В организме тиаминдифосфат образуется в результате этерификации тиамина универсальным донором фосфатных групп -- аденозин-5'-трифосфатом при участии тиаминпирофосфокиназы, возможно, через тиаминмонофосфат. Образование кокарбоксилазы из тиаминмонофосфата происходит быстрее, чем из тиамина.

4.2 Химические свойства фосфорных эфиров тиамина

Тиаминдифосфат по своему химическому поведению во многом подобен тиамину. Он стабилен при хранении на холоду, однако менее устойчив в водных растворах, постепенно превращаясь в тиаминмонофосфат. ТДФ при окислении ферридианидом калия в щелочном растворе образует тиохромдифосфорный эфир, флуоресцирующий в УФ-свете интенсивным синим светом, эта реакция обычно используется для количественного определения малых количеств ТДФ.

Фосфорноэфирные связи у моно-, ди- и трифосфорных эфиров тиамина имеют различную устойчивость к гидролитическому расщеплению в кислой и щелочной средах. При гидролизе в кислой среде отщепляются атомы фосфора положений в и г. В щелочной среде отщепляется атом фосфора б-положения, связанный с органическим остатком молекулы тиамина через атом кислорода.

По своей устойчивости в растворах моно-, ди- и трифосфорные эфиры тиамина располагаются в следующий ряд: при рН 1(100°С) ТТФ < ТДФ < ТМФ, при рН 8,7 (100°С) ТТФ > ТДФ > ТМФ. Тиаминдифосфат наиболее устойчив в растворах с рН 5--5,5 и 4,0. Водный раствор тиаминтрифэсфорного эфира (CXXXIV) довольно устойчив при комнатной температуре, только через несколько часов можно обнаружить ТДФ и свободную ортофосфорную кислоту. При 100°С гидролиз протекает с большой скоростью в сторону образования тиаминдифосфорного эфира (CXXXII); фосфоангндридная связь ТДФ почти с такой же скоростью гидролизуется с образованием тиаминмонофосфорного эфира (CXXXV) с т. пл. 194--199°С. Дальнейший гидролиз протекает в значительно более жестких условиях.

Распад кокарбоксилазы при комнатной температуре идет при рН 8 и даже в нейтральной среде, но при рН 4,6--4,7 он незначителен; фосфорно-эфирная связь ТМФ не гидролизуется при рН 4,6--7,8.

Тиаминдифосфат в гидратной форме более устойчив, чем ТДФ-хлорид в водном растворе при различной температуре. То же самое относится и к кристаллическому состоянию этих двух форм ТДФ; следует отметить, что на холоду расщеплению подвергается менее 1% тиаминдифосфата в обеих формах за 6 месяцев хранения.

Тиаминдифосфат (кокарбоксилазу) в кристаллическом виде впервые выделили из дрожжей в 1937 г. Ломан и Шустер; его строение установлено в виде 5-в-пирофосфорного эфира тиамина (CLXXII).

Для синтеза тиаминдифосфата в качестве фосфорилирующего агента используют смесь ортофосфорной кислоты и фосфорного ангидрида в различных вариантах. 5-в-Гидроксильную группу тиазолиевого цикла тиамина этерифицируют при действии хлорокиси фосфора с низким выходом или с лучшими результатами при действии ортофосфорной кислоты в присутствии пирофосфата натрия, метафосфорной кислоты и пирофосфата натрия при 150°С, фосфорного ангидрида или его смеси с пирофосфатом натрия или пирофосфорной кислотой, хлорангидрида пирофосфорной кислоты, ортофосфорной кислоты, гидратированной хлорокиси фосфора, монохлорангидрида тетрафосфорной кислоты, диметилового эфира монохлорангидрида ортофосфорной кислоты и др.

В 1941 г. Вейлард использовал для получения тиаминдифосфата фосфорилирование тиамина полифосфорной кислотой -- смесью ортофосфорной кислоты и фосфорного ангидрида; этот метод в виде различных вариантов широко применяется как технический. Выход ТДФ составляет 67%. При действии метафосфорной кислоты (100°С) преимущественно получается трифосфорный эфир тиамина (т. пл. 228--232°С), который от других эфиров может быть отделен в виде стифниновой соли или методом ионного обмена.

Из сравнительного изучения различных фосфорилирующих агентов следует, что ортофосфорная кислота почти не реагирует с тиамином, пирофосфорная кислота реагирует слабо и образует преимущественно монофосфат тиамина, метафосфорная кислота приводит к образованию ди-, три- и полифосфатов тиамина. Во всех методах реакция фосфорилирования тиамина протекает неоднозначно с образованием смеси моно-, ди- и трифосфорных эфиров в различных соотношениях.

Из реакционного раствора смесь моно-, ди- и трифосфатов тиамина выделяют ацетоном или спиртом. В небольших количествах это осуществляется хроматографией на бумаге; ТДФ выделяется через фосфорновольфрамовую соль. Для больших количеств предложены методы разделения хроматографией на крахмале, электрофорезом на колонках с порошкообразной целлюлозой или на ионообменных смолах.

В качестве исходного продукта для получения ТДФ известные преимущества имеет применение тиамин-фосфата вследствие уменьшения в реакционной среде содержания соляной кислоты, которая способствует гидролизу кокарбоксилазы в тиаминмонофосфат. Предложен метод получения ТДФ фосфорилированием монофосфорного эфира тиамина.

Легкость гидролиза ТДФ в тиаминмонофосфорный эфир является одной из причин недостаточно высоких выходов при его синтетическом получении. Синтез тиаминмонофосфата описан.

Осуществлен синтез ТДФ путем конденсации пирофосфорного эфира 4-метил-5-в-оксиэтилтиазола и 2-метил-4-амино-5-галогенметилпиримидина.

Пройзвбдные тиаминдифосфата (кокарбоксилазы) с раскрытым тиазолиевым циклом --общей формулы СLХХVI



были получены либо ацилированием тиаминдифосфата в щелочной среде, либо фосфорилированием S-ацилтиамин-О-монофосфата.

S-Бензоилтиамин-О-дифосфат (СLХХV1, R = СОС₆Н₅) по витаминной активности равнозначен кокарбоксилазе, а по действию на восстановление активности транскетолазы в сердечной мышце и крови обнаружил значительно лучший эффект, чем кокарбоксилаза.

Получен ряд N,S-диацилпроизводных фосфорных эфиров тиамина при действии уксусного ангидрида на S-ацилтиамин-О-фосфаты; из них наиболее интересным является N-ацетил-S-бензоилтиамин-О-дифосфат (СLХХVII)

Следует отметить, что реакция N-ацилирования S-ацилтиамин-О-дифосфата сопровождается частичным расщеплением фосфоангидридной связи, приводящим к образованию N-ацетил-S-бензоилтиамин-О-монофосфата.

Как Р¹-(S-бензоилтиамин)-Р²-(аденозин-5')дифосфат, так и Р¹-(S-п-хлор- бензоилтиамин)-Р²(аденозин-5')дифосфат (СLXXVIII)



были получены непосредственной конденсацией аденозин-5'-фосфата с соответствующими S-ацилтиамин-О-монофосфатом в присутствии N,N'-дициклогексилкарбодиимида в среде водного пиридина.

Р¹-(S-Бензоилтиамин)-Р²-(аденозин-5')дифосфат при дебензоилировании цистеином замыкает тиазолиевый цикл и превращается в Р¹-(тиамин)-P²- (аденозин-5')дифосфат.

Карбоднимидным методом также синтезированы тиаминаденозиндифосфат, тиамининозиндифосфат и триацил-О-рибофлавинтиаминдифосфат. Синтезирован также биологически неактивный тиохромдифосфат.

4.3 Биохимические функции тиаминдифосфата

Тиаминдифосфат, соединяясь со специфическими белками и металлами, образует тиаминпротеиды (тиаминовые ферменты), которые и осуществляют биокаталитические функции. Связь кофермента с апоферментом достаточно прочна. При воздействии тиаминовых ферментов на субстраты происходит разрыв и образование С--С-связей в различных группах: между карбонилом и карбоксилом --СО--СООН, между карбонилом и вторичной гидроксильной группой --СО--СНОН-- (разрыв и синтез б-кетола).

Тиаминовые ферменты и их системы принимают участие в углеводном обмене, который в свою очередь через низкомолекулярные органические кислоты (окислительный цикл трикарбоновых кислот и другие обменные реакции) находится во взаимосвязи с обменом жиров и аминокислот в животном организме.

Тиаминдифосфат в составе ферментных систем осуществляет следующие реакции:

· декарбоксилирование б-кетокислот с образованием альдегидов (реакция б-расщепления);

· окислительное декарбоксилирование б-кетокислот с образованием кислот (реакция б-расщепления);

· межмолекулярное перенесение гликольальдегидного остатка между кетосахарами в-расщепление) и альдозами с образованием (ацилоиновый синтез) новых альдозы и кетозы (и новой в ней группировки б-кетола с новым асимметрическим центром).

Декарбоксилирование пировиноградной кислоты в ацетальдегид

СНзСОСООН -- СНзСНО + СО₂

происходит при каталитическом участии пируватдекарбоксилазы (карбоксилазы). Являясь простетической группой, дифосфорный эфир тиамина совместно с белком и магнием входит в состав карбоксилазы -- фермента с молекулярной массой около 75000. Реакция декар боксилирования имеет место в гликолизе и при спиртовом брожении.

Пируватдекарбоксилаза -- довольно специфический по отношению к субстрату фермент. Например, б-кетоглутаровая кислота декарбоксилируется другим ферментом -- б-кетоглутаратдекарбоксилазой. Изучались структура и функции активного центра пируватдекарбоксилазы.

Окислительное декарбоксилирование б-кетокислот в карбоновые кислоты с уменьшенной на один атом цепью углеродных атомов осуществляется при участии системы ферментов. Через ряд каталитических превращений пировиноградная кислота, являющаяся одним из продуктов углеводного обмена (в частности гликолиза), в виде продукта ее декарбоксилирова- ния и дегидрирования -- высоко макроэргического ацетил-КоА -- вводится в цикл трикарбоновых кислот в звене превращений щавелевоуксусной кислоты в лимонную кислоту и в конечном счете окисляется в двуокись углерода и воду. Первичное расщепление пировиноградной кислоты с отделением двуокиси углерода осуществляет ТДФ. В последующих превращениях образовавшегося ацильного остатка окислительным агентом служит (+)б-липоевая кислота (ЛК, тиоктовая кислота), которая сама при этом подвергается восстановительному ацилированию при каталитическом действии пируватдегидрогеназы в 6-ацетилдигидролипоевую кислоту.

Помимо ТДФ и липоевой кислоты, связанной с белком, в декарбоксилировании и дегидрировании пировиноградной кислоты участвуют коферменты: пантетеинадениннуклеотиддифосфат -- кофермент А (НSКоА), никотинамидадениндинуклеотид (НАД), флавинадениндинуклеотид (ФАД) и др. -- в виде системы ферментов. Возможно, что ферментативные реакции пировиноградной кислоты начинаются через промежуточное превращение кофермента в 2-(в-оксиэтил)-ТДФ.

Пировиноградная кислота вступает в реакцию с тиаминдифосфатом и в результате отщепления двуокиси углерода образует «активный ацетальдегид», который затем передает ацетильную группу липоевой кислоте.



Промежуточно образующаяся 6-ацетилдигидролипоевая кислота передает далее ацетильную группу коферменту А, а сама вновь регенерируется в липоевую кислоту окислением НАД. Акцептором водорода от НАД-Н является ФАД.

Окислительное декарбоксилирование б-кетоглутаровой кислоты через сукцинил-КоА в янтарную кислоту -- это еще одно звено в цикле трикарбоновых кислот, осуществляемое ферментными системами, содержащими ТДФ, НSКоА, НАД, ФАД, липоевую кислоту и другие коферменты.

В основе механизма каталитического действия ТДФ в реакциях простого и окислительного декарбоксилирования пировиноградной кислоты и других б-кетокислот в соответствии с теорией Бреслау лежит способность ТДФ легко диссоциировать в нейтральных водных растворах с отщеплением протона при атоме углерода положения 2 тиазолиевого цикла, в результате чего ТДФ приобретает структуру биполярного иона (а). Ион ТДФ является каталитически активной формой, которая непосредственно взаимодействует с молекулой субстрата, обеспечивая тем самым осуществление ферментативной реакции. Механизм каталитического действия ТДФ принципиально одинаков во всех катализируемых им реакциях.

При декарбоксилировании пировиноградной кислоты ион ТДФ (а) взаимодействует с пировиноградной кислотой с образованием неустойчивого промежуточного cоединения (б). Это соединение легко декарбоксилируется и превращается в так называемый активный альдегид (в), представляющий собой ацилкарбанион, в котором свободная электронная пара стабилизирована за счет структуры (г). Дальнейшие превращения «активного альдегида» зависят от того, в составе какой ферментной системы функционирует ТДФ. В реакции простого декарбоксилирования 2-(б-оксиэтил)-ТДФ (в) расщепляется с образованием свободного ацетальдегида

Тиаминдифосфат в составе ферментных систем катализирует ацилоиновый синтез. Это реакция конденсации двух альдегидов, приводящая к группировке б-кетола; так, например, продуктом конденсации двух молекул ацетальдегида является ацетоин СНзСОСН(ОН)СН₃, который образуется при брожении сахара. У многих бактерий, накапливающих в среде ацетоин, он образуется в результате декарбоксилирования б-ацетомолочной кислоты.

В своей простейшей форме транскетолазная реакция, катализируемая транскетолазой, содержащей ТДФ, состоит из реакции б-расщепления оксипировиноградной кислоты (или в-расщепления, если отсчет вести, как в сахарах, от первичной гидроксильной группы), сопровождающегося декарбоксилированием с последующим ацетоиновым ресинтезом остатка гликолевого альдегида с другим альдегидом в б-кето-в-оксисоединения

Окислительный пентозный цикл распада моносахаров до двуокиси углерода, протекающий при участии окисленной формы НАДФ (НАДФ⁺), сопровождается генерированием восстановленной формы -- НАДФ-Н. Эта форма используется в синтетических реакциях получения макроэргического АТФ (при окислительном фосфорилировании и др.). В пентозном цикле из молекулы D-глюкозо-6-фосфата (CXXXIX) получается 12 молекул НАДФ-Н

В промежуточных фазах окислительного пентозного цикла, реакции которого строго стереоспецифичны для cахаров D-конфигурации, происходят различные ферментативные превращения, сопровождающиеся реакциями окисления, укорачивания и удлинения углеродной цепи, изомеризации, эпимеризации, а также альдольного расщепления и синтеза.

В двух реакциях пентозного цикла осуществляется межмолекулярный перенос остатка гликолевого альдегида, катализируемый ТДФ транскетолазы (молекулярная масса 140000). D-Глюкозо-6-фосфат (CXXXIX) в результате окислительного превращения с отщеплением двуокиси углерода при участии НАД превращается в D-рибулозо-5-фосфат (СХХХХ), который при участии рибозофосфатизомеразы переходит в альдозу -- D-рибозо-5-фосфат (CXXXXI) или при каталитическом действии рибулозофосфатэпимеразы в кетозу -- D-ксилуозо-5-фосфат (CХХХХII). Оба эти пентозофосфата подвергаются транскетолазному расщеплению и ресинтезу в углеводы с семью и тремя атомами углерода -- D-седогептулозо-7-фосфат (СLХХХIII) и D-глицеральдегид-3-фосфат (CLХХХIV).

Первоначально D-ксилулозо-5-фосфат (CLХХХII) испытывает в-расщепление связи между карбонилом и атомом углерода, несущим вторичный гидроксил; отщепляется остаток гликолевого альдегида и образуется трехатомная альдоза --D-глицеральдегид-3-фосфат (СLХХХIV)

Затем остаток гликолевого альдегида вступает в ацетоиновую конденсацию с альдозой -- D-рибозо-5-фосфатом (СLХХХI), образуя кетозу -- D-седогептулозо-7-фосфат (СLXXXIII).

D-cедогептулозо-7-фосфат (СLХХХIII) при каталитическом участии трансальдолазы взаимодействует с D-глицеральдегид-З-фосфатом (CLХХХIV), образуя альдозу -- D-эритрозо-4-фосфат (СLХХХV) и кетозу -- D-фруктозо-6-фосфат (СLХХХVI), которая превращается в D-глюкозо-6-фосфат (СLХХIХ), замыкая пентозный цикл.

Транскетолазную реакцию испытывает вторая пара -- альдоза и кетоза -- окислительного пеитозного цикла. Взаимодействует образовавшийся D-эритрозо-4-фосфат (СLХХХV) с D-ксилулозо-5-фосфатом (CXXXXII) при каталитическом участии ТДФ-транскетолазы, в результате реакции приводя к получению D-глицеральдегид-3-фосфата (CXXXXIV) и D-фруктозо-6-фосфата (СLХХХVI). Здесь также происходит ацетоиновый распад и ресинтез. Все реакции носят обратимый характер.

ТДФ в составе транскетолазы является одним из катализаторов реакций фотосинтеза у растений. Синтезируемый в пентозном цикле D-рибозо-5-фосфат (СLХХХI) является источником D-рибозы в реакциях биосинтеза рибонуклеиновых кислот (РНК), АТФ, НАД, ФАД и других соединений.

Ингибитором транскетолазы может служить окситиаминдифосфат.

ТДФ является также коферментом синтетазы б-ацето-б-оксикислот, которая участвует в биосинтезе у растений и микроорганизмов L-валина и L-изолейцина, катализируя альдольную конденсацию пировиноградной и б-кетомасляной кислот с «активным альдегидом», т. е. с 2-в-оксиэтильной группой связанного с белком ТДФ с последующим образованием б-ацетомолочной и б-ацето-б-оксимасляной кислот.

Кокарбоксилазу (ТДФ) с лечебной целью, обычно в виде сухого препарата в ампулах, сопровождаемых отдельно буферным растворителем, в дозировке 50--100 мг в сутки применяют при сахарном диабете, при ацидозах различного другого происхождения, инсулиновом шоке, заболеваниях сердца, при недостаточности коронарного кровообращения, инфаркте миокарда, легких формах рассеянного склероза.

5. Идентификация, анализ чистоты и количественное определение препаратов тиамина

5.1 Препараты тиамина

В медицинской практике применяют тиамин в виде двух препаратов: тиамина бромид и тиамина хлорид. Первый из них представляет собой 4-метил-5-в-оксиэтил-N-(2-метил-4'-амино-5'-метилпиримидил)-тиазолий бромида гидробромид:

Тиамина хлорид отличается только наличием двух хлорид-ионов вместо бромид-ионов:

Препараты тиамина бромид и тиамина хлорид практически идентичны по физическим свойствам.

Они представляют собой белые или с желтоватым оттенком кристаллические вещества со слабым характерным запахом. Тиамина хлорид отличается несколько более высокой гигроскопичностью. Оба препарата легко растворимы в воде, мало растворимы в этиловом спирте и практически нерастворимы в других органических растворителях. Водные растворы (5--6%-ные) имеют рН 2,7--3,4.

Подлинность препаратов можно подтвердить по УФ-спектрам. Так, 0,0015%-ный раствор тиамина бромида в 0,1М растворе соляной кислоты максимум поглощения имеет в области 246 нм.

Идентифицируют препараты с помощью реакции, основанной на окислении тиамина в щелочной среде. Эта реакция известна под названием тиохромной пробы. Общая ее схема:

Тиохром из водных растворов извлекают бутиловым или изоамиловым спиртом. Полученные спиртовые растворы при ультрафиолетовом облучении имеют характерную синюю флуоресценцию, исчезающую при подкислении и вновь возникающую при подщелачивании. Реакцию образования тиохрома используют для количественного флуориметрического определения тиамина.

Тиамина бромид дает характерные реакции на бромиды, а тиамина хлорид -- на хлориды. При действии на препараты тиамина реактивом Несслера появляется желтое окрашивание, которое вследствие восстановления металлической ртути переходит в черное. Тиамин можно также обнаружить по образованию белого осадка с насыщенным раствором хлорида ртути (II), красно-коричневого осадка с 0,02М раствором иода, желтого осадка пикрата (температура плавления 206--208єC) с насыщенным раствором пикриновой кислоты. При добавлении двух капель 15%-ного раствора гидроксида натрия к 0,1%-ному раствору препарата появляется желтое окрашивание.

При сплавлении с кристаллическими едкими щелочами тиамин разрушается с образованием сульфидов, которые легко обнаружить с помощью раствора нитропруссида натрия (красно-фиолетовое окрашивание). Препараты тиамина из растворов количественно осаждаются некоторыми осадительными (общеалкалоидными) реактивами (кремневольфрамовой, фосфорно-вольфрамовой, пикролоновой кислотами и др.). Реакция осаждения кремневольфрамовой кислотой рекомендуется для гравиметрического и фотонефелометрического определения препаратов тиамина.

Сущность количественного гравиметрического определения тиамина бромида, рекомендованного ФС, состоит в нагревании смеси водного раствора навески препарата, концентрированной соляной кислоты и 10%-ного раствора кремневольфрамовой кислоты. Образовавшийся осадок отделяют, промывают на фильтре горячей разбавленной соляной кислотой, затем водой и ацетоном. Все операции выполняют на предварительно высушенной до постоянной массы воронке, которую вместе с осадком сушат, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Масса осадка, умноженная на коэффициент 0,25, соответствует количеству тиамина бромида.

Тиамина хлорид количественно определяют методом неводного титрования. В качестве растворителя используют безводную уксусную кислоту, титрантом служит 0,1 М раствор хлорной кислоты (индикатор кристаллический фиолетовый):

Тиамина бромид количественно определяют способом, основанным на нейтрализации гидробромида и последующем аргентометрическом титровании суммы бромид-ионов:

Наиболее широко применяют алкалиметрический метод определения тиамина хлорида и тиамина бромида с использованием индикаторов бромтимолового синего или фенолфталеина (титрант 0,1М раствор гидроксида натрия). Препараты тиамина можно также определить по хлорид- и бромид-иону аргентометрически методом Фаянса с использованием в качестве индикатора бром-фенолового синего в присутствии разведенной уксусной кислоты (для создания необходимого рН среды).

Известен меркуриметрический метод определения препаратов тиамина в азотнокислой среде с индикатором дифенилкарбазидом или дифенилкарбазоном. Титрантом служит 0,1М раствор нитрата ртути (II):

Препараты тиамина хранят в герметически закрытой таре, предохраняющей от действия света, без контакта с металлами. Недопустимость такого контакта обусловлена возможностью постепенного восстановления тиамина до биологически неактивного дигидротиамина:

Необходимо строго соблюдать условия хранения препаратов тиамина. Менее устойчив при хранении тиамина хлорид, который даже в темноте постепенно разлагается, особенно во влажной атмосфере. При повышении температуры разрушение ускоряется. Нейтральные и щелочные растворы разлагаются быстро, особенно при контакте с воздухом. Растворы с рН 4,0 и менее очень медленно теряют активность.

Препараты тиамина назначают при нарушениях функции нервной системы. Вводят внутрь по 0,005--0,01--0,02 г или внутримышечно по 0,5--1,0 мл 2,5% или 5%-ного раствора тиамина хлорида (3%-ные или 6%-ные растворы тиамина бромида).

5.2 Препараты фосфорных эфиров тиамина и его производных

Наличие спиртового гидроксила в молекуле тиамина позволяет синтезировать его моно-, ди- и трифосфорные эфиры. Некоторые из этих эфиров, например, тиаминдифосфат (кокарбоксилаза), выделены из дрожжей в 1937 г.

В медицинской практике применяют фосфотиамин, кокарбоксилазы гидрохлорид для инъекций и бенфотиамин.

Бенфотиамин практически нерастворим в воде и этаноле, но растворим в 1%-ном растворе гидроксида натрия. Фосфотиамин и кокарбоксилазы гидрохлорид, являясь солями неорганических кислот, легко растворимы в воде, но практически нерастворимы в этаноле.

Наиболее объективная идентификация, позволяющая не только давать групповую оценку, но и отличить друг от друга тиамин, кокарбоксилазу, фосфотиамин и бенфотиамин, может быть достигнута с помощью ИК-спектроскопии. ИК-спектры этих препаратов характеризуются наличием семи основных полос в области 3500--2500 см^-1, причем у тиамина хлорида и тиамина бромида они существенно различаются по интенсивности, а фосфорные эфиры имеют свои четкие характерные полосы.

Общее испытание подлинности препаратов основано на обнаружении фосфора, содержащегося в их молекулах. Фосфотиамин дает положительную реакцию на фосфат-ионы после растворения препарата в разведенной азотной кислоте. Бенфотиамин и кокарбоксилазы гидрохлорид предварительно разрушают кипячением в течение 5 мин в концентрированной азотной кислоте до образования фосфат-ионов. В качестве реактива на фосфат-ионы используют раствор молибдата аммония, с которым образуется желтый кристаллический осадок:

Подлинность кокарбоксилазы гидрохлорида и фосфотиамина подтверждают также, обнаруживая тиамин по реакции образования тиохрома. Эта же химическая реакция лежит в основе установления подлинности бенфотиамина, однако ее выполняют после предварительного нагревания препарата в течение 20 мин на кипящей водяной бане. Кокарбоксилазы гидрохлорид дает положительную реакцию на хлориды.

Основными испытаниями на наличие специфических примесей в препаратах является установление содержания тиамина и дифосфорного эфира тиамина в фосфотиамине (не более 0,5%) и наличия фосфотиамина в кокарбоксилазе и бенфотиамине (соответственно 1,5% и 1%).

Количественное определение бенфотиамина и фосфотиамина выполняют спектрофотометрическим методом. В качестве растворителя используют фосфатный буферный раствор с рН раствора 4,95--5,05 для определения бенфотиамина (при 244 нм) и тот же буферный раствор с рН 6,95--7,05 для определения фосфотиамина (при 268 нм).

Содержание кокарбоксилазы гидрохлорида устанавливают путем нейтрализации навески препарата 0,1М раствором гидроксида натрия (индикатор тимолфталеин). Процесс титрования основан на химической реакции:

В фосфотиамине определяют также содержание связанной фосфорной кислоты, которой в пересчете на сухое вещество должно быть 20,5--23,5% .

Хранят бенфотиамин и фосфотиамин в сухом, защищенном от света месте при комнатной температуре. Кокарбоксилазы гидрохлорид для инъекций фасуют по 0,05 г в ампулы, которые запаивают и хранят в защищенном от света месте при температуре не выше +5° С. Предельный срок хранения один год.

Применяют фосфотиамин и бенфотиамин как аналоги препаратов тиамина. Выпускают в виде таблеток бенфотиамин по 0,025 г, а фосфотиамин по 0,01 г. Кокарбоксилазу для инъекций назначают внутримышечно и внутривенно по 0,05--0,1 г при нарушениях сердечно-сосудистой деятельности и коронарного кровообращения.

6. Экспериментальная часть

6.1 Методика исследования

Раствор тиамина хлорида (витамина В₁) 5% для инъекций

Solutio Thiamini chloridi (Vitamini B₁) 5% pro injectionibus

Состав:

· Тиамина хлорида 50 г

· Воды для иньекций до 1 л

Раствор фильтиуют, разливают в ампулы нейтрального стекла по 1 мл и стерилизуют при 100° в течение 30 минут или при 120° в течение 15 минут.

Описание. Бесцветная или слегка желтоватая прозрачная жидкость со слабым характерным запахом.

Подлинность. 1 мл препарата разводят водой до 25 мл.

К 5 мл раствора приливают 1 мл раствора феррицианида калия, 1 мл раствора едкого натра, 5 мл бутилового или изоамилового спирта, хорошо встряхивают и дают отстояться В верхнем слое возникает наблюдаемая в ультрафиолетовом свете синяя флюоресценция, исчезающая при подкислении и вновь возникающая при подщелачивании раствора.

К 5 мл того же раствора добавляют 1 мл соляной кислоты, 1 мл раствора хлорамина, 1 мл хлороформа и взбалтывают; в хлороформном слое не должно появляться желтое окрашивание.

К 5 мл того же раствора прибавляют 0,5 мл разведенной азотной кислоты и 0,5 мл раствора нитрата серебра; образуется белый творожистый осадок, растворимый в растворе аммиака (реакция на хлорид).

pH 2,7--3,4 (потенциометрически).

Цветность раствора. Окраска раствора не должна быть интенсивнее эталона № 5а.

Количественное определение. 1 мл препарата помещают в коническую колбу емкостью 50 мл, приливают 10 мл уксусного ангидрида, колбу закрывают пробкой с воздушным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 30 минут. Колбу вынимают, с горлышка осторожно удаляют фильтровальной бумагой капли паров воды, содержимое колбы охлаждают, прибавляют 10 мл безводной уксусной кислоты, 5 мл растзора ацетата окисной ртути и титруют 0,1 н. раствором хлорной кислоты до изумрудно- зеленой окраски (индикатор -- кристаллический фиолетовый).

Параллельно проводят контрольный опыт.

1 мл 0,1 н. раствора хлорной кислоты соответствует 0,01686 г C₁₂H₁₇ClN₄OS * HCl, которого в 1 мл препарата должно быть 0,0475--0,0525 г.

Хранение. В защищенном от света месте.

6.2 Результаты исследования

Название и лекарственная форма препарата	Показатель	№ п/п	Методика исследования	Результат
Раствор тиамина хлорида (витамина В1) 5% для инъекций	Подлинность	1	1 мл препарата разводят водой до 25 мл. К 5 мл раствора приливают 1 мл раствора феррицианида калия, 1 мл раствора едкого натра, 5 мл бутилового или изоамилового спирта, хорошо встряхивают и дают отстояться В верхнем слое возникает наблюдаемая в ультрафиолетовом свете синяя флюоресценция, исчезающая при подкислении и вновь возникающая при подщелачивании раствора.	Соответствует
Раствор тиамина хлорида (витамина В1) 5% для инъекций	Подлинность	2	1 мл препарата разводят водой до 25 мл. К 5 мл раствора добавляют 1 мл соляной кислоты, 1 мл раствора хлорамина, 1 мл хлороформа и взбалтывают; в хлороформном слое не должно появляться желтое окрашивание.	Соответствует
Раствор тиамина хлорида (витамина В1) 5% для инъекций	Подлинность	3	1 мл препарата разводят водой до 25 мл. К 5 мл раствора прибавляют 0,5 мл разведенной азотной кислоты и 0,5 мл раствора нитрата серебра; образуется белый творожистый осадок, растворимый в растворе аммиака (реакция на хлорид).	Соответствует

Выводы

Итак, из истории витаминов мы знаем, что термин «витамин» впервые был использован для обозначения специфического компонента пищи, который предотвращал болезнь Бери-бери, распространенную в странах, где употребляли в пищу много шлифованного риса. Поскольку этот компонент обладал свойствами амина, польский биохимик К.Функ впервые выделивший это вещество, назвал его витамин - необходимый для жизни амин.

В настоящее время витамины можно охарактеризовать как низкомолекулярные органические соединения, которые, являясь необходимой составной частью пищи, присутствуют в ней в чрезвычайно малых количествах по сравнению с основными её компонентами. Витамины - это вещества, обеспечивающее нормальное течение биохимических и физиологических процессов в организме. Витамины - необходимый элемент пищи для человека и ряда живых организмов, т.к. не синтезируются или некоторые из них синтезируются в недостаточном количестве данным организмом.

Первоисточником витаминов являются растения, где преимущественно они образуются, а также провитамины - вещества, из которых витамины могут образовываться в организме. Человек получает витамины или непосредственно из растений, или косвенно - через животные продукты, в которых витамины были накоплены из растительной пищи во время жизни животного.

Витамины делят на две большие группы: витамины растворимые в жирах и витамины, растворимые в воде. В классификации витаминов, помимо буквенного обозначения, в скобках указывается основной биологический эффект, иногда с приставкой «анти», указывающей на способность данного витамина предотвращать или устранять развитие соответствующего заболевания.

К витаминам, растворимых в жирах относят: Витамин A (антиксерофталический), Витамин D (антирахитический), Витамин E (витамин размножения), Витамин K (антигеморрагический)

К витаминам, растворимых в воде относят: Витамин В1 (антиневритный), Витамин В2 (рибофлавин), Витамин PP (антипеллагрический), Витамин В6 (антидермитный), Пантотен (антидерматитный фактор), Биотит (витамин Н, фактор роста для грибков, дрожжей и бактерий, антисеборейный), Инозит. Парааминобензойная кислота (фактор роста бактерий и фактор пигментации), Фолиевая кислота (антианемический витамин, витамин роста для цыплят и бактерий), Витамин В12 (антианемический витамин), Витамин В15 (пангамовая кислота), Витамин С (антискорбутный), Витамин Р (витамин проницаемости).

Основной особенностью жирорастворимых витаминов является их способность накапливаться в организме так сказать «про запас». Хранится в организме они могут в течении года и расходоваться по мере надобности. Однако слишком большое поступление жирорастворимых витаминов для организма опасно, и может привести к нежелательным последствиям. Водорастворимые витамины не накапливаются в организме и в случае переизбытка легко выводятся с мочой.

Наряду с витаминами, существуют вещества, дефицит которых, в отличие от витаминов, не приводит к явно выраженным нарушениям. Эти вещества относятся к так называемым витаминоподобным веществам:

Сегодня известно 13 низкомолекулярных органических соединений, которые относят к витаминам. Соединения, которые не являются витаминами, но могут служить предшественниками их образования в организме, называются провитаминами. Важнейшим провитамином является предшественник витамина А - бета-каротин.

Значение витаминов для организма человека очень велико. Эти питательные вещества поддерживают работу абсолютно всех органов и всего организма в целом. Нехватка витаминов приводит к общему ухудшению состояния здоровья человека, а не отдельных его органов.

Болезни, которые возникают вследствие отсутствия в пище тех или иных витаминов, стали называться авитаминозами. Если болезнь возникает вследствие отсутствия нескольких витаминов, ее называют поливитаминозом. Чаще приходится иметь дело с относительным недостатком какого-либо витамина; такое заболевание называется гиповитаминозом. Если своевременно поставлен диагноз, то авитаминозы и особенно гиповитаминозы легко излечить введением в организм соответствующих витаминов. Чрезмерное введение в организм некоторых витаминов может вызвать гипервитаминоз.

Качественные реакции на тиамин:

1. При прибавлении к подкисленному разведенной азотной кислотой 1%-ному раствору нескольких капель раствора нитрата серебра выпадает творожистый осадок, не растворимый в азотной кислоте.

2. Тиохромная проба основана на переводе тиамина красной кровяной солью в щелочной среде в тиохром, растворимый в бутиловом или изоамиловом спирте с синей флуоресценцией: К 5 мл раствора тиамина (с содержанием 0,01 мг) в делительной воронке добавляют 5 мл 1%-ного раствора красной кровяной соли, перемешивают и оставляют стоять в течение 2 минут. Затем добавляют 20 мл изобутилового спирта и сильно перемешивают, встряхивая в течение 1 минуты, отделяют спиртовый слой и фильтруют. Тиохром, полученный в результате окисления тиамина, обусловливает синюю флуоресценцию.

3. Тиамин дает осадки с некоторыми общими алкалоидными реактивами, например с реактивом Драгендорфа (пикриновая кислота не дает осадка).

Количественное определение

1. После нейтрализации (по бромтимоловому синему) тиамин-бромид определяется аргентометрически.

2. Другой метод основан на свойстве витамина В₁ образовывать с диазотированным пара-амино-ацетофеноном соединение фиолетово-красного цвета, которое нерастворимо в воде, со многими органическими растворителями образует цветные растворы, допускающие сравнение с эталонными растворами. Из органических растворителей применяют обычно ксилол или толуол. Для определения тиамина, растворенного в однородном бесцветном растворителе, нет необходимости извлекать цветное соединение из раствора. В этих случаях прибавляют изопропанол в количестве, достаточном для растворения цветного соединения, и проводят определение по стандартному раствору. Для анализа берут такое количество препарата, в котором содержится 100 микрограммов (0,0001 г) тиамина. Эталон готовят растворением 50 мг витамина Вх (точная навеска) в 500 мл 50% по объему) этанола, содержащего 1 каплю 4 н. соляной кислоты. Хотя этот эталонный раствор можно сохранять при комнатной температуре в течение нескольких месяцев, предпочитают все же готовить его на срок не более 1 месяца. Кроме эталонного раствора заготовляют: 1) 0,03%-ного раствора пара-амино-ацетофенона в 0,2 н. соляной кислоте; 2) 0,1%-ный раствор нитрита натрия; 3) 1 н. и 2,5 н. растворы едкого натра; 4) 50%-ный этанол (по объему); 5) толуол; 6) изопропанол и 7) 4 н. соляную кислоту. Для приготовления реактива под названием диазораствор А в небольшой склянке смешивают 10 мл раствора пара-амино-ацетофенона и 2 мл раствора нитрита натрия и охлаждают не менее 2 минут в ледяной воде. Перед пользованием к смеси прибавляют 3 мл 1 н. раствора едкого натра и взбалтывают. Реактив под названием диазораствор Б готовят так же, как и раствор А, с той лишь разницей, что вместо 1 н. раствора едкого натра к раствору Б прибавляют 2,5 н. раствора едкого натра. Испытуемый ампульный раствор смешивают с таким количеством перегнанной воды, чтобы каждый миллилитр смеси содержал около 100 микрограммов тиамина. В калиброванную пробирку на 10 мл вливают 1 мл смеси, прибавляют 2 мл 50%-ного этанола и помещают в водяную баню при температуре 60°. Через 1 минуту приливают 1 мл диазораствора А, сильно взбалтывают и снова оставляют в бане на 2---3 минуты. Затем смесь охлаждают, прибавляют 1 каплю 4 н. соляной кислоты и изопропанол до метки, взбалтывают и сравнивают в колориметре с контрольным раствором, изготовляемым смешением 1 мл воды с 1 мл эталонного раствора тиамина, 1 мл 50% этанола и 1 мл диазораствора А по методу, описанному выше.

3. Для определения витамин В₁ по другому методу растворяют 0,4--1,5 мг его в 10 мл воды, прибавляют 0,5 мл реактива с фосфорно-вольфраматом и 0,4--0,6 мл 10%-ного раствора едкого натра. Появляется синее окрашивание. Титруют 0,002 н. раствором красной кровяной соли, 1,82 мл которого соответствует 1 мг витамина В^ до исчезновения синего окрашивания. Реактив готовят следующим образом: 10 г вольфрамата натрия растворяют в 75 мл воды, прибавляют 8 мл 85%-ной фосфорной кислоты и слабо нагревают в течение 2 часов. Если раствор зеленеет, прибавляют немного бромной воды после нагревания в течение указанного времени и избыток брома удаляют кипячением. По охлаждении доводят до 100 мл.

Проанализированный раствор тиамина хлорида (витамина В₁) 5% для инъекций по показателям идентификации соответствуют требованиям нормативно-технической документации.

Список использованной литературы

витамин пиримидиновый тиазоловый тиамин

1. Фармацевтична хімія. Підручник для студентів вищ. фармац. начальних закладів і фарм. фак. вищих мед. навчальних закладів III-IV рівня акредитації / За заг. ред. П.О. Безуглого. - Вінниця: Нова книга, 2008. - 560 с.

2. Арзамасцев А.П. Фармакопейный анализ - М.: Медицина, 1971.

3. Беликов В.Г. Фармацевтическая химия. В 2 частях. Часть 1. Общая фармацевтическая химия: Учеб. для фармац. ин-тов и фак. мед. ин-тов. -- М.: Высш. шк., 1993. - 432 с.

4. Глущенко Н.Н. Фармацевтическая химия: Учебник для студ. сред. проф. учеб. заведений / Н.Н. Глущенко, Т.В. Плетенева, В.А. Попков; Под ред. Т.В. Плетеневой. -- М.: Издательский центр «Академия», 2004. -- 384 с.

5. Драго Р. Физические методы в химии - М.: Мир, 1981

6. Кольтгоф И.М., Стенгер В.А. Объемный анализ В 2 томах - М.: Государственное научно-техническое издательство химической литературы, 1950

7. Коренман И.М. Фотометрический анализ - М.: Химия, 1970

8. Коростелев П.П, Фотометрический и комплексометрический анализ в металлургии - М.: Металлургия, 1984, 272 с.

9. Логинова Н.В., Полозов Г.И. Введение в фармацевтическую химию: Учеб. пособие - Мн.: БГУ, 2003.-250 с.

10. Мелентьева Г.А., Антонова Л.А. Фармацевтическая химия. -- М.: Медицина, 1985.-- 480 с.

11. Мискнджьян С.П. Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. - К.: Вища школа, 1976. 232 с

12. Фармацевтическая химия: Учеб. пособие / Под ред. Л.П. Арзамасцева. - М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 640 с.

13. Фармацевтический анализ лекарственных средств / Под общей редакцией В.А. Шаповаловой - Харьков: ИМП «Рубикон», 1995

14. Фармацевтичний аналіз: Навч. посіб. для студ. вищ. фармац. навч. закл. III--IV рівнів акредитації/П.О. Безуглий, В.О. Грудько, С.Г. Леонова та ін.; За ред. П.О. Безуглого,-- X.: Вид-во НФАУ; Золоті сторінки, 2001.-- 240 с.

15. Халецкий A.M. Фармацевтическая химия - Ленинград: Медицина, 1966

16. Эшворт М.Р. Титриметрические методы анализа органических соединений кн.1,2 - М.: Химия, 1972

Размещено на Allbest