Выделение, изучение свойств микроорганизмов и их использование для выполнения подготовительных процессов переработки овчинно-мехового сырья

Вместе с тем в ряде работ была показана важная роль щелочной протеиназы в модификации ферментов на поздних этапах спорообразования. Например, показано, что протеиназа может превращать фермент вегетативных клеток фруктозо-6-фосфатальдолазу в белок, специфичны для зрелых спор Bac. subtilis. Не исключено также возможное участие щелочной протеиназы в прорастании спор, при этом предполагают, что щелочные протеиназы, гидролизуюя белковую оболочку спор, включают их прорастание.

Все приведенные выше работы касаются роли внеклеточной щелочной протеиназы в спорообразовании.

Вместе с тем установлено, что к моменту начала процесса спорообразования Bac. subtilis образуется также и внутриклеточная щелочная протеиназа, уровень активности которой составляет 10% от соответствующего уровня внеклеточного фермента. Другие виды Bacillus, например Bac.megaterium, синтезируют, в отличие от Bac. Subtilis, толькл внутриклеточную щелочную протеиназу. В некоторых химических свойствах двух протеиназ существуют различия. В частности, указывается на наличие различной потребности в кофакторах и субстратной специфичности. Было также обнаружено, что двум щелочным протеиназам свойственна различная электрофоретическая подвижность. Внутриклеточная протеиназа обладает более узкой специфичностью в отношении эфиров и абсолютной потребностью в кальции. До последнего времени неясным остается вопрос о роли внутриклеточной протеиназы в спорообразовании Bac. Subtilis, хотя и описаны мутанты, у которых наряду с отсутствием активности внутриклеточной протеиназы не осуществляется процесс споруляции /34/.

Таким образом, процесс спорообразования регулируется на различных уровнях и образующиеся на разных этапах дифференцировки спор биологически активные соединения, в частности представляющие практический интерес, могут участвовать в регуляции этого процесса. В связи с эти принципы регуляции спорообразования представляют интерес. Однако в настоящее время еще мало известно о характере регуляции процесса спорообразования и регуляции синтеза соединений, специфичных для споруляции.

1.2.2 Получение щелочных протеиназ

1) Ряд авторов под руководством А. Мудерризаде Bacillus sp. выделили алкалофильный штамм Bacillus sp. в летний период из почвы на территории Университета Дикла (Турция) и определили по Берги. Почвенный образей суспензировали в 20 мл дистиллированной воды, инкубировали при 80⁰С 5 мин. Затем 1 мл ресуспензировали в 9 мл дистиллированной воды и по 0,1 мл вносили в питательный агар. Через 72 ч инкубации при 37⁰С отдельные колонии высевали для определения активности щелочной протеазы.

Выделенные культуры выращивали на различных средах. Основная Среда имела следующий состав (г/л): соевая мука 10; крахмал 10; КН₂РО₄; глюкоза 20; Na₂CO₃ 10; рН 11,5. Культивирование проводили в колбах на 250 мл со 100 мл среды на качалке при 37⁰С 58 ч. После выращивания клетки отделяли центрифугированием, супернатант использовали для очистки фермента. Все этапы очистки проводились при 4⁰С.

Очистка щелочной протеазы. К фильтрату культуральной жидкости, доведенному до рН 11,5, при перемешивании медленно добавляли сульфат аммония до 75% насыщения. Осадок отделяли центрифугированием, растворяли в 20 мл трис-HCl-буфера, рН 8,8, с 50 мМ NaCl и диализовали против 1 л того же буфера в течение ночи. Диализованный фермент наносили на колонку с ДЭАЭ-целлюлозой (320 см), предварительно уравновешенную 10 мМ натрий-фосфатным буфером, рН 7,6 содержащим 50 мМ NaCl. Активные фракции собирали, затем проводили диализ в 10 мМ фосфатном буфере в течение ночи, затем наносили на колонку с КМ-целлюлозой (215 см), предварительно уравновешенную тем же буфером. Элюция проводилась линейным градиентам NaCl (200 мл, 0-0,5 М) в том же буфере. Активные фракции объединяли для хранения /37/.

2) МотинаЛ.И., Нахапетян Л.А. /38/, также разработали способ получения щелочной протеиназы. Они получали ее культивированием штамма Вacillus subtilis 72 на жидкой питательной среде следующего состава, %: картофельный крахмал-4; кукурузная мука-1; технический казеин - 0,1; БВК - 0,1; кукурузный экстракт - 0,05; аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 0,01; культивирование в лабораторных условиях проводится на круговой качалке, имеющей 240 об/мин, при 40⁰С; начальном рН среды 6,8, в колбах емкостью 750 мл с отбойниками (40 мл питательной среды) в течение 46 ч. Протеолитическая активность составила 10 тыс. ед/мл.

Культуральную жидкость (20 мл), содержащую щелочную протеиназу, наносят на хроматографическую колонку (1,520 см), наполненную силохромом С-80, модифицированным триэтоксилилмасляной кислотой (n=2, R-H-; 0,42 мг*экв/г сорбента-содержание карбоксильных групп), уравновешенную 0,005 М фосфатным буфером с рН 6,0. Колонку промывают тем же буфером, при этом выходит основная часть пигмента, клетки продуцента и некоторые сопутствующие белки. Колонку промывают до тех пор, пока поглощение элюата при 280 нм не достигнет фоновых значений (D₂₈₀0,1). Затем проводят элюцию щелочной протеиназы 0,005 М фосфатным буфером с рН 7,8, содержащим 0,2 М NaCl. Выход фермента по активности составляет 92%. Удельная активность фермента в расчете на белок увеличивается 5,4 раза. Элюат концентрируют методом ультрафильтрации на мембране УАМ-150, затем высушивают лиофильно. Полученный препарат светло-серого цвета имеет активность 1000640 ед/г препарата, содержание белка 530 мг/л. Удельная активность 1888 ед/мг белка.

3) Следующий способ получения щелочной протеазы заключается в следующем. Культуральную жидкость получают выращиванием продуцента Вacillus subtilis 72 на питательной среде следующего состава, %: карфтофельный крахмал-8; кукурузная мука-3; технический казеин-1; БВК - 0,5; кукурузный экстракт - 1,0; аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 0,05.

Культивирование проводится на качалке при 240 об/мин, при 40⁰С, начальная рН среды 6,9, в колбах емкостью 750 мл в течение 47 ч. Культуральную жидкость (40 мл) с активностью 12 тыс. ед/мл наносят на хроматографическую колонку (2,535 см), заполненную силохромом С-80, модифицированным триэтоксисилилундекановой кислотой (n=9; R-H-), уравновешенной дистиллированной водой пока поглощение при 280 нм не достигнет фоновых значений. Затем проводят элюцию щелочной протеиназы 0,05М фосфатным буфером с рН 8,0, содержащем 0,2 М NaCl. Элюат концентрируют методом ультрафильтрации на мембране УАМ-150 и высушивают лиофильно. Получают препарат светло-серого цвета с протеолитической активностью 1056550 ед/г препарата, содержание белка 550 мг/л /39/.

1.3 Микробные липазы

В последние годы для получения различных ферментов находят широкое применение микроорганизмы, которые характеризуются ценнейшими свойствами, обеспечивающими им за короткий цикл развития на доступных питательных средах и в производственных условиях синтез ферментов, необходимых для народного хозяйства /40/.

При этом биосинтез многих гидролаз можно регулировать и осуществлять направленно путем подбора соответствующих условий культивирования, и прежде всего состава питательной среды. Более того, многие микробные ферменты образуются в ответ на действие индуктора, вносимого в питательную среду, причем активность индуцированного фермента в ответ на добавление специфического субстрата возрастает в процессе роста микроорганизма многократно, тогда как на среде без соответствующего индуктора фермент образуется в минимальных количествах /41/.

Особенность микроорганизмов заключается в том, что они способны синтезировать внеклеточные ферменты, активность которых во много раз превышает уровень активности внутриклеточных. Таким образом, при определенных условиях микробная клетка может осуществлять «сверхсинтез». Одним из промышленно важных ферментов, продуцируемых микроорганизмами, являются липазы, которые интенсивно исследуются во всем мире. Липаза - триглицеридгидролаза - фермент, катализирующий гидролиз жиров, широко распространена в природе. Она присутствует в животных и растительных клетках, а также в микроорганизмах. Экспериментальные исследования свидетельствуют о том, что микробные липазы являются ферментами с широкой специфичностью и большим разнообразием свойств. Свойства липаз и характер липолитической активности даже у одного рода можно различно варьировать. Изучение микробных липаз представляет большой теоретический и практический интерес, так как они могут быть использованы при гидролизе разнообразных жировых субстратов /42/.

1.3.1 Субстратная специфичность микробных липаз

Микробная липазы способны гидролизовать животные жиры, растительные масла, а также синтетические моно-, ди- и триглицериды. Синтетические триглицериды являются лучшими субстратами для многих микробных липаз. Липазы можно разделить на две группы: специфичные и неспецифичные. Ферменты из первой группы гидролизуют сложноэфирные связи в первом или втором положении. Многие микробные липазы обычно гидролизуют первичные сложноэфирные связи (-эфирные связи). В гидролизитах с участием таких ферментов обычно обнаруживаются жирные кислоты, 2,3- и 1,2 - диглицериды, 2-моноглицериды. При более длительных гидролизах жирнокислотный остаток из 2-моноглицерида мигрирует в первое положение с образованием 1-моноглицерида, который легко гидролизуется специфичной липазой с образованием глицерина и жирной кислоты. К этой группе относятся липазы из Rhizopus arrhizus, Rhizopus delemar, Rhizopus microsporus, Mucor miechei, Aspergillus niger, Pseudomonas sp. и т.д. Липазы второй группы не различают эфирные связи во всех трех положениях триглицеридной молекулы и способны подвергать субстрат тотальному гидролизу. В гидролизатах триглицеридов с участием этих видов липаз обнаруживаются, как правило, остатки триглицеридов (негидролизованная часть), глицерин и жирные кислоты. Такие липазы были выделены из Geotrichum candidum, Oospora lactis, Humicola lanuginosa и т.д. Активность липаз зависит от длины цепочки и степени насыщенности жирной кислоты. Дженсон описал, что липаза Geotrichum candidum проявляла высокую специфичность к олеиновой и линолевой кислотам независимо от их положения в молекулах триглицеридов. Такими же свойствами обладают липазы из Achromobacter lipolyticum, тогда как липаза из Aspergillus niger проявляла большую специфичность к стеариновой кислоте и молекулам субстратов /44/.

1.3.2 Выделение микробных липаз из микроорганизмов

Известны микроорганизмы, продуцирующие липазы, оптимум действия которых находится в области высоких температур: 50-55⁰С Pseudomonas fragi, 70⁰С Pseudomonas mephitica. В связи с этим представляется актуальным поиск активных продуцентов липаз, специфичных к твердым жирам, содержащимся в промышленных отходов, а также продуцентов липаз с более высокими температурными оптимума действия. Такие исследования имеют большое значение в связи с экологическими проблемами, связанными с очисткой сточных вод в масло-жировой промышленности /45/.

Первоначально скрининг продуцентов липаз проведен качественным методом Эйкмана, при котором в стерильные чашки Петри разливают тонким слоем простерилизованный животный жир и после его застывания вводят агаризованную питательную среду. Культуры высевали на питательную среду для получения гигантских колоний. Чашки выдерживали в термостате при 28-30⁰С для мезофильных и 38-40⁰С для термофильных культур в течение 5-7 суток, учитывали и отбирали культуры, вокруг колоний которых образовывались непрозрачные зоны гидролиза жиров. Активными считали культуры, образующие зоны, превышающие диаметр колоний. Для количественного определения липазной активности грибы выращивали в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке (150 об/мин) в течение 3-4 суток при 36-40⁰С. Посевным материалом для иннокуляции питательной среды служила суспензия спор гриба. Липазную активность определяли в фильтрате культуральной жидкости. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое освобождает 1 мкМ олеиновой кислоты из 40% эмульсии оливкового масла в 10% растворе поливинилового спирта за 1 ч в условиях опыта.

При глубинных условиях выращивания липазную активность культур выявляли на различных питательных средах (%):

1) видоизмененная среда Чапека:

а) KH₂PO₄ - 0,1; MgSO₄*7H₂0 - 0,05; FeSO₄ *7H₂0-0,01; CaCO₃-0,3; хлопковое масло и пептон - по 0,1;

б) минеральный состав с добавлением хлопкового масла и кукурузного экстракта по 1,0;

2) среда из 7% экстракта солодовых ростков с добавлением (NH₄)₂SO₄ - 0,3; CaCO₃ - 0,1 и хлопкового масла - 1,0;

3) среда с гидролизатом БВК -1,0; (NH₄)₂SO₄ - 0,3; CaCO₃ и хлопковое масло - по 0,1; рН питательных сред - 6,5-7,0.

Внутриклеточную липазную активность определяли в гомогенате сырой биомассы. Для этого 0,5 г биомассы, тщательно отмытой дистиллированной воды, растирали в фарфоровой ступке с кварцевым песком, доводили объем до 50 мл дистиллированной воды и выдерживали 2 ч при комнатной температуре, затем отфильтровывали через бумажный фильтр и фильтрат использовали для анализа. Активность рассчитывали на 1 г абсолютно сухой биомассы /46/.

Другой способ биосинтеза липазы заключается в следующем. Сначала была получена культура дрожжей Candida paralipolytica 739. Работа началась с использования питательной среды следующего состава (%): (NH₄)₂SO₄ - 0,3; MgSO₄ - 0,07; NaCl - 0,05; Ca(NO₃)₂ - 0,04; KH₂PO₄ - 1,0; K₂HPO₄ - 0,1; глюкоза - 0,5; дрожжевой автолизат - 0,1 (по сухому веществу). В качестве посевного материала использовали 48-часовую культуру, выращенную на косом агаре. Для опытов культуру дрожжей выращивали при 30⁰С в колбах емкостью 750 мл со 100 мл среды на качалке при 240-250 об/мин в течение 2-х суток. Липазную активность в культуральной жидкости определяли по количеству олеиновой кислоты, образовавшейся в результате действия фермента на оливковое масло. В международной практике эмульсию оливкового масла в поливиниловом спирте в качестве субстрата используют для определения липазной активности и, в частности, для экзолипазы дрожжевой культуры Candida paralipolytica /47/. В данном опыте реакционная смесь содержала 2,5 мл 40%-ной эмульсии оливкового масла в 2%-ном поливиниловом спирте, 2 мл 1/15 М фосфатного буфера с рН 8 и 0,5 мл ферментного раствора. Реакцию проводили при 37⁰С в течение 1 ч и прерывали добавлением 15 мл этанола. Полученную смесь титровали 0,05 н. NaOH в присутствии индикатора тимолового синего. Контрольные образцы обрабатывали так же, но без предварительной инкубации и немедленно оттитровывали. Результаты титрования определяли по разности между контролем и опытом. За единицу активности принимали количество, способное высвобождаться 1 мк/моль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 8,0 и температуре 37⁰ в течение 1 ч /48/.

При биосинтезе ферментов микроорганизмами большое значение имеют условия развития культуры и в первую очередь состав питательной среды. В связи с этим представляло интерес изучить влияние солей среды не биосинтез липазы культурой Candida paralipolytica 739. Путем поочередного исключения солей установили, что все минеральные соли, входящие в состав питательной среды необходимы для биосинтеза фермента. Выявили, что на образование липазы положительно влияют соли аммония и мочевина, нитраты заметно снижают активность липазы. Также проверяли зависимость липазной активности в культуральной жидкости от возраста посевного материала. Полученные данные позволяют сделать следующие выводы:

1) при биосинтезе липазы дрожжами Candida paralipolytica 739 максимальная липолитическая активность достигается в средах при использовании в качестве источника углерода глюкозы; дисахариды мальтоза, сахароза и лактоза несколько снижают активность фермента, а уксусная кислота полностью прекращает его синтез;

2) в углеводной среде соли аммония имеют преимущество по сравнению с нитратами как источником азота;

3) при биосинтезе немаловажную роль играет возраст посевного материала, максимальные показатели соответствуют двухсуточной культуре /49/.

Для определения липолитической активности использовали метод, основанный на титрометрическом определении свободных жирных кислот, образовавшихся при гидролизе липидов. В качестве субстрата использовали оливковое масло, эмульгированное поливиниловым спиртом (степень полимеризации 1725, вязкость 30 сП). Эмульсию готовили следующим образом: к 100 мл оливкового масла добавляли 150 мл 2%-ного водного раствора поливинилового спирта и эмульгировали в течение 20 мин при комнатной температуре (рН 8). Эмульсия была стабильна 24 ч. Реакционная смесь содержала 5 мл субстрата, 4 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН=7,8). Реакционную смесь выдерживали 10 мин при температуре 34⁰, прибавляли 1 мл ферментного раствора. После 60-минутного инкубирования реакцию останавливали добавлением 20 мл этанола и ацетона (1:1). Образовавшуюся олеиновую кислоту оттитровывали 0,05 н. щелочью в присутствии тимолфталеина. За единицу липазной активности принимали такое количество фермента, которое отщепляет 1 мкмоль жирных кислот от эмульсии триолеата за 1 ч при 34⁰.

Ферментативный препарат липазы получали по следующей схеме: 1) отделение биомассы от ферментативного раствора; 2) осаждение фермента органическим растворителями или высаливание; 3) освобождение фермента от солей и низкомолекулярных примесей с помощью хроматографии на колонке с сефадексом Г-25 или диализом; 4) лиофилизация или осаждение ацетоном.

Ферментативный раствор центрифугировали 20 мин при 4000 об/мин для отделения биомассы. Согласно литературным данным, для получения сухого, частично очищенного препарата используют фракционное осаждение органическими растворителями (изопропанолом, этанолом, ацетоном). Оптимальный вариант для получения липазного препарата из ферментативного раствора Candida paralipolytica 739 - высаливание фермента сульфатом аммония /50/.

Фермент из ферментативного раствора осаждали фракционированием сульфатом аммония в интервале насыщения 0,4-0,7. Фермента с самой высокой липолитической активностью осаждался при степени насыщения сульфатом аммония 0,5. При более высокой степени насыщения вместе с ферментом выпадал и белок, не обладающий липолитической активностью. Концентрированный раствор фермента освобождали от солей и низкомолекулярных примесей на колонке с сефадексом Г-25 и диализом (вода) в течение 24 ч. После диализа или гель-фильтрации раствор фермента лиофилизировали или осаждали ацетоном. Препарат хорошо выдерживал лиофилизацию и не терял активности при хранении в лиофилизированном состоянии при температуре 4⁰С в течение 6 месяцев.

Таким образом, можно сделать вывод, что исследованный препарат в дальнейшем может быть использован для получения высокоочищенной и кристаллической липазы, а также в некоторых отраслях народного хозяйства.

1.3.3 Применение микробных липаз

Использование микробных липаз в первую очередь связано с потребностью масложировой промышленности. Они стали широко использоваться для модификации жиров и масел. Следует отметить, что безконтрольный липолиз может вызвать неприятный привкус, связанный с накоплением свободных жирных кислот, для удаления которых требуется дополнительное центрифугирование. С другой стороны, специфичный вкус сыра частично обусловлен присутствием короткоцепочечных жирных кислот, образующихся в результате частичного гидролиза молочного жира под действием липаз, продуцируемых микроорганизмами, и липаз, присутствующих в самом молоке. Пикантный и характерный вкус итальянских сыров обусловлен действием специально добавляемой в молоко липазы, специфичной к короткоцепочечным жирным кислотам. Липазы могут быть рекомендованы для модификации жиров, используемых в производстве хлебобулочных изделий. Использование модифицированных жиров улучшает вкус, цвет, мягкость и структуру хлеба. В кожевенной промышленности микробные липазы используются для обезжиривания кожи. Липазы микроорганизмов в комплексе с другими ферментами применяются для биологической очистки сточных вод /51/.

Существует еще ряд причин, которые делают изучение липаз интересным и перспективным. Прежде всего это касается их использования в медицине. Так, управление липолитической активностью, вероятно, будет играть важную роль в будущих методах лечения нарушений жирового обмена, и, следовательно, в контроле за сердечно-сосудистыми заболеваниями. Определение активности сывороточной липазы широко используется в клинике для диагностики некоторых заболеваний. Врожденная гиперлипемия может возникнуть из-за дефицита липопротеидлипазы, а нарушения процессов депонирования жиров связывают с холестерол-эстеразой и сфингомиелиназой. В еще большей мере обнадеживает и способствует появлению новых гипотез тот факт, что эфиры холестерина с жирными кислотами являются основными компонентами атеросклеротических бляшек и что миелинизация развивающегося мозга коррелирует с уменьшением содержания эфиров холестерина /52/.

В последнее время проводятся целенаправленные исследования по использованию микробных липаз в составе моющих средств, шампуней, кремов и профилактических зубных паст. Важность применения липаз в составе моющих средств определяется не только их высокой эффективностью, но и связана с охраной окружающей среды. Известно, что фосфаты, используемые в качестве синтетических моющих средств, приводят к загрязенению сточных вод. Другим немаловажным фактором является то, что использование ферментов в составе синтетических моющих средств позволяет проводить стирку при более низких температурах, следовательно, приводит к экономии энергозатрат /40/.

За рубежом липазу используют для придания приятного запаха молочным продуктам. Для создания букета запаха в молочных продуктах используют липазы, специфичные к короткоцепочечным жирным кислотам. Для этих целей давно используют ферменты из поджелудочной железы различных животных. Широкое применение липаз в различных областях привело к увеличению числа компаний, производящих микробные липазы /41/.

Таким образом, спектр применения микробных липаз достаточно широк. Эффективность использования их зависит отряда факторов, прежде всего от специфичности липаз и условий проведения конкретного биотехнологического процесса.

Таким образом, на основании литературного обзора можно сделать вывод, что представители рода Pseudomonas широко распространены в природе. Они могут развиваться в самых различных условиях в природе, используя самые разные соединения углерода и азота в энергетическом и конструктивном обмене. Псевдомонады способны расщеплять СПАВ. ПАВ способны взаимодействовать с различными компонентами клеточных стенок бактерий, включая муреиновый слой, белки, липиды, липопротеины, липополисахариды.

Внеклеточные щелочные протеиназы выполняют ряд важных катаболических функций вне клетки. Наиболее очевидной функцией щелочных протеиназ является расщепление белков и других высокомолекулярных субстратов, содержащихся в питательной среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь микробной клетки. Наиболее активными культурами в отношении образования щелочных протеиназ являются различные виды из рода Bacillus, главным образом Bac. Subtilis.

Микроорганизмы обладают особенностью, которая заключается в том, что они способны синтезировать внеклеточные ферменты. Одним из промышленно важных ферментов, продуцируемых микроорганизммами, являются липазы. Изучение микробных липаз представляет большой теоретический и практический интерес, так как они могут использоваться в различных отраслях промышленности (масло-жировой, кондитерской, кожевенно-меховой, в медицине и др.)

2. Объекты и методы исследования

Целью данной работы являлось выделение, изучение свойств концентрированного ферментного препарата и его применение в процессе обезжиривания меховой овчины.

2.1 Объекты исследования

ПРЕВОЦЕЛЛ W-OF-7 представляет собой продукт оксиэтилирования технических жирных спиртов. По внешнему виду Превоцелл воскообразная масса белого цвета, растворяется при температуре 40-45⁰С, устойчив в жесткой воде, а также в кислых и щелочных растворах. Обладает хорошей смачивающей способностью.

WETTER HAC - 100% активный, неионогенный смачивающий и отмачивающий агент, усиленный специальными бактерицидами и фунгицидами. На вид светло-янтарная, немного вязкая жидкость, растворимость неограниченная, рН - (вода) 6,8-7,2 (1% раствор). Применяется в отмоке вместе с обычным количеством соли, концентрация 1 г/л. Преимущества: предохраняет шерсть от вытекания и кожу от повреждения различными бактериями; обладает прекрасными моющими качествами, облегчая вымещение избыточных природных жиров, засохшей крови и чужеродных материалов как с волоса, так и с кожевой ткани.

DE-SOL-A - низкорастворимое моющее средство, на вид представляет собой белую пасту с рН 8-8,5 (1% раствор), растворимость - 10% дисперсионна. Применяется для мойки и обезжиривания меховой и шубной овчины (1,5 г/л DE-SOL-A, 1 г/л кальцинированной соды). Преимущества: гарантирует для шкурки: менее 1% жира в волосе и минимум натуральных жиров в кожевой ткани; позволяет чистое мездрение и более равномерное поглощение в пикеле и дублении; снижает возможность сваливания меха; выпускает шкурки белее, чище и оставляет волос рассыпчатым и открытым; улучшает равномерность окраски меха и кожи, вымещая из кожевой ткани натуральные жиры перед пикелем; стабилен в широком диапазоне рН, а также эффективен перед крашением для выравнивания цвета.

ГАММА представляет собой смесь высококачественных анионных, неионогенных ПАВ, полезных добавок. Препарат обладает высокой обезжиривающей способностью по отношению к натуральным жирам. Рекомендуется для обезжиривания кож КРС. Эффективен в жесткой воде, а также в присутствии электролитов и дубителей. Легко растворим в воде, в том числе и жесткой.

АГАР-АГАР представляет собой порошок белого цвета без постороннего запаха, вкуса. Наличие плесени и видимых посторонних включений не допускается. Физические и химические показатели должны соответствовать требованиям, указанным в табл 1.

Таблица 1. Физические и химические показатели агар-агара

Наименование показателей	Норма
Цвет студня с массовой долей сухого агара 0,85%, %, не менее	45-60
Прочность студня с массовой долей сухого агара 0,85% г, не менее	200-300
Температура плавления студня с массовой долей сухого агара 0,85%, 0С, не ниже	80
Массовая доля влаги, %, не более	18
Массовая доля золы (в пересчете на сухое вещество), %, не более	4,5
Массовая доля общего азота (в пересчете на сухое вещество), %, не более	0,2
Наличие йода и тяжелых металлов	Не допускается

2.2 Методы исследования

2.2.1 Методика приготовления питательных сред для культивирования микроорганизмов

Мясопептонный агар (МПА)

При культивировании микроорганизмов большое значение имеет обеспечение их соответствующим питанием. Белковой основой для всех сред является питательный бульон. Основой для приготовления мясопептонного бульона (МПБ) является мясная вода. Ее приготавливают следующим образом: 15 г. сухого бульона растворяли в 1 дм³ дистиллированной воды и кипятили 1-3 мин. Для приготовления плотной питательной среды МПА к 1 дм³ МПБ добавляют 2-2,5% агар-агара от объема среды и расплавляют в автоклаве.

Синтетическая среда

К 1 дм³ дистиллированной воды для удовлетворения потребности микроорганизмов в макро- и микроэлементах, без которых клетка расти не может, в синтетическую среду вводили соли следующего состава (г/дм³): NaH₂PO₄-1,0; NH₄NO₃-1,0; KCl - 0,5; MgCl₂-0,1. В качестве источника углерода в конструктивном и энергетическом обмене использовали шерстный жир в количестве 1 г/дм³. Также добавляли СПАВ - 1 г/дм³ и агар-агар в количестве 2-2,5% от объема жидкой среды и автоклавировали.

2.2.2 Выделение чистой культуры

Приготовление разведений. Разведения делают в стерильной водопроводной воде. Готовят определенный объем этого раствора и стерилизуют при 1 атм в автоклаве. В ходе одного опыта пользуются постоянным коэффициентом разведения, т. к. в этом случае уменьшается вероятность ошибки. Чаще всего делают десятичные разведения. Для этого берут пробирку с 10 см³ стерильного раствора и переносят стерильной пипеткой 1 см³ исследуемого материала в данную пробирку. Суспензию этого разведения тщательно перемешивают с помощью новой стерильной пипетки, вбирая в пипетку и выпуская из нее полученную смесь несколько раз. Это обеспечивает перемешивание суспензии и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же пипеткой берут 1 мл полученного разведения и переносят его во 2-ую пробирку. Таким образом, готовят и последующие разведения. Степень разведения определяется предполагаемым количеством микроорганизмов в образце и соответственно число разведений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате.

Для приготовления каждого разведения обязательно используют отдельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получению ошибочного результата. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки, в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении соответствующего разведения. Часть клеток, оставшаяся на стенках пипетки, может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится причиной получения завышенного результата.

Посев на агаризованные среды в чашки Петри. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей водяной бане агаризованную среду, по 20-30 см³ в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока не остынет агар. Для посева отбирают чашки, среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влажности, посев проводят сразу же или вскоре после застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предполагаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05; 0,1 или 0,2 мл) соответствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на поверхность агаровой пластинки в чашки Петри. Этот объем распределяют по поверхности среды стерильным шпателем. Затем этим же шпателем проводят по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили. При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относительно не велико, посевной материал распределяют по поверхности среды только в одной чашке.

Из каждого исследуемого разведения делают таким образом 2-3 параллельных высева. Для параллельных высевов из одного разведения можно пользоваться одной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных разведений используют другую стерильную пипетку и другой шпатель. Чашки с засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на определенную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорганизмов.

Подсчет выросших колоний проводят через определенное время после посева, которое зависит от скорости роста выявляемых микроорганизмов на используемой в опыте среде и данной температуре.

Подсчитывают количество колоний, выросших при высеве из определенного разведения на двух (одной) чашки Петри. Результаты параллельных высевов суммируют и определяют среднее число колоний, выросших при высеве из этого разведения. Колонии считают, как правило, не открывая чашки. Для удобства отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки, пользуясь стеклографом или чернилами по стеклу. При большом количестве колоний дно чашки делят на секторы, подсчитывают количество колоний в каждом секторе и результаты суммируют или используют полуавтоматические счетчики.

2.2.3 Методика изучения культуральных свойств

Культуральные свойства определяют по характеру роста микробной культуры на плотной и жидкой питательных средах. Характер роста на плотной питательной среде изучали с подробным описанием формы, величины, цвета, поверхности, консистенции, краев и структуры колоний, образованных на МПА.

Микроскопическое изучение колоний проводят под микроскопом. Рассматривая колонии в проходящем свете невооруженным взглядом, описывают следующее: форму колоний; диаметр колоний; цвет, который обуславливается пигментом; рельеф колоний; поверхность; ее блеск, прозрачность; характер краев колоний; структуру колоний, ее консистенцию.

Из колоний готовят мазки, затем окрашивают по Граму и Трухильо. Техника окраски по Граму заключается в следующем:

1) на обезжиренном стекле делают мазки микроорганизмов. Мазки высушивают на воздухе и фиксируют под пламенем горелки;

2) мазки окрашивают в течение 1 мин генцианвиолетом;

3) препарат промывают в слабой струе водопроводной воды в течение 2 сек.;

4) окрашивают препарат раствором Люголя в течение 1 мин.;

5) промывают препарат слабой струей водопроводной воды;

6) погружают препарат на 30 сек в 96%-ный спирт, взбалтывая последний, после чего препарат подсушивают промокательной бумагой;

7) окрашивают мазки раствором фуксина Пфейфера в течение 30 сек.;

8) промывают препарат в слабой струе водопроводной воды до исчезновения окраски в стоке, подсушивают промокательной бумагой и микроскопируют.

Грамположительные бактерии окрашиваются в синий или фиолетовый цвет, а грамотрицательные в красный.

Окраска по Трухильо заключается в следующем:

1) мазок зафиксировать жаром;

2) нанести водный раствор малахитовой зелени (2%) и в течение 3 мин подогреть на спиртовке до отхождения влаги;

3) промыть водой;

4) опустить на 1 мин в 0,25%-ный водный раствор основного фуксина;

5) промыть водой;

6) высушить фильтровальной бумагой и микроскопировать.

Окраска жгутиков по Леффлеру

Окраска жгутков заключается в следующем:

Суспензию петлей наносят на чистое обезжиренное предметно стекло, наклоняют ее под углом 45⁰ и высушивают на воздухе. Высушенный мазок заливают на 15-20 мин протравой Леффлера. Необходимо следить, чтобы протрава не подсыхала. За это время благодаря оседанию протравы на поверхности жгутиков они становятся видимыми в светопольный микроскоп.

Препарат промывают дистиллированной водой и окрашивают карболовым фуксином Циля в течение 3 мин. Краску смывают, препарат высушивают и микроскопируют. Клетки и жгутики окрашены в красный цвет.

2.2.4 Метод раздавленной капли

Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.

Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.

2.2.5 Протеолитические свойства микробов

Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.)

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок (МПЖ, молоко и др.)

Посевы в МПЖ культивируют 5…7 суток при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, кратерообразное, реповидное, в форме чулка и т.д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина.

Для обнаружения сероводорода делается посев уколом (внутрь столбика) по стенке в агар с ацетатом свинца (МПА с 5% пептона и 0,25% ацетата свинца) или в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещается полоска стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде или на фильтровальной бумажке (в МПБ).

Определение аммиака начинают с того, что под пробирку с бульонной культурой помещают розовую лакмусовую бумажку, культуру термостатируют при 37⁰С в течение 1…3 суток. При наличии аммиака лакмусовая индикаторная бумажка приобретает синюю окраску.

Редуцирующую способность определяют посевом культуры на молоко с метиленовым синим. К стерильному молоку добавляют по капле 1%-ный водный раствор метиленового синего до голубого окрашивания. После культивирования засеянного материала бактерии, обладающие редуцирующей активностью, обесцвечивают лакмусовое молоко (под редукцией понимают химический процесс, заключающийся в отщеплении от вещества кислорода или присоединении к нему водорода).

Для определения каталазы в 3…5 суточную бульонную культуру, выращенную в пробирке, вносят 1 см³ 3%-ного раствора пероксида водорода. При наличии фермента каталазы обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется так называемая «пенистая шапка».

2.2.6 Приготовление бактериальной суспензии

В качестве источника углерода, используемого прокариотическими микроорганизмами в конструктивно-энергетическом обмене является жир и СПАВ. Приготовленную синтетическую среду подвергаем дробному автоклавированию (1; 0.5; 0.5 МПа) в течение 30 мин. По истечении данного времени, среды разливали в стерилизованные конические колбы по 50 см³.

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, выделенной в первой серии эксперимента, делаем посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируем в термостате 24 ч при температуре (400,5)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводили 5 см ³ соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносим в колбы, содержащие по 50 см³ соответствующей синтетической среды. Культивирование микроорганизмов проводили в течение различного времени при температуре (400,5)С при переменном механическом воздействии, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 250 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки.

2.2.7 Определение мутности

Мутность определяют фотометрическим способом на приборе КФК-2-УХЛ-4.2 при D²₅₄₀ и толщине поглощаемого слоя 30 мм. Стандартным раствором является дистиллированная вода.

2.2.8 Высаливание фермента

В колбу отбирают 50 см³ бактериальной суспензии, добавляют 30% от ее массы сульфата аммония, перемешивают. Раствор и образующийся осадок переносят в патроны и устанавливают в центрифугу марки ЦЛН-2. Продолжительность вращения 15 мин со скоростью 5000 об/мин. После чего образовавшийся осадок собирают в бюкс.

2.2.9 Биуретовый метод по Ярош

Метод используется для определения раствора белков с концентрацией от 0,04 до 1,6 мг/см³.

В пробирку наливают 2,4 см³ раствора мочевины, 0,1 см³ раствора белка и 2,5 см³ биуретового реактива. Смесь хорошо перемешивают и пробирки помещают в водяную баню или в термостат при 40⁰С на 10 мин. Затем их охлаждают до 20⁰С. Через 30 мин после добавления биуретового реактива раствор колометрируют при длине волны 540 нм. Количество белка находят по калибровочной кривой, составленной по яичному альбумину (рис. 1).

Для построения калибровочной кривой готовят исходные водные растворы с содержанием 15,20,25,30,35,40 и т.д. мг белка в 10 см³. Из полученных растворов отбирают в пробирки по 0,1 см³, добавляют 2,4 см³ раствора мочевины и 2,5 см³ биуретового раствора и ведут определений описанным выше методом.

2.2.10 Определение активности липазы (модифицированный метод Ота, Ямада)

За единицу ферментативной активности липазы принимают такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль олеиновой кислоты из 40%-ной эмульсии оливкового масла при рН 7,0 и t=37С в течение 1 ч.

Метод основан на определении путем титрования щелочью жирных кислот, образовавшихся под действием липазы при использовании в качестве субстрата оливковое масло.

Для проведения этого анализа необходимы следующие реактивы: раствор оливкового масла (субстрат), 2%-ный раствор поливинилового спирта, 1н раствор соляной кислоты, 0,05н раствор щелочи, фосфатно-цитратный буфер с рН 7,0, 1%-ный раствор фенолфталеина, 90%-ный раствор спирта, 1%-ный раствор фермента.

Приготовление субстрата. 100 см³ оливкового масла смешивают со 150 см³ 2%-ного раствора поливинилового спирта в эмульсаторе. Полученную эмульсию выдерживают на льду в течение 60 мин. Если расслаивания не наблюдается, субстрат пригоден к использованию.

Приготовление раствора поливинилового спирта. 20г спирта помещают в мерную колбу на 1 дм³ и добавляют 800 см³ дистиллированной воды. Суспензию выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, затем добавляют 0,5 см³ 1н раствора соляной кислоты и непрерывно перемешивают при температуре 80-90С в течение 1 ч. Затем раствор охлаждают, доводят до рН 7,0 раствором щелочи, объем доводят до 1 дм³ дистиллированной водой и полученный раствор фильтруют.

5 см³ эмульсии - субстрата и 4 см³ буфера с рН 7,0 помещают в колбу на 100 см³, которую закрывают пробкой. Смесь выдерживают на водяной бане при температуре 37С в течение 10 мин. Затем к смеси добавляют 1 см³ раствора фермента и хорошо перемешивают. Полученную смесь выдерживают при температуре 37С в течение 60 мин, после чего немедленно добавляют 30 см³ этанола для прекращения реакции. Раствор титруют 0,05н раствором щелочи в присутствии 1%-ного раствора фенолфталеина до появления окраски.

Контрольную пробу готовят следующим образом. К смеси субстрата и буфера с рН 7,0, выдержанной при температуре 37С добавляют 30 см³ этанола, затем 1 см³ ферментного раствора и смесь немедленно титруют.

Разность между результатами титрования контрольной и опытной проб соответствует количеству 0,05н раствора щелочи, которое пошло на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся из оливкового масла под действием фермента.

Липазную активность фермента ЛС (в ед/г) определяют по формуле (1):

А Т

ЛС =- 50, (1)

В

где ЛС - липазная активность фермента, ед/г;

А - разность между результатами титрования опытной и контрольной проб, см³;

Т - титр щелочи;

В-концентрация образца ферментного раствора, г/см³.

2.2.11 Определение протеолитической активности (метод Вильштеттера и Вальдшмидт - Лейтца в модификации)

Данный метод основан на определении свободных карбоксильных групп в спиртовых растворах аминокислот и полипептидов.

Протеолитическую активность выражают количеством миллиграммов аминного азота, которое образуется при гидролизе определенного количества 5%-го раствора желатина с рН 7,3-7,5 1 см³ ферментного раствора за 1 ч при температуре 40С. За единицу протеолитической активности принимают количество фермента, которое образует 1 см³ аминного азота за 1 ч в принятых условиях опыта.

Для проведения анализа необходимы реактивы: фосфатный буферный раствор с рН 7,3-7,5; 5%-ный раствор желатина (субстрат) - 5 г желатина предварительно замачивают в стеклянном стаканчике в 15-20 см³ дистиллированной воды в течение 20-30 мин. Набухший белок заливают 20-25 см³ буферного раствора температурой 70-80С и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Растворившуюся часть сливают в мерную колбу на 100 см³ к не растворившейся части добавляют еще 20-25 см³ буферного раствора и снова переносят полученный раствор в эту же колбу. Так повторяют до полного растворения желатина. Охлажденный до 40С раствор желатина доводят до метки буферным раствором такой же температуры.

Перед анализом раствор желатина нагревают до 40С на водяной бане; 1%-ный спиртовой раствор тимолфталеина - 1 г кристаллического тимолфталеина растворяют в 96% спирте-ректификате в мерной колбе на 100 см³ и после растворения доводят до метки; 0,1 н раствор щелочи; 96%-ный этиловый спирт.

К 10 см³ 5%-ного раствора желатина с рН 7,3-7,5 приливают 2 см³ испытуемого ферментного раствора и сразу не отбирают 1 см³ реакционной смеси в коническую колбу на 50-100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1%-ного раствора тимолфталеина. Пробу тут же титруют 0,1 н раствором щелочи. После появления голубой окраски в растворе прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают. Титрование проводят из микробюретки с ценой деления 0,02 см³.

Оставшуюся смесь желатина с ферментным раствором помещают в термостат с температурой 40С для гидролиза. Через 3 ч 1 см³ реакционной смеси отбирают во вторую коническую колбу на 50-100 см³, куда предварительно налито 20 см³ 96%-ного этилового спирта и 0,2 см³ 1%-ного раствора тимолфталеина и титруют аналогично контролю.

Расчет протеолитической активности (ПС) ведут по формуле (2):

А

ПС = -, (2)

(t P)

где ПС - протеолитическая активность, ед/г;

А - количество аминного азота, накопленное за время опыта в реакционной смеси, мг;

t - время протеолиза, ч;

Р - коэффициент, учитывающий разведение и пересчет на 1 г препарата или 1 см³ жидкого ферментного препарата.

Величина А рассчитывается по формуле (3):

А = (а - а_к) 1,4 К, (3)

где а - количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см³ раствора опытного, см³;

а_к - количество 0,1 н раствора щелочи, пошедшее на титрование 1 см³ контрольной пробы, см³;

1,4 - коэффициент пересчета количества 0,1 н раствора щелочи в миллиграммы азота аминокислот и полипептидов;

К - поправка к титру щелочи.

2.2.12 Определение содержания СПАВ

Для определения содержания в сточной воде анионактивных СПАВ применяют фотометрический метод, основанный на том, что эти СПАВ образуют с метиленовым голубым комплексные ассоциаты, растворяющиеся в хлороформе с образованием синих растворов. Сам метиленовый голубой в хлороформе не растворяется.

Приготовление рабочего раствора: 10 см³ стандартного раствора разбавляют дистиллированной водой до 1 дм³.

Построение калибровочного графика: в ряд делительных воронок, содержащих 100 см³ дистиллированной воды, помещают 0; 0,5; 1,0; 2,0;…; 16,0; 20,0 см³ рабочего раствора. В каждую воронку добавляют по 10 см³ буферного раствора, перемешивают и приливают по 5 см³ нейтрального раствора метиленового голубого и по 15 см³ хлороформа, снова перемешивают в течение 2 минут.

Во второй ряд делительных воронок наливают 100 см³ дистиллированной воды и по 5 см³ кислого раствора метиленового голубого. В эти же воронки спускают отстоявшийся хлороформный слой из первого ряда воронок. В первые воронки наливают еще по 5 см³ хлороформа, взбалтывают в течении 2 минут и после отстаивания сливают хлороформные вытяжки во второй ряд делительных воронок. Эту операцию повторяют еще раз. Если хлороформ не окрашивается, значит извлечение комплекса окончено.

Содержимое второго ряда воронок взбалтывают в течении 2 минут и после расслоения спускают хлороформный слой в мерные колбы вместимостью 50 см³ через воронки с кусочками ваты для отделения возможно образовавшейся мути. В делительные воронки наливают еще по 5 см³ хлороформа, взбалтывают 2 минуты и после расслоения спускют хлороформ в мерные колбы. Эту операцию повторяют еще раз. Объем экстракта в мерных колбах доводят до метки хлороформом, перемешивают и определяют оптическую плотность окрашенных растворов на фотоколориметре с красным светофильтром (=650 нм) в кюветах с толщиной поглощающего слоя 20 мм.

При определении содержания анионактивного СПАВ в сточной воде 100 см³ хорошо перемешанной сточной воды помещают в делительную воронку. Если объем пробы меньше 100 см³ его доводят до 100 см³ дистиллированной водой. В делительную воронку вливают 10 см³ фосфатно-буферного раствора, 5 см³ нейтрального раствора метиленового голубого, 15 см³ хлороформа и далее все операции проводят, указанные при построении калибровочного графика.