Маслянокислые бактерии как продуценты кислот

Маслянокислое брожение крахмала исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими 1/3 высокой пробирки, добавляют немного мела, заливают водопроводной водой на 2/3 и помещают в водяную баню при 80^о на 19 мин для пастеризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры. Элективные условия создают: крахмалом- источником углерода, используемым только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу; пастеризацией; анаэробиозом (высокий столбик жидкости в пробирке и выделение в процессе брожения СО₂ и Н₂, вытесняющих воздух). Через 2-3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения.

Качественная реакция на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl₃). Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCl₃ приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа. В пробирку наливают 3-5 мл сброженной жидкости, добавляют 1-2 мл 5%- ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:

3Ca (CH₃CH₂CH₂COO) ₂ + 2Fe₂Cl₃ > 2Fe (CH₃CH₂CH₂COO) ₃ + 3CaCl₂

Раствор маслянокислого железа в отраженном свете приобретает буровато-коричневое окрашивание, а в проходящем свете - кроваво-красное.

Техника посева культур микроорганизмов. В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на твердых и жидких средах в пробирках, колбах или в чашках Петри.

Посевом в микробиологии называется внесение клеток микроорганизмов (посевного материала - инокулята) в стерильные среды.

Пересев- это перенос выращенной культуры микроорганизмов на питательной среде на другую свежую питательную среду.

Посев (и пересев) микроорганизмов проводят при соблюдении определенных правил стерильности, которые необходимо выполнять, чтобы предохранить исследуемую культуру от загрязнения посторонними микроорганизмами и не загрязнять окружающую среду исследуемыми культурами микроорганизмов.

Посев (или пересев) всегда проводят вблизи горелки. Пробирки при взятии мазка необходимо удерживать в наклонном положении, чтобы гарантировать стерильность культуры. Если их держать вертикально, то возможно попадание посторонних клеток микроорганизмов.

В пламени горелки тщательно обжигают бактериологическую петлю, держа ее в правой руке в отвесном положении. Мизинцем правой руки вынимают из второй пробирки ватную пробку и зажимают ее между мизинцем и ладонью, пробку первой пробирки зажимают между безымянным и средним пальцами правой руки. Снова слегка обжигают иглу и вводят ее в пробирку с культурой. Платиновая игла остывает очень быстро. Легким прикосновением ее к колонии микроорганизмов берут небольшое количество микробной массы и переносят во вторую пробирку.

Окраска клеток микроорганизмов по Граму. Метод дифференциации микробных клеток, основанный на различии в химическом составе клеточных оболочек. Сущность его в том, что в клетках одних видов микроорганизмов образуется нерастворимое в спирте соединение йода с основным красителем, у других видов это соединение временно появляется временно и после обработки спиртом растворяется. Микробы первой группы называются грамположительными, второй - грамотрицательными.

Техника окраски по Граму. На хорошо обезжиренное стекло наносят три тонких мазка разных культур микроорганизмов (два из них- контрольные с заведомо известным отношением к окраске по Граму). Мазки высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 1мин феноловым раствором генциана фиолетового (или кристаллического фиолетового), держа стекло в несколько наклоненном положении. Препарат, не промывая водой, обрабатывают, непрерывно покачивая ,96% -ным спиртом в течение 15-20 с. Время обесцвечивания очень существенно, при превышении указанного срока обесцвечиваются и грамположительные клетки, при недостаточном сроке обработки препарат окажется перекрашенным.

Промыв препарат водой, его окрашивают фуксином Пфейфера в течение 1мин. После этой обработки грамположительные микроорганизмы окрашиваются в темно - фиолетовый цвет, грамотрицательные имеют только цвет дополнительной окраски (фуксина) (Теппер и др., 1987).

2.2 Модельные микроэкосистемы

Небольшие автономные «миры» или микрокосмы, в бутылях или других сосудах могут имитировать в миниатюре природу различных экосистем. Эти небольшие «миры» можно рассматривать как Микроэкосистемы. Создание небольших, полностью закрытых систем, нуждающихся в лишь одной световой энергии (своеобразные миниатюрные биосферы), - очень сложная задача. Экспериментальные микрокосмы обычно варьируют от частично закрытых систем, в которых происходит газообмен с атмосферой, но не происходит обмена биогенными элементами и организмами, до полностью закрытых систем, включающих сообщества организмов, содержащихся в различных хемостатах и турбидостатах с регулируемым притоком и оттоком биогенных элементов и организмов. В хорошо смоделированных микрокосмах можно наблюдать многие или даже почти все основные функции и трофические структуры природной экосистемы, однако в силу необходимости разнообразие и размеры компонентов таких микрокосмов крайне невелики. Преимущества микроэкосистем для исследователя заключаются в том, что они имеют четкие границы, легко воспроизводимы и удобны для экспериментов. Не следует, однако, думать, что микрокосмы представляют собой копии той или иной конкурентной экосистемы, это всего лишь живые работающие модели (упрощения) природы.

Можно выделить два типа биологических микрокосмов:1) микроэкосистемы, взятые непосредственно из природы путем множественного засева культуральной среды пробами из различных природных местообитаний, и 2) системы, созданные путем сочетания видов, выращенных в «чистых» или аксенических, культурах (свободных от других организмов), пока не получится желаемая комбинация. Системы первого типа - это, в сущности, «демонтированная» или «упрощенная» природа, сведенная к тем микроорганизмам, которые могут длительное время поддерживаться и функционировать в условиях выбранного экспериментатором сосуда, культуральной среды, освещенности и температуры. Такие системы, следовательно, обычно имитируют какие - то определенные природные ситуации. Одна из проблем, возникающая при работе с такими производными экосистемами, состоит в том, что трудно определить их точный видовой состав, особенно состав бактерий (den et al, 1969). Начало использованию в экологии производных или «множественных» систем положили работы Г. Одума и его учеников (H. Odum, Hoskins, 1957; Beyers, 1963).

При втором подходе путем подбора первоначально изолированных и тщательно изученных компонентов создается система с известным составом. Получаемые при этом культуры часто называют гнотобиотическими (этот термин обсуждается в работе Догерти (Dougherty, 1959)), поскольку здесь точно известен состав и даже то, присутствуют или отсутствуют бактерии. Гнотобиотические культуры прежде использовали главным образом для изучения питания, биохимии и других аспектов жизни отдельных видов и штаммов или для изучения взаимодействия двух видов. Однако в последнее время экологи начали экспериментировать с более сложными полиаксеническими культурами в поисках путей построения автономных экосистем (Nixon, 1969; Taub, 1969, 1974).

Эти два противоположных подхода к созданию лабораторных микроэкосистем параллельны двум давно существующим подходам (холистическому и мерологическому) экологов к изучению озер и других больших систем, существующих в природе.

Существует широко распространенное заблуждение относительно «равновесия» в аквариуме с рыбами. Вполне возможно достигнуть некоторого приблизительного равновесия газового и пищевого режима при условии, что в нем мало рыб, а воды и растений много. Еще в 1851 г. Дж. Уорингтон «установил это удивительное и восхитительное равновесие между животным и растительным царствами» в аквариуме объемом 12 галлонов (54,6 л), поселив в нем несколько золотых рыбок, улиток и большое количество валлиснерии (водное растение), а с ними и множество разнообразных микроорганизмов. Уорингтон правильно оценил не только взаимодействие рыб и растений, но и отметил значение детритоядных улиток «в разложении остатков растений и водорослевой слизи», в результате чего «то, что иначе могло бы действовать как ядовитое начало, превращается в плодородную среду для роста растений». Большинство попыток любителей добиваться равновесия в аквариуме терпит неудачу из-за того, что для наличного количества ресурсов в аквариум помещают слишком много рыб (диагноз: элементарный случай перенаселения). Для полного самообеспечения одной рыбе среднего размера требуется много кубических метров воды и организмов, служащих пищей. Поскольку аквариум обычно держат дома, на работе или в школе ради «наблюдения за рыбами», помещая большое число рыб в малом пространстве, необходимо дополнительное питание, аэрация и периодическая очистка аквариума (Одум, 1986).

В данной работе была проведена постановка двух модельных микроэкосистем. В одной системе исследовалось влияние микрофлоры реки Кривая Болда на микробиологический состав садовой почвы. Во второй микроэкосистеме наблюдалось влияние микрофлоры озера Баскунчак на микробиологический состав садовой почвы.

Для постановки модельных микроэкосистем на дно двух высоких цилиндров V = 500 см³ помещалось 100 г. исследуемой почвы и заливалось 1000мл. воды в первом случае взятой из реки Кривая Болда, а во втором - из озера Баскунчак. В том виде экосистемы оставляли на открытом воздухе на 3 недели. По прошествии этого времени со дна цилиндра забирают небольшое количество почвы, просушивают ее на воздухе, затем взвешивают в количестве 1г, которую помещали в пробирку с 10 г. стерильной воды. Производили ряд последовательных разведений:10^-1 -10^-7. Из каждого разведения брали по 1 мл и помещали в высокие стерильные пробирки методом глубинного посева. В полученную культуральную жидкость заливают жидкую среду Виноградского до 3/4 объема.

Данные экосистемы исследовались также на среде Имшенецкого, при этом среда в высокой пробирке, предварительно простерилизованная засевается комочком почвы и помещается в термостат.

Необходимость изучения маслянокислых бактерий в водоемах была очевидной. Обследование разнотипных водоемов с широким спектром гидролого-гидрохимических и продукционных характеристик позволило впервые выявить экологические особенности распределения отдельных видов маслянокислых бактерий. Главными факторами, обуславливающими преимущественное развитие тех или иных бактерий в отложениях, являются концентрация, состав и доступность С_орг - соединений, отражающие трофический статус водоемов.C pasteurianum, сбраживающий простые сахара, доминирует вилах евтрофных озер донных отложений полисапробных зон с максимальным содержанием легкогидролизуемых соединений. C. butyricum и C. felsineum, ферментирующие различные полисахариды, преобладают в мезотрофных озерах и водохранилищах

, грунты которых формируются под влиянием аллохтонного стока и прибрежной растительности. C. acetobutyricum, обладающий способностью усваивать не только углеводы и аминокислоты, но также лигнино - гумусовые соединения, достигает максимума донных отложениях ацидных хтониоевтрофных озер. Таким образом, полученные на обширном материале новые для водной микробиологии сведения неоспоримо свидетельствуют о геохимической значимости маслянокислых бактерий, которые являются важнейшим звеном бактериальных сообществ донных отложений внутренних водоемов разного типа (Дзюбан, 2005).

Глава 3. Результаты исследований

При постановке накопительной культуры, выделении и микроскопировании маслянокислых бактерий получили следующие данные.

Таблица 1

Культуральные признаки маслянокислых бактерий на среде Виноградского

При анализе данной таблицы можно наблюдать, что здесь весьма интенсивно происходили процессы брожения: происходило помутнение среды, образовывался газ, чувствовался сильный запах масляной кислоты, выделился осадок, присутствовала пленка. При культивировании в среде создались анаэробные бактерии, поэтому обнаруженные здесь бактерии относятся к анаэробам и образуют споры.

Таблица 2

Культуральные признаки бактерий на среде Имшенецкого

При анализе данной пробы наблюдалось присутствие на среде анаэробных спорообразующих палочек. Заметен интенсивный процесс разрушения клетчатки. Бумага ослизняется в результате образования оксикислот.

Таблица 3.

Культуральные признаки бактерий на картофельной среде

При анализе данной пробы можно заметить, что здесь присутствуют анаэробные образующие клостридиальные споры палочки. Интенсивно происходят процессы маслянокислого брожения: помутнение и пожелтение среды, образование пузырьков газа, запах масляной кислоты, образование осадка.

Результаты выделения бактерий из почвы, используемой в микроэкосистеме

Таблица 4

Система с водой из реки Кривая Болда

Культуральные признаки бактерий на среде Виноградского

При анализе данной пробы можно сделать вывод, что на среде присутствуют анаэробные палочки с клостридиально расположенными спорами. Наблюдается помутнение среды, образование осадка, проявление запаха масляной кислоты, пленка не образовалась.

Культуральные признаки бактерий на среде Имшенецкого

Анализируя данную пробу, можно заметить, что здесь встречаются анаэробные споровые и бесспоровые палочки. Среда болотного или зеленого цвета. Происходит ослизнение и разрушение бумаги в результате образования оксикислот

Система с водой из озера Баскунчак

Культуральные признаки бактерий на среде Виноградского

При анализе данной пробы можно сделать вывод, что на среде присутствуют анаэробные палочки с клостридиально расположенными спорами. Наблюдается помутнение среды, образование осадка, проявление запаха масляной кислоты, пленка не образовалась.

Таблица 7

Культуральные признаки бактерий на среде Имшенецкого

При анализе данной пробы отмечается, что здесь присутствуют анаэробные споровые и бесспоровые палочки. Среда приобретает желтый или зеленый цвет, бумага ослизняется и разрушается в результате образования оксикислот.

Приведенные здесь результаты исследований были получены после определенного времени инкубирования: при выделении на среде Виноградского - в течение 2-3 дней; на среде Имшенецкого - в течение 3 - 4 дней.

Проведение качественной реакции на масляную кислоту.

В пробирку помещали 3-5 мл сброженной культуральной жидкости, добавляли 2 мл 5 % - ного хлорида железа и нагревали на пламени горелки. В результате раствор приобрел буровато - коричневое окрашивание, в проходящем свете становящееся кроваво - красным. Данный опыт подтверждает наличие в культуральной жидкости маслянокислых солей, которые дали такую реакцию:

3Ca (CH₃CH₂CH₂COO) ₂ + 2Fe₂Cl₃ > 2Fe (CH₃CH₂CH₂COO) ₃ + 3CaCl₂

Качественная реакция на Fe₂Cl₃

Выводы

1. Из садовой городской почвы, отобранной в парковой зоне АГТУ г. Астрахани, были выделены различные бактерии, осуществляющие маслянокислое брожение. Изучены культуральные и морфологические свойства маслянокислых бактерий, причем на среде Виноградского, среде Имшенецкого и на картофельной среде были выделены различные рода бактерий, являющиеся анаэробными и принадлежащие к разным систематическим группам.

2. При выделении маслянокислых бактерий из данной почвы обнаружили, что качественный состав бактерий в садовой городской почве и в почве, задействованной в экосистеме, различен. Так, для почвы характерны бактерии родов Clostridium и Bacillus. Для почвы, задействованной в экосистеме реки Кривая Болда характерны бактерии рода Clostridium. Для почвы экосистемы озера Баскунчак кроме бактерий рода Clostridium встречаются бактерии рода Bacillus.

Анализируя бактериологический состав почвы экосистем можно сделать вывод, что в данных экосистемах анаэробные условия, созданные при помощи воды, способствовали более интенсивному развитию маслянокислых бактерий, чем в почве. Это можно объяснить частично аэробными условиями открытой почвы, в то время как под слоем воды создаются полностью анаэробные условия. Таким образом, подтопление территории дало более интенсивное развитие маслянокислых бактерий.

Исходя из того, что в системе озера Баскунчак был отмечено большее видовое разнообразие, можно заключить, что повышенная соленость данного водоема положительно действует на активность процессов маслянокислого брожения.

Полученные результаты позволяют получить картину тех изменений, которые произошли бы в почве в результате подтопления из- за повышения уровня Каспийского моря.

Список используемой литературы

1. Алешукина А.В. Медицинская микробиология. Ростов - на - Дону, «Феникс», 2003.-472 с.

2. Беркли Р., Э. Бок, Д. Бун и др.; Под ред. Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли и С. Уильямса. Пер. с англ. Г.А. Заварзина. Определитель бактерий Берджи -9- е изд.- Москва, Мир, 1997.-432 с.

3. Богданов В.М., Баширова Р. С., Кирова К. А., Корнеев И.П., Кострова Е.И., Петржиковская Л.М., Панкратов А.Я., Свитыч К.А. Техническая микробиология пищевых продуктов. Издательство пищевая промышленность. Москва, 1968.- 743 с.

4. Градова Н.Б., Бабусенко Е.С., Горнова И.Б., Гусарова Н.А. Лабораторный практикум по общей микробиологии. Москва, Дели принт, 2001.-144 с.

5. Емцев В.Т., Мишустин Е.Н.. Микробиология 6-е издание, исправленное. Дрофа, Москва, 2006. - 444 с.

6. Журнал «Микробиология» том 74 №1, А.Н. Дзюбан, 2005, 119 -125 с.

7. Одум Ю. Экология: В 2 - х. томах, том 2 / Пер. С англ. Ю.М. Фролова; Под ред. Акад. Соколова - М.: Мир, 1986. - 376 с.

8. Родина А.Г. Методы водной микробиологии/Практическое руководство. Москва; Наука, 1965. - 363 с.

9. Руководство к практическим занятиям по микробиологии/Учебное пособие. Под ред. Н.С. Егорова - Москва, МГУ, 1995.-224 с.

10. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. Москва, агропромиздат, 1987.-238 с.