Гальмування залізоініційованого окиснення фосфоліпідів

Окиснення фосфоліпідів у даній системі протікає, як доведено в роботі [2], за вільнорадикальним механізмом. Процес має свої особливості, зв'язані насамперед з тим, що окиснення проходить на границі розділу фаз, процес гетерогенний, ініціатор - метал перемінної валентності, дисперсійне середовище - вода. Ефективність інгібітору повинна залежати від його колоїдної локалізації, розподілу між водною і масляною фазами, взаємодії з поверхнево-активними речовинами емульсії й ініціатором [32]. Незважаючи на велику кількість досліджень, присвячених вивченню антиоксидантних властивостей різних речовин у ліпідних субстратах, дотепер не отримано однозначних даних навіть про поведінку в таких системах іонола. В зв'язку з цим було проведене дослідження антиоксидантної активності типових фенольних антиоксидантів у процесі залізоініційованого окиснення емульсії яєчного жовтка. Необхідно відзначити, що ортополіфеноли, що є найбільш ефективними антиоксидантами неможливо досліджувати на даній модельній системі, тому що вони утворюють комплекси з ініціатором окиснення - двовалентним залізом, тим самим, виводячись із системи. Контроль за процесом окиснення емульсії здійснювали за поглинанням кисню. Вплив на окиснення різних фенольних антиоксидантів оцінювався при однакових концентраціях (10-³моль/л). Отримані кінетичні результати приведені на рис.3.5. Видно, що вивчені сполуки в межах помилки вимірів (±5 хв) практично не впливають на величину періоду індукції окиснення модельної емульсії, обумовленого наявністю ендогенних антиоксидантів.

Вплив уведених добавок позначається на швидкості процесу окиснення після виходу з періоду індукції, що пропорційна об'єму поглиненого кисню. Як критерій антиоксидантної дії фенолів обрана величина (V₀-V)/V₀, де V₀ - об'єм поглиненого кисню емульсією без добавок фенолу через 20 хв після початку окиснення, V - об'єм кисню, поглиненого емульсією, що окиснюється, з добавками фенолу в той же момент часу.

Очевидно, що чим більше відношення (V₀-V)/V₀, тим ефективніше антиоксидант в обраних умовах гальмує процес окиснення.

З рис.3.5 видно, що феноли в різному ступені гальмують окиснення фосфоліпідів яєчного жовтка, що обумовлено будовою антиоксиданту.

Рис.3.5 - Кінетичні криві поглинання кисню при залізоініційованому окисненні ЯЖ в присутності [InH] = 1*10^-3 M:

[InH] = 0

ферулової кислоти

емоксипіна

7-гідрокси - 4-метилкумарина

фенікаберана

арбідола

іонола

Зі збільшенням концентрації уведеного фенолу ступінь гальмування окисного процесу в емульсії яєчного жовтка зростає. Причому вплив концентрації фенолів різний для слабких і сильних антиоксидантів. Так для емоксипіна, що є слабким антиоксидантом (рис.3.6), зниження швидкості окиснення фосфоліпідів спостерігається тільки при досить високих концентраціях (10^-3- 10^-4 моль/л) і плавно змінюється з ростом концентрації. У той же час іонол (рис.3.7) гальмує процес вже при концентрації в системі 10^-5-10^-6 моль/л, а подальше збільшення концентрації суттєво не змінює швидкості процесу. Таке розходження в поведінці різних фенольних антиоксидантів виявляється в концентраційній залежності параметра, що характеризує ефективність фенолу у вивченій системі. Для слабких антиоксидантів (рис. 3.8) залежність (V₀-V)/V₀ від концентрації фенолів лінійна, а для сильних (рис.3.9) має верхню границю.

Побудова концентраційних залежностей для усіх вивчених фенолів дало можливість визначити концентрацію антиоксиданту, що викликає в однакових умовах 50%-ве зниження об'єму поглиненого кисню (С_50%). В медичних дослідженнях аналогічний показник використовується для порівняння антиоксидантної активності різних лікарських препаратів за їхньою здатністю знижувати на 50% хемілюмінесценцію або вихід продуктів окиснення ліпідів.

Для трьох вивчених антиоксидантів (арбідол, іонол та емоксипін) значення С_50%, визначені в даному дослідженні газоволюмометричним методом і літературні дані [6,8,9,37,43], отримані хемілюмінесцентним методом, приведені в табл.3.1. Як видно з таблиці отримані результати збігаються в межах погрішності застосовуваних методів. Цей факт свідчить на користь можливості використання запропонованої газоволюмометричної методики окиснення фосфоліпідів яєчного жовтка для тестування сполук на антиоксидантну активність.

Рис.3.6 - Окиснення дисперсії ЯЖ в присутності емоксипіна, [InH]: 1 - 0; 2 - 6,5*10^-4M; 3 - 1,3*10^-3M; 4 - 2 ,6*10^-3M.

Рис.3.7 - Окиснення дисперсії ЯЖ в присутності іонола, [InH]: 1 - 0; 2 - 3,0·10^-6М; 3 - 4,0·10^-6М; 4 - 1,0·10^-4М; 5 - 1,0·10^-3М.

Рис.3.8 - Вплив концентрації антиоксидантів на відносне зниження обєму поглиненого кисню при окиснені ЖЛП в присутності: 1 - іонола, 2 - арбідола.

Рис.3.9 - Вплив концентрації антиоксидантів на відносне зниження обєму поглиненого кисню при окиснені ЖЛП в присутності: 3 - фенікаберана, 4 - 7-гідрокси - 4-метилкумарина, 5 - емоксипіна, 6 - ферулової кислоти

Таблиця 3.1

Значення С_50%, визначені газоволюмометричним методом (ГВ) і методом хемілюмінесценції (ХЛ) при пероксидному окисненні ліпідів

Концентрація фенолу, що викликає 50%-ве зниження об'єму поглиненого кисню при окисненні лецитинової емульсії, є характеристикою фенолу як антиоксиданту. Чим менше величина С_50%, тим ефективніше фенол гальмує процес окиснення. В табл.3.2 приведені значення цих концентрацій для всіх вивчених фенолів. В таблиці 3.2 феноли розташовані в порядку зменшення величини С_50%. Це дозволяє зробити ряд висновків щодо взаємозв'язку антиоксидантної активності фенолу в досліджуваній системі з будовою антиоксиданту:

Збільшення загального числа алкільних замісників в орто- і пара-положеннях до гідроксильної групи зменшує міцність О-Н зв'язку і підвищує ефективність сполуки як антиоксиданту. Цей висновок погодиться з класичним механізмом антиоксидантної дії фенолів, зв'язаним з обривом ланцюгів окиснення при гомолітичному розриві О-Н зв'язку.

Таблиця 3.2

Антиоксидантні властивості фенолів при залізоініційованому окисненні дисперсії ЖЛП. ЯЖ=3,2 % мас.; t=37С; Fe²⁺=510^-3М

2. Найбільш ефективні феноли з орто-алкільними замісниками, причому збільшення об'єму таких замісників неоднозначно позначається на активності антиоксиданту. Обумовлено це з однієї сторони стеричними перешкодами в реакції з пероксирадикалами субстрату, що окислюється, а з іншого боку - активністю феноксильного радикала, що утворюється. Проте, в цілому, просторово-екрановані феноли більш ефективні антиоксиданти пероксидного окиснення ліпідів.

3. Введення в молекулу фенолу будь-яких електронноакцепторних замісників знижує антиокисну активність сполуки.

Аналіз отриманих даних показав, що антиоксидантна активність фенолів при окисненні ліпідів, як і в процесі гомогенного радикально-ланцюгового окиснення вуглеводнів, залежить від різних факторів, у першу чергу, від міцності ОН-зв'язку реакційного центра й активності феноксильного радикала, що залежить від можливості делокалізації електрона в подвійних зв'язках [9] і наявності об'ємних замісників в орто-положенні до гідроксогрупи.

В процесі пероксидації ліпідів ці фактори дуже важливі, але в гетерогенній системі суттєвий вплив на ефективність антиоксидантів робить, крім того, гідрофобність фенолів, що визначає їхній розподіл у системі і вміст у масляній фазі, а також адсорбція АО на її поверхні [2, 35]. Ці фактори сприяють збільшенню локальної концентрації АО в поверхневому шарі, а, отже, підсилюється інгібування ПОЛ.

Відомо, що основними складовими частинами ліпосомного подвійного шару є фосфатидилхолін (ФХ) і фосфатидилетаноламін (ФЕА). Структура подвійного шару така, що гідрофільні головні групи фосфоліпідів орієнтуються на поверхні ліпосом, а гідрофобні частини - асоційовані усередині [15]. В приведеній формулі ФХ

R - залишок ненасиченої вищої жирної кислоти (НЖК), що і піддається в першу чергу окисненню. Тобто, чим вище ліпофільність антиоксиданту, тим легше він вбудовується в подвійний шар і, знаходячись ближче до місця окиснення НЖК, буде ефективніше перехоплювати радикали, запобігаючи розвиток ланцюгового процесу.

Високу антиоксидантну активність іонола при пероксидному окисненні ліпідів пояснюють його здатністю утворювати комплекси з НЖК [45], тобто він володіє підвищеною ліпофільністю. Незважаючи на те, що в етилбензолі значення k₇ і, наприклад, 2-метил-6-гідроксибензгексазола (спол. 9, табл. 3.2) дуже близькі, величина С_50% у бензола на ~ 2 порядки більше, ймовірно, через низьку спорідненість до ліпідів.

Вплив ліпофільності антиоксиданту на його ефективність можна побачити у випадку фенола-85 і ірганокса 1076 (спол. 18,19, табл. 3.2). у складі молекули фенола-85 утримується два іонольних фрагменти, з'єднаних містком з гідрованих кілець піридину і -СН₂-груп, однак, судячи з С_50%, він у ~ 5 разів ефективніше іонола, а в молекулі іргонокса 1076 наявність довгого вуглеводневого радикала, що містить складноефірну групу, полегшує вбудовування в подвійний шар і призводить до збільшення його ефективності. Як відомо, в класичній кінетиці [28], замісники третинні аміногрупи, володіючи донорними властивостями, підсилюють антиоксидантну активність фенолів. На нашій моделі суттєва присутність аміногрупи в формі четвертинної солі, тоді як в етилбензолі солі не інгібують окисний процес. Позначається, видимо, краща сумісність солей із зарядженою полярною поверхнею фосфоліпідного подвійного шара.

Ліпофільність фенольних антиоксидантів досліджувалася методом тонкошарової хроматографії. Коефіцієнт утримування R_f є характеристикою гідрофобності речовини. Це повязано з тим, що в системі рухливою фазою є суміш органічних розчинників: хлороформ - бензол - гексан, а нерухливою фазою є гідрофільний силікагель. Інгібітор в гетерогенній системі розподіляється між водною та масляною фазами. Чим більша величина R_f , тим більша ліпофільність фенолу. Отримані дані приведені в таблиці 3.3.

Як видно, збільшення АОА фенолів корелює з коефіцієнтом утримування. Таким чином, стає зрозумілим, що активність антиоксидантів у фосфоліпідних емульсіях деякою мірою залежить від ліпофільності сполуки. Будучи жиророзчинним, антиоксидант одночасно повинний володіти і частковою спорідненістю до водної фази, що забезпечує перебування його на границі розділу фаз, і тим самим, дає максимально ефективну дію.

Таблиця 3.3 - Співвідношення між коефіцієнтом утримування та антиоксидантною активністю інгібіторів.

Висновки

Підтверджена можливість використання запропонованої газоволюмометричної методики окиснення фосфоліпідів яєчного жовтка для тестування сполук на антиоксидантну активність. Отримані значення С_50% збігаються з літературними даними для ряду препаратів, визначеними хемілюмінесцентним методом.

Вивчені фенольні сполуки дають інгібуючу дію на процес окиснення модельної емульсії. Ефективність антиоксидантів залежить від будови молекул.

Збільшення загального числа електроннодонорних замісників в орто- і пара-положеннях до гідроксильної групи підвищує, а електроакцепторних - знижує АОА сполук. Найбільш ефективні феноли з двома орто-алкільними замісниками, у тому числі просторово екрановані.

Проведені дослідження, спрямовані на вивчення ліпофільності сполук, зв'язаної з їхньою хімічною спорідненістю до фосфоліпідів, і міжфазний розподіл антиоксидантів.

Література

1. Барабой В.А., Сутковой Д.А. Окислительно-антиоксидантный гомеостаз в норме и патологии. - К.: Чернобыльинтеринформ, 1997. - Т.1. - 204с.

2. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252с.

3. Герчиков А.Я. Влияние некоторых средств, используемых в анестезиологии, на перекисное окисление липидов плазмы крови / А.Я.Герчиков, Г.Г.Гарифуллина, Л.Н.Ахметшина // Хим. - фарм. журнал. - 2000. - Т.34, №12. - С.34

4. Опейда И.А. Кинетика поглощения кислорода и хемилюминесценции при окислении липидов в присутствии ионов железа (2+) / И.А.Опейда, А.Н.Шендрик, И.О.Качурин, А.Н.Николаевский // Кинетика и катализ. - 1994. - Т.35, №1. - С.38-44.

5. Золотов Н.Н. Определение антирадикальной активности химических соединений методом хемилюминесценции / Н.Н.Золотов, К.Ю.Залилов, В.Э.Мухтаров, С.Б.Гашев // Хим. - фарм. журнал. - 1990. - Т.24, №1. - С.15.

6. Krasowska A. The antioxidant activity of BHT and new phenolic compounds PYA and PPA measured by chemiluminescence / A.Krasowska, D.Rosiak, K.Szkapiak, M.Oswiecimska // Cell. & Mol. Biol. letter. - -001. - V.6. - PP.71-81.

7. Yu W. Antioxidant effect of coumarin derivatives on free radical initiated and photosensitizes peroxidation of linolenic acid in micelles / W.Yu, Z.-Q.Liu, Z.-L.Liu // J. Chem. Soc., Perkin Trans 2. - 1999. - PP.969-974.

8. Губский Ю.И. Антирадикальные и антиокислительные свойства нестероидных противовоспалительных средств - производных пиридинкарбоновых кислот / Ю.И.Губский, А.Г.Горюшко, И.Е.Вистунова, Т.Н.Курапова // Укр. биохим. журнал. - 1999. - Т.71, №5. - С.85-89.

9. Васильева О.В. Антиоксидантные свойства арбидола и его структурных аналогов / О.В.Васильева, О.Б.Любицкий, Т.А.Гуськова, Р.Г.Глушков // Вопр. мед. химии. - 1999. - Т.45, №4. - С.326-331.

10. Селищева А.А., Козлов Ю.П. Метаболизм фосфолипидов и биологические мембраны. - Иркутск: Изд-во Иркут. ун-та, 1988. - 88с.

11. Рогов И.А., Антипова Л.В., Сунченко Н.И., Жеребцов Н.А. Химия пищи. - М.: Колос, 2000. - 426с.

12. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987. - 815с.

13. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Динамическая структура липидного бислоя. - М.: Наука, 1981. - 296с.

14. Бадер Х. Полимерные монослои и липосомы - модели биологических мембран / Х. Бадер, К.Дорн, Б.Хупфер, Х.Рингсдорф // Успехи химии. - 1987. - Т.56, №12. - С.2028-2074.

15. Бергельсон Л.Д. Биологические мембраны. - М.: Наука, 1975. - 183.

16. Ивков В.Г., Берестовский Г.Н. Липидный бислой биологических мембран. - М.: Наука, 1982. - 224с.

17. Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е.Б. Бурлакова, Н.Г.Храпова // Успехи химии. - 1985. - Т.54, №9. - С.1540-1558.

18. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1983. - 752с.

19. Громовая В.Ф. Некоторые особенности действия аскорбиновой кислоты на окислительно-восстановительные реакции с участием кислорода / В.Ф.Громовая, Г.С.Шаповал, И.Е.Миронюк, В.И.Пивень // Хим. - фарм. журнал. - 1996. - Т.30, №7. - С.3-5.

20. Владимиров Ю.А. Реакции цепного окисления липидов в мембранных структурах клетки / Ю.А. Владимиров, Т.Б.Суслова // В кн. Сверхслабые свечения в биологии. - М.: Наука, 1972. - 272с.

21. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. - 1987. - Т.32, №5. - С.830-844.

22. Козлов Ю.П. Свободнорадикальное окисление липидов в биомембранах в норме и при патологии //В кн. Биоантиокислители. - М.: Наука, 1975. - 268с.

23. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы и антиоксиданты // Вестник РАМН. - 1998. - №7. - С.43-51.

24. Бурлакова Е.Б. Биоантиоксиданты и синтетические ингибиторы радикальных процессов // Успехи химии. - 1975. - Т.44, №10. - С.1871-1886.

25. Барабой В.А. Корекція променевих уражень, спричинених низькоінтенсивним опроміненням, за допомогою антиоксидантів / В.А.Барабой, Н.О.Горчакова, С.А.Олійник, Ю.В.Хмєлєвський // Укр. біохім. журнал. - 1994. - Т.66, №6. - С.3-22.

26. Бурлакова Е.Б. Кинетические особенности токоферолов как антиоксидантов / Е.Б.Бурлакова, С.А.Крашаков, Н.Г.Храпова // Хим. физика. - 1995. - Т.14, №10. - С.151-182.

27. Каган В.Е. Проблема анализа эндогенных продуктов перекисного окисления липидов / В.Е.Каган, О.Н.Орлов, Л.Л.Прилипко //В кн.: Итоги науки и техники. Биофизика. - М.: ВИНИТИ. - 1986. - Т.18. - 136с.

28. Азатян В.В., Денисов Е.Т. Ингибирование цепных реакций. - М.: Черноголовка, 1997. - 267с.

29. Осипов А.Н. Изучение кинетики гибели перекисных радикалов в липидах / А.Н.Осипов, А.П.Моравский, В.Ф.Шувалов, О.А.Азизова // Биофизика. - 1980. - Т.25, №2. - С.234.

30. Денисов Е.Т. Элементарные реакции ингибиторов окисления // Успехи химии. - 1973. - Т.42, №3. - С.361-390.

31. Schwarz K. Partition behavior of antioxidative compounds in heterophasic systems / K.Schwarz, E.N.Frankel, J.B.German // Fett/Lipid. - 1996. - V.98, №3. - РР.115-121.

32. Frankel E.N. Interfacial phenomena in the evaluation of antioxidants: bulk oils as emulsions / E.N.Frankel, Shu-Wen Huang. J.Kanner, J.Bruce German // J. Agric. Food Chem. - 1994. - V.42. - PP.1054-1059.

33. E.N.Frankel. Food antioxidants and phytochemicals: present and future perspectives // Fett/Lipid. - 1999. - V.101, №12. - Р.450-455.

34. Rice-Evance C.A. / Structure - Antioxidant activity relationships of flawonoids and phenolic acids / C.A. Rice-Evance, N.G.Miller, G.Palanga // Free Radical Biology & Medicine. - 1996. - V.20, №7. - РР.933-956.

35. von Gadow A. Effect of extraction and additional heating on the antioxidant activity of rooibos tea extracts / A. von Gadow, E.Joubert, C.F.Hansmann // J. Agric. Food Chem. - 1997. - V.45. - PP.1370-1374.

36. Клебанов Г.И. Оценки Антиокислительной активности плазмы крови с применением желточных липопротеидов / Г.И.Клебанов, И.В. Бабенкова, Ю.О.Теселкин и др. // Лабораторное дело, 1988. - №5. - С.59-69.

37. Владимиров Ю.А., Шерстнев Н.П., Азимбаев Т.К. Оценки антиокислительной и антирадикальной активности веществ и биологических объектов с помощью железоинициированной хемилюминесценции // Биофизика, 1992. - Т.37, вып.6. - С.1041-1047.

38. Клебанов Г.И., Теселкин Ю.О., Владимиров Ю.А. Ингибирование антиокислительной активности Плазмы крови азидом натрия // Биофизика, 1988. - Т.33, вып.3. - С.512-516.

39. Шаров В.С., Суслова Т.Б., Деев А.И., Владимиров Ю.А. // Активация хемилюминесценции при перекисном окислении липидов комплексом европий-тетрациклин // Биофизика, 1980. - Т.25, №5. - С.923-928.

40. Кандалинцева Н.В., Дюбченко О.И., Терах Е.И., Просенко А.Е., Шварц Я.Ш., Душкин М.И. Антиокислительная и гепатопротекторная активность водорастворимых 4-пропилфенолов, содержащих гидрофильные группы в алкильной цепи // Химико-фармацевтический журнал, 2002. - Т.36, №4. - С.13-15.

41. Ахрем А.А., Кузнецова А.И. Тонкослойная хроматография. - М.: Наука, 1965. - 123с.

42. Antolovich M. Methods for testing antioxidant activity / M.Antolovich, P.D.Prenzler, E.Pat-Salides, S.McDonald, K.Robards // Analyst. - 2002. - №127. - РР.183-198.

43. Ли Хо Ик. Сравнительное изучение действия карнозина и других антиоксидантов на хемилюминесценцию суспензии однослойных липосом в присутствии ионов железа / Ли Хо Ик, Ю.А.Владимиров, А.И.Деев // Биофизика. - 1990. - Т.35, №1. - С.82-85.

44. Mili B.L.J. Antioxidative activity of phenolic compounds on the metal-ion breakdown of lipid peroxidation system / B.L.J.Mili, S.M.Djilas, I.M.Brunet //Food Chem. - 1998. - V.62. - PP.443-447.

45. Зарудий Ф.С. 2,6-ди-трет. - бутил-4-метилфенол (дибунол, ионол, тонарол) классический антиоксидант (обзор) / Ф.С.Зарудий, Г.З.Гильмутдинов, Р.Ф.Зарудий, М.А.Мышкин // Хим. - фарм. журнал. - 2001. - Т.35, №3. - С.42-48.

Summary

This work deals with the investigation of application possibility of gasometric method which is widely used on other systems for lipoproteins of egg yolk (EY, biomembranes model of peroxide oxidation of lipids) oxidation kinetics studying and for substances antioxidant activity (AOA) testing. The oxidation process was initiated by two-valent iron salt.

To obtain reproductive results the optimal conditions of oxidation (t =37⁰C, [Fe²⁺] = 5*10^-3 M, W(EY) = 3,2 % mass, the phosphate buffer solution ) has been chosen. It enable us to obtain results, adequately characterized AOA of substances. As a parameter of substances AOA was used C_50% (substance concentration twice decreasing the volume of absorbed oxygen in comparison with experiment without inhibitor). The received data analysis shows that studied phenols AOA depends on reaction center OH-bond strength, phenolic radical activity, phenols hydrophobia, that determine there partition in heterogeneous system and also on interface AO adsorption. The last promotes the increasing of AO local concentration in oxidizing dispersion surface layer and results in AO inhibition effect intensification.

Резюме

Данная работа посвящена исследованию возможности применения газоволюмометрического метода, широко применяемого на других системах, для изучения кинетики окисления липопротеинов яичного желтка (ЯЖ, модель ПОЛ биомембран), инициированного солями двухвалентного железа, и для оценки антиоксидантной активности (АОА) веществ.

Для получения воспроизводимых данных выбирались оптимальные условия окисления (t =37⁰C, концентрация инициатора [Fe²⁺] = 5*10^-3 M и субстрата окисления W(ЯЖ) = 3,2 % по массе, раствор в фосфатном буфере). Это позволило получать результаты, адекватно характеризующие АОА препаратов. В качестве параметра АОА соединений использован параметр С_50% (концентрация соединения, в два раза снижающая объем поглощенного кислорода по сравнению с опытом без ингибитора). Анализ полученных данных показал, что АОА изученных фенолов зависит от прочности ОН-связи реакционного центра, активности феноксильного радикала, гидрофобности фенолов, определяющей их распределение в гетерогенной системе, а также от адсорбции АО на границе раздела фаз. Последнее способствует увеличению локальной концентрации антиоксиданта в поверхностном слое окисляющейся дисперсии и приводит к усилению ингибирующего действия АО.