Способы получения ферментов

Бактериальная а-амилаза была получена в сухом состоянии на вакуумной сушильной установке. При этом из 5000 л фильтрата культуральной жидкости, подвергнутого фракционированию спиртом, за 8 ч работы было получено 73,5 кг продукта. При промышленном производстве аспарогеназы сублимационным методом было получено несколько килограммов готового продукта. Для сушки ферментных препаратов сублимацией весьма важно обеспечить максимально полное удаление влаги из обрабатываемого материала.

7. Биологическая безопасность при промышленном производстве

Безопасность производства и применения являются неотъемлемыми требованиями к любому технологическому процессу. Мерой безопасности на предприятии служит содержание в воздухе помещений и на поверхностях любых потенциально опасных материалов. Объектами наблюдения при решении проблем производственной безопасности являются как рабочая среда, так и персонал. Только при благополучном состоянии указанных объектов наблюдение можно гарантировать, что принимаемые меры эффективны. Сказанное в равной мере относится также и к контролю всех материальных потоков, поступающих с предприятия в окружающую среду.

7.1 Меры безопасности

Стандартные ферментаторы представляют собой адекватные системы обеспечения техники безопасности при работе с любыми микроорганизмами, исключая патогенные. Если применяемые микроорганизмы обладают потенциальной опасностью, то в конструкцию ферментаторов следует внести очень небольшие усовершенствования с тем, чтобы полностью изолировать их внутренние пространства от окружающей среды. В ходе культивирования основное внимание должно быть уделено обработке выходящего из ферментатора воздуха, который подлежит либо фильтрации, либо пропусканию через печи-инсинераторы. Технология последних процессов отработана весьма тщательно. Однако, несмотря на это, неисправность каких-либо элементов или фиттингов может свести принимаемые меры защиты окружающей: среды к нулю. Основные проблемы возникают при выгрузке культуральной жидкости из ферментаторов. При производстве внеклеточных ферментов влажные микробные клетки с примесью вспомогательных фильтровальных порошков или без них обычно подвергаются автоклавированию. Клетки, свободные от вспомогательных фильтровальных порошков, могут, если в этом есть необходимость, идти на корм скоту. Жидкость, из которой были удалены тем или¹ иным путем ферменты, продолжает содержать определенные питательные вещества и поэтому имеет значительную биологическую потребность в кислороде. В качестве осадителя белков применяется сульфат аммония, который оказывает координирующее действие на бетон и на различные металлы. Поэтому жидкости, содержащие указанное химическое вещество, обычно сбрасываются на грунт в качестве удобрений.

Разрушение микроорганизмов в целях получения внутриклеточных ферментов выдвигает новую проблему техники безопасности. Фрагменты клеточных оболочек, получающиеся в результате механических воздействий на клетки, содержат целую серию биологически активных материалов. В случае непатогенных грамотрицательных организмов, таких, как Е. coli, в среду из клеточной оболочки высвобождаются эндотоксины. Последние при аэрозольной аппликации могут вызывать неприятные, хотя и кратковременные симптомы, например тошноту, головную боль и боль в грудной клетке, а также раздражение мочевых путей. Кроме того, эндотоксины сохраняются и в перерабатываемых материалах на протяжении всех стадий фракционирования после разрушения клеток. Биохимическая технология во многом использует оборудование, разработанное и разрабатываемое для химической промышленности. При этом предполагается, что уровни утечки, допустимые для неорганических химических веществ, могут также иметь место при высокоактивных биологических материалах. Так, в частности, рассматривается вопрос применительно к большинству промышленных центрифуг, работающих при довольно высоких частотах вращения роторов. При недостатке вполне совершенных модификаций центрифуг и в условиях, когда существующие центрифуги отличаются высокой стоимостью, единственно правильным решением является монтаж такого оборудования в боксах определенного вида, поскольку применение ламинарных воздушных потоков на протяжении всей операции, идущих от места проведения процесса к фильтрам, обходится дорого, а при реализации в промышленных масштабах недостаточно эффективно. Требование о работе операторов в специальных пневмокостюмах, питаемых воздухом от воздушных коммуникаций, встречается весьма неодобрительно, и, кроме того, не решает проблемы обезвреживания производственных выбросов и охраны воздушной окружающей среды.

Большинство из известных боксов безопасности представляет собой жесткие конструкции из нержавеющей стали, стекла и пластиков. Эти конструкции довольно дороги, а сами установки громоздки. Доступ в эти установки и особенно их обслуживание затруднительны", а последующие модификации производства могут легко нарушить целостность и герметичность созданных систем. Более многообещающим является применение боксов из гибких пленок, которые были ранее разработаны для использования при получении животных-гнотобитов, свободных от микроорганизмов.

Стенки подобных боксов выполняются из тонкого листового полиэтилена или из листового поливинилхлорида. Их соединение производится посредством электронной сварки. В нужных точках боксов могут размещаться (опять-таки с помощью электронной сварки) соответствующие перчатки и фильтры, а боксы могут работать под избыточным давлением и под разрежением.

Особенно полезным дополнением к боксам служит специальный полукостюм, заделываемый при помощи электронной сварки в боковую стенку секции. Он представляет собой верхнюю половину пластикатового костюма со шлемом и плечевыми перчатками. Жилетка полукостюма создает ламинарный поток воздуха и соединена с питающей воздушной линией; подпор воздуха под полукостюмом создает для оператора значительную свободу движений.

Если оператору требуется перемещаться от бокса па большие расстояния, то «юбка» полукостюма может быть сделана более длинной, так что образуется как бы тоннель, в котором может двигаться оператор. Работающий может покидать костюм практически мгновенно, не опасаясь быть при этом контаминированным. Исполнение им рабочих функций производится в комфортных условиях ламинарного воздушного потока.

Самый большой недостаток боксов является следствием неудобств, связанных с применением резиновых перчаток. Заделывание в бокс более толстых перчаток может лишь снизить вероятность контактной контаминации. Но это будет достигнуто ценой потери легкости манипуляций оператором. Однако, если основная опасность при работе в боксе связана с движением воздуха, то быстрая замена порвавшихся перчаток будет вполне допустима. Проведение такой операции может быть облегчено, если в боксах будет применяться конструкция, разработанная для хирургических операций через гибкие пленки.

7.2 Контроль окружающей среды

Аэрозолированные микроорганизмы обычно фракционируются путем применения щелевых пробоотборников, в которых находятся вращающиеся чашки Петри с соответствующей питательной средой на основе агара. В течение заданного времени над чашками прокачивается измеряемый объем воздуха. Затем чашки помешаются в термостат и находятся в нем при условиях, специфичных для развития отдельных микроорганизмов. Анализы воздуха с помощью подобных пробоотборников должны осуществляться при остановке предприятий и в ходе их работы с тем, чтобы установить нормальный уровень загрязненности и выявить любую утечку материала. После того как были получены данные о реакциях организма на попадание в него порошкообразных протеолитических ферментов, стали возможными разработка стандартов безопасности и контроль в соответствии с ними окружающего воздуха. В настоящее время аналогичные работы по стандартизации проводятся применительно и к другим ферментам в виде аэрозолей.

7.3 Обучение персонала и медицинская защита

После инженерных средств и методов обеспечения безопасности важнейшая роль в безаварийной работе принадлежит обучению персонала правильному обращению с соответствующими материалами и оборудованием. Прежде всего здесь важно подчеркнуть необходимость соблюдения общих правил безопасной работы. Например, на предприятиях по выделению ферментов применяются машины, оснащенные мощными электрическими двигателями и требующие больших расходов воды. В таких условиях крайне важно уделять особое внимание обеспечению безопасной электропроводки и электроизоляции. В дополнение к указанному следует иметь в виду, что высокая биологическая активность получаемых и обрабатываемых материалов ставит на особую ступень проблему личной гигиены работающего персонала. На предприятии следует пользоваться чистой защитной спецодеждой, не допуская работы персонала в домашней одежде. При выходе с предприятия каждый работающий обязан тщательно вымыть руки.

Прием пищи и курение внутри производственных помещений категорически запрещаются.

Желательно, чтобы все работающие с большими количествами: целевых и промежуточных продуктов подвергались первичному медицинскому освидетельствованию и проходили периодические медицинские проверки. Необходимо организовать дело так, чтобы по поводу любых симптомов, не объяснимых внешними причинами, все работающие давали немедленную информацию по службе. Медицинские освидетельствования и периодические проверки должны предусматривать функциональные исследования крови и органов дыхания, рентген грудной клетки, а при возможности и кожные пробы на аллергию. Не исключено, что отдельные лица, когда-то переболевшие сенной лихорадкой или другими аллергическими заболеваниями или имеющие в роду родственников с подобными заболеваниями, будут подвергаться при работах особому риску, в частности в отношении кожных раздражений. Оснований для отстранения таких лиц от участия в работах весьма мало, но возможность аллергии должна быть разъяснена им заранее.

7.4 Обработка отходов

Обязанность обеспечить безопасность персонала предприятий должна сопровождаться такими же мероприятиями в отношении зашиты всех других людей от какого бы то ни было влияния всех видов отходов, сбрасываемых с предприятий. Отводимый воздух должен подвергаться фильтрации и контролироваться на чистоту. Для замены фильтров и их обезвреживания должны быть разработаны безопасные процедуры. Твердые отходы подлежат автоклавированию, а затем обычно выбрасываются на свалку. Обработка жидких отходов отчасти определяется местоположением предприятия. Местные инструкции регламентируют главным образом такие факторы, как благоприятное биологическое потребление кислорода и меры по исключению из стоков солей, обладающих, например, коррозионным действием. Присутствие в сточных водах микробных клеток не обязательно будет представлять собой опасность, так как содержание их в обычных сточных водах бывает довольно высоким. Однако отдельные виды или даже штаммы микроорганизмов могут оказаться опасными или необычными для бытовых стоков данного района. Влияние же на характер стоков и на их безопасность (или опасность) таких факторов, как внутриклеточные материалы и эндотоксины, выяснено пока только частично.

7.5 Безопасность и безвредность продукта

Стандарты, относящиеся к безопасности и безвредности продуктов, различны в разных странах. Они основываются в большинстве случаев па долгосрочных наблюдениях за применением тех или иных продуктов. Американский перечень под кодовым названием GRAS (препараты, большей частью оцениваемые как безопасные) точно отражает то положение, что конкретный препарат, который в момент своего появления был отнесен к безопасным, в определенное время может оказаться небезопасным. Практическим выводом из законов о безопасности продуктов является тот факт, что лишь ограниченное число микробиологических источников ферментов допускается к применению в промышленности в том случае, если получаемые ферментные препараты предназначаются для использования в продуктах питания. Дополнения к перечню GRAS допускается вносить только после длительных испытаний соответствующих препаратов. Это означает, что большие капиталовложения в разработку того или иного продукта приходится делать без достаточных гарантий того, что этот продукт из нового сырьевого источника будет разрешен к использованию.

Принципы построения безопасных технологических процессов -в обобщенном виде представлены ниже. Ответственность за безопасность должна лежать в одинаковой степени на главе управления данного предприятия и на не зависящем от него работнике внешней инспекции.

Инженерные мероприятия

1. Ограждение предприятия.

2. Полная изоляция рабочего оборудования от внешней среды.

3. Контроль воздуха общего предназначения и отдельно воздуха, отходящего от рабочих установок и из рабочих помещений.

4. Строгий контроль входа персонала на предприятие и выхода из него.

5. Применение защитной одежды.

6. Санобработка и деконтаминация персонала.

7. Организация специальных зон приема пищи.

Контроль окружающей среды

1. Регулярная очистка предприятия.

2. Построение процессов со сведением к минимуму риска.

3. Первичное и периодические определения фона воздуха.

4. Первичное и периодические измерения величины воздушных потоков.

5. Контроль оборудования в ходе операций.

Наблюдения за персоналом

1. Первичные и периодические диспансерные осмотры.

2. Постоянная регистрация отсутствующих и больных.

3. Установление системы информации о несчастных случаях и о заболеваниях.

4. Постоянная связь и взаимодействие с медицинскими работниками.

8. Резюме по процессам выделения

8.1 Выделение внеклеточных ферментов

Число последовательных технологических стадий для выделения внеклеточных ферментов обычно меньше, чем для внутриклеточных. Однако существует широкий диапазон возможных операций и уровней фракционирования. В табл. 1 в обобщенном виде представлены некоторые альтернативные технологические стадии, а также приведены количественные данные о степени концентрирования продуктов на отдельных стадиях и в целом по процессу. Интерес представляет в первую очередь степень концентрирования фермента из культуральной жидкости, а не его чистота. Относительное совершенство каждого процесса и метода, а именно различных методов осаждения, процессов сепарации в системе твердое тело - жидкость, концентрирования и высушивания оценивается именно по показателю системы концентрирования.

Underkofler описал технологию выделения а-амилазы из В. subtilis с выходом 63 % следующим образом:

Исходная культура. В. subtilis на питательном агаре; инкубация при 32 °С; хранение при 0--5°; пересев каждые 2 мес.

Посевные колбы. Колбы вместимостью 2,2 л, содержащие 1 л среды; инкубация 12 ч при 32 °С па качалке с возвратно-поступательным движением.

Посевная емкость. 180 л среды; 10 ч при 32 °С; давление в емкости 0,2 кгс/см²; подача воздуха 150 л/мин; частота вращения мешалки 150 об/мин.

Ферментация. Комплексная среда в составе: мука соевых бобов 1,85% с содержанием растворимых сухих веществ 0,76%; ферментативный гидролизат казеина 0,65%; лактоза 4,75%; MgS0₄-7H₂0 0,04%; противопенный агент 0,05%. Количество среды 5000 л; температура 35°С; давление в ферментаторе 0,3 кгс/см ; частота вращения мешалки 170 об/мин; подача воздуха 3000 л/мин.

Выделение растворенного нативного фермента. 5500 л культуральной жидкости (2160 BAU/мл); 2% диатомита к объему культуральной жидкости, вакуумная предфильтрация с подвижным ножом; объем фильтрата с промывной водой 5000 л (2000 BAU/мл).

Осаждение. 13600* л денатурированного спирта добавлено при перемешивании; после выстаивания декантация надосадочной жидкости; добавлено 4500 л спирта; надосадочная жидкость вновь декантирована.

Сепарация в системе твердое вещество -- жидкость. С помощью пластинчатого и рамного прессов. Высушивание. Вакуумная сушка в течение 8 ч.

Отделочные операции и составление композиции. Продукт-- 73,5 кг (102000 BAU/r) смешан с 385 кг гипса (16800±5 BAU/r).

Данные более поздних разработок в нашем распоряжении отсутствуют. Однако не вызывает сомнения, что новейшие методы флокуляции, ультрафильтрации и высушивания оказали свое влияние на построение соответствующих процессов. Типовая схема производства внеклеточных ферментов показана на рис. 3.

8.2 Выделение внутриклеточных ферментов

Во введении в данную главу отмечалось, что выделение внутриклеточных ферментов требует фракционирования весьма сложной смеси продуктов по сравнению с простой обработкой внеклеточной культуральной жидкости при получении соответствующих ферментов. Это фракционирование за последние 50 лет закреплено во многих конкретных методах обработки. Среди работников лабораторий укоренилась тенденция рассматривать каждый метод выделения ферментов как уникальный. Несомненно справедливо, что каждый фермент отличается специфичностью, но мнение о том, что для каждого фермента метод выделения должен быть обязательно свой, ведет к замедлению создания технологии и отдельных ее операций. А фактически анализ любого набора практических рецептов для выделения ферментов показывает, что широко применяется в реальных условиях лишь относительно небольшое число процедур. Безусловно, промышленное выделение внутриклеточных ферментов требует большей гибкости при применении различных методов, чем выделение внеклеточных ферментов. Тем не менее, и для выделения внутриклеточных ферментов может быть разработана относительно стабильная технология и оборудованы производственные линии. Выделение аспарогеназы на промышленном уровне подтверждает дальнейшие возможности совершенствования этого процесса.

Ферментация. Вместимость встряхиваемых на качалке колб 250 мл, ферментаторов от 400 л до 75,7 м³ (выход снижается до 70%). Среда -- настой пшеницы; критический питательный компонент--аминокислоты; мощность подводимой энергии 0,3--0,4 л. с./378,5 л.

Выделение клеток. Дисковая центрифуга с соплами (1300 g), производительность 26.5 л/мин. Концентрирование от 6 г/л до 120 г/л (по массе СВ).

Разрушение клеток. Гомогенизатор APV фирмы «Manton Gaulin»,-- 2- кратное пропускание (563 кг на см²); при первом пропускании высвобождается 90% фермента, при втором --97%; подъем температуры до 30 °С; охлаждение рассолом.

Отделение остатков клеток и белка. Добавление 3 3% этанола (пол слои жидкости); удаление твердой фазы под давлением на ротационном фильтре (11,25 м²); за время менее 2 ч получается 7570 л фильтрата. Осаждение фермента. 50 % метанола; пониженные значения рН.

Фильтрация. Фильтр-пресс (1,62 м); добавление кизельгура; ресуспендирование фермента в 946,25 л воды. Переосаждение фермента. 60% метанол.

Отделение твердой фазы: С помощью центрифуги Шарплес с трубчатой корзиной.

Концентрирование. Путем ультрафильтрации (выход 90 %).

Хроматография. Сефадекс DEAE-A50 (колонка: диаметр 29,48 см. высота 58.96 см); исходный буфер 0.025М до 0.12М; осаждение фермента; ресуспендирование; хроматография с помощью СМ-целлюлозы (0,11 г белка/г полимера); снижение содержания пирогенных веществ.

Кристаллизация. С помощью 0,6 объема этанола; рН 5. Сбор осадка с помощью центрифуги с твердой корзиной.

Стерилизация. Обработка углем, стерилизующая фильтрация; обработка маннитолом; сушка сублимацией.

Выход. 1 кг кристаллической аспарагиназы (30%--общий выход); длительность всего цикла --24 ч; многочисленные стадии обработки перед ультрафильтрацией; стерилизация, которая не полностью касается аспарагиназы; ламинарное движение воздуха; вода, свободная от пирогенных веществ.

8.3 Непрерывное выделение ферментов

При рассмотрении отдельных операций было показано, что осуществление, например, таких стадий, как осаждение, сепарация в системе твердая фаза -- жидкость, классическими периодическими методами оказывается слишком сложным. Масштабирование периодических процессов при неизбежном увеличении продолжительности процесса часто сопровождается значительной потерей активности фермента. Непрерывные операции имеют еще то дополнительное преимущество, что они позволяют использовать оборудование в незначительных масштабах и в этом отношении в положительную сторону отличаются от периодических процессов, которые, как правило, имеют дело с крупногабаритным оборудованием. Непрерывное выделение ферментов осложняется требованием надежности применяемого оборудования и выбора его с таким расчетом, чтобы производительности на отдельных стадиях процессов были равны. Решение этих проблем может быть значительно упрощено благодаря внедрению небольших промежуточных емкостей, играющих роль буферных, и перевода полностью непрерывного режима в полунепрерывный.

8.4 Одновременное выделение внеклеточных и внутриклеточных ферментов

Подавляющее большинство схем выделения ферментов предусматривают регенерацию отдельных ферментов. В случае внеклеточных ферментов это может быть подтверждено на многих примерах, поскольку практически лишь один внеклеточный фермент в смеси различных продуктов имеет значительную концентрацию. Для дополнительного получения внутриклеточных ферментов или иных внутриклеточных продуктов требуется разрушить клетки и подвергнуть полученную смесь строгому фракционированию. Однако, если осуществлено выделение хотя бы одного внутриклеточного фермента, к стоимости процесса дополнительно добавляется стоимость разрушения клеток и удаления их остатков и значительно превосходящая ее стоимость осадителей и адсорбентов независимо от того, сколько ферментов и других продуктов фактически выделено из клеток. В этом отношении полезно проведение аналогии с фракционированием нефтяных продуктов.

Известно множество примеров одновременного выделения из субстрата ряда животных ферментов. Особенно хорошо разработан процесс выделения гликолитических ферментов из мышечной ткани. Последняя очень подходит для этой цели, так как различные ферменты содержатся в ней в достаточно высоких концентрациях. Одновременное выделение внутриклеточных микробных ферментов осуществляется пока крайне редко, является менее прямым процессом, изучение которого началось, по сути дела, только в самое последнее время. Есть основания полагать, что аффинная хроматография может существенно облегчить разработку технологии одновременного выделения внутриклеточных и внеклеточных микробных ферментов. Прогрессу указанных исследований и разработок будет также способствовать разработка более экс-прессных систем аналитического контроля, поскольку последний при процессах выделения нескольких ферментов является исключительно сложным, особенно во время разработки этих процессов.

Список использованных источников

1. Д. Уонг, Ч. Кооней. Ферментация и технология ферментов. М: Легкая и пищевая промышленность, 1983г.

2. Ред. коллегия М Ф. Гулый. Ферменты в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Киев, «Наукова думка», 1968г.

3. Ред. акад. А.А. Имшенецкий. Ферменты микроорганизмов. М.: «Наука», 1973г.

4. Ред. Я.М. Варшавского. Ферменты и синтез биополимеров. М.: «Мир», 1967г.

5. Н.П. Блинов. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников. Издательская фирма «Наука». СПб| 1995г.

6. В.К. Акименко. Альтернативные оксидазы микроорганизмов. М., Наука, 1989г.

7. Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в 2 частях. М., Мир, 1989г.

8. A.M. Егоров., А.П. Осипов., Б.Б. Дзаптиев., Е.М. Гаврилова. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.. Высшая школа, 1991г.

9. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988г