Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

б. Оценка числа копий по кинетике реассоциации ДНК

Более точную информацию о числе копий можно получить, исследуя кинетику реассоциации ДНК. Кинетические методы стали применяться в этой области по крайней мере на десять лет раньше методов, описанных в разд.7.5. а, и именно с их помощью были получены первые данные о том, что эукариотические геномы содержат много повторов. Для того чтобы понять суть кинетического метода, необходимо вывести несколько уравнений.

Скорость реассоциации отдельных комплементарных цепей в растворе зависит от концентрации ДНК и подчиняется кинетике второго порядка. Если

С₀ и С-это суммарные концентрации денатурированной ДНК в момент времени t₀ и в момент времени t после начала гибридизации соответственно, то скорость реакции описывается уравнением

Хотя, чем больше размер генома, тем меньше истинная концентрация каждого гибридизующегося фрагмента. Другими словами, в более сложном геноме каждый гибридизующийся фрагмент составляет меньшую часть суммарной ДНК и поэтому гибридизуется при более высоких значениях Cot. Таким образом, кинетические кривые позволяют оценить размер генома, если у нас имеется препарат геномной ДНК известного размера, который может служить стандартом, и если кривые соответствуют кинетике второго порядка. Если N_a и N_b-размеры геномов а и b, то

где С - число молей мононуклеотидов на 1 л, t - время в секундах.

Величина обычно обозначается словом, которое пишется и произносится как "Cot".

Как и во многих экспериментах по гибридизации, ДНК перед денатурацией и реассоциацией была разрезана на фрагменты длиной около 400 пар оснований. Обратите внимание на то, что шкала Cot логарифмическая; это облегчает сравнительный анализ данных. Соответствие кинетических кривых простой реакции второго порядка следует из того, что ренатурация на 90% укладывается в интервал значений Cot, охватывающий два порядка величины.

Конкретные значения Cot_0.5 зависят от общего размера генома, поскольку С - это суммарная кон-

Характер кинетических кривых второго порядка для ДНК SV40, Т4 и E. coli позволяет сделать вывод о том, что каждый геномный сегмент представлен в геноме только один раз. Аналогичные кривые для эукариотической геномной ДНК имеют более сложную форму. В качестве примера приведены данные для ДНК Drosophila. Гибридизация протекает в широком диапазоне значений Cot, поскольку многие сегменты ДНК повторяются, причем одни из них многократно, другие менее часто, а третьи - лишь несколько раз. Те сегменты, которые встречаются в геноме только один раз, имеют низкую концентрацию и гибридизуются при самых высоких значениях Cot. Большинство высокоповторяющихся последовательностей, концентрация которых наиболее высока, гибридизуются очень быстро и характеризуются самыми низкими значениями Cot. Предположив, что гибридизация сегментов ДНК, представленных в единственном числе, следует кинетике второго порядка, можно из сложных Cot-кривых с помощью метода наименьших квадратов выделить отдельную кривую для однокопийной последовательности и оценить ее Cot.

Для таких последовательностей Drosophila значение Cot₀₅ равно 28,6 моль"с/л при экспериментальных условиях, которые использовались в случае. Это значение принято за стандартное; сравнивая с ним значение Cot_0.5 для какого-то клонированного фрагмента ДНК Drosophila, можно рассчитать число копий этого фрагмента по формуле.

Вторая кривая относится к гибридизации клонированного фрагмента в присутствии суммарной геномной ДНК Drosophila. Клонированный фрагмент помечен радиоизотопом, благодаря чему кинетику его гибридизации можно регистрировать отдельно. Заметим, что концентрация фрагмента достаточно мала, так что его самогибридизацией можно пренебречь. Эффективная концентрация клонированной последовательности обеспечивается соответствующими последовательностями геномной ДНК. Поэтому значение C₀t по оси абсцисс, используемое для получения значения Cot для фрагмента, рассчитывается из концентрации геномной ДНК Drosophila, а С и С₀ по оси ординат относятся к фракции клонированной ДНК, которая гибридизовалась. Вот почему значения C₀t действительно относятся к геномной ДНК. Значение Cot_0.5 для клонированной последовательности равно 1,06, а число копий составляет 28,6/1,06 = 27.

Для определения числа копий от одной до десяти этот метод малопригоден, поскольку для достижения высоких значений Cot требуется длительное время или очень высокие концентрации ДНК. Эта проблема еще более усложняется, если геном имеет большой размер, поскольку увеличивается значение Cot_{0 5} для однокопийных сегментов. Значение Cot_{0 5} для таких последовательностей в геноме Drosophila, имеющем размер 1,7*10⁸ пар нуклеотидов, равно 28,6, а соответствующее значение Cot_0.5 для генома млекопитающих по меньшей мере в десять раз выше.

На самом деле кинетический анализ гибридизации несколько более сложен, чем это здесь представлено. Скорость гибридизации зависит не только от концентрации ДНК, но и от температуры, ионной силы, вязкости раствора и размера гибридизующихся фрагментов. Все эти параметры должны быть строго фиксированными.

Процент гибридизовавшейся ДНК измеряют разными способами. Во-первых, можно использовать тот факт, что при определенных условиях с гидроксилапатитом связывается дуплексная, но не одноцепочечная ДНК. Во-вторых, можно определять в разные моменты времени процент ДНК, которая становится устойчивой к нуклеазе, специфичной в отношении одноцепочечной ДНК. Результаты, получаемые с помощью этих двух методов, различаются, если анализируются сложные эукариотические геномы. Нуклеазный метод позволяет определять только количество дуплексной ДНК, образовавшейся при реассоциации, а метод осаждения на гидроксилапатите дает не только количество дуплексной ДНК, но и ДНК с неспаренными одноцепочечными хвостами. Такие дуплексы образуются, в частности, в результате случайных разрывов одиночных цепей еще до реассоциации с образованием фрагментов подходящих размеров, а также благодаря наличию повторяющихся последовательностей. Нуклеаза S1 расщепляет все одиночные нереассоциировавшие цепи, а также все одноцепочечные концы дуплексов. Гидроксилапатит связывает все дуплексные цепи, включая и цепи с одноцепочечными хвостами, и поэтому дает более высокую оценку доли гибридизовавшихся цепей, чем нуклеазный метод. Иными словами, в опытах с применением гидроксилапатита мы получаем большую степень реассоциации ДНК и большую скорость реассоциации, чем в опытах с 81-нуклеазой. Эти различия уменьшаются, если используются относительно короткие фрагменты ДНК.

в. Оценка числа копий с помощью гибридизации в условиях насыщения

Еще один метод оценки числа копий состоит в определении общего количества ДНК клонированного сегмента, реассоциирующегося с известным количеством геномной ДНК. Клонированный сегмент должен присутствовать в избытке в отличие от ситуации, описанной в разд.7.5. б, где в избытке присутствовала геномная ДНК. Гибридизация в условиях насыщения особенно полезна в тех случаях, когда исследуемый сегмент присутствует в ДНК в очень малом числе копий и изучение реассоциации затруднено.

Эксперимент состоит в следующем. Возрастающее количество препарата радиоактивно меченного клонированного сегмента инкубируют с фиксированным количеством денатурированной и фрагментированной геномной ДНК и определяют количество гибридизовавшейся клонированной ДНК. Время реакции должно быть достаточным для достижения насыщения. Лучше, чтобы меченый фрагмент был одноцепочечным; это позволяет избежать его самогибридизации при относительно высоких концентрациях, необходимых для получения насыщения. В условиях насыщения все клонированные геномные сегменты связаны с зондом. Высота плато дает суммарное число гомологичных последовательностей в геноме, которое можно рассчитать исходя из удельной радиоактивности меченого фрагмента. Для повышения точности метода проводят калибровочные эксперименты, в которых к препаратам геномной ДНК добавляют известные количества немеченого клонированного фрагмента. В эксперименте количество гибридизовавшегося радиоактивного фрагмента при насыщении эквивалентно двум копиям гена на гаплоидный геном. Чтобы упростить эксперимент, препараты денатурированной геномной ДНК фиксируют в виде пятен на нитроцеллюлозном фильтре. В усовершенствованном варианте сначала определяют насыщающую концентрацию радиоактивного зонда, а затем инкубируют зонд с разным количеством геномной ДНК, фиксированной на нитроцеллюлозном фильтре.

Изменение клонированных сегментов: получение мутантов

а. Общие положения

В основе классического генетического анализа лежит получение случайных мутаций, вызывающих наследуемые фенотипические изменения. Разработка новых молекулярно-генетических методов привела к созданию так называемой обратной генетики. В охарактеризованные клонированные гены вносят специфические мутации и затем устанавливают корреляцию между изменениями в определенных участках этих генов и изменением фенотипа или локализуют регуляторные элементы. Например, если в кодирующую часть гена внести мутации, то на нем будет синтезироваться модифицированный полипептид. Это позволяет изучать влияние аминокислотной последовательности белка на его кон-формацию или ферментативную активность. Аналогично нуклеотидная замена в предполагаемом регуляторном участке может привести к подавлению или стимуляции транскрипции, что подтвердит предположение о функциональной роли данного участка.

Существуют разные способы внесения мутаций в клонированные фрагменты или небольшие геномы, но мы рассмотрим лишь немногие из них. Во всех случаях успех зависит от двух условий. Во-первых, должна быть хорошо известна структура исходной ДНК. Как минимум, необходимо знать подробную карту сайтов рестрикции, но еще лучше, если известна вся последовательность изучаемого фрагмента. Во-вторых, поскольку все методы дают некую смесь продуктов, нужный элемент следует очистить с помощью клонирования, амплифицировать и охарактеризовать. При некоторых типах мутагенеза мутации образуются в случайных местах, при других - в определенных сайтах; о последних говорят как о сайт-специфических мутациях.

б. Делеционные мутанты

Использование рестриктирующих эндонуклеаз. Внести делецию в определенный участок можно в том случае, если клонированный фрагмент ДНК содержит два близко расположенных уникальных сайта рестрикции в интересующей нас области. После эндонуклеазного расщепления фрагмента образующиеся "хвосты" отщепляют с помощью специфичной к одноцепочечным участкам нуклеазы и тупые концы вновь сшивают. Однако столь простой подход применим лишь в редких случаях. Чаще используют другой метод, при котором делецию создают в окрестности одного уникального сайта рестрикции. После эндонуклеазного разрезания фрагмента соседние нуклеотиды удаляют с помощью эндонуклеазы Bal 31 или какой-либо экзонуклеазы, например ехоШ E. coli, совместно с нуклеазой S1. При последующем лигировании образуется семейство молекул с делециями, расположенными вокруг исходного эндонуклеазного сайта. Делеционные мутанты очищают с помощью молекулярного клонирования. В одном из вариантов этого метода перед образованием кольцевой молекулы к концам присоединяют рестриктазные линкеры. При этом в молекулу вводятся эндонуклеазные сайты, которые могут оказаться полезными для исследования ее свойств, секвенирования и последующего моделирования.

При помощи более сложных манипуляций может быть получен целый набор делеций разной длины, берущих начало от одного исходного сайта. Для этого рекомбинантную молекулу обрабатывают двумя способами. Из одной ее части удаляют с помощью двух рестриктирующих эндонуклеаз большой сегмент, включающий мишень для делеций. Вторую часть линеаризуют с помощью одного из двух ферментов и затем обрабатывают ферментом Bal 31. Далее в результате разрезания вторым ферментом получают набор фрагментов уменьшающейся длины. Лигирование этих фрагментов с частью А и последующее клонирование дает набор молекул с делециями, начинающимися в сайте RE1.

Использование неспецифических эндонуклеаз. В сверхспиральные кольцевые молекулы могут быть внесены единичные разрывы с помощью неспецифических эндонуклеаз, например ДНКазы I. При этом образуется целый набор линейных молекул с разрывами в разных сайтах. После внесения разрыва и расширения делетированной области осуществляют лигирование с помощью методов, описанных ранее для устранения эндонуклеазных разрывов. При таком подходе используют некоторые интересные свойства ДНКазы I: в присутствии Мп²+ этот фермент расщепляет сразу обе цепи дуплексной ДНК, а в присутствии Mg²+ гидролизует за один раз только одну цепь, в результате чего в ДНК появляются одноцепочечные пробелы. Кроме того, фермент расщепляет сверхспиральную ДНК быстрее, чем линейную дуплексную, вследствие локальной неупорядоченности ДНК в сверхспиральном состоянии. Поэтому после непродолжительной обработки сверхспиральной ДНК ДНКазой I в присутствии Mg²+ образуются в основном полноразмерные линейные дуплексные молекулы. Обработка их с помощью Bal 31 или экзонуклеазы, а затем 81-нуклеазы расширяет образовавшийся ранее пробел. После лигирования отдельные продукты можно получить с помощью молекулярного клонирования.

в. Инсерционные мутанты

Принципы конструирования инсерционных мутантов сходны с описанными выше для делеционных мутантов. Клонированный сегмент ДНК расщепляют по одному из сайтов с помощью рестриктирующей эндонуклеазы или неспецифической эндонуклеазы. При необходимости заполняют пробелы на концах образовавшейся линейной молекулы или отщепляют одноцепочечные "хвосты" с помощью нуклеазы и осуществляют лигирование в присутствии сегмента, который хотят встроить в молекулу. В качестве вставки может использоваться синтетический фрагмент, содержащий множество сайтов для рестрикционных эндонуклеаз, - так называемый полилинкер. Если первое расщепление было неспецифичным, то появление новых сайтов рестрикции в наборе клонированных мутантов поможет построить физическую карту мутаций.

г. Точечные мутации

Химический мутагенез. Для получения точечных мутаций в определенном участке молекулы чаще всего используют дуплексную кольцевую ДНК, содержащую короткий одноцепочечный участок. Один из способов создания таких сайт-специфических пробелов состоит в обработке сверхспиральной ДНК соответствующей рестриктирующей эндонуклеазой в присутствии бромистого этидия, который встраивается между плоскостями пар оснований и вносит нарушения в структуру дуплекса. При этих условиях многие рестриктирующие эндонуклеазы разрезают только одну из цепей в соответствующих сайтах. По-видимому, при встраивании бромистого этидия в обычную дуплексную молекулу ДНК разрезания вообще не происходит, а в сверхспиральной молекуле разрезается только одна цепь. Не все рестриктирующие эндонуклеазы ведут себя подобным образом, но все же число их достаточно велико. После разрезания молекулы с помощью экзонуклеазы в дуплексной молекуле создают небольшой одноцепочечный пробел в месте разреза. Альтернативный способ получения дуплексной молекулы с пробелом состоит в использовании векторной системы на основе фага М13. Для этого создают одноцепочечный М13-рекомбинант, содержащий нужный сегмент, а также другой, двухцепочечный, рекомбинант, содержащий такой же сегмент, но с делецией. Этот двухцепочечный рекомбинант денатурируют и реассоциируют с одноцепочечным, в результате чего образуется гетеродуплекс с пробелом.

Если ДНК, содержащую одноцепочечный пробел, обработать бисульфитом натрия, то в одноцепочечном участке произойдет дезаминирование остатков цитозина с образованием урацила, т.е. дезаминируются только определенные остатки цитозина. Если пробел невелик, а число дезаминированных остатков цитозина ограничено благодаря малому времени реакции и низкой концентрации бисульфита, то возникает очень небольшое число специфических мутаций. Далее пробел заполняют с помощью ДНК-полимеразы и осуществляют лигирование. Вместо исходных С"С-пар в молекуле ДНК теперь содержатся пары и"А, которые после репликации превращаются в Т"А-пары.

Мутагенное копирование. Специфические мутации другого типа можно получить, если при заполнении пробела вместо нормального дезоксирибонуклеозидтрифосфата использовать его мутагенный аналог. ДНК-полимераза I способна использовать в качестве субстратов различные аналоги обычных дезоксирибонуклеозидтрифосфатов. Некоторые из них являются мутагенами. Например,] М⁶-гидро-ксидезоксицитидин-5'-трифосфат может включаться в синтезируемую цепь в положение, соответствующее А или G в матричной цепи в зависимости от того, находится ли он в иминной или аминной форме соответственно. Если пробел в дуплексной ДНК заполняется с помощью HO-dCTP вместо dTTP, то напротив А будет находиться HO-dC. После трансфекции и репликации наряду с нормальными формами будут обнаруживаться мутантные геномы с транзициями Т * А - " С * G. Проведя отбор, эти мутанты можно клонировать. Аналогично замещение dCTP на HO-dCTP приводит к транзициям С * G - > Т * А.

Сайт-специфический мутагенез с применением синтетических олигодезоксинуклеотидов. Олигодезоксинуклеотиды можно синтезировать в больших количествах, что позволяет разработать достаточно универсальные методы получения сайт-специфических точечных мутаций в клонированных сегментах ДНК. В основе одного из таких методов лежит образование гетеродуплекса между одноцепочечным синтетическим олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность, и комплементарной одноцепочечной рекомбинантной векторной ДНК, несущей соответствующий сегмент дикого типа. Для этого ген, в котором мы хотим получить мутацию, клонируют, например, в фаге М13 и получают одноцепочечную кольцевую рекомбинантную вирусную ДНК. Затем с этой кольцевой молекулой отжигают синтетический олигодезоксирибонуклеотид длиной от 8 до 20 нуклеотидов, содержащий мутантную последовательность. Этот олигодезоксирибонуклеотид выполняет роль праймера, а оставшийся одноцепочечным участок-роль матрицы при синтезе ДНК in vitro с помощью ДНК-полимеразы I. После копирования всей кольцевой молекулы начало и конец новой цепи соединяют лигазой. Образовавшаяся дуплексная молекула содержит неспаренные основания в мутантной последовательности. Интересно, что фаговое потомство, вышедшее из одной инфицированной клетки, сегрегирует как смешанная популяция фагов дикого типа и мутантных рекомбинантов, которые можно разделить при последующем клонировании.

При втором подходе, так называемом кассетном мутагенезе, участок клонированной ДНК дикого типа замещают синтетическим дуплексным олигодезоксирибонуклеотидом, содержащим мутантную последовательность. В приведенном примере клонированная вставка встроена в дуплексный вектор типа pBR322. В простейшем случае для вырезания участка, в который мы хотим внести мутацию, используют уникальные рестрикционные сайты, встречающиеся во вставке, но не в векторе. Если такие сайты отсутствуют, приходится прибегать к дополнительным ухищрениям. Дуплексный олигонуклеотид получают путем отжига двух синтетических комплементарных цепей, каждая из которых содержит соответствующую замену основания. Кроме того, эти цепи синтезируют таким образом, чтобы дуплекс, который они образуют, имел соответствующие липкие концы. В отличие от гетеродуплексного метода, при трансфекции и клонировании измененного рекомбинанта геномов дикого типа не образуется. Однако если используют смесь синтетических олигодезоксирибонуклеотидов, содержащих альтернативные основания в мутантных участках, то смесь мутантов сегрегирует после трансфекции и ее можно разделить с помощью последующего клонирования. Такой подход оказывается полезным, если необходимо получить разные мутации в одном эксперименте. Напомним, что синтез таких смешанных олигодезоксирибонуклеотидов осуществляется простым использованием на нужной стадии химического синтеза не одного мононуклеотида, а их смеси.

Изучение функций клонированных сегментов ДНК

Нередко клонирование определенных сегментов геномной ДНК, или кДНК, осуществляют с целью выяснения функций их внутриклеточных двойников.

Исходя из результатов структурного анализа клонированных последовательностей, указывающих на присутствие в них открытых рамок считывания, можно предположить, что они содержат гены. Часто удается выявить специфические промоторные последовательности и другие регуляторные элементы. Однако, чтобы подтвердить эти данные, необходимо провести прямые функциональные исследования. При этом нужно ответить на следующие вопросы:

1. Транскрибируется ли данная последовательность только в одном или нескольких типах клеток?

2. Являются ли транскриптами молекулы мРНК?

3. Влияют ли на транскрипцию изменения, происходящие в клетке?

4. Содержит ли клонированный сегмент промоторы, терминаторы или другие регуляторные сигналы, и если да, то как они работают?

5. Какова связь между структурой клонированного сегмента и структурой внутриклеточных транскриптов?

6. Могут ли транскрипты транслироваться в полипептид? Для ответа на все эти вопросы используют различные экспериментальные подходы в зависимости от того, какая именно система анализируется.

а. Характеристика внутриклеточных транскриптов, соответствующих клонированным сегментам ДНК

Говоря о любом клонированном сегменте генома, нам прежде всего необходимо ответить на вопросы, связанные с его транскрипцией in vivo. Очень важными являются также данные о структурном сходстве между клонированной кДНК и внутриклеточными родственными транскриптами. В основе соответствующих исследований лежат три метода: РНК-блоттинг, анализ с использованием специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз и копирование РНК, выделенной из клеток, с помощью обратной транскриптазы. Все методы включают предварительное выделение и очистку РНК из целых клеток или специфических внутриклеточных органелл, таких, как ядро или цитоплазма. Результативность всех методов зависит от способности РНК образовывать гетеродуплексы с комплементарной клонированной ДНК.

РНК-блоттинг. Блоттинг РНК аналогичен блоттингу ДНК. Он состоит в следующем. Выделенную РНК разделяют по размерам с помощью электрофореза в агарозном геле. Обычно электрофорез проводят в условиях, способствующих денатурации РНК, чтобы свести к минимуму влияние вторичной структуры молекулы на ее электрофоретическую подвижность. Щелочные условия для этой цели не подходят ввиду лабильности фосфодиэфирных связей в молекуле РНК в этих условиях. Поэтому используют такие агенты, как глиоксаль, формальдегид или мочевину. Затем РНК переносят на иммобилизованную подложку, стараясь сохранить распределение молекул РНК. Далее используют меченую ДНК в качестве зонда для выявления на фильтре соответствующих молекул РНК. Фильтр инкубируют с ДНК в условиях, благоприятствующих гибридизации. Промыв фильтр для удаления избыточной ДНК, с помощью радиоавтографии устанавливают положение зонда, а следовательно, и положение гомологичной РНК в том геле, в котором проводился электрофорез. Таким способом выявляют продукты транскрипции клонированного сегмента ДНК. Если на параллельной дорожке этого же геля одновременно провести разделение смеси РНК или молекул одноцепочечной ДНК известного размера, то можно оценить размер транскриптов. Кроме того, РНК-блоттинг позволяет оценить количество РНК, синтезированной в клетках, из которых она получена. Метод оценки аналогичен используемому при определении числа копий ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах. Плотность полосы на рентгеновской пленке пропорциональна количеству присутствующей гомологичной РНК. Как и ранее, желательно, чтобы меченый зонд был одноцепочечным, поскольку он не должен реассоциировать с комплементарной цепью ДНК вместо РНК.

С помощью всех этих довольно простых методов можно получить обширную информацию о функциональных свойствах клонированного сегмента ДНК. Сюда относятся не только данные о способности к транскрибированию, но и оценка числа траскриптов и ее зависимость от типа клеток или внеклеточной среды. Анализируя РНК из очищенных клеточных компонентов, можно установить, где локализуются разные транскрипты - в ядре, цитоплазме или полисомах. Часто очень важным является вопрос о полиаденилировании гомологичной РНК, поскольку полиаденилирование является характерным признаком большинства эукариотических мРНК. Разделить полиаденилированную и неполиаденилированную] РНК не составляет труда, поскольку полиаденили-рованная РНК спаривается при соответствующих условиях с poly или poly. Сами полимеры обычно фиксируют на инертной твердой подложке, что упрощает отделение несвязанной poly-PHK. Фракцию poly-PHK элюируют при денатурирующих условиях. Затем РНК из каждой фракции подвергают электрофорезу, блоттингу и

тестированию на способность гибридизоваться с клонированной ДНК. Если РНК, идентифицированная с помощью клонированной ДНК, выделена из цитоплазмы и полиаденилирована, то скорее всего она представляет собой мРНК. Идентификация становится более надежной, если, кроме того, РНК связана с полисомами.

Еще одной характеристикой мРНК, гибридизовавшихся с клонированным сегментом ДНК, является их размер. Иногда РНК имеет больший размер, чем клонированный сегмент; это означает, что в клоне представлена лишь часть гена. В других случаях РНК оказывается короче клонированного сегмента, что свидетельствует о наличии в клонированной последовательности дополнительных последовательностей, не представленных в транскрипте. Это могут быть геномные последовательности, фланкирующие транскрибируемую область, или не-кодирующие последовательности, прерывающие кодирующую область и подвергающиеся сплайсингу во время созревания мРНК. Все эти взаимоотношения между клонированным сегментом ДНК и гомологичной клеточной РНК можно установить более точно, используя специфичные к одноцепочечным ДНК нуклеазы или осуществляя обратную транскрипцию.

Исследование родства между клонированным сегментом ДНК и внутриклеточной РНК с помощью ДНК-РНК-гибридизации и специфичных к одноцепочечным ДНК нуклеаз. Эксперимент включает три этапа. На первом клонированный фрагмент ДНК метят радиоактивным изотопом и денатурируют. Можно также использовать одноцепочечную ДНК. На втором этапе ДНК гибридизуют с выделенной клеточной РНК в растворе в условиях, благоприятных для образования ДНК-РНК-гибридов. Любые последовательности ДНК, присутствующие в клонированном фрагменте, но не представленные в РНК, остаются одноцепочечными. Их удаляют с помощью нуклеазы, специфичной к одноцепочечной ДНК. И наконец, гибридные молекулы денатурируют и подвергают гель-электрофорезу. Размер образующейся радиоактивной ДНК определяют с помощью радиавтографии, сравнивая положение исследуемой ДНК с положением молекул ДНК известного размера.

Этот основной эксперимент можно проводить во многих разных вариантах, каждый из которых позволяет выявить свои особенности структуры РНК в зависимости от того, какая именно нуклеаза используется, является ли РНК суммарной или очищенной цитоплазматической ро1у-мРНК. Один из таких вариантов, где в ДНК имеется один протяженный участок, комплементарный РНК, и не спарены только концы молекулы. Метод позволяет также выявить любую область, где отсутствует комплементарность между РНК и ДНК. Во многих экспериментах такого рода используется специфичная к одноцепочечной ДНК эндонуклеаза S1, поэтому метод называют картированием.

81-картирование часто используют для установления соответствия между началом молекулы РНК и специфическим сайтом в клонированном сегменте ДНК. Во многих случаях этот сайт представляет собой сайт инициации транскрипции. Точность эксперимента значительно повышается, если используется небольшой ДНК-зонд, что позволяет измерить длину защищенного сегмента ДНК с точностью до одного нуклеотида. Для получения такого зонда обычно субклонируют строго определенные участки длинного фрагмента ДНК. Размер защищенного фрагмента ДНК определяют с помощью электрофореза в таких же гелях, что и при определении нуклеотидной последовательности.

Удлинение праймера: исследование родства между внутриклеточной РНК и клонированным фрагментом ДНК с помощью обратной транскриптазы. Для проведения этого эксперимента необходим относительно короткий ДНК-зонд, который гибридизуется с участком РНК, желательно находящимся на расстоянии не более 100 пар оснований от предполагаемого 5'-конца РНК. ДНК-зонд отжигают с РНК, и он играет роль праймера при обратной транскрипции, а матрицей служит РНК. Поскольку обратная транскриптаза прекращает копирование, когда достигает 5'-конца РНК, размер продукта позволяет установить, где начинается РНК. Обычно праймер бывает радиоактивно меченным, что позволяет легко определить положение продукта в геле. Поскольку ДНК-зонд специфичен только к конкретной РНК, исследуемый препарат может представлять собой смесь разных РНК.

б. Функциональное тестирование клонированной ДНК

Клонированные сегменты ДНК можно транскрибировать и транслировать в эукариотических системах либо in vitro с использованием клеточных экстрактов или очищенных ферментов, либо in vivo после введения клонированного сегмента в клетку.

Системы in vitro. Для приготовления бесклеточных экстрактов, содержащих РНК-полимеразы I, II и III, обычно используют разнообразные эукариотические клетки. В анализируемом сегменте должны присутствовать последовательности, ответственные за регуляцию транскрипции; необходимы также вспомогательные белки, стимулирующие транскрипцию. При фракционировании таких экстрактов получают очищенные или частично очищенные полимеразы и факторы, с помощью которых можно детально изучить механизмы транскрипции. Для осуществления трансляции мРНК с образованием соответствующих полипептидов используют другие типы клеточных экстрактов.

Системы in vivo. Для изучения функций клонированного сегмента ДНК лучше всего использовать целые клетки, поскольку это позволяет следить как за процессом транскрипции, так и за процессом трансляции. Наиболее изученной биологической тест-системой являются ооциты лягушки. Ооциты - это крупные клетки объемом до 1 мкл, которые можно многократно получать от одной лягушки. ДНК инъецируют непосредственно в ядро, при этом обычно достаточно 5 нг препарата. ДНК в комплексе с гистонами ооцита упаковывается с образованием хроматина, далее осуществляются ее транскрипция и трансляция, и в течение нескольких часов можно идентифицировать продукты экспрессии генов - мРНК и полипептиды. Для проведения эксперимента часто оказывается достаточно того количества РНК и полипептидов, которое синтезируется одним ооцитом. Во многих отношениях экспрессия инъецированных клонированных генов в ооцитах протекает нормально. Исходные ядерные транскрипты генов РНК-полимераз II и III подвергаются процессингу, а зрелые мРНК и тРНК переходят в цитоплазму.

Рекомбинантные ДНК могут быть введены и в эукариотические клетки в культуре. Молекулы можно инъецировать непосредственно в отдельные клетки, однако проще вводить клонированные молекулы в большую популяцию клеток одновременно. При этом используется методика трансфекции в связи с клонированием в эукариотических клетках. По крайней мере часть молекул, введенных таким способом, достигает ядер.

Синтез полипептидов, кодируемых клонированными сегментами эукариотической ДНК

В предыдущих разделах мы уже не раз останавливались на синтезе in vitro и in vivo полипептидов, кодируемых вставками в рекомбинантных векторах. Скрининг по фенотипу зависит от экспрессии интересующего нас гена в клетках хозяина. Отбор нужных клонов такими методами, как HART и гибридизационная селекция, осуществляется с помощью трансляции in vitro, а функциональный анализ клонированного сегмента после введения его в исходную клетку основывается на изучении как транскрипции, так и трансляции. Цель многих экспериментов по клонированию состоит в синтезе нужного полипептида, а иногда - в получении его в количествах, достаточных для проведения фенотипического анализа. В ряде случаев цель клонирования состоит в получении антител. В этом разделе мы опишем некоторые системы хозяин-вектор, специально созданные для продукции нужного белка.

Синтез белков, предназначенных для проведения тех или иных исследований или для применения в медицине и промышленности, - это одна из самых первых задач, которые ставились при разработке технологии рекомбинантных ДНК. В настоящее время ряд поступающих в продажу ферментов, используемых для конструирования рекомбинантных молекул ДНК, в свою очередь синтезируются под контролем генов, клонированных в плазмидных векторах E. coli. Использующиеся при этом препараты имеют высокую степень очистки, относительно недороги и включают ДНК-полимеразу I, ДНК-лигазу E. coli, обратную транскриптазу. Другие белки и их мутантные формы, полученные после сайт-специфического мутагенеза соответствующих клонированных генов, используют для установления связи между структурой белка и его функцией. К ним относятся алкогольдегидрогеназа, в-лактамаза, цитохром с - и тирозил-тРНК-синтетазы. С помощью методов клонирования были синтезированы важные в клиническом отношении белки, которые трудно было получить иным способом. Сюда относятся интерфероны, инсулин и гормон роста человека. Были синтезированы белки, кодируемые некоторыми вирусами животных и простейшими. Они использовались в качестве антигенов в некоторых вакцинах.

а. Выбор системы экспрессии

Для экспрессии уже клонированного гена выбор хозяина имеет такое же важное значение, как и при самом клонировании. Наиболее подходящими хозяевами для получения белка часто оказываются клетки E. coli, поскольку с ними просто манипулировать и их легко выращивать в больших объемах. После открытия интронов, прерывающих кодирующие участки многих эукариотических генов, для использования в экспрессирующих векторах чаще стали применять клонированные кДНК, а не сами гены. Однако при синтезе активных форм определенных эукариотических белков в клетках E. coli возникает ряд проблем. Так, первичные продукты трансляции некоторых эукариотических генов должны подвергнуться специфическим посттрансляционным модификациям, прежде чем образуются функциональные молекулы. Обычно эти модификации состоят в протеолизе, фосфорилировании, ацетилировании и гликозилировании. Ферменты, катализирующие эти реакции в клетках Е. coli, обычно отсутствуют. Отчасти для решения этой проблемы были разработаны эффективные эукариотические системы экспрессии. В животных системах хозяин-вектор в качестве кодирующих последовательностей не обязательно использовать кДНК, поскольку эти клетки способны удалять интроны.

Векторы, предназначенные для эффективной транскрипции и трансляции клонированного сегмента, содержат элементы, повышающие эффективность репликации вектора и экспрессии соответствующих генов. Репликация как таковая для экспрессии генов не требуется, но, обеспечивая образование большого числа матриц для транскрипции, она повышает содержание мРНК и полипептидов в клетке. Таким образом, экспрессирующие векторы обычно содержат точку начала репликации и кодируют некоторые другие функции, необходимые для эффективной внутриклеточной репликации и не обеспечивающиеся хозяйскими клетками. Транскрипция зависит от наличия в векторе промотора, который соответствует присутствующей в клетках РНК-полимеразе, т.е. промотора E. coli для экспрессии в клетках бактерий и промотора, используемого РНК-полимеразой II, для экспрессии в эукариотических клетках. Этот промотор должен быть расположен в векторе таким образом, чтобы клонированный ген мог встроиться в правильной ориентации и за промотором по ходу транскрипции. Эукариотические экспрессирующие векторы должны также иметь сайт для расщепления и полиаденилирования транскрипта-предшественника функциональной мРНК. Для точной трансляции в начале кодирующей области должен находиться кодон ATG, а в конце - один из стоп-кодонов. Последний обычно содержится в клонированном сегменте, но стартовый кодон часто отсутствует во вставке кДНК, поэтому его функции должен выполнять вектор. Для трансляции в Е. coli на 5'-конце на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от инициирующего кодона должен находиться сайт связывания с рибосомой, последовательность Шайна-Дальгарно.

В экспрессирующие векторы часто бывают включены дополнительные элементы. Обычно они предназначаются для увеличения выхода полипептидов или для упрощения процедуры очистки нужного белка от других клеточных белков. Одним из основных факторов, ответственных за уменьшение выхода, является нестабильность многих белков в чужеродной клеточной среде.

Чтобы добиться экспрессии гена, обычно каждый раз приходится решать уникальную экспериментальную задачу. Поэтому многие экс-прессирующие векторы, хотя и обладают некоторыми общими свойствами, имеют свои особенности. Ниже мы рассмотрим системы, в которых используются оригинальные экспрессирующие векторы, предназначенные для конкретных целей.

б. Экспрессирующие векторы, используемые в E. coli

Векторы, сконструированные для осуществления эффективного белкового синтеза в E. coli, обычно происходят от pBR322 или другой высококопийной плазмиды; это необходимо для получения максимального числа матриц для транскрипции.

Промоторы. Большинство векторов, предназначенных для изучения экспрессии генов, содержат один из сильных промоторов, описанных в разд.3.11: Лас-промотор с соответствующим оператором, trp-промотор и оператор, а также Р_ь-промотор бактериофага X. Обычно используют мутантный промотор, называемый UV5, поскольку это позволяет осуществлять транскрипцию с большей скоростью, чем в случае промотора дикого типа, а кроме того, активность сохраняется даже в отсутствие положительного эффектора САР-сАМР. Другой часто используемый промотор, lac, представляет собой синтетическую конструкцию: его - 35-последовательность представляет собой - 35-последовательность trp-промотора, а блок Прибнова - соответствующую последовательность промотора UV5. Таким образом, 1ас-промотор идентичен оптимальному промотору E. coli, структура которого была определена исходя из данных, полученных при сравнении последовательностей многих природных промоторов. Как и ожидалось, он оказался весьма эффективным.

Помимо такого достоинства, как эффективность, эти четыре промотора обладают еще одним ценным свойством: они позволяют осуществлять временной контроль инициации транскрипции, поскольку связаны с регуляторными элементами. Это очень важно, так как накопление больших количеств чужеродного для E. coli белка может подавлять рост клеток и тем самым ограничивать конечный выход белка. Впрочем, если клетки удается вырастить до высокой плотности, а затем индуцировать к оптимальной экспрессии клонированного гена, то часто можно достигнуть оптимального выхода белка. Если белок, который предполагается синтезировать, нестабилен в клетках Е. coli, то молекулы, синтезированные в начале цикла роста, вероятно, деградируют ко времени достижения культурой высокой плотности. Поэтому имеет смысл отсрочить экспрессию до того момента, когда плотность культуры повысится достаточно сильно. Если используются векторы, в которых экспрессия клонированного гена зависит от этих промоторов, то количество нужного белка обычно составляет от 1 до 10% уровня суммарного белка в клеточном экстракте.

Экспрессирующий вектор с lac-промотором. Плазмидные векторы, содержащие промотор lac UV5, часто содержат также последовательность Шайна-Дальгарно ас-оперона и кодирующие последовательности для в-галактозидазы. Поскольку экспрессия, инициируемая на участке с ас-оператором-промотором, находится под контролем ас-оперона, транскрипцию можно инициировать с помощью индуктора изопропил-в-В-тиогалактозида. В приведенном примере вместо восьмого кодона в-галактозидазного гена встроен полилинкер, что нарушает кодирующую рамку. Клетки E. coli, несущие такой вектор, не способны синтезировать активную в-галактозидазу. Две части рамки считывания можно совместить, если в один из рестриктазных сайтов полилинкера встроить фрагмент с определенной рамкой считывания. В этом случае трансляция мРНК может инициироваться в начале кодирующего участка в-галактозидазного гена, проходить через вставку и остальную часть кодирующего участка этого гена и заканчиваться на обычном стоп-кодоне. В результате клетки, содержащие плазмиду с такой вставкой, будут продуцировать активную в-галактозидазу, поскольку первые восемь аминокислот молекулы несущественны для активности фермента и чужеродные аминокислоты не будут влиять на нее. Гибридный полипептид можно очистить, при этом показателем степени очистки будет служить удельная активность в-галактозидазы. В некоторых случаях гибридный белок можно расщепить и удалить протяженную карбоксильную в-галактозидазную часть. Однако и сами гибридные белки находят применение: с их помощью получают антитела к чужеродному белку.

Экспрессирующий вектор с trp-промотором. В векторе, перед полилинкером находятся trp-промотор, оператор, последовательность Шайна-Дальгарно, аттенуатор, а также примерно 300 кодонов гена trp E. Транскрипцию можно контролировать, поместив содержащие плазмиду клетки Е. coli, выращенные до высокой плотности, в среду без триптофана и добавив затем 3-в-индолилакриловую кислоту. Последняя конкурирует с оставшимся триптофаном за связывание с trp-репрессором, однако образует неактивный комплекс, в результате чего происходит дерепрессия промотора. Как и в случае с вектором, содержащим Лас-промотор, при встраивании чужеродного гена в рамку считывания по одному из сайтов рестрикции в полилинкере синтезируется гибридный белок. Трансляция останавливается, дойдя до случайного стоп-кодона вектора.

В случае вставка кодирует обратную транскриптазу ретровируса. После трансфекции и дерепрессии в клетках E. coli синтезируется ферментативно активный гибридный белок. Для повышения стабильности обратной транскриптазы большую часть избыточных последовательностей гена trpE делетируют с помощью некоторых манипуляций и переклонирования. Несколько аминокислот trpE, остающихся на N-конце образовавшегося полипептида, слабо влияют на активность обратной транскриптазы.

Экспрессирующий вектор, использующий P_L-npo-мотор бактериофага X. Вектор позволяет синтезировать эукариотические белки, не сливающиеся с чужеродным полипептидом. Транскрипция с этого промотора подавляется X-репрессором, который образуется профагом, присутствующим в клетке-хозяине. Применение клеток, лизогенизированных фагом, который кодирует чувствительный к нагреванию репрессор, позволяет индуцировать экспрессию гена путем переноса клеток, выращенных при 30°С, в среду с температурой 42°С. Кроме промотора вектор содержит часть последовательности Шайна-Дальгарно гена cII фага X. Между промотором и этой последовательностью находится группа регуляторных элементов фаговой ДНК, которые функционируют в цис-положении, ослабляя транскрипционную полярность. Эти последовательности с антиполярным эффектом функционируют при наличии продукта гена N фага X, поставляемого лизогенизированными хозяйскими клетками, которые обычно используются с вектором этого типа. В таком векторе сегмент, содержащий связывающийся с рибосомой участок Ш-Д-последовательности, включает также кодон ATG cII-гена фага X. Более того, ATG перекрывает BamHI-сайт, унаследованный от плазмиды pBR322. Эукариотические кодирующие участки встраивают в BamHI-сайт разными способами, зависящими от кодирующей последовательности. Очень важным моментом является встраивание кодирующей последовательности таким образом, чтобы она находилась в рамке с ATG. Таким образом, вектор поставляет все регуляторные элементы, необходимые для транскрипции и трансляции, за исключением стоп-кодона, который обычно находится в пределах клонированных эукариотических кДНК.

в. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках дрожжей

Наиболее эффективные в отношении экспрессии генов дрожжевые векторы сконструированы на основе 2 мкм-кольцевой плазмиды дрожжей. Эта плазмида обеспечивает образование в дрожжевых клетках большого числа копий рекомбинантной ДНК до тех пор, пока сегмент REP3 находится в цис-положении, а функциональные гены REP1 и REP2 - либо в цис-, либо в транс-положении. Применяются несколько разных регулируемых дрожжевых промоторов; в примере это промотор гена CYC1, кодирующего изо-1-цитохром с. Этот промотор и связанные с ним регуляторные сигналы составляют область размером в несколько сотен пар оснований, что типично для подобных сложных эукариотических областей, в которых транскрипция регулируется с помощью РНК-полимеразы II. Сегменты ДНК, трансляцию которых мы хотим осуществить, встраивают в рамку считывания в сайте. В этом случае они непосредственно прилегают к инициирующему кодону ATG гена CYC1. Сайт полиаденилирования в векторе отсутствует, но обычно кДНК содержат такой сайт, который расположен за стоп-кодоном трансляции.

г. Экспрессирующие векторы, используемые в клетках животных

Для экспрессии клонированных генов в клетках животных были сконструированы два типа векторов; в основе одного из них лежит геном SV40, а другого - геном папилломавируса крупного рогатого скота. Основные свойства этих двух систем вирусных векторов описаны в разд. 5.7. Векторы на основе папилломавирусов особенно полезны для синтеза больших количеств белка, а векторы на основе SV40 используются во многих экспериментах.

Типичные векторы содержат либо весь геном BPV, либо его часть, необходимую для стабильной трансформации хозяйских клеток, например мышиных клеток в культуре. Такие векторы часто включают эукариотический ген вместе с промотором, сигналом полиаденилирования и другими регуляторными областями. Между сайтом инициации транскрипции и стартовым кодоном трансляции находится удобный рестриктазный сайт. Когда в этот сайт встраивается определенная кодирующая последовательность, она транскрибируется с образованием соответствующей мРНК. Синтез этой мРНК начинается от стартового кодона транскрипции и заканчивается на сигнале полиаденилирования, находящемся во вставке или в векторной последовательности. Кодирующая последовательность должна содержать свой собственный стартовый и стоп-кодоны. Одним из преимуществ экспрессирующих векторов, созданных на основе BPV, является то, что трансформированные ими клетки сохраняются в культуре в течение многих месяцев. В результате непрерывного деления клеток постоянно синтезируется нужный белок. В одном из экспериментов в BPV-вектор была встроена предварительно клонированная кодирующая часть гена поверхностного антигена вируса гепатита В. Трансформированные клетки секретировали около 10 мг антигена на 1 л культуры за 24 ч.

Ферментативная амплификация сегментов ДНК и РНК

На заре развития методов молекулярного клонирования применение альтернативных способов амплификации специфических сегментов ДНК или РНК, присутствующих в больших популяциях молекул, казалось маловероятным. Однако в настоящее время такой метод разработан и широко используется. Он получил название полимеразной цепной реакции. С его помощью можно получать микрограммы ДНК-копии сегментов ДНК или РНК, даже когда они присутствуют в препарате в виде единственной молекулы.

Вся полимеразная цепная реакция осуществляется in vitro с использованием ДНК-полимеразы и олигонуклеотидных праймеров, комплементарных двум 3'-концам участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. Таким образом, разработка ПЦР-метода стала возможной лишь после того, как были созданы методы быстрого и недорогого химического синтеза олигонуклеотидов. Для осуществления реакции необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка, который мы хотим амплифицировать, чтобы можно было синтезировать соответствующие олигонуклеотидные праймеры.

Полимеразная цепная реакция. Для того чтобы амплифицировать какой-то сегмент ДНК, синтезируют два олигонуклеотидных праймера, каждый из которых комплементарен одному из двух 3'-концов участков, ограничивающих амплифицируемый дуплексный сегмент. В ходе ПЦР-реакции необходимо копировать последовательность каждой из цепей, находящуюся между участками, с которыми спариваются олигонуклеотидные праймеры. После спаривания праймеров с денатурированной ДНК, содержащей амплифицируемый сегмент, осуществляют встречное удлинение праймеров с помощью ДНК-полимеразы в присутствии четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов. Образующиеся дуплексные ДНК денатурируют, вновь спаривают с праймерами и проводят ДНК-полимеразную реакцию. Этот цикл может быть повторен примерно 60 раз с удвоением в каждом цикле количества дуплексного сегмента ДНК. За п циклов образуется 2" копий дуплексного сегмента, ограниченного праймерами.

Используя термостабильную ДНК-полимеразу, выделенную из термофильных бактерий Thermus aquaticus, можно осуществлять множество ПЦР-циклов при однократном введении фермента. Сначала смешивают ДНК, избыточное количество праймерных молекул, дезоксинуклеозидтрифосфаты и полимеразу. Цикл запускают, нагрев смесь до температуры, обеспечивающей денатурацию ДНК; затем охлаждают раствор до температуры, необходимой для отжига праймеров. Далее устанавливают температуру, при которой может происходить синтез ДНК. Весь процесс, который длится несколько часов, можно автоматизировать, используя нагреватели, работа которых регулируется с помощью компьютера.

Использование ДНК-полимеразы Т. aquaticus не только позволяет автоматизировать процесс, но дает и другое преимущество. Этот фермент наиболее активен в температурном интервале 70-75°С. При таких условиях спаривание олигонуклеотидных праймеров и ДНК происходит более специфично, чем при 37°С - оптимальный температуре для ДНК-полимеразы Е. coli. В результате ассоциация праймеров происходит более точно, что сводит к минимуму амплификацию нежелательных сегментов ДНК, особенно в присутствии всей геномной ДНК. Точность отжига повышается также при подборе оптимального температурного режима, ионной силы, длины праймера и его нуклеотидного состава. Специфичность может быть достаточно высокой, чтобы осуществлялась амплификация двух разных сегментов в одном и том же препарате ДНК в присутствии двух пар праймеров.

РНК можно амплифицировать с образованием дуплексной ДНК аналогичным образом с той лишь разницей, что в начале первого цикла необходимо синтезировать кДНК-копию РНК. Если РНК представлена молекулами мРНК, то роль одного из праймеров в ПЦР, а также в реакциях с участием обратной транскриптазы могут выполнять короткие рогу-цепочки.