Определение характеристик макета БПК-биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС с использованием различных синтетических сточных вод

Существуют методы быстрого и медленного определения БПК (BODst). Медленный - основанный на использовании медиатора феррицианида представлен в работе [54]. Позволяет преодолеть некоторые проблемы, связанные со стандартным анализом БПК (БПК5), таких как долгая инкубация (5 дней), необходимость разбавлять образцы и низкая воспроизводимость. Здесь представлены вариант измерений, где Klebsiella pneumoniae успешно окисляет феррицианид без деаэрации образцов с линейной зависимостью БПК5 30 - 500 мг/л или 30 - 200 мг/л, с использованием глюкозо-глутаматной смеси (ГГС ) и стандарта OECD соответственно. Кроме того, предложено решение для прекращение анализа, что позволяет увеличить воспроизводимость и стандартизовать анализ, используя формальдегид (22,7 г/л) или другие соединения, чтобы остановить восстановление феррицианида без ущерба для амперометрического обнаружения и, следовательно, заменить центрифугирование, обычно используемое для остановки реакции феррицианида с микроорганизмами. Эти усовершенствования привели к точному определению БПК реальных образцов муниципальных сточных вод.[55]

Данные представленые в статье [56] описывают быстрый метод определения БПК. Активный ил был успешно использован в качестве биокатализатора в быстром методе определения БПК с использованием феррицианида (FM-BOD). Процедура подготовки активного ила были оптимизированы для трех потенциальных биокатализаторов: ила из аэротенка, ила из осадка аэробного реактор и регенерированного активного ила. После 24 часов голода регенерированный активный ил и ил из аэротенка показали самые высокие показатели окисления стандарта ГГС и регенерированный активный ил также показал самый низкий уровень эндогенного дыхания. Рабочий диапазон составил до 170 мг/л БПК5 для стандарта OECD и 300 мг/л БПК5 для ГГС. Это значительное улучшение по сравнению с другими методами быстрого анализа БПК. Высокие значения коэффициента корреляция с стандартным методом БПК5 (n = 35, p < 0.001, R = 0.952) наблюдались для широкого разнообразия реальных образцах сточных вод. Средняя эффективность деградации не отличался от наблюдаемой для стандартного БПК5 анализа. Эти результаты показывают, что активный ил в FM-BOD анализе может быть использован для простого ежедневного анализа сточных вод.



1.5 Различные стандарты применяемые для калибровки БПК-датчиков

Синтетические сточные воды служат основой многих анализов связанных с определением качества воды. Их применяют для таких анализов как определение биохимического потребления кислорода (БПК), химического потребления кислорода (ХПК), TS и TSS. Так, например, при контроле анаэробных процессов определяют высокий уровень биохимического потребления кислорода (БПК) в образцах сточных вод от фабрики, обрабатывающей концентрированный каучук. Эти данные представлены в статье: [53].

Для формирования синтетических сточных вод используют различные органические и неорганические компоненты. Состав синтетических вод зависит от того, какие воды моделируются: городские сточные воды или индустриальные (промышленные) сточные воды. В городских стоках нет таких веществ, как крахмал, сахар и других легко деградируемых веществ, т.к. для очистки воды используют бактерии. Для создания более сложных органических синтетических сточных вод подходят такие компоненты как пептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт и глюкоза. Для моделирования синтетической водопроводной воды используют органические и неорганические соединения азота и фосфора.

Во многих зарубежных статьях описаны методики приготовления синтетических сточных вод, их состав и свойства. Так в статье Xiufen Li описано применение синтетической сточной воды на основе следующих компонентов: глюкоза 360 г/л, протеин 80г/л, NaHCO3 24г/л, KH2PO4 14 г/л, NH4Cl 60 г/л, CaCl2 18 г/л, MgSO4.7H2O 24 г/л. Интервал рН 7,4±0,4. Показатель ХПК составил 300±150 г/л. . [57].

Для создания синтетических сточных вод моделирующих сточные воды текстильных предприятий был выбран следующий компонентный состав: КН2РО4 8,5 г/л, К2НРО4 21,75 г/л, Na2HPO4 .7H2O 50,3 г/л, NH4Cl 0,5 г/л , NaOH 60 г/л, HCl 0,1 мл/л. А также компоненты: В - CaCl2 27,5 г/л, С - MgSO4. 7H2O 22,5 г/л, D - FeCl3.6Н2О 0,25 г/л которые обновляли каждые две недели. Приготовление синтетических сточных вод: компонент В 1 мл/л, компонент С 1 мл/л, компонент D 1 мл/л, NaOH 2 мл/л, NaCl 1,5 г/л, пептон 0,5 г/л, глюкоза 0,5 г/л, КН2РО4 0,5 г/л. [57]

Автор статьи «Practical field application of a novel BOD monitoring system» показывает возможность использования микробных топливных элементов для определения индекса БПК. Синтетические сточные воды были использованы для предварительной работы БПК-сенсора. Синтетической основой сточных вод явились следующие компоненты: 15 мг/л КН2РО4, 30 мг/л (NH4)2SO4, 50 мг/л MgSO4-7H2O, 3,75 мг/л CaCl2, 0,25 мг/л FeCl3-6H2O, 5,0 мг/л MnSO4-H2O, 105 мг/л NaHCO3 и 10 мл/л микроэлементных компонентов. Микроэлементные компоненты: 1,5 г/л нитрилотриуксусная кислоты, 0,1 г/л FeSO4 -7H2O, 0,1 г/л MnCl2-4H2O, 0,17 г/л CoCl2-6H2O, 0,1 г/л CaCl2-2H2O, 0,1 г/л ZnCl2, 0,02 г/л CuCl2-2H2O, 0,01 г/л H3BO3, 0,01 г/л MoNa2O4, 0,017 г/л Na2SeO3, 0,026 г/л NiSO4-6Н2О, 1 г/л NaCl и 0,1 г/л Na2WO4 -7H2O. Для полного формирования синтетических сточных воды добавляли соответствующие количества глюкозы и глутаминовой кислоты на базе раствора буфера с рН 7,0±0,2. Для предотвращения засорения микробных топливных элементов осадок суспензии частично фильтруется через фильтровальную бумагу (4 класс, удержание частиц диаметром: 20-25 мm, Ватман, США). После проведения измерений с использованием синтетических сточных вод система была применена к измерению БПК в реальных сточных водах из очистных сооружений в тех же экспериментальных условиях. Ответы на синтетические сточные воды были больше, чем ответы на реальные сточные воды с тем же значением БПК. Автор статьи объясняет этот факт наличием в реальных образцах моющих средств и токсических веществ [59]

Во многих зарбежных работах для колибровки БПК-биосенсора используют ОЕСD-синтетическую сточную воду. В работе [60] при создании БПК-датчика использовали OECD-синтетическую сточную воду. Для приготовления OECD-синтетической сточной воды в литре водопроводной воды растворяют следующие компоненты: 160 мг пептона, 110 мг мясного экстракта, 30 мг мочевины, 28 мг K2HPO4, 7 мг NaCl, 4 мг CaCl2 * 2H2O, 2 мг Mg2SO4 * 7H2O. Значение БПК5 для данной смеси было определено стандартным методом и составило 14000мг/л. Выбор OECD-синтетической сточной воды, а не раствора на основе глюкозы и глутаминовой кислоты, основан на том, что реальные образцы сточных вод содержат различные виды органических веществ с широким диапазоном молекулярных масс. Линейный диапазон ответа сенсора от значения БПК5 составил от 15 до 260 мг/л. После калибровки датчика с использованием OECD-синтетических сточных вод, был проведен анализ реальных образцов сточных вод. Средний коэффициент корреляции составил 0, 8713.

Таким образом, актуальным направлением применения биосенсоров может являться анализ интегральных характеристик водных сред. Как видно из представленных в обзоре данных, биосенсорная детекция БПК является достаточно развитым направлением аналитической биотехнологии. Биосенсорные анализаторы БПК представляют собой надежные аналитические инструменты и с успехом используются для контроля водных экосистем наряду с традиционными методами определения БПК.

В то же время в Российской Федерации отсутствует опыт промышленного выпуска анализаторов этого типа, а исследования по данной проблеме начали проводиться сравнительно недавно и не продемонстрировали существенных успехов.

Следует отметить, что несмотря на полученные зарубежными исследователями положительные результаты, поиск новых решений, обеспечивающих более высокую точность оценки индекса БПК, оперативность и воспроизводимость анализа, продолжаются.

Основными тенденциями являются повышение стабильности, увеличение степени корреляции данных, полученных биосенсорным методом, с данными, полученными стандартным методом оценки БПК.



2. Экспериментальная часть

2.1 Культивирование клеток микроорганизмов

Для работы использовали: клетки штамма Debaryamyces hansenii BKM-Y-2482, полученные во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН (Пущино). Клетки штамма Debaryamyces hansenii BKM-Y-2482 выращивали на богатой минеральной среде (жидкая глюкозо-пептонная питательная среда). Состав жидкой среды: глюкоза - 10 г/дм3, пептон - 5 г/дм3, дрожжевой экстракт - 0,5 г/дм3 (Sigma, США). Среду для выращивания клеток стерилизовали автоклавированием при давлении в 1 атмосферу в течение 45 минут. Клетки выращивали аэробно 18-20 часов в качалочных колбах объемом 750 см3 при температуре 29 оС. Затем полученную биомассу центрифугировали при комнатной температуре при 8000 об/мин 10 минут. Далее центрифугат промывали 20 мМ фосфатным буфером рН 6,8. Осевшие клетки рассуспендировали в свежей порции буфера, распределяли по порциям и осаждали на центрифуге «Eppendorf» 5 минут при 8000 об/мин. Промытую биомассу взвешивали и хранили в микропробирках при температуре -25 С.

2.2 Иммобилизация клеток Debaryamyces hansenii в модифицированный ПВС

Для формирования рецепторного элемента к 40 мг дрожжей Debaryamyces hansenii добавляли 200 мкл модифицированного ПВС. Для распределения дрожжей в пленки проводили встряхивание в течение 5 минут на центрифуге «Sky Line». Полученную субстанцию переносили на предметное стекло и оставляли на воздухе до полного высыхания. Последующие измерения проводились при комнатной температуре.



2.3 Биосенсорные измерения

Принцип работы микробного сенсора на основе кислородного электрода основан на том, что при окислении субстрата иммобилизованными на поверхности кислородного электрода микроорганизмами возрастает их дыхательная активность, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода (рис.11).

Рис. 11 - Схема биосенсора кюветного типа

Основным элементом биосенсорного анализатора является кислородный электрод Кларка, на поверхности которого располагали рецепторный элемент.

Рис. 12 - Электрод с рецепторным элементом: 1 - раствор KCl - 30 мМ, 2 - защитный колпачок, 3 - рецепторный элемент, 4 - платиновый электрод, 5 - полупроницаемая целлофановая мембрана

В качестве преобразователя использовали многофункциональный анализатор Эксперт-001, в режиме «термооксиметр», что позволило производить непрерывную регистрацию сигнала.

Рис. 13 - Внешний вид лабораторной модели микробного биосенсора кюветного типа

Управление прибором проводилась с помощью встроенной программы «EXP2PR». Перед непосредственным измерением проводили промывку системы натрий-калиевым фосфатным буферным раствором рН = 6,8 (концентрация солей 33 мМ). Ввод пробы осуществлялся автоматическими микропипетками переменного объема (1-10мкл, 20-200мкл, 200-1000мкл, 1-5 мл) («ЛИНПИПЕТ» Россия) После окончания измерений систему снова промывали буферным раствором в течение 3 мин., до восстановления начальных параметров (концентрации кислорода).

Обработка данных проводилась в программе Exel. В ходе измерения на мониторе компьютера отображались изменения параметров системы, таких как зависимость концентрации кислорода от времени. Измеряемым параметром (ответом биосенсора) являлась максимальная скорость изменения выходного сигнала биосенсора при добавлении субстратов.

2.4 Заполнение и проверка качества электрода

Кислородный электрод заполняли 30 мМ раствором хлорида калия. Полупроницаемая мембрана электрода - целлофан. Проверка качества электрода осуществлялась с помощью свежеприготовленного 20% раствора сульфита натрия. Данная операция носит название сульфидный тест.

При растворении сульфита натрия в воде происходит восстановление свободного кислорода по реакции:

2 Na2SO3+O2=2Na2SO4

Электрод подключали к прибору «Эксперт-001» в режиме «термоокиметр» в кювету добавляли 20% раствор сульфита натрия и запускали процесс измерения пробы. Критерием пригодности электрода к измерениям являлось снижение содержания кислорода в кювете до 0 мг/дм3.

2.5 Формирование рецепторного элемента

Полученную пленку разрезали на одинаковые части размером 3Ч3 мм. Биорецепторный элемент помещали на поверхность кислородного электрода типа Кларка и фиксировали с помощью капроновой сетки.

2.6 Определение БПК5 методом разбавления

Определение БПК стандартным методом проводили по методике описанной в ПНДФ [61]. Для определения БПК образцов браги проводили предварительное разбавление, сточные воды анализировали без предварительного разбавления.

2.6.1 Приготовление разбавляющей воды и растворов

Приготовление разбавляющей воды

Разбавляющую воду готовят из дистиллированной воды, полученной накануне анализа, выдержанной при температуре 20 °С; ее насыщают кислородом воздуха, аэрируя до концентрации растворенного кислорода не менее 8 мг/дм3 и не более 9мг/дм3. В разбавляющую воду добавляют фосфорные и аммонийные соли, гексагидрат хлорида железа, хлорид кальция и сульфат магния для создания устойчивой буферной системы, которая позволяет поддерживать постоянное значение рН в течение любого времени инкубации, не изменяющееся при выделении СО2 (продукт метаболизма бактерий).

Растворы солей для приготовления разбавляющей воды

Фосфатный буферный раствор рН = 7,2: 8,5 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4), 21,75 г двузамещенного фосфорнокислого калия (K2HPO4), 33,4 г двузамещенного фосфорнокислого натрия 7-водного (Na2HPO4·7H2O) и 1,7 г хлорида аммония (NH4Cl) растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до 1 дм3.

Сульфат магния: 22,5 г MgSO4·7H2O ч.д.а. растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 1 дм3.

Хлорид железа: 0,25 г. FeCl3·6H2O ч.д.а. растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 1 дм3.

Хлорид кальция: 27,5 г. CaCl2 ч.д.а. безводного растворяют в дистиллированной воде, доводят объем до 1 дм3.

Растворы хранят в темноте, при комнатной температуре не более месяца. Не используют при появлении осадка.

В день анализа к 1 дм3 разбавляющей воды прибавляют 1 см3 фосфатного буферного раствора, 1 см3 раствора сульфата магния, 1 см3 раствора хлорида кальция, 1 см3 раствора хлорида железа.

Заражение микрофлорой.

В разбавляющую воду в день анализа добавляют бактериальную затравку. (При анализе сточных вод сооружений биологической очистки такой затравки не требуется). Бактериальную затравку добавляют при исследовании искусственно приготовленных растворов, производственных сточных, олиготрофных поверхностных пресных, грунтовых, глубоко очищенных и обеззараженных сточных вод.

Бактериальная затравка может отбираться из разных источников, приготовлений разбавляющей воды используется один из предлагаемых вариантов:

а) Сточные воды с городских сооружений биологической очистки, отобранные после песколовок. Добавляют 0,3-1,0 см3 на 1 дм3 разбавляющей воды.

б) Аквариумная вода. Добавляют 5,0-10,0 см3 на 1 дм3 разбавляющей воды.

в) Речная вода. Добавляют 10,0-20,0 см3 на 1 дм3 разбавляющей воды.

Проверка степени чистоты разбавляющей воды холостым опытом. При определении БПК5 две кислородные колбы заполняют разбавляющей водой, в первой определяют кислород сразу в день исследования («нулевой» день), время между разбавлением пробы и определением кислорода в «нулевой» день не должно превышать 15 мин. В во второй, которую помещают в термостат вместе с анализируемыми пробами, - через 5 суток.

Разница средней концентрации кислорода в пробе холостого опыта нулевого дня и через 5-суточный срок инкубации не должна превышать 0,5 мг/дм3 кислорода.

2.6.2 Выполнение измерений с разбавлением пробы

Для загрязненных речных и сточных вод с БПК5 выше 6 мг/дм3 требуется предварительное разбавление пробы. Определение производят в разбавленной пробе по разности содержания кислорода до и после инкубации в стандартных условиях. Для разбавления пробы применяют искусственно приготовленную разбавляющую воду (п. 3.5.1). При приготовлении разбавлений температура исследуемой пробы должна соответствовать температуре 18-20 °С.

Для расчета необходимых разбавлений пробы следует ожидаемое содержание БПК в пробе разделить на 4-5 (поскольку в воде после инкубации при правильном разбавлении должно остаться 4-5 мг/дм3 кислорода). Если нельзя предположить ожидаемое разбавление рассчитывается по результатам определения пермонганатной окисляемости (ХПК). Условно принимают биохимическое потребление кислорода 50% ХПК, а поскольку в воде после инкубации должно остаться 4-5 мг/дм3 кислорода, вычисленное значение (ХПК:2) делят на 4 или 5. Полученный результат показывает, во сколько раз надо разбавить анализируемую воду.

В мерную колбу вместимостью 1 дм3 наливают хорошо перемешанную испытуемую жидкость, отбирают пипеткой определенный объем и вносят в другую колбу (цилиндром отмеряются объемы больше 50 см3). Затем доливают до метки разбавляющей водой и хорошо перемешивают; полученную смесь сифоном, опущенным до дна колбы, наливают в шесть кислородных колб объемом 250 см3, закрывают пробкой, следя за тем, чтобы внутри не осталось пузырьков воздуха. Затем оставшейся смесью заполняют колпачки от колб и, наклонив колбу, вставляют их в колпачки с водой, вытесняя из них воду, чтобы не осталось пузырьков воздуха. Для каждого разбавления заполняют две колбы.

В первых двух кислородных колбах немедленно определяют кислород. Все остальные колбы помещают в термостат при 20 °С для инкубации.

Через 2, 5 сут от начала инкубации вынимают из термостата по две колбы с испытуемой водой, определяют в них растворенный кислород и содержание нитритов.

2.6.3 Расчет БПК при определении с разбавлением пробы

X = [(Cx1 - Cx2) - (Cy1 - Cy2)] N,

где, X - БПК, мг/дм3;

Сx1 - содержание растворенного кислорода в исследуемой воде до инкубации, мг/дм3;

Сx2 - то же, после инкубации, мг/дм3;

Сy1 - содержание растворенного кислорода в разбавляющей воде до инкубации, мг/дм3;

Сy1 - то же, после инкубации, мг/дм3;

N - величина разбавления.

2.7 Определение перманганатной окисляемости

Определение перманганатной окисляемости проводили согласно ПНДФ [62]. Метод основан на окислении веществ, присутствующих в пробе воды, известным количеством перманганата калия в сернокислой среде при кипячении в течение 10 минут. Не вошедший в реакцию перманганат калия восстанавливают щавелевой кислотой. Избыток щавелевой кислоты оттитровывают раствором перманганата калия.

При определении перманганатной окисляемости после реакции должно оставаться не менее 40 % введенного перманганата калия, так как степень окисления зависит от его концентрации.

Для получения достоверных и сравнимых между собой результатов необходимо строго придерживаться условий проведения анализа.

2.7.1 Подготовка дистиллированной воды

Перед использованием воду проверяют на отсутствие восстановителей. При холостом опыте расход раствора перманганата калия на титрование не должен превышать 0,5 см3, в противном случае следует провести процедуру очистки или использовать воду с меньшим содержанием органических соединений.

Для очистки от восстановителей к 1 дм3 дистиллированной воды добавляют 10 см3 серной кислоты (1:15) и небольшой избыток (до образования розового цвета) основного раствора перманганата калия, а затем перегоняют. Первую порцию дистиллята объемом 100 см3 отбрасывают. Перегнанную дистиллированную воду хранят в стеклянной бутыли со стеклянной пробкой.

Приготовление растворов вели согласно методике прописанной в ПНДФ [62].

2.7.2 Выполнение измерений

В колбу помещают 100 см3 хорошо перемешанной пробы (при необходимости разбавленной дистиллированной водой до 100 см3), несколько капилляров или стеклянных шариков, приливают 5 см3 разбавленной серной кислоты (1:3) и 10 см3 раствора перманганата калия (0,01 моль/дм3 эквивалента). Смесь нагревают так, чтобы она закипела не позднее чем через 5 минут, и кипятят 10 ± 2 мин, закрыв маленькой конической воронкой для уменьшения испарения. Если в процессе кипячения содержимое колбы потеряет розовую окраску или побуреет, то определение надо повторить, разбавив исследуемую воду. К горячему раствору (80 - 90 °С) прибавляют 10 см3 раствора щавелевой кислоты (0,01 моль/дм3 эквивалента). Обесцвеченную горячую смесь титруют раствором перманганата калия (0,01 моль/дм3 эквивалента) до слабо-розового окрашивания. Если при титровании пробы расходуется перманганата калия более 60 % от добавленного количества, т.е. если при обратном титровании израсходовано более 7 см3 раствора титранта, то пробу разбавляют и повторяют определение.

Если при анализе предварительно разбавленной пробы на титрование расходуется менее 2 см3 раствора перманганата калия, то определение повторяют с менее разбавленной или неразбавленной пробой.

Холостое определение

Одновременно проводят холостой опыт со 100 см3 дистиллированной воды и обрабатывают ее так же, как анализируемую воду. Расход раствора перманганата калия при холостом определении не должен превышать 0,5 см3. В противном случае проводят дополнительную очистку используемой дистиллированной воды и посуды.

2.7.3 Обработка результатов эксперимента

Величину перманганатной окисляемости, выраженную в мгО/дм3, рассчитывают по формуле:

где V1 - объем раствора перманганата калия (0,01 моль/дм3 эквивалента), израсходованного на титрование исследуемой пробы, см3;

V2 - объем раствора перманганата калия (0,01 моль/дм3 эквивалента), израсходованного на титрование холостой пробы, см3;

V - объем пробы, взятой для анализа (100), см3;

N - коэффициент разбавления пробы;

8 - эквивалент кислорода.

2.8 Результаты определения перманганатной окисляемости и расчет величины разбавления

Для определения перманаганатной окисляемости проведено предварительное разбавление образцов браги. Образец №1 (до начала бражения) разбавлен в 500 раз, образец №2 (24 часа от начала брожения) - в 500 раз, образец №3 (48 часов от начала брожения) - в 500 раз, образец №4 (72 часа от начала брожения) разбавлен в 750 раз.

Расчет перманганатной окисляемости

X№1: 880 ± 90, мгО/дм3 (P = 0,95)



X№2:1500 ± 100, мгО/дм3 (P = 0,95)

X№3: 1600 ± 200, мгО/дм3 (P = 0,95)

X№4: 480 ± 50, мгО/дм3 (P = 0,95)

Применяя то, что перманганатная окисляемость составляет 50% от ХПК, и остаточный кислород в кювете должен составлять 4-5 мг/л, то предварительное разбавление для определения БПК для образца №1 нужно провести в 200 раз. Образец №2 необходимо разбавить в 300 раз, образец №3 - в 350 раз, образец №4 нужно разбавить в 100 раз.

3. Обсуждение результатов

Анализ литературных данных показывает, что наиболее экспрессным методом определения БПК является метод на основе биосенсора. Для калибровки БПК-датчиков используют различные стандарты. В связи с этим, целью наших исследований был подбор оптимального стандарта для калибровки датчика БПК-биосенсора.

Для формирования рецепторного элемента сенсора использовали дрожжевой штамм Debaryamyces hansenii ВКМ Y-2482. Согласно литературным данным штамм обладает широкой субстратной специфичностью и способен окислять многие спирты, углеводы, аминокислоты и другие органические вещества [статьи про дрожжи]. Также штамм Debaryamyces hansenii устойчив к высоким концентрациям солей и к высокому осмотическому давлению. Данные особенности позволяют использовать данный штамм для анализа технологических сточных.

Формирование рецепторного элемента проведено включением клеток микроорганизмов в гель модифицированного поливинилового спирта (ПВС).

3.1 Определение характеристик макета БПК-биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС на основе ГГС и ОЕСD

Операционная стабильность

Операционная стабильность является одной из важнейших характеристик биосенсора. Она показывает устойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата при проведении большого числа последовательных измерений и тесно связана с метрологической характеристикой сходимостью (повторяемостью).

Операционная стабильность сенсоров характеризуется относительным стандартным отклонением при многократном измерении стандартного образца и остаточной активностью (% от исходной) биосенсора после нескольких последовательных измерений в течение определенного периода времени.

Операционная стабильность на основе ГГС

Для определения операционной стабильности на основе ГГС было проведено 15 последовательных измерений ответа сенсора на 20 мкл 3 г/дм3 раствора глюкозо-глутаматной смеси (ГГС) (концентрация в кювете 19,9 мг/дм3). Смесь ГГС была выбрана, так как её применение как стандарта при анализе БПК определено в ПНДФ [61].

При введении субстрата в измерительную ячейку микроорганизмы окисляют его. При этом возрастает дыхательная активность клеток, и в приэлектродном пространстве снижается концентрация кислорода, что регистрируется с помощью электрода Кларка (рис.13). На монитор выводится графическое отображение изменения концентрации кислорода от времени (рис. 14). По полученному отклику вычисляется ответ сенсора как максимальная скорость изменения концентрации кислорода от времени (первая производная).

Рис. 14 - Ответ биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii, иммобилизованного в модифицированный ПВС на добавление 35 мкл ГГС 

Время между последовательными измерениями составляло около 7 минут. Данные по операционной стабильности были получены на четвертый день после иммобилизации. Результаты представлены на рисунке 15 и в таблице 2

Рис. 15 - Операционная стабильность биосенсора на основе иммобилизированных клеток Debaryamyces hansenii

Таблица 2 - Данные по операционной стабильности на основе ГГС

	Стандартное отклонение S, мг/(дм3•мин)	Относительное стандартное отклонение Sr, %
Обсчет в ручную	6,611•10-3	2,4
Обсчет в Excel	6,611•10-3	2,4

Операционная стабильность на основе OECD

Для определения операционной стабильности на основе ГГС было проведено 15 последовательных измерений.



Таблица 3 - Данные по операционной стабильности на основе ОЕСD

	Стандартное отклонение S, мг/(дм3•мин)	Относительное стандартное отклонение Sr, %
Обсчет в ручную	5,332•10-3	2,7
Обсчет в Excel	5,332•10-3	2,7

Данные операционной стабильности представлены на рис. 16

Рис. 16 - Операционная стабильность биосенсора на основе иммобилизованных клеток Debaryamyces hansenii

Как видно из графиков ответы изучаемых биорецепторов оставались стабильными на протяжении всех 15 измерений. Стандартное отклонение, рассчитанное с помощью двух программ и вручную (приложение 1), составило 6,611•10-3 мг/(дм3•мин) на основе ГГС, относительное стандартное отклонение - 2,4%, среднее значение равняется 0,272 ±0,004 мг/(дм3•мин). С использованием стандарта ОЕСD стандартное отклонение составило 5,332•10-3 .относительное стандартное отклонение - 2,7%, среднее значение равняется 0,198 ±0,003 мг/(дм3•мин).

Устойчивость ответа сенсора на одну и ту же концентрацию субстрата с использованием двух стандартов составляет менее 3% и различается незначительно.

Долговременная стабильность на основе ГГС

Долговременная стабильность является характеристикой самого рецепторного элемента. Она зависит от природы биомассы и от способа иммобилизации клеток. Долговременная стабильность характеризует устойчивость работы сенсора в течение длительного периода времени.

Долговременную стабильность определяли путём ежедневного определения величины ответа сенсора на одну и ту же концентрацию раствора глюкозо-глютаматной смеси (рис. 17). Между измерениями сенсор хранился в буферном растворе при температуре 20 єС. За время стабильной работы рецепторного элемента принимали время, в течение которого величина сигнала составляла не менее 30% от начальной. Для определения долговременной стабильности микробных сенсоров использовали ГГC тех же концентраций, что и для определения операционной стабильности. За 100% принимается ответ биосенсора в первый день измерений.

Рис. 17 - Долговременная стабильность биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii



В первый день после формирования рецепторного элемента дорожи D. hansenii иммобилизованные в модифицированный поливиниловый спирт имеют низкую активность. К четвертому дню активность возрастает (на %) что можно объяснить адаптацией микроорганизмов к изменившимся условиям внешней среды. К пятому дню дыхательная активность иммобилизованных дрожжей стабилизируется. Высокая активность клеток D. hansenii сохраняется до 36 дня посли формирования рецепторного элемента. К 43 дню активность дрожжей упала на 21 % от первоначальной, а к 46 дню снизилась до 75 %. Таким образом долговременная стабильность рецепторного элемента на основе дрожжей Debaryamyces hansenii иммобилизованных в модифицированный ПВС составила 43 дня.

Определение зависимости ответа биосенсора от концентрации

Для получения количественной информации о содержании анализируемых веществ в образце необходимо знать калибровочные характеристики биосенсора, то есть зависимость аналитического сигнала от концентрации в случае использования ГГС - стандарта, и зависимость аналитического сигнала от БПК в случае ОЕСD - стандарта. Поэтому градуировочная зависимость ответа сенсора от концентрации (БПК) определяемого вещества является важнейшей метрологической характеристикой.

Зависимость ответа сенсора от концентрации на основе ГГС

По полученным экспериментальным данным была построена градуировочная зависимость отклика биосенсора от концентрации ГГС в измерительной кювете.



Рис. 18 - Зависимость ответа сенсора от концентрации субстрата

Биорецепторы на основе целых клеток микроорганизмов относятся к каталитическому типу, т.е. биологический ответ в таких системах обеспечивается ферментативными реакциями микроорганизмов. Поэтому зависимость, приведенная на рис. 18 хорошо описывается уравнением типа Михаэлиса-Ментен:

, где

Rmax - максимальная скорость потребления кислорода иммобилизованными микроорганизмами, при которой все молекулы фермента участвуют в образовании фермент-субстратного комплекса. Достигается при [S]>?; - скорость.

КM - эффективная константа Михаэлиса численно равна концентрации субстрата, при которой скорость ферментативной реакции достигает половины максимального значения (R=Rmax/2).

Была произведена аппроксимация зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен. Параметры были рассчитаны с помощью программы Sigma Plot (см. приложение 2). Параметры уравнения для биосенсоров на основе используемых штаммов приведены в таблице 3.

Таблица 4 - Параметры уравнения Михаэлиса - Ментен зависимости ответа сенсора от концентрации ГГС

Эффективная константа Михаэлеса КґМ,мг/дм3	Максимальная скорость потребления кислорода Rmax, мг/(мин•дм3)	Коэффициент смешанной корреляции R
44±2	2,37±0,06	0,9936

Полученные зависимости величины ответа сенсора от концентрации субстрата имеют гиперболический вид.

Согласно уравнению Михаэлиса - Ментен концентрация субстрата будет пропорциональна отклику биосенсора только при концентрациях, гораздо меньших KM. Тогда уравнение приобретает следующий вид:

Для снижения ошибок анализа нередко ограничиваются использованием линейного участка градуировочной кривой.

Верхняя граница линейной зависимости была определена из уравнения Михаэлеса-Ментен. Численное значение верхней границы определяемых концентраций равно константе Михаэлеса, Кґм. Итак, верхняя граница определяемых концентраций клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт, составляет 44±2 мг/дм3.

Далее были проведены дополнительные опыты по определению зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата на линейном участке градуировочной прямой. По полученным данным построен график зависимости ответа сенсора от концентрации ГГС. (рис. 19)

Рис. 19 - Линейный участок зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата

Обсчет уравнения прямой был сделан с помощью двух программ и вручную (приложение 2). Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок зависимости ответа сенсора от концентрации субстрата для биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС, представлены в таблице 4

Таблица 5 - Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок калибровочной зависимости: R = aЧC + b

параметры	Sigma Plot	Excel	Ручной обсчет
коэффициент чувствительности а, мин-1	0,031±0,008	0,031±0,008	0,031±0,008
Коэффициент b, мг/(мин•дм3)	0,12±0,04	0,12±0,04	0,12±0,04
Уравнение прямой	R=0,031ЧC+0,12	R=0,031ЧC+0,12	R=0,031ЧC+0,12
Коэффициент корреляции R	0,9946	0,9949	0,9948

Верхняя граница линейной зависимости была определена из уравнения Михаэлеса-Ментен. И составляет 44±2 мг/дм3 на основе ГГС-стандарта.

Зависимость ответа сенсора от концентрации для ОЕСD- синтетических сточных вод

О содержании анализируемых веществ в образце необходимо знать калибровочные характеристики биосенсора, то есть зависимость аналитического сигнала от БПК.

По полученным экспериментальным данным была построена градуировочная зависимость отклика биосенсора от БПК в измерительной кювете.

Рис. 20 - Зависимость ответа сенсора от БПК

Была произведена аппроксимация зависимости ответа сенсора от БПК субстрата с помощью уравнения Михаэлиса - Ментен. Параметры были рассчитаны с помощью программы Sigma Plot (см. приложение 2). Параметры уравнения для биосенсоров на основе используемых штаммов приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Параметры уравнения Михаэлиса - Ментен калибровачной зависимости

Эффективная константа Михаэлеса КґМ,мг/дм3	Максимальная скорость потребления кислорода Rmax, мг/(мин•дм3)	Коэффициент смешанной корреляции R
1,21±0,08	0,9±0,2	0,9962

Полученные зависимости величины ответа сенсора от БПК имеют гиперболический вид.

Далее были проведены дополнительные опыты по определению зависимости ответа сенсора от БПК на линейном участке градуировочной прямой. По полученным данным построен график зависимости ответа сенсора от БПК. (рис. 21)

Рис. 21 - Линейный участок зависимости ответа сенсора от БПК

Обсчет уравнения прямой был сделан с помощью двух программ и вручную (смотри приложение 2). Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок зависимости ответа сенсора от БПК для биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii иммобилизованных в модифицированный поливиниловый спирт представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Параметры уравнения прямой, аппроксимирующей линейный участок калибровочной зависимости для OECD-синткетических сточных вод: R = aЧC + b

параметры	Sigma Plot	Excel	Ручной обсчет
коэффициент чувствительности а, мин-1	0,56±0,02	0,56±0,02	0,56±0,02
Коэффициент b, мг/(мин•дм3)	0,03±0,04	0,03±0,04	0,03±0,04
Уравнение прямой	R=0,56ЧC+0,03	R=0,56ЧC+0,03	R=0,56ЧC+0,03
Коэффициент корреляции R	0,9940	0,9948	0,9948

Высокие значения коэффициента корреляции рецепторного элемента характеризует то, что выбранный участок с большой достоверностью может быть аппроксимирован линейной зависимостью.

С использованием ОЕСD - синтетических сточных вод верхняя граница определяемых БПК составляет 1,21±0,08 мг/дм3.

Коэффициент чувствительности биосенсора

Простейшей численной характеристикой чувствительности служит коэффициент чувствительности. Он определяется как производная аналитического сигнала по концентрации определяемого компонента:

Если градуировочная функция линейна (R=аЧC+b), то коэффициент чувствительности - это тангенс угла наклона градуировочной прямой a. Чем выше коэффициент чувствительности, тем меньшие количества компонента можно обнаруживать и определять, получая один и тот же аналитический сигнал, тем точнее можно определить одно и то же количество вещества.

В настоящей работе чувствительность сенсоров находили как тангенс угла наклона калибровочной прямой в координатах ответ сенсора - концентрация субстрата. При использовании ГГС-стандарта чувствительность составила 0,031±0,008 мин-1. При применение ОЕСD - синтетических сточных вод для калибровки БПК-датчика чувстительность составила 0,56±0,02 мин-1. Таким образом чувствительность сенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii к OECD-синтетическим сточным на порядок превышает чувствительность к ГГС.

В случае амперометрических биосенсоров повысить чувствительность датчика оказывается, возможно путем увеличения количества иммобилизованного фермента либо за счет увеличения истинной поверхности индикаторного электрода на микро уровне (увеличение фактора шероховатости) [63].

Однако использование величины а для описания чувствительности имеет ряд недостатков. Во-первых, коэффициент чувствительности -величина размерная, поэтому сопоставление коэффициентов чувствительности для принципиально разных (различающихся природой аналитического сигнала) методов невозможно. Во-вторых, сопоставление величин а даже одинаковой размерности имеет смысл действительно только "при прочих равных условиях", т.е. в первую очередь при одинаковой точности измерения аналитических сигналов. Поэтому для характеристики чувствительности используют еще две величины, называемые пределом обнаружения и нижней границей определяемых содержаний.

Предел обнаружения

Предел обнаружения (Cmin) - это наименьшее содержание вещества которое может быть обнаружено данной методикой с заданной степенью достоверности. Таким образом, предел обнаружения характеризует методику с точки зрения возможностей качественного анализа.

Предел обнаружения соответствует наименьшей концентрации, которая дает сигнал, отличимый от значения холостого опыта. При доверительной вероятности Р = 0,95 данный параметр можно определить по формуле:

, где

S0 - стандартное отклонение холостого опыта, а - коэффициент чувствительности

Из этой формулы следует, что предел обнаружения зависит не только от коэффициента чувствительности а, но и от S0, т.е. точности измерения аналитических сигналов. Чем она выше, тем меньше Сmin. Также величина предела обнаружения имеет одну и ту же размерность - концентрации - независимо от природы аналитического сигнала.

Стандартное отклонение холостого опыта рассчитывалось для семи последовательных измерений. Производили регистрацию отклика биосенсора на 50 мкл дистиллированной воды. Ответ сенсора определяли как первую производную отклика.

Результаты холостого опыта приведены в таблице 8. Расчеты минимального предела обнаружения приведены в приложении 3.

Таблица 8 - Результаты холостого опыта биосенсора на основе иммобилизированных клеток Debaryamyces hansenii в пленку из сополимера ПВС с ПВП.

Номер опыта	Ответ сенсора, мг/(мин•дм3)
1	0,0288
2	0,02634
3	0,03222
4	0,02742
5	0,03144
6	0,02622
7	0,0321

Таким образом, минимальный предел обнаружения ГГС биосенсором на основе клеток Debaryamyces hansenii иммобилизованных в ПВС составил 0,02 мг/дм3. минимальный предел обнаружения OECD составил 0,01 мг/дм3.

3.1.6 Нижняя граница определяемых содержаний

Для характеристики возможностей методики с точки зрения количественного анализа используют величину, называемую нижней границей определяемых содержаний (Cн). Это минимальное содержание компонента, которое можно определить с заданной степенью точности, характеризуемой предельно допустимой величиной относительного стандартного отклонения. Очевидно что Сн > Cmin.

Для нахождения Сн определили ряд значений стандартного отклонения при различных БПК Sr(БПК), по полученным значениям построили экспериментальную зависимость относительного стандартного отклонения от БПК (имеющую вид убывающей кривой - обычно близкой к гиперболе) и нашли БПК, начиная с которой величины Sr(БПК) становятся меньше, чем заданное предельное значение Sr(C)max = 0,33[64].

Нижняя граница определяемых содержаний по ГГС

Для расчета нижней границы использовали грудуировку в коордринатах ответ сенсора - БПК. Пересчет проводили по формуле:

БПК=0,687ЧС(ГГС)

Детальный расчет нижней границы определяемых содержаний приведен в приложении 3.

На рисунке 22 представлен результат аппроксимации зависимости относительного стандартного отклонения от БПК(ГГС)



Рис. 22 - Экспериментальная зависимость относительного стандартного отклонения ответа биосенсора от БПК (ГГС)

Нижняя граница определяемых содержаний для ОЕСD

На рисунке 23 представлен результат аппроксимации зависимости относительного стандартного отклонения от БПК (ОЕСD)

Рис. 23 - Экспериментальная зависимость относительного стандартного отклонения ответа биосенсора от БПК (ОЕСD)



Таким образом нижняя граница определяемых содержаний БПК на основе ГГС-стандарта составила 0,157 мл О2/дм3, а нижняя граница определяемых содержаний БПК на основе OECD-стандарта составила 0,05 мл О2/дм3.

Применение OECD-стандарта позволит анализировать образцы с очень низким значением БПК.

Рабочий диапазон

Для любого аналитического метода важно знать диапазон концентраций определяемого вещества, в котором этот метод работает - рабочий диапазон. Рабочий диапазон определяется из калибровочной зависимости биосенсора. Рабочий диапазон не всегда ограничен лишь линейным участком, но для снижения ошибок анализа ограничиваются использованием линейного участка калибровочной зависимости (линейный диапазон).

Для калибровочных зависимостей гиперболического вида линейный диапазон ограничен снизу нижней границей определяемых содержаний, сверху - концентрацией, равной КМ. Так для биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от концентрации ГГС составил 0,23 - 44 мг/дм3. Учитывая, что теоретическая зависимость БПК от концентрации ГГС имеет вид: БПК = 0,687ЧС, линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК составил 0,16 - 30 мг/дм. Для биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii иммобилизированного в модифицированный ПВС линейный диапазон зависимости ответа биосенсора от БПК (ОЕСD-синтетических сточных вод) составил 0,05 -1,21мг/дм3 .

При калибровке БПК-датчика по ГГС-стандарту диапазон линейности в 30 раз превышает диапазон линейности в случае калибровки по OECD-синтетическим сточным водам.



3.2 Экспрессность биосенсора

Важной аналитической характеристикой любого метода является его экспрессность, т.е. быстрота проведения анализа. Временные затраты метода определяются в первую очередь длительностью единичного измерения. Для биосенсора этот параметр складывается из времени развития ответа и времени восстановления активности рецепторного элемента (промывки сенсора). Для биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в ПВС, на развитие ответа сенсора требуется 1-2 минуты в зависимости от концентрации субстрата, время восстановления активности рецепторного элемента после измерения (промывание) - 3-5 минут. Таким образом, длительность одного измерения 4-7 минут.

3.3 Анализ образцов вод

Проведен анализ реальных образцов воды и полупродуктов брожения с использованием разработанного макета БПК-биосенсора и стандартным методом разбавления.

Определение БПК5 образцов вод стандартным методом разбавления проводилось согласно действующим в РФ нормативным документам [61]. Содержание растворенного кислорода до и после пятидневной инкубации определялось с помощью анализатора жидкости «Эксперт - 001».

3.3.1 Анализ образцов, калибровка БПК-датчика по ГГС-стандарту

Для определения БПК анализируемых образцов воды по ГГС-стандарту с помощью биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС была построена градуировочная зависимость в координатах ответ сенсора - БПК:



БПК = 0,68ЧC(ГГС)

R = 0,031C(ГГС) +0,12

После ряда математических операций было получено уравнение зависимости ответа сенсора от БПК:

БПК = 22,14R-2,67

Рис. 24 - Зависимость ответа сенсора от БПК по ГГС

Образцы воды (Упа, парк, талые) анализировали без предварительного разбавления. Объем вносимых образцов (Упа и талые воды) составил 200 мкл, а для образца «парк» - 400 мкл.

При непосредственном определении БПК с помощью биосенсора проводили предварительное разбавление образцов браги. Величина разбавления подбиралась таким образом, чтобы ответ сенсора лежал внутри линейного участка калибровочной зависимости. Для образца браги №1 проведено разбавление в 50 раз, образца браги №2 - 70 раз, образца браги №3 - 85 раз, а для образца №4 - 25 раз. Объем образцов вносимых в кювету составил 250 мкл.



3.3.2 Анализ образцов, калибровка БПК-датчика по OECD-стандарту

Аналогично, для определения БПК по ОЕСD сточных вод с помощью биосенсора на основе иммобилизованных клеток Debaryamyces hansenii была построена градуировочная зависимость в координатах ответ сенсора - БПК:

R = 0,56БПК +0,03

БПК = 1,77 R - 0,05

Рис. 25 - Зависимость ответа сенсора от БПК по OECD

Образцы воды (Упа, парк, талые) анализировали без предварительного разбавления. Объем вносимых образцов составил 100 мкл.

При непосредственном определении БПК5 с помощью биосенсора проводили предварительное разбавление образцов браги. Величина разбавления подбиралась таким образом, чтобы ответ сенсора лежал внутри линейного участка калибровочной зависимости. Для образца браги №1 проведено разбавление в 50 раз, образца браги №2 - 70 раз, образца браги №3 - 85 раз, а для образца №4 - 25 раз. Объем образцов вносимых в кювету составил 100 мкл.

Результаты измерения БПК анализируемых образцов с использованием биосенсора на основе клеток Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС, представлены в таблице 9

Таблица 9 - Результаты измерения БПК полученные с использованием биосенсора и стандартным методом

Анализируемые образцы сточных вод	БПК, измеренное с помощью биосенсора по ГГС, мг/дм3	БПК, измеренное с помощью биосенсора по ОЕСD, мг/дм3	БПК5, измеренное стандартным методом, мг/дм3
Вода из р. Упа	7,8±0,6	8,0±0,1	7,6±0,8
Вода из парка	2,7±0,7	2,5±0,1	2,4±0,3
Талая вода	3,0±0,5	3,2±0,2	3,0±0,3
Образец №1 до брожения	1030±70	1100±20	1100±100
Образец №2 24 ч от начала брожения	1480±90	1590±20	1500±100
Образец №3 48 ч от начала брожения	1740±70	1670±20	1700±100
Образец №4 72 ч от начала брожения	530±20	596±9	600±80

По методике ПНДФ [61] допускается ошибка в определении БПК5 не более 11%.

Таким образом, значение БПК, определенное с помощью биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii иммобилизованного в модифицированный ПВС совпадает со значением БПК, полученными стандартным методом с учетом доверительных интервалов.

Применение OECD-синтетических сточных вод в качестве стандарта для калибровки БПК-датчика позволяет на порядок повысить чувствительность сенсора, в сравнении с применением в качестве стандарта глюкозо-глутаматной смеси. Данная особенность позволяет анализировать образцы сточных вод с низкими значениями БПК.

Выводы

Определены аналитические и метрологические характеристики БПК-биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii иммобилизованного в химически модифицированный ПВС на основе двух стандартов. Относительное стандартное отклонение операционной стабильности для обоих стандартов составляет менее 3%. Долговременная стабильность рецепторного элемента составила 43 дня. Чувствительность сенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii к OECD-синтетическим сточным водам на порядок превышает чувствительность к ГГС. При калибровке БПК-датчика по ГГС-стандарту диапазон линейности в 30 раз превышает диапазон линейности в случае калибровки по OECD-синтетическим сточным водам. Применение OECD-стандарта позволяет анализировать образцы с очень низкими значениями БПК, т.к. нижняя граница определяемых содержаний БПК составляет 0,05 мг О2/дм3.

Проведено определение БПК стандартным методом разбавления и с помощью разработанного БПК-биосенсора. Значения БПК, определенные с помощью биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii иммобилизованного в модифицированный ПВС совпадают со значениями БПК, полученными стандартным методом с учетом доверительных интервалов.

Список литературы

1. Тернер Э., Карубе И., Уилсон Д. Биосенсоры: основы и приложения. М.: Мир. 2012. - 614 с.

2. Каттрал В.Р. Химические сенсоры. М.: Научный мир, 2000. - 123с.

3. Эггинс Б. Химические и биологические сенсоры. М.: Техносфера, 2005г. - 336с.

4. А. Н. Решетилов. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов. // Прикладная биохимия и микробиология, 2005, т. 41, №5, с. 504-513.

5. Divies C. Ethanol oxidation by an acetobacter xylinum microbial electrode.// Ann.Microbial (Paris).- 1975.- Vol.126A.- P.175-186.).

6. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое применение.Учебное пособие ,Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов В.А.

7. Racek J. Cell-based biosensors. Lancaster. Technomic: Publishing Company, Inc. 2009. 107 p.

8. Иммобилизованные клетки и ферменты. Под ред. Дж. Вудворда. М.:Мир, 1988. 215с., ил.

9. Guilbault G.G. Handbook of Immobilized Enzymes. - N.Y.: Marcel Dekker, 1984.

10. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей. Учебное пособие для университетов, электронная версия, 2011.

11. Шлегель Г. Общая микробиология. -- М.: Мир, 1987. -- 567 с.

12. Palбgyi Zs., Ferenczy L., Vбgvцlgyi Cs. Carbon-source assimilation pattern of the astaxanthin-producing yeast Phaffia rhodozyma (англ.) // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2012. V. 17. № 1. p. 95 -- 97

13. McCann A. K., Barnett J. A. Starch utilization by yeasts: mutants resistant of carbon catabolite repression (англ.) // Current Genetics. 1984. V. 8. № 7. p. 525 -- 530

14. GrootWassink J. W. D. , Fleming S. E. Non-specific в-fructofuranosidase (inulase) from Kluyveromyces fragilis: Batch and continous fermentation, simple recovery method and some industrial properties (англ.) // Enzyme and Microbial Technology. 2010. V. 2. № 1. p. 45 -- 53

15. Pereira M. S. A Portait of State-of-the-Art Research at the Technical University of Lisbon Part VII. :Springer Netherlands, 2007, p.457-464.

16. Большая статья Debaryomyces hansenii: Osmotolerant

17. Immobilization of enzyme and cells. / Edited by Jose M. Guisan. - 2nd ed. New Jersey: Humana Pres inc. 2006. 449 p.

18. Синицын А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ. 1994. 288с

19. Handbook of Biosensors and Biochips. / Edited by Marks R. S., Cullen D. C., Karube I., Lowe C. R., Weetall H. 2012. 356 p.

20. Понаморева О.Н., Решетилов А.Н., Алферов в.А. Биосенсоры. Принципы функционирования и практическое применение. - Тула: Изд-во ТулГУ, 2007. - 255с. ил.