., Bryant D., Steel M.A., Lockhart P.J., Penny D., Martin W. //Mol. Biol. and Evol. - 2004. - V. 21, № 9. - P. 1643-1660.

30. Шаталкин А.И. Высший уровень деления в классификации организмов. 3. Одноплёночные (Monodermata) и двуплёночные (Didermata) организмы // Журн. общ. биологии.- 2004. - Т. 65, № 3. - С. 195-210.

31.Gupta R.S. Protein phylogenies and signature sequences: a reappraisal of evolutionary relationships among Archaebacteria, Eubacteria, and Eukaryotes // Microbiol. Mol.Biol. Rev. - 1998. - V. 62. - P. 1435-1491.

32. Cavalier-Smith T. A revised six-kingdom system of life // Biol. Rev. Camb. Philos. Soc.- 1998. - V. 73. - P. 203-266.

33. Makarova K., Koonin E. DOMAIN ARCHAEA //Genome Biology - 2003. - V.4, №8. - Р.115.

34. Pyrite formation linked with hydrogen evolution under anaerobic conditions / Drobner E., Huber H., Wachtershauser G., Rose D., Stetter K.O. // Nature. - 1990. - №346. - Р.742.

35. Hyperthermophilic archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs / Stetter K. O., Huber R., Blеchl E., Kurr M., Eden R. D., Fielder M., Cash H., Vance I. // Nature. - 1993. - №365. - Р. 743-745.

36. Hyperthermophilic archaebacteria within the crater and open-sea plume of erupting Macdonald Seamount / Huber R., Stoffers P., Cheminee J.L., Richnow H.H., Stetter K.O. // Nature. - 1990. - №345. - Р.179.

37. Distribution of Archaea in a Black Smoker Chimney Structure /Takai K., Komatsu T., Inagaki F., Horikoshi K. // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - V.67, №8. - Р.3618-3629.

38. Summit M. Baross J.A. A novel microbial habitat in the mid-ocean ridge subseafloor // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. - 2001. - №98. - Р.2158-2163.

39. A thermophilic acidophilic mycoplasm isolated from a coal refuse pile / Darland G., Brock T.D., Samsonoff, W., Conti, S.F.// Science. - 1970. - №170. -- Р.1416-1418.

40. Embden-Meyerhof-Parnas and Entner-Doudoroff pathways in Thermoproteus tenax: metabolic parallelism or specific adaptation? / Ahmed H., Tjaden B, Hensel R. and. Siebers B. // Biochemical Society Transactions. -- 2004. - V.32, part 2. - Р.303-304.

41. Arab H., Volker H., Thomm M. Thermococcus aegaeicus sp. nov. and Staphylothermus hellenicus sp. nov., two novel hyperthermophilic archaea isolated from geothermally heated vents off Palaeochori Bay, Milos, Greece // International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. - 2000. - V.50. - Р.2101-2108.

42. Cell Surface Structures of Archaea / Sandy Y.M. Zolghadr B., Driessen A.J. M., Albers S.-V., Jarrell¹ K. F. // Journal of Bacteriology. - 2008. - V. 190, №18. -Р.6039-6047.

43. Stetter. K.O. Hyperthermophilic prokaryotes //FEMS Microbiology Reviews. -2006. - V.18, Issue 2-3. - P.149 - 158.

44. Ferroglobus placidus gen. nov., sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeum that oxidizes Fe2+ at neutral pH under anoxic conditions / Hafenbradl D., Keller M., Dirmeier R., Rachel R., Ro?nagel P., Burggraf S., Huber H., Stetter K. O. // Archives of Microbiology - 1996. -V. 166, №5. - Р. 308-314.

45. Aeropyrum pernix gen. nov., sp. nov., a novel aerobic hyperthermophilic archaeon growing at temperatures up to 100 degrees C / Sako Y, Nomura N, Uchida A, et al // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1996. - V.46,№ 4. - Р.1070-1077.

46. Archaeoglobus profundus sp. nov., represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria / Burggraf S., Jannasch, H.W. Nicolaus B. Stetter, K.O.// Systematic and Applied Microbiology. - 1990. - V.13, №1. - Р.24-28.

47. Tor J.M., Kashefi K., Lovley D.R. Acetate oxidation coupled to Fe(III) reduction in hyperthermophilic microorganisms // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - № 67. - Р.1363-1365.

48. Geoglobus ahangari gen. nov., sp. nov., a novel hyperthermophilic archaeon capable of oxidizing organic acids and growing autotrophically on hydrogen with Fe (III) serving as the sole electron accepter / Kashefi K., Tor J.M., Holmes D.E., Gaw Van Praagh C.V., Reysenbach A.L., Lovley D.R. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2002. - № 52. - Р.719-728.

49.Comparative analysis of Embden-Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic pathways in hyperthermophilic archaea and the bacterium Thermotoga / Selig M., Xavier K.B., Santos H., Schonheit P. // Arch. Microbiol. - 1997. - V.167, №4. - Р. 217-232.

50. Kitano T., Onoue T., Yamauchi K. Archaeal lipids forming a low energy-surface on airwater interface // Chemistry and Physics of Lipids. - 2003. - V. 126. - P. 225-232.

51. Robb F.T., Clark D. S. Adaptation of Proteins from Hyperthermophiles to High Pressure and High Temperature // Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology. - 1999. - №1(1) -Р.101-105.

52. Eichler J., Adams M. W. W. Posttranslational Protein Modification in Archaea // Microbiology and Molecular Biology Reviews. - 2005. - V.69, №3. - Р.393-425

53. DiRuggiero J., Robb F.T. Expression and in vitro assembly of recombinant glutamate dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus // Appl. Environ. Microbiol. - 1995. - №61. - Р.159-164.

54. Unsworth L.D, van der Oost J., Koutsopoulos S.. Hyperthermophilic enzymes stability, activity implementation strategies for high temperature applications // FEBS Journal. - 2007. - №274. - Р.4044-4056.

55. Holden J.F., Adams M.W.W., Baross J.A. Heat shock response in hyperthermophilic microorganisms // Stress Genes: Role in Physiological Ecology. - 1999. - №5. - Р.663-670.

56. D. W. Grogan. Stability and Repair of DNA in Hyperthermophilic Archaea // Curr. Issues Mol. Biol. - 2004. - №6. - Р.137-144.

57. Cellular polyamines of the acidophilic, thermophilic and thermoacidophilic archaebacteria, Acidilobus, Ferroplasma, Pyrobaculum, Pyrococcus, Staphylothermus, Thermococcus, Thermodiscus and Vulcanisaeta / Hamana K., Tanaka T., Hosoya R., Niitsu M., Itoh T. // J. Gen. Appl. Microbiol.- 2003. - V. 49. Р. 287-293.

58. A new phylum of Archaea represented by a nanosized hyperthermophilic symbiont. /Huber H., Hohn M.J., Rachel R., Fuchs T., Wimmer V.C., Stetter K.O. // Nature. - 2002. - №417. - Р.63-67.

59. Sato T., Atomi H., Imanaka T. Archaeal Type III RuBisCOs Function in a Pathway for AMP Metabolism // Science. - 2007. - V.315. - P. 1003-1006.

60. Crabb, W.D., Mitchinson C. Enzymes involved in the processing of starch to sugars // Trends Biotechnol. - 1997. - №15. - Р. 349-352.

61. Cowan, D., Daniel R., Morgan H. Thermophilic proteases: properties and potential applications. // Trends Biotechnol. - 1985.- №3. - Р. 68-72.

62. Purification and characterization of an extremely thermostable cyclomaltodextrin glucanotransferase from a newly isolated hyperthermophilic archaeon, a Thermococcus sp. / Tachibana Y., Kuramura A., Shirasaka N., Suzuki Y., Yamamoto T., Fujiwara S., Takagi M., and Imanaka T. // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - №65. - Р.1991-1997.

Размещено на Allbest.ru