Магнитные наночастицы, как средство влияния на релаксационные свойства водородосодержащих биологических сред

Обработка полученных результатов в методе электронной микроскопии приводилась с помощью программы Scan Soft 2000.

Обсчет кривых спада сигналов спинового эха, полученных методом протонной релаксометрии, проводился по встроенной в прибор программе MULTIT2 (“Брукер”).

4. Результаты и их обсуждение

4.1 Синтез растворов на основе наночастиц

Метод получения наночастиц с помощью реакции Элмора достаточно хорошо описан в литературе, однако важной задачей является поиск нужного поверхностно-активного вещества, позволяющего получить биологически приемлемые наночастицы и одновременно оптимизировать необходимые физические свойства [4]. Основные этапы синтеза перечислены в табл.2.

Выбор метода и режимов получения коллоидного раствора на основе наночастиц практически полностью определяет его конечные физико-химические свойства. Существуют две методики получения высокодисперсного магнетита по реакции Элмора - с помощью добавления гидрата аммония и добавления гидроксида натрия. Существенным недостатком второго метода является тот факт, что добавление гидроксида натрия следует проводить при повышенной температуре, что приводит к увеличению размера наночастиц. Количество и механизм добавления аммиака у различных авторов публикаций сильно разнится [16,18]. В случае полной нейтрализации соли железа (III) направление процесса кристаллизации получаемого гидроксида железа зависит главным образом от рН и температуры. Изменение условий (температуры и рН раствора) позволяет существенно изменять как фазовый состав, так и размер образующихся наночастиц. Повышение температуры окисления до значений 60-700С приводит к образованию фазовочистых частиц Fe3O4 кубической фазы. При увеличении температуры выше 1000С и при рН, равном 6-8, образуются кристаллы оксида железа, имеющие ромбическую форму. Увеличение значения рН создает условия роста кристаллов и возникновению частиц б-оксида железа шарообразной формы, с широким распределением по размерам наночастиц. Наиболее оптимальное распределение получается при рН = 2-4, но такие среды не приемлемы с биологической точки зрения [24]. Дисперсность осадка определяется двумя процессами: образованием зародышей и ростом частиц. Образование зародышей может быть спонтанным, когда в пресыщенном растворе под действием химических сил образуется скопление ионов, число которых достаточно для кристаллизации, или индуцированным, когда ионы скапливаются вокруг посторонней твердой частицы, например, пылинки. Если размер образовавшихся частиц меньше 100 нм, то осадок не выпадает, в этом случае образуется коллоидный раствор. Стабилизация размера частиц магнетита достигается добавлением специального поверхностно-активного вещества (ПАВа) при интенсивном перемешивании раствора. Основанием для выбора лимонной кислоты[22] в качестве стабилизатора размера зародешей являются следующие факторы: лимонная кислота - ПАВ, так как обладает амфифильными свойствами; лимонная кислота - участник цикла Кребса, участвовует в естественных цепях биохимического метаболизма и обладает низкими токсичными свойствами; успешно самоорганизуется, образуя капсулярный слой на кристалле магнетита, и оказывает минимальное воздействие на магнитные свойства суперпарамагнитного ядра; имеет маленький геометрический размер, а, значит, минимально влияет на размер частиц, обеспечивая необходимые фармакокинетические параметры.

В качестве стабилизатора структуры коллоидного раствора применяли цитрат натрия, который предпочтительней стандартного декстрана и позволят применять коллоидный раствор для контрастирования сосудов в течение достаточно длительного времени [11].

Одним из факторов, которые необходимо учитывать, это конечное значение рН раствора наночастиц. Оно должно соответствовать значению рН крови и, кроме того, исследование тенденции изменения рН в ходе химического синтеза позволит создать надежный способ технологического контроля производства фармацевтической субстанции. Поэтапное измерение рН на всех стадиях синтеза и стабилизации наночастиц магнетита представлено в табл. 2.

Табл. 2. Этапы синтеза наночастиц оксида железа

Данные, приведенные в табл.2, свидетельствуют, что конечное значение рН раствора наночастиц магнетита доведено до физиологически приемлемого значения с помощью выбора условий и концентрации восстановителя. Значение рН раствора субстанции определяет безопасность введения контрастного средства в кровоток человека и должно учитываться при клиническом использовании.

Условием суперпарамагнетизма является соизмеримость размера наночастиц с размером магнитного домена, поэтому размер наночастиц является параметром, определяющим конечные магнитные и, соответственно, контрастные свойства полученных растворов.

В ходе проведенных исследований, был получен раствор субстанции потенциального магнитно-резонансного контрастного средства на основе суперпарамагнитных наночастиц магнетита с использованием стабилизаторов - лимонной кислоты и цитрата натрия. Согласно технологии получения наночастиц, их дисперсность характеризуется наличием двух процессов: образованием зародышей наночастиц и ростом размера, ранее образовавшихся частиц, путем их агрегации. Скорость обоих процессов является функцией пересыщения раствора. Этим объясняется тот факт, что в коллоидном растворе наблюдается одновременное существование двух фракций наночастиц по размеру (рис.7). С целью получения оптимальных контрастных свойств крупную фракцию отделяли с помощью центрифугирования тремя сериями со скоростью 800 оборотов в минуту по 5 минут и фильтрацией, что приводило к снижению концентрации оксида железа в растворе ( Рис.8). Конечная концентрация железа в полученном растворе, определенная с помощью рентгенофлуоресцентного количественного анализа, составила 50 г/л. Фазовый состав полученного раствора подтверждался с помощью рентгенофазового анализа. Ядро атома железа обладает достаточно высоким зарядом, поэтому полученный раствор обладает рентгенопоглощающими свойствами, что и потвердели дополнительные исследования. В случае необходимости его можно использовать в качестве рентгеноконтрастного средства.

Рис.7а. Электронная микрофотография исходного коллоидного раствора наночастиц оксида железа.

Раствор содержит наночастицы оксида железа двух размерных фракций с диаметрами 8 нм и 37 нм.

Рис.7б. Гистограмма распределения наночастиц по размеру.

Рис. 8а. Электронная микрофотография коллоидного раствора с дополнительной обработкой

Раствор содержит наночастицы оксида железа диаметром 8,2 нм

Рис. 8б. Гистограмма распределения наночастиц по размеру.

Анализ изображений, полученных с помощью просвечивающего электронного микроскопа, показал, что после дополнительной обработки раствор содержит наночастицы с узким распределением по размерам и средним диаметром около 8,2 нм(рис.8б).

Следующим этапом работы являлась оценка полученных растворов с помощью метода протонной релаксометрии.

4.2 Анализ кривых спада времен релаксации

Влияние полученных растворов наночастиц на времена спин-спиновой и спин-решеточной релаксации аналогов биологических жидкостей, исследовались с помощью метода протонной релаксометрии. В результате были получены кривые спада значений времен релаксации Т1 и Т2 в зависимости от концентрации вводимого реагента.

Таблица 3. Зависимость обратных величин времен релаксации Т1 и Т2 от концентраций НЧОЖ(5-8 нм)

Рис.9. Зависимость обратных значений величин времен релаксации Т1 - черная линия и Т2 - синяя линия от концентрации вводимых в водный раствор наночастиц оксида железа со средним размером 5-8 нм.

Таблица 4. Зависимость обратных величин времен релаксации Т1 и Т2 от концентраций НЧОЖ(30-50нм)

Рис.10. Зависимость обратных значений величин времен релаксации Т1 - черная линия и Т2 - синяя линия от концентрации вводимых в водный раствор наночастиц оксида железа со средним размером 30-50 нм.

Анализ кривых показал, что растворы наночастиц со средними размерами - 5-8 нм (суперпарамагнитные) и 30-50 нм (ферримагнитные) обладают контрастными свойствами. Однако в случае суперпарамагнитных частиц контрастные свойства проявлялись как по параметру Т1, так и по Т2(рис. 9.), а в случае боле крупных частиц преимущественно по Т2. Интенсивность спада кривой по времени Т2 у суперпарамагнитных частиц существенно превышала интенсивность по Т1, в особенности на малых и очень высоких концентрациях вводимых наночастиц. Превышение интенсивности спада кривых Т2 по отношению к Т1 является отрицательным фактором для создания железосодержащего контрастного средства для клинических МРТ-томографов, так как процесс формирования сигнала таков, что сильное укорачивание Т2 приводит к существенному снижению интенсивности сигнала на томографе[49], хотя применяемый метод релаксометрии этого не показывал. На первом этапе решение этой проблемы достигалось выбором оптимальной концентрации вводимых наночастиц, выбираемой таким образом, чтобы при приемлемом конечном значении Т1, относительный спад по кривой Т2 был минимален. Анализ кривых спада времен релаксации Т1 и Т2 в зависимости от концентрации введенного раствора показал, что максимальная концентрация вводимых в водный раствор наночастиц, соответствующая пределу измерения для суперпарамагнитных наночастиц, составляет 0.5 мг/мл - после чего значение времен релаксации уходит в «ноль». По результатам исследований была определена основная физическая величина, характеризующая контрастирующую способность контрастного вещества - релаксирующая способность(тангенс угла наклона). Для комбинаций на основе суперпарамагнитных наночастиц она составила 12,1л/(ммоль*с) для величины Т1 и 30.1 л/(ммоль*с) для Т2. С целью оценки полученных значений они были сравнены с характеристиками существующего на рынке парамагнитного гадолинйсодержащего контрастного средства «Магневист» (Bayer AG), предназначенного для визуализации по времени Т1. Значение релаксирующей способности, в условиях эксплуатации установки, для него составило 5.64 л/(ммоль*с).

Для комбинаций на основе ферримагнитных частиц релаксирующая способность для Т2 составила 35 л/(ммоль*с) и для Т1 3,2 л/(ммоль*с).

Таким образом крупные частицы пригодны только для контрастирования по Т2, а мелкие частицы являются универсальными, то есть могут использоваться для контрастирования как по Т1 так и по Т2.

Исследования поведения кривых спада времен релаксации в среде на основе альбумина, не выявило никаких аномалий, что свидетельствует об отсутствии процесса связывания наночастиц с данным белком и это необходимо учитывать при возможном клиническом использование полученного раствора в качестве контраста. По результатам исследований можно сделать вывод о возможности создания нового контрастного средства для МР-томографии, на основе синтезированных наночастиц сложного оксида железа, превосходящего по своим характеристикам существующие аналоги.

4.3 Оценка влияния соединений железа на жизнеспособность фибробластов МТТ-тестом

Для оценки влияния, наночастиц оксида железа и соединений гадолиния, на жизнеспособность клеток фибробластов, на первом этапе использовался МТТ-тест.

В планшете инкубировали клетки фибробластов под воздействием соединений с различными концентрациями железа и лунки контроля, относительно которых рассчитывали достоверность эффекта соединений.

Рассмотрим цитотоксичность веществ сложного оксида железа -2-х образцов коллоидного раствора магнетита(Fe3O4), различающиеся преимущественно размером. Первый образец имеет размер 5-8 нм. Второй образец - 30-50 нм. (№1 и №2 соответственно). В качестве препарата сравнения использован «Резовист» (RV).

Таблица 5. Оптическая плотность ячеек планшета с культурой фибробластов в присутствии соединений (МТТ-тест), усл.ед.:

Примечание:*-Достоверные отличия от контроля при р<0,05

После обработки результаты были представлены в процентах от контроля

Таблица 6 . Жизнеспособность клеток в присутствии соединений (% от контроля):

Для расчета использовано значение оптической плотности «чистого» контроля.

По данным таб.5 и таб.6 построена нижеследующая диаграмма, представленные на рис. 11.

Рис.11.Влияние соединений железа на жизнеспособность фибробластов (МТТ-тест)

Примечание:*-Достоверные отличия от контроля при р<0,05

Ось абсцисс: исследуемые соединения в концентрации 0,01-10%

По оси ординат отложены значения жизнеспособности клеток в процентах(контроль 100%)

У препарата RV в концентрации 1% наблюдается достоверное отличие в сторону увеличения жизнеспособности на 33% Это возможно происходит при повышении цитотоксичности, такой эффект встречается в литературе как метаболическая стимуляция (активация метаболических процессов, при токсическом ответе).

Наибольшую токсичность в максимальной концентрации проявили образцы НЧОЖ №1 и №2. В Концентрациях 10% и 5% наблюдалось достоверное снижение жизнеспособности фибробластов на 40-60%.

Согласно данному исследованию образец №1 имеет большую токсичность, по сравнению с образцом №2 и препаратом сравнения.

При 10% концентрации у образца №1 происходило снижение жизнеспособности на 59%. Тогда как у образца №2 при такой же концентрации снижение жизнеспособности на 38%.

Здесь хотелось бы обратить внимание на следующее:

Токсичность исследуемых веществ №1 и №2 статистически неотличима от токсичности препарата сравнения (резовиста) при равной конечной концентрации железа 0,1% и 0,05%.

Выводы

1. В ходе данной работы были получены образцы НЧОЖ, стабилизированные цитратом натрия, размерами 5-8 нм и 30-50нм.(рН 6,2- 7,2 )

2. Методом протонной релаксометрии показано, что частицы размером 5-8нм имеют релаксирующую способность 12,1л/(ммоль*с) для Т1 и 30.1 л/(ммоль*с) для Т2.

3. Показано, что частицы размером 30-50 нм имеют релаксирующую способность 3,2 л/(ммоль*с) для Т1 и 35 л/(ммоль*с) для Т2.

4. Выявлено, что в концентрациях менее 0,5мг/мл по данным МТТ-теста частицы не проявляют токсического действия на нормальные клетки фибробластов.

5. Экспериментально обнаружено, что токсичность исследуемых веществ №1 и №2 статистически неотличима от токсичности препарата сравнения (резовиста) при равной конечной концентрации железа 0,1% и 0,05%.

Список литературы

1) Berry C., Curtis A. Functionalisation of magnetic nanoparticles for applications in biomedicine // J. Phys. D. Appl. Phys. 2003. V. P.36.

2) Bruce I.J., Sen T. Surface Modification of magnetic nanoparticles with alkoxysilanes and their application in magnetic bioseparations // Langmuir. 2005. V. 21. P. 7029--7035.

3) Ch. H. Vestal, Z.John Zhang // Int.J.of Nanotechnology, V.1, p.240 (2004).(6)

4) Edward A. Neuwelt, Bronwyn E. Hamilton, Csanad G. Varallyay, William R. Rooney,Robert D. Edelman6, Paula M. Jacobs and Suzanne G. Watnick Ultrasmall superparamagnetic iron oxides (USPIOs): a future alternative magnetic resonance (MR) contrast agent for patients at risk for nephrogenic systemic fibrosis (NSF)?//Kidney International (2009) 75, 465-474;

5) Fuentes M., Mateo C., Rodriguez A. et al. Detecting minimal traces of DNA using DNA covalently attached to superparamagnetic nanoparticles and direct PCR-ELISA // Biosensors and Bioelectronics. 2006. V. 21. P. 1574--1580.

6) F. C. Meldrum, N. A. Kotov, J.H. Feodler. Preparation of Particulate Mono- and Multilayers from Surfactant-Stabilized, Nanosized Magnetite Cristallites. American Chemical Society - 1994. - V.98. - P. 4506-4510

7) He X.X., Wang K., Tan W. et al. Bioconjugated nanoparticles for DNA protection from cleavage // J. Am. Chem. Soc. 2003. V. 125. P. 7168--1769.

8) Hong J., Gong P., Xu D. et al. Stabilization of chymotrypsin by covalent immobilization on amine-functionalized superparamagnetic nanogel // J. of Biotechnology. 2007. V. 128. P. 597--605.

9) Jain T.K., Morales M.A., Sahoo S.K. et al. Iron oxide nanoparticles for sustained delivery of anticancer agents // Am. Chem. Soc. 2003. V. 125 (51). P. 15754 --15755.

10) Koneracka M., Kopcansky P., Antalik M. et al. Immobilization of proteins and enzymes to fine magnetic particles // J. Magn. Magn. Mater. 1999. V. 201. P. 427.

11) Koneracka M., Kopcansky P., Timko M. et al. Direct binding procedure of proteins and enzymes to fine magnetic particles // J. Magn. Magn. Mater. 2002. V. 252. P. 409.

12) Kouassi G.K., Irudayaraj J., McCarty G. Activity of glucose oxidase functionalized onto magnetic nanoparticles // BioMagnetic Research and Technology 2005. V. 3 [Электронный ресурс] режим доступа: http://www.biomagres.com/ content/3/1/1.

13) Kin Man Ho, Pei Li. Design and Synthesis of Novel Magnetic Core- Shell Polymeric Particles. American Chemical Society 2008;24(5): 1801-1807

14) Lacava L.M. et al. Magnetic resonance of a dextran-coated magnetic fluid intravenously administered in mice // Biophys. J. 2001.V. 80. P. 2483--2486.

15) Liao M.-H., Chen D.-H. Immobilization of yeast alcohol dehydrogenase on magnetic nanoparticles for improving its stability // Biotechnology Letters. 2001. V. 23. P. 1723--1727.

16) Li X, Du X, Huo T, Liu X, Zhang S, Yuan F. Specific targeting of breast tumor by octreotide-conjugated ultrasmall superparamagnetic iron oxide particles using a clinical 3.0-Tesla magnetic resonance scanner.// Acta Radiol. 2009 Jul;50(6):583-94.

17) Louie A.Y., Huber M.M., Ahrens E.T. et al. In vivo visualization of gene expression using magnetic resonance imaging // Nat. Biotechnol. - 2000. - Vol. 18. - P. 321-325.

18) Martinez-Mera I., Espinoza-Pesqueira M.E., Perez-Hernandez R., Arenas-Alatorre J., “Synthesis of magnetite (Fe3 O4 ) nanoparticles without surfactants at room temperature”, Materials Letters, 2007, 61, 4447-4451

19)MacNeil S, Bains S, Johnson C, Idйe JM, Factor C, Jestin G, Fretellier N, Morcos SK. Gadolinium contrast agent associated stimulation of human fibroblast collagen production.//InvestRadiol. 2011 Nov;46(11):711-7.

20) Molday R.S., MacKenzie D. Immunospecifc ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells // J.Immunol. Methods. 1982. V. 52. P. 353--367.

21) Mossman Т. // J. Immunol. Methods, 1983, V. 65, р. 55-63.-45&catid=55:s-22006&Itemid=52

22) M. Taupitz, S. Wagner, J. Schnorr, et al. Phase I Clinical Evaluation of Citrate-coated Monocrystalline Very Small Superparamagnetic Iron Oxide Particles as a New Contrast Medium for Magnetic Resonance Imaging. Investigative Radiology 2004;39:394-405.

23) Pardoe H., Chua-Anusorn W., St. Pierre T. G., Dobson J. Structural and magnetic properties of nanoscale iron oxide particles synthesized in the presence of dextran or polyvinyl alcohol // J. Magn. Magn. Mater. V. 225. P. 41--46.

24) PangS.C., Chin S.F., Anderson M.A., “Redox Equilibria of iron oxides in aqueous-based magnetite dispersions: Effect of the pH and redox potential”, J. Colloid and Interface Sci., 2007, 311, 94-101

25) Pedro Tartaj P., Serna C.J. Synthesis of monodisperse superparamagnetic Fe/Silica nanospherical composites // J. Am. Chem. Soc. 2003. № 125 (51). Р. 15754--15755.

26) Port M., Idee J.M., Medina C. et al. Efficiency, thermodynamic and kinetic stability of marketed gadolinium chelates and their possible clinical consequences: a critical review // Biometals. -2008. - Vol. 21. - P. 469-490.

27) Portet D., Denoit B., Rump E. et al. Nonpolymeric coatings of iron oxide colloids for biological use as magnetic resonance imaging contrast agents // J. Coll. Inter. Sci. 2001. V. 238. P. 37--42.

28) Robinson D.B., Persson H.H.J., Zeng H. et al. DNA-Functionalized MFe2O4 (M = Fe, Co, or Mn) Nanoparticles and Their Hybridization to DNA-Functionalized Surfaces // Langmuir 2005. V. 21. P. 3096--3103.

29) Salata O.V. Applications of nanoparticles in biology and medicine [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.jnanobiotechnology.com/content/2/1/3

30)Абрагам А., Ядерный магнетизм, пер. с англ., М., 1963

31) Акопджанов А.Г, Шимановский Н.Л., Науменко В.Ю., Семейкин А.В., Старостин К.М., Быков И.В., Манвелов Э.В.. Перспективы применения суперпарамагнитных наночастиц магнетита в качестве магнитно-резонансного контрастного средства. Сборник статей IV съезда фармакологов России. Сентябрь 2012. с.8.

32)Александров И. В., Теория магнитной релаксации. Релаксация в жидкостях и твердых неметаллических парамагнетиках, М., 1975

33)Баранов Д.А., «Магнитные наночастицы: проблемы и достижения химического синтеза», 2009.

34)Белов К.Л. Электронные процессы в магнетите. Успехи физических наук.- 1993г. - Том 163 №5.

35)Вонсовский С. В., Суперпарамагнетизм, в кн.: Физический энциклопедический словарь, т. 5, М., 1966, с. 103; его же, Магнетизм, М., 1971, с. 805.

36)Губин С.П., Кокшаров Ю.А., Хомутов Г.Б., Юрков Г.Ю. Магнитные наночастицы: методы получения, строение и свойства. Успехи химии. - 2005. - № 74(6). - С. 539-574.

37)Зильберман Г.Е. Электричество и магнетизм, М.:Наука, 1970.- 384с.

38)Коновалов А.Н., Корниенко В.Н., Пронин И.Н. Магнитно-резонансная томография в нейрохирургии. - М.: Кондор-М., 1997. - 697 с.

39)Ландау Л. Д., Лифшиц Е. М., Теория поля, 7 изд., М., 1988; Ахиезер А. И., Ахиезер И. А., Электромагнетизм и электромагнитные волны, М., 1985.

40)Лучевая диагностика рассеянного склероза: Т. Н. Трофимова, Н. А. Тотолян, А. В. Пахомов -- Санкт-Петербург, ЭЛБИ-СПб, 2010 г.- 128 с.

41)Магнитно-резонансная спектроскопия: Под редакцией Г. Е. Труфанова, Л. А. Тютина -- Москва, ЭЛБИ-СПб, 2008 г.- 240 с

42)Магнитно-резонансная томография: практическое руководство К. Уэстбрук, ТД Бином, 2012г.

43)НАМ И. Ф., ЯНОВСКИЙ В. А., ШИПУНОВ Я. А. СОВРЕМЕННЫЕ ТЕНДЕНЦИИ СОЗДАНИЯ КОНТРАСТНЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ МАГНИТНО-РЕЗОНАНСНОЙ ТОМОГРАФИИ // СМЖ (Томск). 2012. №3. С.134-137.

44)НиТ. Нобелевские лауреаты, 2003

45) Сивухин Д. В. Общий курс физики. -- В 5 т. -- Т. II. Термодинамика и молекулярная физика. -- М.: ФИЗМАТЛИТ, 2005

46) Синицын В.Е., С.П.Морозов, Справочник поликлинического врача Том 04/N 4/2006, consilium-medicum.com

47)Сликтер Ч., Основы теории магнитного резонанса, пер. с англ., 2 изд., М., 1981

48)Стандарты РКТ и МРТ-исследований с внутривенным контрастированием в онкологии / Долгушин Б.И. и соавт., Российский онкологический научный центр им. Н.Н.Блохина. - РАМН, 2011. - 58 с.

49)Хорнак Дж. П. Основы МРТ (1996--1999)

50) Черепович В.С, Е. В. Волочник,Е. В. Антоненко, Е. С. Лоткова, Т. В. Романовская, В. В. Гринев Оптимизация критических параметров МТТ-теста для оценки клеточной и лекарственной цитотоксичности БГМУ // http://bsmu.by/index.php?option=com_content&view=article&id=1943:2010-01-26-10-10

51)Шимановский Н.Л., Науменко В.Ю., Акопджанов А.Г., Манвелов Э.В. Возможности применения наночастиц магнетита для диагностики и лечения онкологических заболеваний. Лекарственные средства №1(2) 2011.

52)Шимановский Н.Л., Акопджанов А.Г., Сергеев А.И., Манвелов Э.В.,

Семейкин А.В., Науменко В.Ю., Панов В.О., Быков И.В.

Фармакологические свойства наночастиц сложного оксида железа как

субстанции магнитно-резонансного контрастного средства.

53)Шимановский Н.Л.Контрастные средства: руководство по рациональному применению. -М.: ГЭОТАР_Медиа, 2009. - 464 с.: ил. (Библиотека врача_специалиста).

54) Н. Л. Шимановский, М. А. Епинетов, М. Я. Мельников, Молекулярная и нанофармакология, 2010.

55)Экспериментальная и клиническая фармакология. Том №73 №6 с.23-28. 2010.

56) Ядерный магнитный резонанс; под ред. П. М. Бородина, Л., 1.982;

57)Якобсон М.Г., Подоплелов А.В., Рудых С.Б. Введение в МР-томографию. - Новосибирск: СО РАМН. - 1991. - 271 с.

Размещено на Allbest.ru