Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК

18

Рис. 19. Схема нанесения проб в лунки планшета.

Рис. 20. Результат амплификации в пластиковых микропланшетах.

По результатам эксперимента (рис. 20) видно что в 1 и 3 ряду амплификация прошла, так как интенсивность флуоресценции заметно возросла. Темное пятнышко по центру лунок - это некоторый объем воздуха который образуется при покрытии плашки пленкой. Это указывает на то, что практически весь объем лунки заполнен образцом.

В этих же рядах в лунках под номером 5 сигнал значения не изменил. Это доказывает то, что матрица здесь не присутствовала. Контроль номер 2 также сработал, так как флуоресценция в 4 ряду свое значение не изменила. Второй и пятый ряды практически не флуоресцируют. Это подтверждает наличие в их лунках воды. Значения сигнала флуоресценции каждой лунки представлены в таблице 4. Графическое изображение полученной картины представлено на рис. 21.

Таблица 4

Рис. 21. Диаграмма, отображающая уровень сигнала в лунках пластиковой микроплашки.

3.4. Постановка ПЦР в микрообъеме с отрицательными контролями

ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Общий объем ПЦР смеси составлял 1 мкл. Количество внесенной матрицы одинаково - 7 нг. Контролем служили пробы без матрицы. Измерение и регистрацию флуоресцентного сигнала проводили с помощью описанной системы детекции и программы «Qwantа». Результаты измерений представлены в таблице 5.

По данным таблицы видно, что приращение сигнала флуоресценции сопоставимо с измерениями, полученными при проведении ПЦР в капле смеси объемом 1 мкл в среде масла в обоих случаях. А значит амплификация проходит с не меньшей эффективностью чем на моделях с каплями. Сильный разброс значений в случае SYBRgreen лишний раз доказывает, что работа с микрообъемами - это очень сложный процесс, где даже самые минимальные погрешности в работе (погрешности пипеток, чистота преперата и т.д.) становятся критичными и влияют на результат.

Таблица 5.

3.5. Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в образцах ПЦР-смеси после амплификации

ПЦР ставили по протоколам с использованием SYBRgreen и TaqMan. Амплификация проходила в микропланшетах в объеме смеси - 1 мкл (на геле эти образцы обозначены прописной буквой «ч») и как контроль в амплификаторе «ТерЦик» под минеральным маслом в объеме 20 мкл(на геле - это образцы с индексом «а»). Заглавные буквы T и S означают ПЦР с системой TaqMan и SYBRgreen соответственно. Индексы 1, 2 и 3 в системе TaqMan означают использование разных растворов полимераз и в принципе важного значения для этого опыта не имеют, поэтому их можно расценивать как 3 повтора. Индекс «ч_до» у одного из S означает ПЦР-смесь до амплификации. В карман геля наносили по 5 мкл образца. М - маркер - смесь нуклеиновых кислот размером от 50 до 1000 п.н.

На рис. видно, что амплификация прошла во всех пробах системы TaqMan. Шесть полос, проявившихся на геле чуть ниже уровня полосы маркера с цифрой 100 означают, что во всех этих пробах прошла реакция и наработался фрагмент ДНК размером около 100 п.н. На дорожках, куда вносили пробы после амплификации в «Терцике» полосы проявились сильнее, чем на дорожках с пробами из чипа. Значит наработанного фрагмента в плашках меньше, чем в макрообъеме под маслом. Это обстоятельство опять же объясняется форматом микрообъемов, где погрешности каждого из этапов работы становится критичным. В случае с SYBRgreen также наблюдается подобная картина. Полоски не проявились в случае с образцом не прошедшим амплификацию и проявились на дорожках лунок, куда вносили образцы после амплификации. Следовательно амплификация в них прошла и наработался фрагмент размером около 600 п.н.

Гель фотографировали с зеленым светофильтром, пропускающим соответствующую длину волны красителя (520 нм). На геле хорошо заметны зеленые полосы крашенной наработанной в процессе амплификации ДНК и исходной матрицы(полосы в самом начале карманов), которая имеет большой размер (5000 п.н.) и за время разделения успела только войти в гель. Опять же количество наработанного фрагмента в чипе меньше (хоть и не значительно по сравнению с системой TaqMan), чем в макрообъемной ПЦР-смеси. Однако нужно обратить внимание на то, что верхняя полоса в лунке S₁₈ч окрашена слабее, чем в лунке S₁₈а. Это говорит о том, что изначально количество матрицы в образце было меньше, что опять же связано с погрешностями в работе с микрообъемами.

Выводы.

· Созданы экспериментальные образцы микропланшетов, позволяющие проводить полимеразную цепную реакцию в общем объеме ПЦР-смеси - 1 мкл.

· Подобраны условия эффективной полимеразной цепной реакции в объеме реакционной смеси 1 мкл.

· Отработаны условия ПЦР в микрообъеме (1 мкл) - формате биологических микрочипов.

Заключение.

Сейчас без преувеличения можно сказать: развитие "технологии манипулирования с наследственной информацией" сравнимо по темпам роста с микроэлектроникой и информатикой, нередко эффективно сочетается с ними. И только уникальное сочетание преимуществ традиционных методов и технологий приведет человека к решению ранее недоступных задач в этой интересной и перспективной области. Подобные направления позволяют устанавливать структуру и изучать процессы на уровне генов всего генома, белков всей клетки или клеток всей ткани.

В ходе выполненной работы создана система, которая позволила объединить преимущества таких методов как RealTime ПЦР и микрочипового анализа. Внедрение основы этой разработки в медицину может положить начало создания уникальных тест систем и инструментов клинической диагностики. Количественный ПЦР особенно необходим для обнаружения и мониторинга некоторых вирусных заболеваний ( таких как вирусный гепатит С и В, СПИД). Биочип является уникальным устройством, позволяющим проводить одновременно большое количество анализов на одной подложке. Перевод количественного ПЦР в формат чипа сделает анализ быстрым и экономичным.

Список литературы

1. А.Шляпникова, Ю.М.Шляпников, В.Н.Афанасьев, Г.В.Афанасьева, А.В.Гаврюшкин, И.П.Белецкий. «Исследование качества амино-модифицированных подложек, используемых для гибридизационного анализа» Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН. УДК 547.963.3

2. Шляпникова Е.А., Шляпников Ю.М., Грановский И.Э., Афанасьева,Г.В., Гаврюшкин А.В., Белецкий И.П «Биологические микрочипы в медицине» Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН.

3. Шишкина И.Г., Левина А.С., Зарытова В.Ф. «Аффинные сорбенты, содержащие нуклеиновые кислоты и их фрагменты» // Успехи химии//2001 г. №70(6), с.581,.

4. Иванов, И., Ершов Г., Барский, В., Бельговский, А., Кириллов, Е., Крейндлин, Э., Паринов, С., Мологина, Н., и Мирзабеков А., Диагностика генетических мутаций на олигонуклеотидных микрочипах. (1997 г.) Мол. Биол., 31, с. 159-167.

5. «Биочипы в биологии и медицине XXI века» Академик А.Д. Мирзабеков. Выступление на научной сессии общего собрания РАН

6. Барский В., Колчинский А., Лысов Ю., Мирзабеков А. Биологические микрочипы, содержащие иммобилизованные в гидрогеле нуклеиновые кислоты, белки и другие соединения: свойства и приложения в геномике // Мол. биол., 2002. Т. 36. С. 563-584.

7. Новейшие технологии в генодиагностике: полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR). Екимов А.Н., Шипулин Г.А., Бочкарев Е.Г. Рюмин Д.В. Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии Министерства Здравоохранения РФ.

8. Л. И. Патрушев «Искусственные генетические системы» Том 1 Москва, Наука, 2004 С.228.

9. Момыналиев К.Т., Говорун В.М. «Методы развития ДНК-диагностики в клининеческой медицине» Лаборатория генной инженерии и иммуногенетики НИИ физико-химической медицины МЗ РФ, Москва 2003

10. Ekins R.P. (1987) An overview of present and future ultrasensitive nonisotopic immunoassay development. Clin. Biochem. Revs. 8, 12-22.

11. Bernard P.S., Pritham G.H., Wittwer C.T. Color multiplexing hybridization probes using the apolipoprotein E locus as a model system for genotyping. //Analytycal Biochemistry.-1999. - № 273.- p. 221-228.

12. Coutlee, F., He Y., Saint-Antoine P., Olivier C. , Kessous A. Coamplification of HIV type 1 and beta-globin gene DNA sequences in a nonisotopic polimerase chain reaction assay to control for amplification efficiency.// AIDS Res. Hum. Retroviruses.-1995.-№ 11.- p.363-371

13. Heid C.A. Real-time quantitative PCR. // Genome Res.-1996.-№ 6.-p. 986-994.

14. Higuchi R. Kinetic PCR Analysis: Real-time monitoring of DNA amplification reactions// Biotechnology.-1993.-№ 11.- 1026-1030.

15. Sykes P.J., Neoh S.H., Brisco M.J., Hughes E., Condon J., Morley А.А. Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.// BioTechniques.-1995.-№ 13.- p.444-449.

16. Tyagi S., Kramer F.R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization.// Nat Biotechnol.-1996.-№ 14.- p.303-308.

17. Timofeev E., Mirzabekov A. (1998) Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manifacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips and protein microchips. Anal.Biochem., 259, 34-41.

18. Adessi C., Matton G., Ayala G., Turcatti G., Mermod J., Mayer P. , Kawashima E. Solid phase DNA amрlification: characterisation of primer attachment and amplification mechanism //Nucleic Acids Research. - 2000. - Vol. 51. - No. 20.

19. Bing D., Boles C., Rehman F., Audeh M., Belmarsh M., Kelley B., Adams C.. Bridge amplification: a solid phase PCR system for the amplification and detection of allelic differences in single copy genes //Genetic Identity Conference Proceedings, Seventh International Symposium on Human Identification. - 1996.

20. Brookes A., Lehvaslaiho H., Siegfried M., Boehm J., Yuan Y., Sarkar C., Bork P., Ortigao F. HGBASE: a database of SNPs and other variations in and around human genes //Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - № 1- pp. 356-60.

21. Mercier J., Slater G. Solid Phase DNA Amplification: A Brownian Dynamics Study of Crowding Effects //Biophysical Journal.- 2005. - Vol. 89.