Нобелевские лауреаты в иммунологии

Используя метод связывания комплемента, предложенный Борде в 1906 году немецкий иммунолог Август Вассерман и его коллеги сделали сразу несколько важных открытий. Во-первых, обнаружили антисифилитические антитела в крови обезьян, зараженных сифилисом. Во-вторых, нашли такие же антитела в цереброспинальной жидкости больных tabes dorsales (сухоткой спинного мозга) и тем самым доказали, что эта страшная болезнь является одной из форм сифилиса. В-третьих, продемонстрировали наличие этих антител в крови больных сифилисом. С тех пор реакция Вассермана остается одним из самых распространенных тестов в венерологии.

Реакция связывания комплемента была также применена для диагностики сапа.

Глава 6. 1930 Карл Ландштейнер (1868-1943)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытие групп крови человека».

В 1900 году Ландштейнер и Самуэл Шатток, работая независимо, сообщили о несовместимости разных типов человеческой крови. Заслуга Ландштейнера состояла в том, что именно он понял, что агглютинация эритроцитов, происходящая при переливании крови, не патологическое, а нормальное явление [1]. Уже в следующем (1901) году он предложил относить кровь каждого человека к одной из трех групп: А, В или С. (Группа С позднее была переименована в «группу 0».) Различие между группами состояло в том, какие антигены (сложные белки, активирующие иммунную систему) имелись на поверхности эритроцитов данного человека. Эритроциты группы А несли антиген А, эритроциты группы В- антиген В, эритроциты группы 0 не содержали ни того, ни другого антигена. Не менее важным было то, что в крови большинства людей изначально содержатся готовые антитела к антигенам А и В чужих эритроцитов. Поэтому, если перелить человеку кровь иной группы, чем его собственная, возможна встреча антител с соответствующими им антигенами, реакция между ними и как результат - склеивание эритроцитов. Агглютинированные эритроциты закупоривают капилляры и тем самым нарушают кровоток в жизненно важных органах, прежде всего в почках, от чего человек может погибнуть.

В 1902 году сотрудник Ландштейнера А. Штурли вместе с А. фон Декастелло существенно уточнили схему, добавив к ней еще одну группу крови - АВ (эритроциты ее обладателей содержат оба антигена). То же сделал в 1907 году чех Ян Янский.

В течение нескольких лет было предложено два усовершенствования, которые сделали переливание крови практически выполнимым. Во-первых, был создан способ определения групп крови. Во-вторых, обнаружено, что цитрат натрия препятствует свертыванию крови, что позволило хранить донорскую кровь в течение хотя бы непродолжительного времени, а не переливать ее непосредственно от донора реципиенту. Первая мировая война показала, насколько своевременным было открытие Ландштейнера, хотя мощные службы переливания крови были созданы по всему миру позднее. Переливание крови сделало возможными операции на сердце, крупных сосудах, легких. Хирургия в целом смогла перейти к более продолжительным и сложным операциям. Периодическое переливание донорской крови - обязательный компонент лечения анемий, лейкемий и многих других болезней крови и иммунной системы.

Кровь рассматривают, как жидкую ткань. Переливание крови - строго говоря, первая успешная пересадка ткани от одного человека к другому. За ней последовали пересадки все более сложных и крупных органов вплоть до трансплантации сердца и даже комплекса «сердце-легкие».

Открытие Ландштейнера имело и другие, но началу неожиданные, последствия; для судебной медицины стало громадным подспорьем определение групповой принадлежности следов крови, находимых на месте преступления.

В 1910 году Эмиль фон Дунгерн высказал предположение о наследовании групп крови, в 1924-1925 годах математик Ф. Бернштейн проверил эту идею, и она утвердилась среди ученых. Теперь, сравнив группы крови ребенка и предполагаемого отца, можно было прийти к одному из двух заключений: «X может быть отцом У» или «Х не может быть отцом У». (Однако, утверждать«X, является отцом У» на основе сравнения групп крови нельзя. Это стало возможным лишь в последние десятилетия XX века в результате развития методов сравнения ДНК, пока еще сложных и очень дорогих.) Выяснилось, что АВО - не единственная система групп крови человека. Сам. Ландштейнер в 1927 году обнаружил антигены M и N, а в 1940-м он вместе с Александром Соломоном Винером и Ф. А. Т. Левином описал еще один белок эритроцитов, названный резус-фактором (Rh). Вскоре удалось объяснить многие случаи гемолитической желтухи новорожденных. Если кровь плода содержит резус-белок, а кровь матери - нет, то те небольшие количества белков крови плода, которые проникают сквозь плацентарный барьер в кровоток матери, оказываются достаточными для активации ее иммунной системы. Материнский организм вырабатывает средства защиты от чужеродного белка и они разрушают плод. Прежде такие дети почти всегда погибали, теперь их стали спасать с помощью полного (заместительного) переливай крови. Беременность «Rh-отрицательной» женщины от «Rh-положительного» мужчины стала предметом особой заботы врачей.

В 1937 году У. Бонд и Л. Дж. Бонд обнаружили антиген А и В в тканях мумий. Позднее такие методы были использованы для анализа миграции древних народов. Антропологи получили возможность, сравнивая распространенность различных групп крови среди населения разных стран, судить о перемещениях народов, происходивших в доисторические времена.

В 1950-1960-е годы количество антигенов, открытых в крови нарастало лавинообразно. Были описаны системы Кид, Даффи, Келл-Келдано, Льюис, Лютеран и многие другие. Однако все они, включая МN и Rh имели одно весьма существенное отличие от системы АВО только к антигенам А и В в крови здорового человека могли изначально присутствовать антитела. Поэтому переливание крови без учета групповой принадлежности в системе АВО часто приводило к тяжелым осложнениям фазу же, в момент трансфузии. Игнорирование всех прочих факторов при первом переливании никак не проявлялось, антитела к чужеродным белкам должны были накопиться в крови реципиента в течение нескольких месяцев. Только повторное переливание той же иногруппной крови могло закончиться трагически.

Возможность многократно производить массивные переливания крови во время хирургических операций позволила создать в 1960-е годы аппараты искусственного кровообращения, заменявшие на время операции сердце и легкие пациента. Стали проводить операции на «сухом» сердце.

Отрицательные последствия увлечения переливаниями крови появились позднее. Даже при постоянном и строгом контроле время от времени переливают кровь, зараженную вирусами гепатитов, СПИДа, реже - возбудителем сифилиса. Это послужило одной из причин разработки искусственных кровезамещающих жидкостей.

Глава 7. 1951 Макс Тэйлер (1899-1972)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытия, касающиеся желтой лихорадки и способов борьбы с ней».

В 1930 году Тейлер сообщил, что желтую лихорадку можно привить и белым мышам, если вводить возбудителей непосредственно в мозг животных (введение в другие органы заболевания у мышей не вызывало) [1].

В следующем году Тейлер доказал, что мыши, которым привили желтую лихорадку введением сыворотки больных людей или обезьян, приобретают устойчивость к возбудителю. Тейлер также установил, что возбудитель, перевитый от одной мыши к другой, становится настолько ослабленным, что им уже можно прививать обезьян, делая их, таким образом, невосприимчивыми к болезни. Тейлер использовал для этого вирулентный (заразный) для макак-резусов штамм вируса, выделенный в Дакаре, Французская Западная Африка, Мати, Селляром и Легре. В результате прививки у мышей развивался энцефаломиелит (воспаление головного и спинного мозга). Селляр, Ллойд и Пенна показали, что этот вирус обладает выраженной нейротропностью, то есть поражает только нервную систему, но не затрагивает внутренние органы животного. Успешная проверка прививки па людях была произведена Селляром и Летре в 1932 году. Разработанная ими вакцина получила название французской.

Эта вакцина все еще считалась небезопасной для людей, что привело Тейлера и его сотрудников Ллойда, Смита и Риччи к попытке создать более безопасную вакцину. После 89-го пассажа вируса Asibi они получили мутантный штамм, названный штаммом 17D. Eго нейротропность была значительно ниже: при введении в мозг обезьян он вызывал менее тяжелые формы энцефалита, не приводящие, как правило, к смерти животных.

Тейлер также создал тест на наличие иммунитета к желтой лихорадке: сыворотку крови исследуемого человека вводили мышам, и после -этого их заражали вирусом. Отсутствие заражения свидетельствовало о наличии в крови человека антител к возбудителю.

Вакцину 17D в течение трех лет (1937-1940) испытывали в Бразилии. Рокфеллеровский институт разослал миллионы доз вакцины, которой было привито более 100 млн. человек.

Пельтье с сотрудниками в 1939 году разработали методику прививания желтой лихорадки путем скарификации (небольшого надреза) кожи, то есть так же, как это делали уже давно, прививая оспу. Это существенно упростило массовую вакцинацию, что позволило французам подвергнуть ей в своих африканских колониях 20 млн. человек без каких-либо серьезных осложнений.

Сойер, Китчен и Ллойд разработали методику иммунизации для всех, работающих с вирусом желтой лихорадки, после чего случаи заражения в лабораториях прекратились.

Желтая лихорадка из-за своей высокой контагиозности (заразности) и частоте смертельных исходов была отнесена (наравне с чумой и оспой) к числу особо опасных инфекций.

Всемирная организация здравоохранения разработала правила обязательной вакцинации пассажиров, путешествующих через страны, где распространена желтая лихорадка. Открытие Тейлора позволило ускорить освоение тропических территорий. Непривитые лица, побывавшие в районе эпидемии желтой лихорадки, подвергаются строгому карантину. Открытие Тейлера позволило держать под контролем распространение этой болезни, спасло жизнь и сохранило здоровье многим миллионам людей. Представляя лауреата, председатель Нобелевского комитета профессор X. Бергстра сказал, что хотя идея, положенная в основу работы Тейлера, известна чуть ли не со времен Дженнера, открытие Тейлера дает надежду на обуздание, других вирусных инфекций, и потому Тейлер оказал услугу человечеству, что сделал именно то, что Альфред Нобель определил в качестве критерия для награждения премией его имени.

Именем Тейлера назван эпидемический вирусный энцефаломиелит мышей, вспышка которого в лаборатории может полностью уничтожить всех лабораторных мышей - болеть Тейлера. Имя Тейлера сохранилось также в названии «вируса Тейлера, вызывающего эту болезнь.

Глава 8. 1957 Даниель Бове (1907)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытия, касающиеся синтетических соединений, которые подавляют действия некоторых веществ организма и особенно их действие на сосудистую систему и скелетные мышцы».

Разработка фармакологических средств, действующих на передачу возбуждения в синапсах автономной (вегетативной) нервной системы, которая регулирует работу главным образом внутренних органов, была начата в парижской лаборатории учителя Бове химика Эрнеста Фурно. Именно на этом направлении Бове решил применить увлекшую его идею конкурентных отношений между физиологическими регуляторами и их аналогами - потенциальными лекарствами. Ему удалось синтезирован, вещества, структурно подобные важнейшим эндогенным регуляторам - нейротрансмиттерам ацетилхолину и норадреналину, гормону адреналину, а также к местному гормону серотонину. Новые вещества действовали как конкуренты или блокаторы эндогенных регуляторов. В этих работах, проводившихся в Высшем институте здоровья в Италии, участвовали, кроме самого Вове, химики Марини-Беттоло и Чиаварелли, также фармакологи Филомена Нитти, Лонго и Гварино. Они выявили некоторое структурное сходство между молекулами адреналина и некоторых вызывающих те же эфекты симпатомиметиков таких как амфетамин, с одной стороны и алкалоидами спорыньи, например, амидом лизергиновой кислоты, с другой. У некоторых производных алкалоидов спорыньи было обнаружено, наоборот, симпатолитическо, например, сосудорасширяющее действие. Это навело Бове и его коллег на мысль о возможности синтезирования ряда структурно родственных веществ, в которых симпатомиметические свойства постепенно снижались бы, а симпатолитические - также постепенно увеличивались, что и было сделано.

Бове и его коллеги синтезировали более 400 курареподобных веществ и создали препарат галламин (коммерческое название -- флакседил).

Поиски антагонистов еще одного местного гормона гистамина были начатые лаборатории Фурно в 1937 году. Первый активный препарат, антегран, был получен в 1939 году. Его антиаллергическое действие отвечало запросам медицины и сразу же сделало разработку данного направления в высшей степени перспективным.

Бове считал, что антигистаминные средства могут быть найдены среди веществ, сходных по структуре либо с симпатолитиками, либо с симпатолитиками и парасимпатолитиками одновременно, либо, наконец, с самим гистамином. Оправдались все три предположения [1].

Бове говорил, что примененный им подход дал фармакологам в руки нить Ариадны и избавил их «от блужданий в лабиринте физиологических эффектов и химических структур».

Бове инициировал создание антагонистов биогенных аминов, которые стали важнейшими средствами лечения гипертензии, нервных и психических расстройств а также множества других нарушений гуморальной и нервной регуляции. Например, холинолитики были применены для снятия колик (болезненных спазмов гладких мышц) внутренних органов, расширения зрачка для подробного исследования дефектов зрения и мн. др.

После первых успехов Бове и его коллег разработкой антигистаминных препаратов занялось сразу несколько исследовательских групп. Вскоре к ним присоединились еще 500 химиков, которые в совокупности менее чем за 10 лет синтезировали примерно 5000 антигистаминных препаратов.

Антигистаминные средства широко применяются для лечения аллергий, например, астмы и сенной лихорадки. Производные фенотиазина, первоначально синтезированные в качестве антигистаминных средств, позднее применялись при лечении болезни Паркинсона и шизофрении.

Глава 9. 1960 Френк Макфалейн Бернет (1899-1985) и Питер Брайн Медавар (1915-1987)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытие приобретенной иммунологической толерантности».

Френк Макфалейн Бернет

Вклад Бёрнета был результатом, главным образом, его теоретических разработок. Он первым обратил внимание на то, что организм каждого позвоночного животного обладает способностью отличать собственные ткани от чужих и именно поэтому он не отвечает иммунной реакцией на антигены собственного тела. С точки зрения Бёрнета выработка искусственной иммунологической толерантности в опытах Оуэна являлась простым расширением «списка собственных антигенов организма» путем внесения в нее информации о чужих антигенах.

Белок или другая макромолекула несет антигенную информацию потому, что содержит в своем составе химические конфигурации (антигенные детерминанты), отличные от любых конфигураций в аналогичных молекулах другого организма. Были получены данные о том, что каждая антигенная детерминанта, подобно активному центру антитела, имеет маленькую площадь (примерно 1 - 2 нмІ) и, чтобы быть активной, она должна быть частью соответствующей молекулы-носителя. На поверхности молекулы могло находиться несколько сотен паттернов, образованных узлами из 3-5 аминокислотных остатков, и каждый из них мог бы играть роль детерминанты. Большая часть потенциальных детерминант донора не отличается от таковых хозяина и потому - инертна.

Сенгер - (Нобелевская премия по химии за 1958 и 1980 годы) обнаружил, что молекулы инсулина у разных видов позвоночных различаются тремя аминокислотными остатками. Поскольку введение бычьего инсулина человеку вызывает у него иммунную реакцию. Бернет предположил, что антигенная информация должна быть сосредоточена в очень небольшой части молекулы.

Где же хранилась эта информация? Ерне (Нобелевская премия 1984 года) преполагал, что в глобулинах (белках плазмы крови). Вернет и Д. У. Толмэдж предпочитали видеть хранителей памяти в лимфоидных клетках (некоторых белых клетках крови и родственных им образованиях). Предполагалось также существование клеточных рецепторов, способных, подобно антителам, связываться с антигенной детерминантой и в результате активировать иммунную реакцию. Количество и доступность таких рецепторов определяли силу иммунной реакции.

Бёрнет создал методику выращивания вирусов in vitro на клетках куриных эмбрионов, которая была лучшей до тех пор, пока Эндерс (Нобелевская премия 1954 года) не предложил свою. Опыты Бёрнета с выращиванием вирусов в клетках куриных эмбрионов показали, что эти клетки не вырабатывают антител против вирусов, из чего он сделал вывод о том, что условием возникновения иммунологической толерантности является встреча иммунной системы с антигеном на ранней стадии развития организма [1].

Достижения Бёрнета окончательно опровергли инструктивную интерпретацию теории иммунитета и утвердили торжество селекционной интерпретации.

Питер Брайн Медавар

Вклад Медавара заключался в получении им ценнейших экспериментальных данных. Через несколько лет после Оуэна Медавар и Руперт Э. Биллинхем изучали телят - дизиготных близнецов, то есть близнецов, родившихся из двух оплодотворенных яйцеклеток и потому обладающих неодинаковыми наборами генетической информации. При этом они вовсе не стремились открыть один из основных законов иммунологии, а просто выполняли задание Г. П. Дональда - разработать методику, с помощью которой можно было бы надежно отличать дизиготных близнецов от монозиготных, (то есть родившим из одного оплодотворенного яйца). Медавар и Биллингэм пересаживали лоскуты кожи от одного теленка-близнеца другому и обнаружили, что у большей части близнецов трансплантаты (пересаживаемые ткани) прекрасно приживаются. Это происходило и у моно-, и у дизиготных пар, так что Медавар и Биллингэм задания не выполнили - теста не создали. Зато они заметили очевидную аналогию с феноменом Оуэна и сделали то, что отличает великое открытие от результатов рутинной исследовательской работы: они поняли, что открыли способ сделать так, чтобы взрослое животное (называемое хозяином) принимало без отторжения трансплантат от другого животного (донора), принадлежащего к тому же биологическому виду, Для этого сразу же после рождения хозяина надо пересадить ему небольшой фрагмент ткани донора, и в результате в течение всей своей жизни хозяин будет способен принимать от донора любые трансплантаты как свои собственные ткани, без реакции отторжения. Элемент везения здесь тоже присутствовал: химеризм чаще встречается у крупного рогатого скота, чем, например, у овец.

На основании результатов своих исследований на мышах Медавар сформулировал следующие выводы:

1. После пересадки адаптация происходит не в трансплантате, а в организме хозяина, так антигенные свойства трансплантата сохраняются. Клетки-потомки клеток трансплантата при введении их интактному взрослому животному вызывают иммунную реакцию.

2. Состояние иммунологической толерантности, то есть способности принимать; трансплантат без отторжения, специфично: хозяин, толерантный к трансплантатам от донора, по-прежнему отторгает трансплантаты от всех других доноров.

3. Толерантность неизбирательна: хозяин, принявший один трансплантат от донора, примет от него и все другие трансплантаты. Таким образом, разные ткани одного

организма не различаются антигенами, определяющими реакцию отторжения.

Однажды выработанную иммунологическую толерантность можно и ликвидировать. Для поддержания полной толерантности антигены трансплантата должны постоянно присутствовать в организме хозяина, хотя бы в крайне низких количествах.

Толерантность градуальна, то есть не подчиняется правилу «все или ничего». Можно получить любую степень от ослабленного иммунного ответа до полной толерантности.

Все указывало на то, что изменения, приводящие к толерантности, происходят не на периферическом уровне, но в центральном механизме иммунной защиты.

Медавар, Биллингзм и Лесли Брент опубликовали результаты своих экспериментов в 1953 году и, таким образом, подтвердили теоретические построения Бёрнета. Примерно в то же время дополнительное подтверждение было получено Н. Гашеком в Чехословакии, хотя он и исходил из неверных теоретических предпосылок. Бёрнет и Ф. И. Феннер включили феномен толерантности в новую теорию иммунологии.

Глава 10. 1972 Родни Р. Портер (1917-1985) и Джеральд М.Эдельман (1929)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытия, касающиеся химической структуры антител».

Портер поставил себе задачу найти те части молекулы, которые ответственны за способность антитела специфически связываться именно с тем антигеном, против которого они выработаны. Он нашел, что это действительно могло быть сделано при помощи протеолитического (расщепляющего белки) фермента папаина. По некоторым причинам у него была уверенность, что антитело должно иметь два идентичных сайта связывания. Расщепив молекулу антитела, Портер получил два одинаковых малых Fab-фрагмента и один непарный большой Fc-фрагмент. Портер обнаружил, что Fab-фрагменты сохраняют способность связывания с антигеном, а Fc-фрагмент таким свойством не обладает. Поначалу Портер считал, что молекула антитела представляет собой линейную цепочку из примерно 1300 аминокислотных остатков.

Эдельман исходил из предположения, что если уж молекула инсулина, имеющая в своем составе только 51 аминокислотный остаток, состоит из двух цепей, то

антитело, молекулярная масса которого на десятки раз больше, должно состоять из нескольких полипептидных цепей, скрепленных скорее всего дисульфидными мостиками. Поскольку эти последние связи довольно слабы, Эдельман испробовал методы, способные их разорвать. В 1961 году Эдеяьман и М. Пулик сообщили, что им удалось разделить молекулу на отдельные полипептидные цепи: две «легкие» (L) и две (в два раза более длинные) «тяжелые» (H) цепи. Ни одна цепей не обладала специфической способностью связываться с антигеном.

Портер объединил эти данные с результатами собственных исследований и 1962 году объявил о создании модели молекулы антитела, которая с тех пор стала общепринятой. Согласно Портеру, молекула антитела (иммуноглобулина класса G) имеет вид буквы Y. Каждая из двух ветвей сформирована одной легкой цепью передней частью тяжелой цепи, а стебель образован задними частями тяже, цепей. Различные цепи залегают бок о бок, скрепляемые дисульфидными связями. Таким образом, способность к специфическому связыванию, свойственная кончикам ветвей, основана на взаимодействий между свободными концами легкой и тяжелой цепей, каждая из которых сама по себе неактивна.

Портер и Эдельман объединили усилия своих лабораторий, и периодически обсуждли полученные результаты на совместных рабочих совещаниях. Было установлено, что и в легких, и в тяжелых цепях есть вариабельные и константные области. Ценную информацию принесло сравнение структуры антител различной специфичности и антител, полученных от животных разных биологических видов.

Стало возможным определение аминокислотной последовательности в полипептидных цепях, из которых состоят молекулы антител. Проделав огромную работу, сотрудники Эдельмана к 1969 году полностью расшифровали первичную структуру молекулы иммуноглобулина (все 1300 аминокислотных остатков) и определили в ней домены, ответственные за различные функции антител [1].

Как известно, существует несколько главных классов антител с различными функциями и характеристиками. Легкие цепи во всех видах антител принципиально одни и те же (хотя и обладают разной электрофоретической подвижностью), а тяжелые цепи в каждом классе - свои. Задние части тяжелых цепей в стебле определяют способность антител активировать систему комплемента, который например, при контакте антитела с некоторыми клетками и микробами раствору и уничтожает их. В этой же части молекулы расположены химические группы, которых зависит способность антитела проникать сквозь некоторые мембраны, например, сквозь плаценту от матери в организм плода.

Эдельман и Портер дали миру ясное изображение структуры и механизм действия антител - важнейших биологических веществ. Этим они заложили надежную основу для дальнейшего изучения иммунных процессов метода точных наук, то есть создали то, чего иммунологии так недоставало. Открытие тотчас же вызвало «взрыв» иммунологических исследований по всему миру.

В 1967 году Эдельман и Дж. Хелли предложили гипотезу, которая должна была указать решение парадокса, связанного с необходимостью генетической заданности 10 млн. возможных вариантой антител. Согласно гипотезе, каждая цепь (Н и L) в молекуле антитела определяется лишь одной парой генов. В ходе развития клеток, синтезирующих антитела, эти гены рекомбинируют, в результате чего и возникает такое обилие вариантов белка. Эта гипотеза получила признание только в конце 1970-х годов, когда была подтверждена методами генной инженерии.

Последовавшие вслед за признанием поиски быстро привели к результатам, ценным для клинической диагностики и терапии.

Глава 11. 1977 Розалин Ялоу (1921)

Формулировка нобелевского комитета:

«за открытие метода радиоиммунологического исследования пептидных гормонов ».

Ялоу и Соломон Берсон оказались способны устранить возникшее препятствие на пуги развития физиологии и сделали это наиболее неожиданный способом. К середине 1950-х годов они обнаружили, что в организме людей, которым для лечения диабета или шизофрении вводили инсулин, возникали антитела против; данного гормона. Этот вывод противоречил преобладавшей в то время концепция, согласно которой столь малый фрагмент белка (51 аминокислотный остаток) не может обладать антигенной активностью. Для принятия научным сообществом нового; взгляда потребовалось значительное время. Были получены и другие важные данные. Так, антитела образовывали растворимые комплексы с инсулином, к молекуле которого была присоединена радиоактивная метка (изотоп йода). Добавление в смесь немеченного (обычного) инсулина влияло на связывание меченного инсулина с антелами. Другими словами: процент меченого инсулина, связывающегося с антителами, является функцией общей концентрации инсулина в растворе. Этот факт стал отправной точкой для радиоиммунологического определения инсулина, а позднее всех прочих пептидных гормонов в крови и других жидкостях и тканях тела.

В серии блестящих, признанных теперь классическими, статей 1956-1960 годов Ялоу и Берсон подробно описали свой радиоиммунологический метод (англ. radioimmunolodical assay - RAI) определения пептидов [3]. Это было захватывающим воображение соединением иммунологии, изотопных методов, математики и физики. RAI настолько чувствителен, что позволяет определять инсулин в концентрации 10-20 пг/мл, а АКТГ - менее 1 пг/мл {одна триллионная доля грамма в одном миллилитре).

Глава 12. 1980 Бару Бенацерраф (1920), Жан Доссе (1916) и Джорд Д. Снелл (1903)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытие метода радиоиммунологического исследования пептидных гормонов ».

Снелл изучал на мышах возможность пересева опухолей и установил, что переносимость опухолей детерминирована присутствием на поверхности клеток особых белково-углеводных комплексов, которые Снелл назвал антигенами тканевой совместимости, или Н-антигенами. Правила переносимости опухолей, которые вывел Снелл, оказались приложимы и к нормальной ткани, такой как кожа. При пересадках тканей клетки трансплантата, несущие на своей поверхности чужой для организма набор антигенов, входят в контакт с клетками иммунной системы организма-хозяина. Те вырабатывают защитную реакцию и отторгают чужую ткань.

В 1946 году Снелл обнаружил, что Н-антиген идентичен антигену, описанному Горером. Объединив свои усилия, Снелл и Горер начали серию исследований на мышах чистых линий. (Чистой линией, или просто линией, называется потомство, полученное в результате многократных близкородственных скрещиваний и ставшее генетически однородным, как монозиготные близнецы.)

После длительных экспериментов, результаты которых однажды были уничтожены пожаром в лаборатории, Снеллу удалось доказать, что формирование Н-антигенов детерминировано генами (Снелл назвал Н-генами), находящимися в пределах одной области в одной хромосоме. Эта область получила название гладкого комплекса гистосовместимости (англ. major histocompatibility complex - MHC), МНС был обнаружен у всех исследованных классов позвоночных - у рыб, рептилий, птиц и млекопитающих, В пределах МНС мыши было установлено существование приблизительно 80 различных генов. Участие МНС в регуляции важных иммунологических реакций позволило Снеллу назвать гены МНС «супергенами». Он усомнился в том, что истинное их назначение -- сопротивляться пересадкам тканей, поскольку трансплантация - ситуация искусственная, в природе почти не встречающаяся. Возникал вопрос: зачем природа создала механизм защиты от пересадок?

Между 1930 и 1950 годами иммунологические закономерности трансплантаций устанавливались в опытах на мышах и ничего не было известно о соответствующей системе в организме человека. Экспериментальные пересадки тканей здесь невозможны. Выход нашел Доссе, обнаруживший громадное значение лейкоцитов (белых клеток крови) для реакции отторжения. Первоначально Доссе изучал аутоиммунные болезни, в том числе он исследовал пациентов, перенесших многократные переливания крови. В 1954 году Доссе обнаружил, что кровь таких пациентов содержит антитела против донорских лейкоцитов. Эти антитела агглютинировали (склеивали) лейкоциты большинства других людей, но не свои собственные. Подтверждение этому Доссе получил, исследуя антитела в крови женщин, родивших нескольких детей. В конце 1950-х годов он идентифицировал первый антиген (белок) гистосовместимости человека. Вскоре были описаны и другие подобные антигены. По месту своей локализации (на мембранах белых клеток крови) они были названы человеческими лейкоцитарными антигенами (англ. human leukocyte antigens - HLA). В 1965 году Доссе показал, что они детерминированы единой системой генов, локализованных на одной хромосоме [4]. Их назвали HLA-генами. Так Доссе открыл человеческий эквивалент МНС мышей. Вскоре было выявлено, что сходство систем МНС и HLA намного больше, чем первоначально предполагалось. Доссе показал, что в пределах HLA-системы человека, как и в МНС мышей, есть две доминирующих области. Была выдвинута гипотеза о существовании двух тесно сцепленных локусов (А и В). Позднее были открыты локусы С и D. Все они расположены в маленькой области хромосомы 6. Каждый из них может встречаться в нескольких альтернативных формах. Так, ген А встречается по крайней мере в 15 вариантах, В - в 29, С - в 9 и D - в 12-ти. Индивид может иметь два варианта каждого их этих генов - по одному в каждой хромосоме 6-й пары. Вероятность того, что два человека, не состоящие в кровном родстве друг с другом, получат одинаковый набор HLA-генов, мала, так как число возможных комбинаций превышает 100 млн. Монозиготные близнецы всегда имеют одинаковый набор HLA-генов.

Сподвижниками Доссе в это время были Ф. Киссмейер-Нильсен и многие др. Они, как до них это делали исследователи фагов, объединились в интернациональную труппу, члены которой в конце 1960-х - начале 1970-х годов регулярно обменивалась информацией, в том числе путем периодического проведения рабочих совещаний по гистосовместимости. Движущим фактором прогресса в этой области была вера членов группы в то, что результаты их труда позволят решить главную проблему, связанную с пересадками органов.

Работая с Эдельманом (Нобелевская премия 1972 года), Бенасерраф обнаружил, что одни морские свинки в ответ на введение простых антигенов (синтетических полипептидов) вырабатывали антитела, другие - нет. Бенасерраф понял, что способность реагировать таким образом детерминированна генетически. Он назвал эти факторы Ir-генами (англ, immune response - иммунный ответ). В 1965 году его коллеги описали подобные гены у мышей и выяснили, что они входят в МНС. В конце 1960-х годов Бенасерраф и его сотрудники в опытах на морских свинках чистых линий проверили эти данные.

В 1976 году другие авторы показали, что белки-продукты трансплантационных генов регулируют процесс, в ходе которого Т-лимфоциты отличают нормальные клетки своего организма от чужих (трансплантат) или переродившихся своих (опухоль) клеток. Иммунная система постоянно следит за тем, чтобы собственные клетки тела не изменяли своих уникальных поверхностных характеристик. Изменение этих характеристик может произойти при встрече с вирусом или когда нормальная клетка трансформируется в клетку опухоли. Именно в этих случаях способность отличать «свое» от «не-своего» становится очень важной; изменившиеся клетки должны быть обнаружены и уничтожены. Вскоре было выяснено, что Ir-гены, как и трансплантационные гены, входят в состав МНС. Продукты трансплантационных генов получили название молекул класса I. а продукты Ir-генов -- молекул клаcca II.

Таким образом, главное назначение МНС -- организация системы иммуннологического надзора, а отторжение трансплантатов лишь побочный результат деятельности МНС. В нормальном организме иммуннологический надзор сбалансирован так, чтобы организм внезапно не отреагировал против своих же собственных здоровых клеток. Если же такое случается, то возникают аутоиммунные заболевания, такие как, например, ревматоидный артрит.

Глава 13. 1984 Нильс К. Ерне (1911-1994), Георг Й. Келлер (1946-1995) и Сезар Мильштейн (1927-2002)

Формулировка нобелевского комитета: «за теории, касающиеся специфичности в развитии и регуляции иммунной системы и открытие принципа производства моноклональных антител».

Нильс К. Ерне

Иммунная система должна распознавать огромное количество чужеродных антигенов и специфически реагировать с каждым. Вопрос о причинах разнообразия в иммунной системе оставался долгое время открытым. Как лимфоциты развивают свои жизненно важные свойства и как они создают высокочувствительную систему распознавания антигенов? Все это озадачивало многие поколения исследователей.

В 1955 году Ерне предложил теорию естественного отбора в антителообразовании. Согласно этой теории каждый индивид имеет огромное количество естественных антител со специфичностями для всех антигенов, с которыми его организм может встретиться. Антитела развиваются уже во внутриутробной жизни, то есть в отсутствии каких-либо внешних антигенов. Когда появляется чужеродный антиген, он выбирает себе наиболее подходящую молекулу антитела. Реакция «антиген-антитело» стимулирует производство антител именно этой специфичности. Эта теория противоречила инструктивным теориям, которые преобладали в то время. Согласно этим теориям, антиген служит шаблоном для производства антител. В теории естественного отбора Ерне подразумевается, что возникновение огромного числа специфичностей антител происходит независимо от экзогенных антигенов. Эти представления и составляют основу современной иммунологии.

Если теория естественного отбора трактует вопросы созревания иммунной системы после того, как она приобрела способность реагировать с антигеном, то в теории соматического природы иммунного распознавания (1971) Ерне объяснил, как созревают лимфоциты, способные реагировать с антигеном. Он предположил, что каждый индивид обладает всеми генами, необходимыми для производства антител и антителоподобных молекул, которые могут связывать все сильные трансплантационные антигены. Ерне полагал, что лимфоциты созревают в тимусе и в других лимфоидных органах. Клетки, распознавшие антигены, активируются и начинают делиться. По мере того, как в быстро делящихся клетках накапливаются мутации, могут развиваться новые иммунологические специфичности. В то же самое время специфичности лимфоцитов к собственным трансплантационным антигенам ослабляются. Зрелые лимфоциты распознают чужеродный антиген. Теория объясняет, как иммунная система нормально созревает под влиянием собственных антигенов. Она также объясняет, как иммунологическая специфичность регулируется генами, принадлежащими к системе трансплантационных генов.

В теории сети Ерне (1974) объясняет, как регулируется специфический иммунный ответ. Основанием для теории стало наблюдение того, что антитела могут вызывать образование апти-антител, направленных против антиген-связывающих структур первого антитела. Кроме того, анти-антитела могут стимулировать производство следующею поколения антител - анти-анти-антител. По существу, этот каскад антител бесконечен, он последовательно добавляет иммунной системе всё новые специфические свойства. Различные поколения антител или стимулируют, или подавляют производство друг друга. В обычных условиях сеть сбалансирована. Однако когда появляется антиген, равновесие нарушается. Иммунная система пробует восстановить равновесие, что ведет к иммунному ответу на антиген. Теория мощно стимулировала исследования и привела к более глубокому проникновению в природу иммунной системы. Позднее она была приложена к диагностике и лечению болезней.

Георг Й. Келлер и Сезар Мильштейн

Известно, что в организме есть клетки - лимфоциты, которые могут производить миллионы различных антител. Однако каждая отдельная клетка может производить антитела только с определенной специфичностью. Причина возникновения множества антител - не более, чем обилие лимфоцитов. Если организму представлен некий чужеродный антиген, может произойти активация лимфоцита, который случайно обладает способностью опознавать именно данный антиген. Этот лимфоцит начинает делиться и формирует клеточный клон, производящий идентичные моноклинальные антитела. В обычных условиях развитие клона находится под жестким контролем. Иногда же организм теряет контроль над антителопродуцируюшим клоном, что может привести к возникновению особого типа опухоли - миеломы. Клетки миеломы обычно сохраняют способность производить определенные антитела.

Антителопродуцирующие лейкоциты - это высокоспециализированные клетки. Поэтому они не могут долго жить в культуре клеток (вне организма). Клетки миеломы,

наоборот, иногда удается выращивать в питательной среде непрерывно. Долгое время биологи и медики лелеяли мечту получить клоны клеток, производящих антитела заданной специфичности. Эта мечта осуществилась, когда Кёлер и Мильштейн в 1975 году предложили гибридомную технологию производства моноклональных антител [5]. Принципиально способ получения гибридомы таков. Мышей иммунизируют избранным антигеном. Затем клетки их селезенки перемешивают с культурой миеломных клеток. Результат смешивания называется гибридомой. Как ни странно, гибрид двух типов клеток способен выживать и делиться. В этот гибрид клетки миеломы вносят способность к выживанию, в то время как клетки селезенки направляют синтез на производство антител с заданной специфичностью. Специальными мерами можно достичь размножения клеток гибридомы, а не только клеток миеломы. Полученную гибридную культуру разбавляют, чтобы выделить колонии, происходящие от единичных гибридных клеток. При помощи специального чувствительного метода определяют клоны, производящие специфичные антитела. Полученную гибридому можно использовать для безграничного производства высокоспецифичных антител.

Глава 14. 1987 Сусуму Тонегава (1939)

Формулировка нобелевского комитета: «за открытие генетического принципа происхождения разнообразия антител».

В 1976 году Тонегава сумел путем ряда изобретательных экспериментов показать, как части генома клетки (ДНК) перераспределяются в ходе дифференцировки от зародышевой клетки до В-лимфоцита, производящего антитела. К 1978 году Тонегава уже мог детально разъяснить, как те части генома, которые порождают, антитело, перемещаются так, чтобы позволить каждому В-лимфоциту производить; свои собственные уникальные антитела. Тонегава ответил на вопрос, как генетический материал В-клеток может создавать бесконечное число структур различных антител [6]. В 1976 году он убедительным и изящным способом смог показать как различные гены иммуноглобулина, которые были далеко друг от друга в зародышевой клетке, в В-лимфоците входят в более близкий контакт. В ходе развития от зародышевых клеток к антителобразующему В-лимфоциту гены, формирующие иммуноглобулины, перераспределяются. Различные части генома перемещаются, повторно объединяются и могут быть даже «потеряны», чтобы, наконец, создать ДНК, которую находят в зрелом В-лимфоците.

У человека гены для длинных цепей расположены в хромосоме 14, для к- на хромосоме 2 и для л-цепей - на хромосоме 22. Три группы генов участвуют» создании переменной части длинной цепи, которая вместе с неременной частью короткой цепи является специфичной для каждою антитела. Эти гены получили названия V, D и J. Короткая цепь детерминируется генами V и J. У человека число V-генов для длинных цепей примерно 200, и, кроме того, есть приблизительно 20 D генов и 4J-гена. Когда для синтеза антитела нужен функционирующий ген, по одному V-,D- и J-гену в случайном порядке берется от трех групп генов. Этот можно сравнить с лотереей, где число номеров равно 16000, то есть 200 х 20 х 4.

Случайный порядок сборки генов V, D и J еще более увеличивает обилие вари тов. И поскольку гены V и D часто неодинаковы (наследуются и от отца, и от матери), это уже означает уже возможность примерно 5 млн. различных вариантов переменной части длинной цепи. Последний вклад вносит легкая цель с ее 10 тыс. антов. Итоговая сумма составляет много миллиардов возможных форм антитела.

Человек хорошо подготовлен к встрече с любым возможным антигеном. Вероятно, только незначительная часть типов антител когда-либо используется. Иммунная система чрезвычайно экономична в использовании ДНК. В то же самое время производится большое количество лимфоцитов, и только некоторые из них будут когда-либо участвовать в иммунной защите организма. Экономия ДНК, таким образом, соседствует с очевидным расходованием клеток. Однако такой порядок позволяет сохранять состояние высокой готовности, которая требуется против возможных новых инфекционных болезней.

Глава 15. 1996 Питер К. Догерти (1940) и Рольф М. Цинкернагель (1944)

Формулировка нобелевского комитета:

«за открытия, касающиеся специфичности клеточно-опосредованной иммунной защиты».

Цинкернагель и Догерти в опытах на мышах изучали, как иммунная система и особенно Т-лимфоциты, защищают организм от проникших в него вирусов менингита. В организме инфицированных мышей развивались Т-лимфоциты-киллеры, которые in vitro могли убивать клетки,]инфицированные вирусом. Но было сделано и неожиданное открытие: Т-лимфоциты, полученные от мыши линии А, в пробирке успешно уничтожали пораженные вирусом клетки, полученные от мышей той же линии А, но оказывались неактивны против таких же пораженных вирусом менингита клеток, полученных от мышей В. Таким образом, для того,чтобы пораженная клетка была уничтожена лимфоцитами-килерами, она должна быть не только инфицирована вирусом, но и нести на своей поверхности то же вариант антигенов гистосовместимости, что и в организме, из которого были взяты лимфоциты-киллеры. Несколько упрощая, можно сказать что лимфоциты уничтожали пораженные клетки только в собственном организме, а в чужом теряли свою активность.

Результаты работы Цинкернагеля и Догерти, которые были опубликованы в Nature в 1974 году [7], убедительно продемонстрировали, что клеточная иммунная система должна одновременно распознавать и чужеродную молекулу, например, молекулу вируса, и молекулу МНС собственного организма. Стало очевидным, что антигены МНС играют важнейшую роль в нормальном иммунном ответе, а не только в отторжении трансплантатов.

Впоследствии Догерти и Цинкернагель предложили две модели. Одна описывает единичное распознавание измененных тканей собственного организма (когда антиген гистосовместимости изменен вирусом). Вторая модель объясняет двойное распознавание «чужого» и «своего». В течение нескольких лет было продемонстрировано, что только те Т-лимфоциты, которые оказываются способными распознавать трансплантационные антигены собственного организма, выживают и созревают, остальные - элиминируются (не получают развития и исчезают). Поэтому, принцип одновременного (двойного) распознавания важен для способности иммунной системы отличать «свое» от «не-своего». Дальнейшие молекулярные исследования подтвердили обе модели Цинкернагеля и Догерти, а также разъяснили структурную основу их открытия. Небольшая часть молекулы, например, пептид из состава вируса, непосредственно привязана к определенной переменной части антигенов гистосовместимости организма. И именно этот комплекс узнается специфичными молекулами распознавания Т-лимфоцитов (рецепторами Т-клеток).

Раскрыв механизмы, используемые иммунной системой, для того, чтобы отличать микробы от молекул собственного тела, открытие Догерти и Цинкернагеля существенно изменило представления о развитии и нормальном функционировании иммунной системы и обеспечило новые возможности для направленного влияния на иммунные реакции.

Глава 16. 1997 Стенли Б. Прузинер (1942)

Формулировка нобелевского комитета: «за его открытие прионов - новой биологической причины инфекций».

Вначале 1970-х годов в клинике Калифорнийского университета Прузинер наблюдал пациента, который медленно умирал от ВКЯ. При этом возбудителя столь грозного заболевания никак не удавалось выявить. Этот «медленный вирус», как его тогда называли, поразил воображение Прузинера, и он подумал, что определение молекулярной структуры этого неуловимого агента могло бы стать прекрасной темой для исследовательской работы.

Чем больше он читал о куру и скрапи, тем больше его интересовала эта проблема. Прузинер получил место ассистента и начал обустраивать лабораторию для изучения скрапи в 1974 году, хотя было довольно трудно получить финансирование по этой тематике. Пробы упорно выявляли только белок, но не нуклеиновые кислоты.

Прузинер решил точно идентифицировать болезнетворное начало. Этому препятствовала длительность инкубационного периода болезни. Всякий раз произведя заражение животных, Прузинер был вынужден использовать множество мышей в каждом эксперименте терпеливо ждать около 200 дней до появления симптомов заболевания. Усилия по очищению ускорились, когда было показано, что скрапи может быть привита хомякам, у которых инкубационный период заметно короче.

После десяти лет усилий Прузинер и его коллеги выделили инфекционный агент из мозга больных хомяков. Эксперименты упорно свидетельствовали, что он состоял из одиночного белка, который Прузинер назвал прионом (англ. prion от Proteinaceous Infectious particle белковая инфекционная частица).

В сотрудничестве с коллегами Прузинер выделил прион-белок PrP (англ. Prion protein), определил часть последовательности аминокислот. Далее получение антител к прион-белку сделало возможным определение его локализации в клеточной мембране.

Выводы, к которым пришел Прузинер в первой половине 1980-х годов, вызвал естественное недоверие вирусологов. Его взгляды явно противоречили традиции согласно которой структура белка определяется информацией, хранимой и переносимой нуклеиновыми кислотами. Большинство биологов и врачей не желали даже всерьез рассматривать идею о существовании прионов, поскольку абсолютно все открытые за почти полтора столетия инфекционные агенты (вирусы, бактерии, грибы, простейшие) обязательно содержали в себе генетический материал (ДНК или РНК). При разрушении нуклеиновых кислот болезнетворность агента исчезала. Прузинер проявил должное упорство, и к началу 1990-х годов доказательства существования прионов возобладали над всеобщим скептицизмом. Теория прионов была принята значительной частью научного сообщества.

Ген приона (Prnp) обнаружили в 1985 году у млекопитающих и птиц, а затем и у человека [8]. Оказалось, что нормальный прионовый белок - обычный компонент лейкоцитов, но особенно часто он встречается на поверхности нейронов мозга.

Обнаружение гена приона у всех исследованных (нормальных!) животных; заставило задуматься о том, как могут прионы быть причиной тяжелейших заболеваний мозга. Казалось очевидным, что Прузинер ошибся.

Пришлось ввести различие между двумя формами прион-белка. Нормальная форма РгР получила обозначение РгРС, а прионная - РгРSс (где Sс означает scrapie). В отличии от нормальной, прионная форма повышенно гидрофобии и склонна к образованию агрегатов, она также более устойчива к протеазам. РгРSс имеет конформацию с повышенным содержанием в-складчатой структуры, он чрезвычайно стабилен и резистентен к действию ферментов, органических растворите и высоким температурам (выше 100 °С).

Механизм инфицирования предполагается таким: РгРSс, связываясь с клеткой, способствует превращению РгРС в РгРSс. Иногда превращение РгРС в РгРSс происходит спонтанно - спорадическое возникновение прионного заболевания. Причина наследственных прионных болезней - измененный ген, кодирующий белок, который повышенно склонен к спонтанному превращению в РгРSс. Журналисты тотчас окрестили нормальный РгРС «доктором Джекилем», а патогенный РгРSс - «мистером Хайдом», подчеркнув тем самым, что одна и та же сущность может иметь два противоположных проявления. При смешивании in vitro РгРС с РгРSс нормальный белок превращается в прионный очень медленно: за несколько месяцев или лет РгРSс накапливается до уровня, приводящего к повреждению та мозга.

Точный механизм прионного превращения еще не известен. Согласно гетеродимерной модели самого Прузинера, мономер РгР катализирует переход РгРС в РгРSc через образование комплекса РгРС/РгРSс. Полимеризационная модель рассматривает прион как упорядоченный полимер РгР, или одномерный кристалл. Его присутствие вызывает дальнейшую полимеризацию, подобно тому, как это происходит с истинными кристаллами. Различия, которые не только существуют между отдельными штаммами прионов, но и передаются от одного животного другому, лучше объясняются полимерной моделью (различная закладка РгР в фибриллы). Предполагается, что так же образуются и фибриллы амилоидообразующих белков. Возможно даже, что прионы - инфекционная разновидность амилоидных фибрилл.

Прузинер предположил, что наследственные формы прионных заболеваний зависели от мутаций в гене приона. Уверенность в том, что это, возможно, появилась после того, как мутантные гены были перенесены мышам. Эти трансгенные мыши заболели болезнью, сходной со скрапи. В 1992 году исследователи смогли уничтожить ген, кодирующий прионы у мышей, получив так называемых «мышей с выбитыми прионами». Было показано, что эти мыши полностью резистентны к заражению прионами. Более того, когда ген приона был повторно введен мышам, они снова стали восприимчивы к прионной инфекции. Пока непонятно, почему остаются здоровыми мыши prion knock-out. Выходит, что нормальный белок приона не является обязательным для жизни.