Изучение аллельного полиморфизма генов андрогенового и окситоциного рецепторов в популяциях хадза и датога

1.6 Примеры полиморфных маркеров, ассоциированных с поведенческими реакциями

1.6.1.1 Андрогены

Рецепторы андрогенов (AR), присутствуют в организме мужчин в различных тканях, в предстательной железе, семенных пузырьках и других. Ген андрогенового рецептора располагается на Х хромосоме (Хq11-q12). Ген содержит 8 экзонов, которые кодируют три домена андрогеновго рецептора. Экзон А - это первые экзон гена, который кодирует N-конец рецептора и регулирует транскрипцию. Далее второй и третий экзоны кодируют «цинковые пальцы», особые ДНК связывающие участки белка, которые характерны для всех стероидных гормонов. Четвертый экзон кодирует информацию о структуре шарнирной области участвующей в связывании ДНК. Последующие экзоны кодируют С-конец белка, который содержит домен для связывания андрогенов. (И.А. Корнеев. 2007.). Рецепторный белок состоит из 910 аминокислотных остатков, и имеет молекулярную массу 98,5 кДа (Brinkman A.O., Jenster G., Kuiper G.G.J.M. et al. 1992.).

При возникновении, мутаций в областях гена кодирующих С-конец рецептора, наблюдается потеря способности связывания с андрогенами. При мутациях в первом и третьем экзонах, сохраняется возможность формирования комплекса гормон- рецептор, однако не происходят связывание данного комплекса с ДНК и последующей транскрипции. На сегодняшний день насчитывается более 200 видов, мутации которые характеризуются полной резистентностью к андрогенам. (Brinkman A.O., Jenster G. et al. 1992.)

1.6.1.3 Взаимодействие рецептора и гормона

Комплексы андрогенового рецептора со связанным лигандом перемещается в ядро, процесс транслокации является зависимым от температуры. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. И соавт., 1985 г.). Для связывания с рецептором и дальнейшей транслокации комплекса в ядро, в мужских половых тканях, обязательным является превращение тестостерона в дигидротестостерон, которое происходит до связывания с цитоплазматическими рецепторами. Процесс превращения тестостерона в дигидротестостерон проходит под действием 5б-редуктазы. С процессом ферментативного превращения андрогенных гормонов в дигидротестостерон и активации рецепторов, связаны некоторые формы генетически детерминированной резистентности к андрогенам. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. и др., 1985 г.).

Активированный стероидорецепторный комплекс приобретает способность связываться с хроматином, ДНК и другими полианионами, и накапливаться в ядре. В ядре происходит связывание с хроматином и инициация синтеза м-РНК. Установлено что, хроматин из тканей, не реагирующих на эффекты тестостерона, связывает меньше комплексов рецептора с гормоном, чем ткани, клетки которых являются мишенями для тестостерона. Связывание комплекса белок-гормон с ДНК происходит за счет электростатических взаимодействий между положительно заряженными областями молекулы рецептора и отрицательно заряженными фосфатными группами ДНК, так же предполагаются неионные - гидрофобные и полярные взаимодействие. Предполагается, что участок молекулы рецептора, который связывается с молекулой ДНК, содержит положительно зараженные аминокислотные остатки аргинин, гистидин, лизин. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. И соавт., 1985 г.). Считается, что синтез специфических м-РНК, активируемый комплексами рецептора с гормоном, исчезает после удаления гормона.

1.7 Маркеры андрогеновой системы, ассоциированные с поведенческими реакциями

Исследования гена, кодирующего андрогеновый рецептор у здоровых мужчин, показали, что существуют значительные различия в строении первого экзона, который может содержать от 8 до 35 тринуклеотидных повторов CAG (микросателлитный кластер), кодирующих аминокислоту глутамин. Была показана корреляция между длиной микросателлитного кластера и степенью конформационных изменений рецептора. Оказалось, что при малом количестве повторов уменьшается степень конформационных изменений рецептора и, как следствие, рецептор становится более чувствительным к андрогенам из-за усиления связи в комплексе гормон-рецептор, которая приводит к активации транскрипции (Chamberlain et al., 1994). Большинство исследователей полагает, что не существует зависимости между длиной микросателлитного кластера CAG и уровнем тестостерона в крови у мужчин (Kenny et al., 2005), однако показано, что число CAG-повторов коррелирует с клиническими проявлениями андроген-зависимых реакций (Zitzmann et al., 2001).

В ряде молекулярно-генетических исследованиях обнаружена ассоциация между длиной микросателлитного кластера CAG и агрессивным поведением. Шведские ученые выявили тенденцию к увеличению частоты аллелей с короткими кластерами CAG среди испытуемых с высокими показателями доминирования и агрессии (Jцnsson et al., 2001). Также было показано, что среди насильников и убийц

встречаются более короткие кластеры повторов (среднее значение - 18.44 и 17.59), чем в контрольной группе (среднее значение - 21.19). Был сделан вывод о том, что сокращение количества CAG-повторов в гене AR ассоциировано с преступным поведением (Rajender et al., 2008). Однако другие исследователи показали, что нет никакой связи между длиной CAG - кластеров в AR и преступными насильственными действиями, хотя отмечают, что короткие кластеры CAG- повторов гена AR (<17) встречаются у осужденных за насильственные действия чаще, чем в контрольной группе (7.5% и 1.9%, соответственно; P = 0.047). При этом авторы полагают, что полиморфизм CAG-повторов гена AR не играет важной роли в девиантном поведении преступников (Cheng et al., 2006).

1.8 Окситоциновая система

Окситоцин

Окситоцин (OT) впервые был выделен в 1906 г. Дейл Г. из задней доли гипофиза (Мельников А.П., и др. 2009 г.). В 1953 г. Винсент дюВиньо с коллегами установил химическую структуру пептида, а спустя 30 лет в 1983 г. Лэнд Х. с коллегами впервые провела клонирование гена окситоцина. Окситоцин представляет собой нонапептид с молекулярной массой 1007 Дa, который имеет следующую аминокислотную последовательность: Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu- Gly. За счет образования дисульфидного мостика между цистеинами молекула замыкает кольцо из 6 аминокислотных остатков. (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009.). Окситоцин синтезируется в медиальной части передней доли гипоталамуса в паравентикулярных и супраоптических ядрах, а также в ядрах миндалевидного комплекса, перегородки и в нейронах спинальных ганглиев. (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009.). За пределами ЦНС окситоцин синтезируется в амнионе, плаценте, надпочечниках, поджелудочной железе, яичках, яичниках, в клетках миокарда левого сердца. (Gutkowska J. 2000.; Mukaddam Daher S., et al. 2001.) и в мышечных клетках пищеварительного тракта (Monstein H.J., Grahn N., Truedsson M., et al. 2004.) Установлено, что большие нейросекреторные клетки паравентикулярных и супраоптических ядер синтезируют молекулы препро- окситоцина нейрофизина I. В результате дальнейших реакций комплекс расщепляется до нонапептида, который секретируется в кровь задним отделом гипофиза. В процессе упаковки гормона с белком нейрофизином I образуются гранулы, окруженные мембраной. Считается, что транспорт этих гранул осуществляется с помощью аксонального тока. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. И соавт., 1985 г.), а секреция происходит с помощью экзоцитоза, зависимого от ионов кальция. По нейрону распространяется электрический импульс, который деполяризует клеточную мембрану и способствует притоку ионов кальция, слиянию секреторных гранул с мембраной и выталкиванию их содержимого. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. И соавт., 1985 г.). В крови, а также в плаценте окситоцин может подвергнуться расщеплению за счет фермента плацентарной лейциновой аминопетидазы, другое название которой цистеиновая аминопептидаза, или окситоциназа. Окситоциназа разрушает пептидные связи между аминокислотами цистеином и тирозином. (Мельников А.П., и др. 2009 г.). В пределах ЦНС разрыв этих связей предотвращает белок-носитель нейрофизин I (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009.). Окситоцин обнаружен почти у всех млекопитающих, также у многих видов птиц, пресмыкающихся, амфибий и костистых рыб. (Фелиг Ф., Бакстер Дж. И др., 1985 г.).

У человека ген окситоцина (OXT) расположен на хромосоме 20 в области p13 и состоит из 3 интронов и 4 экзонов. Первый экзон кодирует нонапептид окситоцин, второй - белок нейрофизин I. В этой же хромосоме располагается ген вазопрессина, который образует с геном окситоцина один кластер. (Мельников А.П., и др. 2009 г.). Транскрибируются гены окситоцина и вазопрессина с противоположных цепей ДНК. (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009). В энхансерной зоне промотора гена окситоцина содержатся сайты связывания б- и в-рецепторов эстрадиола, рецепторов три- и тетрайодтиронинов, рецепторов ретиноевой и cis-ретиноевой кислот. Выше сайта инициации транскрипции располагается консервативной участок ДНК длиной в 160 нуклеотидов. (Gimpl G., Fahrenholz F. 2001.). Также установлено, что делеция в участке с 170 по 148 нуклеотиды приводит к полному снижению чувствительности гормонов щитовидной железы, значительно снижает чувствительность эстрогена и ретиноевой кислоты. Этот участок состоит из трех повторов мотива TGACC. (Gimpl G., Fahrenholz F. 2001.).

К основным биологическим эффектам окситоцина относятся развязывание родовой деятельности, облегчение грудного кормления и регуляция деятельности репродуктивной системы (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009; Gimpl G., Fahrenholz F. 2001.). Кроме того окситоцин играет важную роль в формировании и поддержании социальных отношений, таких как отношение родителей к своим потомкам, чувства романтической любви и доверия, а также эмпатия и щедрость к незнакомцам. Было показано, что при интраназальном введении окситоцина у человека усиливается склонность к просоциальному поведению, например к доверию (Kosfeld et al., 2005; Mikolajczak et al., 2010), щедрости (Zak et al., 2007), взгляду глаза в глаза (Guastella et al., 2008) и к эмпатии (Domes et al., 2007). Предполагается, что нарушения обмена окситоцина вследствие генетической изменчивости могут снижать склонность к альтруизму и предрасполагать индивида к антисоциальному поведению.

Окситоциновый рецептор

Окситоциновый рецептор относится к группе окситоцин-вазопрессиновых рецепторов, представителей суперсемейства G-белок-связанных рецепторов. Рецепторы данного типа опосредованно активируют или ингибируют определенные ферменты или ионные каналы, связанные с плазматической мембраной. Взаимодействие между рецептором и ферментом или ионным каналом происходит через третий белок, ГТФ-связывающий регуляторный белок (или G-белок). G-белок- связанные рецепторы обычно запускают целую цепь событий, изменяющих концентрацию одной или нескольких малых внутриклеточных сигнальных молекул, часто называемых внутриклеточными посредниками или внутриклеточными медиаторами. Эти молекулы в свою очередь изменяют поведение других белков- мишеней в клетке. Два наиболее важных посредника - это циклический АМФ (cAMP) и Са2+ . (Албертс Б., и др. 1994 г.).

Окситоциновый рецептор - это полипептид, который состоит из 389 аминокислотных остатков и образует семь трансмембранных доменов. Исследования структуры окситоцинового рецептора показали, что переключение из неактивной конформации в активную связано с изменением ориентации третьего и шестого трансмембранных доменов, которые воздействуют на сайт связывания с G- белком. Установлено, что для активации окситоцинового рецептора человека важны остаток аспарагиновой кислоты Asp-85 и трипептид глутаминовая/аспарагиновая кислота-аргинин-тирозин (Asp/Glu-Arg-Tyr), которые расположены во втором трансмембранном домене, а также первая внутриклеточная петля. Высоко консервативными для G-белок-сопряженных рецепторов являются остатки цистеинов на первой и второй внеклеточных петлях, которые, по-видимому, образуют дисульфидную связь. Также консервативные остатки цистеинов располагаются на С-конце рецептора. Окситоциновый рецептор человека имеет три потенциальных сайта для гликозилирования, которое, однако, не изменяет функциональную активность рецептора.

Известно три механизма активации окситоцинового рецептор. При взаимодействии с окситоцином все они проходят с участием G-связывающих белков. (Тепляшина Е.А. 2013 г.). Первый механизм является основным. Окситоцин связывается со своим рецептором, активируя G бq /11 и фосфолипазу С (PLC), которая расщепляет PIP2 (фосфоинозитолфосфат 2) до инозитолтрифосфата (InsP 3) и диацилглицерола (DAG). Происходит кальций-зависимое высвобождение внутриклеточного кальция (CICR), вызванное InsP 3 с помощью рецепторов инозитолтрифосфата (InsP3R) и рианодиновых рецепторов (RyR). Далее происходит выделение Са2+ из внутриклеточных депо и активация протеинкиназы С (РКС).

(Gimpl G., Fahrenholz F. 2001.). Согласно второму механизму происходит активация протеина Gq , который деполяризует мембрану. После этого происходит активация потенциал-зависимых кальциевых каналов VGCCs, что способствует выходу кальция через VGCCs. Возрастание концентрации ионов Ca2+ способствует образованию кальмодулина (СаМ). Комплекс Ca2+/CaM активирует кальмодулинкиназу, которая вызывает различные реакции, например, сокращение

мышц во время родов. (Viero C., Shibuya I., Kitamura N., et al. 2010.). Третий механизм активации представляет собой дополнительный каскад активации OT-Р, который связан с повышением активности MAP-киназы (митоген-активированные протеинкиназы, MAPK) и Rho-киназы. Повышение активности Rho- и MAP-киназ, концентрации внутриклеточного Сa2+ и секреции простагландинов способствуют

сократительным эффектам. (Devost D. et al. 2008; Rimoldi V., Reversi A., Taverna E., et al. 2003). Синтез окситоциновых рецепторов в центральной нервной системе происходит в вентромедиальном гипотоламусе, в перегородке, миндалине, в центрах входа ствола, а также в спинном мозге.

Ген окситоцинового рецептора располагается на 3 хромосоме в области p25-

26. Ген состоит из 3 интронов и 4 экзонов, 3 и 4 экзоны кодируют окситоциновый рецептор. Гипометелирование интрона 2 приводит к усиленной экспрессии окситоцинового рецептора (Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009.). В энхансерной области промотора находятся сайты связывания следующих транскрипционных факторов: рецептора эстрадиола (ERE), белков острой фазы воспаления (APRE) и цАМФ-зависимый транскрипционный фактор (CREB). (Gimpl G., Fahrenholz F. 2001.). В промоторе также находится ингибиторная область, в которой локализованы респонсивные элементы к ядерному фактору провоспалительного интерлейкина 6 (NF-IL6), транскрипционному фактору NF-kB, а также к интерферону г (IFNг-RE).(Чернышева М.П., Ноздрачев А.Д. 2009.).

Взаимодействие рецептора и гормона

Характеристика объектов исследования

Из-за многочисленных стрессовых воздействий исследования поведения в современных индустриальных развитых обществах затруднены. В связи с этим несомненный интерес представляют такие модельные системы, как традиционные племенные общества, характеризующиеся разным уровнем культурно-допустимой агрессии, в частности хадза и датога, проживающие на севере Танзании в районе озера Эйяси (рис.1) и существующие по настоящее время практически вне контактов с западной цивилизацией.

Рисунок 1. Карта Танзании. Красным прямоугольником обозначен район обитания хадза и датога

Хадза (хадзапи, тиндига, киндига, кангеджу, вахи) (рис. 2) - неспециализированные охотники-собиратели тропического пояса, одни из немногих подобных групп земного шара, сохраняющие традиционный образ жизни. На сегодняшний день численность хадза оценивается примерно в 1000 человек, из них 250 человек ведут образ жизни охотников-собирателей. Для представителей хадза характерны малые моногамные семьи. В обществе хадза существует специализация дифференцированная по полу, так женщины занимаются сбором дикорастущих растений, ягод и корнеплодов, мужчины регулярно ходят на охоту. Кроме охоты мужчины занимаются сбором меда диких пчел. Социальная организация хадза отличается высокой степенью эгалитарности. Здесь интенсивно практикуются механизмы уравнивания, не позволяющие отдельным индивидам доминировать над остальными членами группы. Эгалитарность хадза отчетливо проявляется и в отношениях между лидером и остальными членами группы. Лидер не имеет каких- либо преимуществ перед другими в распределении пищи или иных материальных благ, не имеет какого-либо влияния (сакрального, выраженного в нормах обычного права или иного рода) на других членов группы, кроме личного авторитета. Любые формы физического воздействия со стороны лидера исключены. Лидер не вправе заставить что-то сделать взрослого члена группы против его воли (Бутовская и др., 2008).

Рисунок 2. Фотография представителей хадза.

Датога (татог, мангати, барабайг) (рис. 3) - патрилокальные полукочевые скотоводы, в подавляющем большинстве продолжающие придерживаться традиционных верований, нилоты, говорящие на языке шари-нильской группы нило-сахарской языковой семьи. На сегодняшний день численность датога оценивается примерно в 200 000 человек. Колониальные власти, равно как и постколониальное независимое правительство, относились с большим недоверием ко всем скотоводам, считая их агрессивными, плохо контролируемыми и не поддающимися цивилизации. В глазах власть предержащих кочевой образ жизни, частые набеги с целью угона скота у соседей, приверженность Їтрадиционным культам делали датога реальной угрозой для развития ряда регионов Северной Танзании. Как следствие, в настоящий момент датога являются маргинальной, стигматизированной группой, отчетливо испытывающей социальную и политическую дискриминацию. У датога сохраняется патриархальная расширенная семья и полигамные патрилокальные браки. Отчетливо выражена система возрастных классов и разделение труда между полами. Наследование осуществляется по мужской линии. Приобретая жену, мужчина должен заплатить родителям невесты выкуп скотом (Бутовская и др., 2009).

Рисунок 3. Фотография представителей датога.

2.2 Сбор биологических образцов для исследования

Полевые материалы в виде буккального эпителия (эпителий, выстилающий слизистую оболочку полости рта) для данного исследования были собраны в 2006 - 2013 гг. в Объединенной Республике Танзания специалистом по эволюционной антропологии Института этнологии и антропологии им. Н.Н. Миклухо-Маклая РАН Бутовской М.Л. Для данного исследования отбирались только чистокровные хадза и датога, не являющиеся родственниками первого порядка. Для оценки агрессии была использована адаптированная на суахили с использованием стандартной процедуры (прямые и обратные переводы были осуществлены четырьмя двуязычными ассистентами) версия опросника BPAQ. Оценка по шкалам, а также по общей агрессии рассчитывалась только, если респондент ответил на все пункты опросника. Все данные описательной статистики количественных признаков, предоставленные

нашими коллегами-антропологами, приведены в таблице 5. (Butovskaya et al., 2015). На основе этих данных было показано, что исследованные выборки достоверно отличаются друг от друга по средним баллам физической и вербальной агрессии, гнева и враждебности, а также по суммарному среднему баллу общей агрессии (P<0.001). Хадза характеризуется более низкими средними баллами по всем шкалам опросника (табл. 5). Также было установлено, что форма агрессивного поведения никак не коррелирует с возрастом респондентов (P>0.1).

Таблица 5. Описательная статистика количественных признаков в выборке мужчин хадза и датога (по Butovskaya et al., 2015)

Примечания: N - размер выборки, Min - минимальное значение, Max - максимальное значение, Mean - среднее значение, S.E. - стандартная ошибка, t - критерий Стьюдента, df - количество степеней свободы, P - уровень достоверности

Методы исследования

Выделение геномной ДНК

Для анализа использовалась геномная ДНК, полученная из буккального эпителия с помощью набора реагентов для выделения ДНК из различного биологического материала DiatomTM DNA Prep 200 (ООО ЇЛаборатория Изоген?) согласно протоколу производителя.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Амплификацию изученных локусов проводили методом локусспецифичной полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием праймеров индивидуального дизайна. Для амплификации локуса OXTR rs53576 использовали набор реагентов GenePak ® PCR MacterMix Core (ООО ЇЛаборатория Изоген?) согласно протоколу производителя. Для амплификации локуса AR (CAG)n использовалась реакционная смесь, содержащая 10 нг матричной ДНК, 2 пМ каждого праймера, 250 мкМ каждого dNTP в 67 мМ трис-HCl-буфере рН 8.8, 16 мМ (NH4)2SO4, 0.1% Tween 2.0, 2.5 мМ MgCl2, 1.0 ед. полимеразы Thermus aquaticus

(ЇFermentas?). Условия амплификации включали начальную денатурацию при 940С в течение 4 мин и 35 циклов, состоящих из трех стадий: денатурация - 1 мин, 940С; отжиг праймера - 1 мин, 560С для локуса AR (CAG)n и 600С для локуса OXTR rs53576; элонгация - 1 мин, 720С. На последней стадии проводили заключительную элонгацию при 720С в течение 2 мин.

Обработка ДНК с помощью эндонуклеаз рестрикции

Для определения SNP продукты амплификации локуса OXTR rs53576 делили на равные аликвоты по 10 мкл, одну из которых обрабатывали эндонуклеазой рестрикции BamHI (ЇFermentas?) (5 ед. на пробу) при 370С в течение ночи. Аллели идентифицировали по размерам фрагментов ДНК после их электрофоретического разделения в агарозном геле (рис. 4).

Рисунок 4. Электрофореграмма продуктов ПЦР-амплификации полиморфного локуса OXTR rs53576.

Электрофорез ДНК в агарозном геле

Разделение продуктов амплификации и рестрикции проводили при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном геле Agarose LE 2 (ЇHelicon?) с прокрашиванием бромистым этидием (с итоговой концентрацией в геле 0,2 нг/мл). Пробы ДНК смешивали с буфером для нанесения 6X DNA Loading Dye (ЇFermentas?). Электрофорез проводили в 1X буфере TБE (89 мМ Трис, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА.). В качестве маркера длин фрагментов ДНК на агарозный гель дополнительно наносили GeneRulerTM 50bp DNA Ladder Mix (ЇFermentas?). После проведения электрофореза флуоресценцию бромистого этидия в ультрафиолете документировали при помощи прибора BioDocAnalyze.

Фрагментный анализ ДНК

После амплификации локуса AR (CAG)n с использованием флуоресцентно- меченной пары праймеров фракционирование полученных фрагментов проводилось научно-производственной компанией «Синтол» на приборе Applide Biosystems 3100. Результаты анализировались с помощью программы Peak Scanner Software v. 1.0.

Статистическая обработка полученных данных

Расч?т частот аллелей и генотипов, коэффициентов Райта, проверку соответствия равновесию Харди-Вайнберга, а также попарные сравнения распределений частот аллелей и генотипов проводили с помощью программы Genepop (v.4.2; http://kimura.univ-montp2.fr/~rousset/Genepop.htm). Статистическую обработку и визуализацию данных осуществляли с помощью компьютерной среды для статистических вычислений и графики R (https://www.r-project.org). Для выявления ассоциации CAG-полиморфизма гена AR с уровнем агрессии был проведен корреляционный анализ (коэффициент ранговой корреляции Кендалла). Для выявления ассоциации локуса OXTR rs53576 с различными формами агрессивного поведения был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с предварительной проверкой на подчинение количественных данных нормальному распределению тестом Колмогорова-Смирнова.

Глава 3. Результаты исследований

3.1 Ген андрогенового рецептора (локус AR (CAG)n)

Полиморфизм гена AR обусловлен вариациями длины микросателлитного кластера CAG в экзоне 1, которая коррелирует со степенью конформационных изменений рецептора (Chamberlain et al., 1994). Распределение частот аллелей по полиморфному локусу AR (CAG)n в исследуемых выборках представлено на рисунке 5 и в таблице 6. У мужчин хадза и датога нами выявлено 19 аллельных вариантов. При этом представители хадза оказались менее полиморфны по данному локусу (индекс аллельного разнообразия составил у хадза - h=0.840, у датога - h=0.911). В обеих выборках преобладают аллельные варианты со средним количеством (от 19 до 25) CAG-повторов. Их суммарная частота у хадза составляет 0.905, причем хорошо выраженный максимум приходится на частоты 21R- и 22R- аллелей (0.237 и 0.253, соответственно). У датога суммарная частота аллелей со средним количеством CAG-повторов составляет 0.708, при этом отсутствует выраженный максимум. Кроме того у датога повышена частота аллельных вариантов с малым (? 18) (0.056 - датога, 0.031 - хадза) и большим (?26) (0.235 и 0.063, соответственно) количеством CAG-повторов. Проведенный сравнительный анализ распределений частот аллелей показал достоверные различия между индивидами хадза и датога по данному локусу (P<0.001).

Рисунок 5. Распределение частот аллелей по локусу AR (CAG)n у представителей хадза и датога.

Таблица 6. Распределение частот аллелей локуса AR (CAG)n

Таблица 7.Распределение частот генотипов и аллелей локуса rs53576 гена OXTR

Примечания: N - размер выборки, p(N) - частота генотипа/аллеля (число носителей), НЕ - ожидаемая гетерозиготность, P - уровень достоверности; полужирным шрифтом выделены статистически значимые значения попарных различий.

В исследуемых выборках преобладающим является G-аллель. Его частота у хадза составила 0.617, у датога - 0.725. А-аллель обнаружен у индивидов хадза с частотой 0.383, у индивидов датога - 0.275. Среди представителей хадза преобладает гетерозиготный генотип с частотой 0.563. Доля гомозигот у хадза составляет: G/G -

0.335 и A/A - 0.102. Среди представителей датога преобладают гомозиготы G/G c частотой 0.537. Доля других генотипов у датога составляет: G/A - 0.376 и A/A -

0.087. Сравнительный анализ распределений частот аллелей и генотипов показал значимые различия между индивидами хадза и датога (P=0.001). У датога по сравнению с хадза повышена частота G-аллеля (0.725 и 0.617, соответственно), а также частота гомозигот G/G (0.537 и 0.335, соответственно). Значение коэффициента фиксации Райта (FST = 0.023) свидетельствует об очень слабой дифференциации между хадза и датога по данному локусу.

3.3 Анализ ассоциаций изученных полиморфных локусов с различными формами агрессивного поведения

Для выявления взаимосвязи между CAG-полиморфизмом гена AR и уровнем агрессии был проведен корреляционный анализ, который показал достоверную взаимосвязь данного полиморфизма с показателями враждебности и общей агрессии у датога и показателями гнева и общей агрессии у хадза (табл. 8). Носители аллелей с меньшим количеством CAG-повторов характеризовались более высокими баллами по соответствующим шкалам опросника. Тенденция в таком же направлении выявлена для показателей физической агрессии у представителей обоих племен (табл. 8). Таким образом, было показано, что мужчины с меньшим количеством CAG-повторов в генотипе ведут себя более агрессивно, чем их соплеменники с большим количеством CAG- повторов в генотипе.

Для выявления взаимосвязи полиморфизма гена окситоцинового рецептора OXTR rs53576 с разными формами агрессивного поведения был проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) в отдельных выборках хадза и датога, результаты которого представлены в таблице 9. Для проведения анализа каждая выборка была разделена на три группы: первую группу составили гомозиготы A/A , вторую - гетерозиготы A/G, третью - гомозиготы G/G.

Таблица 8.Результаты корреляционного анализа взаимосвязи между CAG- полиморфизмом гена AR и показателями различных форм агрессии

Примечания: N - размер выборки, ф - коэффициент ранговой корреляции Кендалла, P - уровень достоверности: (**) - P<0.01, (*) - P<0.05, (·) - P<0.1.

Таблица 9.Результаты дисперсионного анализа в выборках мужчин хадза и датога

Примечания: Df - количество степеней свободы, SS - сумма квадратов, MS - средний квадрат, F - критерий Фишера, P - уровень достоверности, полужирным шрифтом выделены статистически значимые значения.

В выборке датога анализ не выявил ассоциаций между генотипами локуса OXTR rs53576 и уровнем разных форм агрессивного поведения. Однако в выборке хадза была обнаружена ассоциация данного локуса с показателями гнева (рис. 7.). Средний балл по шкале «Гнев» группы гомозигот А/А с учетом стандартной ошибки не отличался от среднего балла группы гомозигот G/G. Однако гетерозиготы характеризуются более высоким средним баллом, чем другие генотипы (рис. 7).

Рисунок 7. Средние значения и стандартные ошибки баллов по шкале «Гнев» в группах OXTR rs53576 у представителей хадза

Глава 4. Обсуждение результатов

Нами было проведено исследование, которое позволило сравнить аллельный полиморфизм генов андрогенового и окситоцинового рецепторов и выявить их ассоциации с агрессивным поведением в выборках мужчин хадза и датога, характеризующихся разным уровнем культурно допустимой агрессии. В наше исследование были включены только мужчины, так как существуют обусловленные полом различия генотип-средовых эффектов на агрессию (Еslund et al., 2011; Dmitrieva et al., 2011). Полученные нашими коллегами данные анкетирования свидетельствуют, что мужчины датога характеризуются более высокими средними баллами по всем шкалам агрессии, чем мужчины хадза. В этой связи важно отметить несколько различий между представителями этих двух культур. Среди хадза существует негативное отношение к агрессии, однако это не характерно для датога. Хадза предпочитают избегать ситуаций с потенциальной угрозой. В противоположность этому, у датога агрессия является инструментом с социального контроля, как внутрисемейных, так и внутриплеменных взаимоотношений. Для мужчин датога свойственно конкурировать друг с другом и действовать агрессивно при особых обстоятельствах.

Согласно данным Alfred (http://alfred.med.yale.edu/) и Ensembl (http://www.ensembl.org/) полиморфизм локусов AR (CAG)n и OXTR rs53576 хорошо изучен в выборках из других африканских популяций. В данном исследовании было показано, что мужчины хадза менее полиморфны по числу CAG-повторов гена AR (17-30), чем датога (15-34). Кроме того, генетическое разнообразие мужчин хадза по данному локусу также снижено по сравнению с другими африканскими популяциями, в том числе представителями ариаал (Восточная Африка) (15-34) (Campbell et al., 2009). Такая низкая вариабельность мужчин хадза, по-видимому, может быть обусловлена различиями численности популяций, выбранных для исследования. Мы зафиксировали слабую отрицательную корреляцию между количеством CAG-повторов в гене AR и показателями враждебности и общей агрессии у мужчин датога и показателями гнева и общей агрессии у мужчин хадза. Таким образом, наши данные согласуются с выявленной ранее тенденцией к увеличению частоты аллелей с короткими кластерами CAG среди испытуемых с высокими показателями доминирования и агрессии (Jцnsson et al., 2001). Было показано, что при малом количестве повторов уменьшается степень конформационных изменений рецептора и, как следствие, рецептор становится более чувствительным к андрогенам из-за усиления связи в комплексе гормон- рецептор, которая приводит к активации транскрипции (Chamberlain et al., 1994). Вероятно, такое повышение чувствительности андрогеновых рецепторов к андрогенам приводит к проявлению агрессивного поведения, активируемого андрогенами (Field et al., 2006).

Результаты прямого теста на соответствие распределения частот генотипов локуса OXTR rs53576 равновесию Харди-Вайнберга, проведенного в нашем исследовании, указывают на то, что данный локус в выборке хадза находится в неравновесном состоянии. На основании оценки доли полиморфных сайтов установлено, что эффективная численность популяции хадза должна составлять от 9200 до 20900 индивидов, однако в настоящее время их численность значительно сократилась и составляет около 1000 человек, что подтверждает эффект «бутылочного горлышка», пережитый популяцией хадза в недавнем прошлом (Lachance et al., 2012). Принимая во внимание низкую численность популяции хадза, случайный дрейф или действие естественного отбора могут приводить конкретные локусы в неравновесное состояние. Также данное исследование показало достоверные различия в распределениях частот аллелей и генотипов локуса rs53576 гена OXTR между мужчинами хадза и датога. В обеих выборках преобладающим является G-аллель, его частота ниже у хадза, чем у датога. По сравнению с другими африканскими представителями, такими как ишан, йоруба, мандинка и менде (Западная Африка) (данные Ensembl), мужчины хадза и датога имеют самую низкую частоту G-аллеля. Кроме того у мужчин хадза частота гомозигот G/G ниже, а частота гетерозигот G/A выше, чем у датога. Частоты гомозигот А/А статистически

значимо не отличаются у исследованных мужчин. По сравнению с другими африканскими представителями (данные Ensembl), мужчины хадза имеют самую высокую частоту гетерозиготного генотипа. Ранее было показано, что лица, гомозиготные по G-аллелю, в сравнении с индивидами с одной или двумя копиями А-аллеля показывают более высокий уровень сочувствия и склонны к проявлению просоциальности (альтруизма) (Rodrigues et al., 2009; Kogan et al., 2011). Наше исследование выявило ассоциацию данного локуса с показателями гнева только в выборке мужчин хадза. Возможно, данные этнические различия объясняются влиянием социальной среды, то есть различиями культурных факторов и истории исследованных популяций. Данные формы агрессии могут иметь разное приспособительное значение среди охотников-собирателей и скотоводов. Группа гомозигот G/G характеризовалась более низким средним баллом гнева, чем гетерозиготы. Средний балл группы гомозигот А/А с учетом стандартной ошибки не отличался от среднего балла группы гомозигот G/G. Предполагается, что гипофункция окситоциновой системы, при которой наблюдается снижение склонности индивида к альтруизму, предрасполагает его к агрессивному поведению (Fetissov et al., 2006). Таким образом, наши данные согласуются с предположением, что гомозиготный генотип G/G, являющийся маркером склонности к альтруизму, ассоциирован с более низким уровнем агрессии.

Полученных нами результаты указывают на существование взаимосвязи полиморфизмов в генах андрогенового и окситоцинового рецепторов с различными формами агрессии в выборках мужчин хадза и датога. Эти данные представляют интерес для понимания молекулярно-генетических основ социального и агрессивного поведения и могут быть использованы в исследовании других этносов и популяций, выборочных групп и отдельных индивидов, а также для разработки и апробации диагностической системы на предрасположенность человека к агрессивному поведению.

Выводы

1. Впервые определены частоты аллелей и генотипов локуса AG (CAG)n гена андрогенового рецептора и локуса OXTR rs53576 гена окситоцинового рецептора в выборках мужчин хадза и датога;

2. Установлено, что мужчины хадза и датога различаются по распределениям частот аллелей и генотипов полиморфных локусов AG (CAG)n и OXTR rs53576;

3. Показана отрицательная корреляция между количеством CAG-повторов в гене AR и показателями враждебности и общей агрессии у мужчин племени датога, и показателями гнева и общей агрессии у мужчин племени хадза;

4. У мужчин племени хадза показана ассоциация локуса OXTR rs53576 с показателями гнева.

Список работ, опубликованных по теме выпускной квалификационной работы

Список используемой литературы

1. База данных Alfred [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://alfred.med.yale.edu/

2. База данных Ensembl [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.ensembl.org/

3. База данных Human Genome Epidemiology Network (HuGENet) [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.cdc.gov/genomics/hugenet/

4. База данных KEGG pathway maps [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.genome.jp/kegg/pathway.html

5. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная человека: В 3-х томах. Пер. с англ. - М: Мир. 1987 г. 366 с.

6. Альбертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Робертс К., Уотсон Дж. Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., перераб. М75 и доп. Т. 1. Пер. с англ.-М.: Мир. 1994 г. С. 340-365.

7. Артамонова В.С., Махров А.А. Генетические методы в лососеводстве и форелеводстве: от традиционной селекции до нанобиотехнологий. М. Товарищество научных изданий КМК. 2015 г. 128 с.

8. Биохимия: Учеб. для вузов, Под ред. Е.С. Северина., 2003 г. 779 с.

9. Бутовская М. Л., Буркова В. Н. Церемония включения и отделения ребенка как обряды перехода у датога северной Танзании //Этнографическое обозрение. - 2009 г. - №. 2. - С. 51-67.

10. Бутовская М. Л., Драмбян М. Ю., Буркова В. Н. и др. Почему хадза Танзании продолжают в наши дни заниматься охотой и собирательством? //Полевые исследования Института этнологии и антропологии РАН - 2006. -2008. С. 38-62.