Биопленки. Методы изучения

В этом методе импульсное облучение сорбента, с которым связаны анализируемые макромолекулы, приводит к их эффективной фрагментации и десорбции в вакуум благодаря избирательному поглощению сорбентом энергии света. При этом время полета образовавшихся ионов в анализаторе прямо пропорционально их массе. Данный метод позволяет проводить сравнительный анализ белковых профилей различных мутантных штаммов, что дает возможность определить, каково влияние исследуемой мутации на экспрессию других генов и на генетический контроль изучаемого процесса, в котором эти гены участвуют.[10]

2.3 Методы выявления биоплёнок

В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. [12]

Принцип действия микроскопа заключается в том, что рефлексируемое изображение, получаемое через объективы в результате преломления по системе зеркал, поступает на детектор, который обрабатывает приходящие лучи, составляя изображение, передаваемое на монитор компьютера. При помощи движения лазерного луча происходит послойное сканирование исследуемого объекта. Изображение, получаемое на мониторе CLSM по отношению к световому микроскопу, имеет зеркальное отображение под углом 90°. [11]

Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе.

Применение конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия(технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению,[10] хотя и при более низких увеличениях. С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры, однако основная структура сообщества универсальна, с некоторыми незначительными вариациями. [2]

Оценить значение ЛСКМ в современных методах изучения биоплёнок можно на примере работы И.В. Чеботарь с соавт. «Современные технологии исследования бактериальных биоплёнок».

Объектом исследования был придонный слой бульонной культуры клинического изолята коагулазопозитивного стафилококка.

Микроскопическое исследование проводили с помощью лазерного сканирующего (конфокального) микроскопа LSM 510 Meta. Непосредственно в чашке Петри слой стафилококков окрашивали флюорохромными красителями. Полученные изображения реконструировали и анализировали при помощи компьютерной программы ZeissLSM Image Browser. Визуализация биопленки с помощью конфокальной выявила характерную для биопленок трехмерную .Толщина двухсуточной биопленки S. aureus колебалась от 20 до 47 мкм.

Отдельная серия микроскопических исследований подвижности биопленочных стафилококков (с аналогичной флюорохромной окраской) была проведена с применением технологии «резонансный сканер» на лазерном сканирующем (конфокальном) микроскопе TCS; изображения были восстановлены при помощи программного обеспечения LAS AF Lite. Микроскопическое наблюдение за живой биопленкой в режиме реального времени позволило обнаружить особый вид хаотического (теплового) движения стафилококков, находящихся в ее составе. Некоторые стафилококки, являясь микроскопическими частицами, совершали хаотические колебания внутри ограниченного объема, соизмеримого с их размерами. При этом стафилококки могли не иметь прямых контактов с соседними клетками. В отличие от классического броуновского движения перемещения стафилококков были ограничены. Это свидетельствовало о том, что стафилококки механически связаны между собой, и являлось косвенным подтверждением существования необходимого атрибута любой биопленки -- внеклеточного матрикса, связывающего биопленочные микробы между собой и с подлежащей поверхностью.

Для ультраструктурных исследований рельефа биопленки использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6390А. Фиксацию препарата осуществляли при 4оС в два этапа. Вначале проводили предфиксацию (30 мин) образца в 2,5% растворе глутарового альдегида (рН=7,2) с последующим троекратным отмыванием дистиллированной водой. Затем препарат фиксировали (30 мин) 0,5% раствором OsO4 с последующим троекратным отмыванием в дистиллированной воде. После этого препарат криофиксировали в жидком азоте (-196°С) и подвергали низкотемпературной дегидратации (-100°С) в высоком вакууме в течение 24 ч. После лиофилизации препарат монтировали на держатель электронного микроскопа и на его поверхность методом ионного распыления в аргоновой плазме наносили слой платины (10 нм). Сканирующая электронная микроскопия проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз. В пространственном расположении стафилококков прослеживались два уровня организации. Первый уровень связан с тем, что стафилококки формировали кластеры, включающие от 9 до 55 клеток. На более высоком уровне организации стафилококковые кластеры формировали единую надкластерную структуру, состоящую из многих слоев, -- биопленку. Массив биопленки пронизан многочисленными каналами, устья которых открывались на внешнюю (исследуемую) поверхность биопленки. Через просветы каналов не видно подложки, на которой сформировалась биопленка. На 100 мкм2 поверхности биопленки открывается в среднем от 4 до 6 устьев каналов. В образовании стенок каналов в районе устьев принимают участие от 9 до 27 стафилококков. Между стафилококками наблюдалось два типа контактов: непосредственное взаимодействие, с помощью которого формируются кластеры, и матрикс-опосредованные связи. Последние обнаруживались при увеличении от 3000 до 15 000: между отдельными стафилококками существовали необычные «перемычки» -- структуры биопленочного матрикса, связывающие бактерии друг с другом. Клеточная поверхность большинства стафилококков -- ровной округлой формы, исключения составляли участки клеточной поверхности, связанные с внеклеточным матриксом. Эта поверхность была неровной, матрикс представлял собой неструктурированную, неоформленную субстанцию. Следует отметить, что биопленочный матрикс в условиях in vitro может быть образован как активно секретируемыми бактериальными полимерами, так и дериватами клеток, полученными в результате аутолиза.[8]

Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители. Такой способ индикации биопленок наиболее часто используется в статических методах культивирования микробных биопленок и позволяет дать условную количественную характеристику образовавшимся микробным сообществам, т.е. чем больше образуется матрикс биопленки, тем больше красителя сорбируется на его поверхности и тем выше оптическая плотность образца.[5]

Подобный метод был использован в работе Л. В. Лагун с соавт.

«Интенсивность образования микробных биоплёнок микроорганизмами, выделнными при пиелонефритах и мочекаменной болезни»

В исследовании использовали суточные культуры микроорганизмов, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона. Посевы инкубировали в шейкере-инкубаторе при 37 °С в течение 24 ч, после чего бульонную культуру осторожно удаляли и вносили в пробирки 1 мл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового для окрашивания сформированных биопленок. Окрашивание проводили при 37 °С в течение 30 мин. Далее, полностью удалив из пробирок раствор кристаллического фиолетового, проводили экстракцию красителя из биопленки в 1 мл 96% этанола в течении 1 часа при комнатной температуре.[14]

Измерение биолюминесценции (BPI) - достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. При искусственном введении в бактерии плазмид, ответственных за синтез люминесцирующего белка, можно проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки .

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине (этот метод часто совмещается с методом CLSM). Метод гибридизации применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях. С помощью этого метода была определена неоднородность бактерий в биопленке и выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции во время воздействия летальных для основной массы клеток факторов.[9]

Заключение.

Таким образом в работе были рассмотрены ультроструктура и этапы формирования биоплёнок, а так же представлены механизмы взаимодействия микроорганизмов между собой и с окружающей средой в составе биоплёнок.

Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. Отличительными особенностями биоплёнки, по сравнению с колониями микроорганизмов, являются наличие внеклеточного матрикса, наличие у бактерий генов, контролирующих биопленкообразование, сложная архитектурная структура.

Выделяют пять стадий существования биоплёнки: первичная и вторичная адгезия, созревание, рост, дисперсия. Адгезия к биологическим поверхностям обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток. У грамположительных микроорганизмов одним из важнейших элементом в процессе адгезии является (Polysaccharide Intercellular Adhesin) (PIA) - полисахарид, который участвует как в клеточной субстратной адгезии, так и в последующем формировании клеточных кластеров (клеточно-клеточная адгезия). У грамотрицательных микроорганизмов важную роль в адгезии и клеточной агрегации играют жгутики и фимбрии IV типа.

Одним из основных компонентов биоплёнки является экзополисахаридный матрикс, который содержит такие полисахариды как декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу. Концентрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот 1-20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80-90% объема биопленки занимает вода.

Клетки в слизистом матриксе располагаются не хаотически, а определенным образом. Структура многоклеточных кластеров представлена в виде грибоподобных, столбоподобных образований, «цементированных» в экзополисахаридный слой.

Биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида.

Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) - это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном.

Биоплёнки играют значительную роль в возникновении и развитии инфекционного процесса. Данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, а фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток. Биоплёнки так же являются одной из причин повышения устойчивости бактерий к антибиотикам.

В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок. Основное направление этих исследований связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических и статических условиях.

К динамическим можно отнести методы с использованием лабораторных ферментеров, культивирование в аппарате Робинсона, проточный метод. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем.

Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов. К ним можно отнести метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов, ALI-метод, метод гидроксиапатитовых дисков.

Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки, используют различные методы гинетического исследования с использованием флуоресцентных белоков, плазмидного экспрессионного вектора, сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий.

В настоящее время наиболее надежным методом изучения микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. Применение КЛСМ для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия.

Ещё одним методом изучения биоплёнок является измерение биолюминесценции (BPI) . Это достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. Он позволяет проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки .

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине. Данный метод применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях.

Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители.

Список литературы

1) Гигиена полости рта. Микробные биоплёнки. [ сайт] . URL: http://dental-hygiene.ru/index.

2) Гигиена полости рта. Микробные биопленки/Ультраструктура биопленок [ сайт] . URL: http://dental-hygiene.ru/index.php?title

3) Гостев В.В., Сидоренко С.В. Бактериальные биоплёнки и инфекции // Журнал инфектологии.- 2010.- Том 2.- № 3

4) Николаев Ю. А., Плакунов В. К., Биопленка -- «город микробов» или аналог многоклеточного организма?, Микробиология, 76(2), 2012г.

5) Практическая медицина. Что такое биоплёнка? [ сайт] . URL: http://pmarchive.ru/chto-takoe-bioplenka

6) Альманах научных открытий. Изучение влияния «Quorum Sensing на проявление признака антибиотикорезистентности у Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. [ сайт] . URL: http://tele-conf.ru/aktualnyie-problemyi-infektologii-i-parazitologii/izuchenie-vliyaniya-quorum-sensing-na-proyavlenie-priznaka-antibiotikorezistentnosti-u-pseudomonas-aeruginosa-i-staphylococcus-aureus.html

7) Интернист. Клиническое значение микробных биоплёнок. [ сайт] . URL: http://www.internist.ru/articles/cardiology/cardiology_216.html

8) И.В. Чеботарь и др. Современные технологии исследования бактериальных биоплёнок // Современные технологии в медицине.- 2013.- Том5.- №1.- С. 14-20.

9)А.В. Лямин и др. Методы выявления биоплёнок в медицине: возможности и перспективы// Клиническая микробиология и антимикробнаяхимиотерапия.- 2012.- Том14.- №1.-С.17-22.

10)Получение мутантов Burkholderia cenocepacia с измененной способностью к формированию биопленок и их характеристика in vitro и in vivo: дис. ... канд. биол. наук : 03.00.07 / Андреев, Александр Львович. - Москва,2009. - 112 с.

11)Кулаков О.Б., Матюнин В.В. Оценка поверхности дентальных имплантанов при помощи конфокального лазерного сканирующего микроскопа (CLSM) // Клиническая стоматология.-2003.

12) Афиногенова А.Г., Даровская Е.Н. Микробные биоплёнки ран: состояние вопроса // Травмотология и ортопедия России.- 2011.-Том3.-№61

13)Чернявский В. И. Бактериальные биоплёнки и инфекция(лекция)//Annals of Mechnikov Institute.- 2013.- №1

14)Белорусский Государственный Медицинский Университет. Интенсивность образования микробных биоплёнок микроорганизмами, выделенными при пиелонефритах и мочекаменной болезни. [ сайт] URL:. http://www.bsmu.by/files/mj/4-2012/16.pdf

Приложение 1

Стадии развития биоплёнки

Приложение 2

Сканирующая электронная микроскопия поверхности двухсуточной биопленки, сформированной S. Aureus

Размещено на Allbest.ru