2.2.6 Метод раздавленной капли

Применяется при исследовании морфологии и подвижности микроорганизмов.

Каплю микробной суспензии помещают на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. При работе с культурой, выросшей на твердой среде, на предметное стекло наносят каплю водопроводной воды, затем стерильной пипеткой берут небольшое количество культуры и перемешивают ее в капле. Покрывное стекло помещают ребром на предметное и осторожно помещают его на суспензию, следя за тем, чтобы между стеклами не было пузырьков воздуха. Избыток жидкости удаляют полоской фильтровальной бумаги.

2.2.7 Определение общего количества микроорганизмов (КОЕ)

Сущность метода заключается в определении в 1 см³ воды общего содержания мезофильных аэробов и факультативных анаэробов при культивировании на синтетической питательной среде при температуре 40 С в течении 24 часов. Определение начинают с приготовления разведений. Для этого в несколько пробирок наливают 10 см³ стерильной воды. В первую пробирку стерильной пипеткой добавляют 1 см³ исследуемой воды. Новой стерильной пипеткой вносят пробу в пробирку со стерильной водой, после чего этой же пипеткой набирают 1 см³ из приготовленного разведения и переносят во вторую, из второй в третью и т. д. Из каждой пробы делают посев не менее двух различных объемов, выбранных с таким расчетом, чтобы на чашках выросло от 30 до 300 колоний. По истечении 24 часов при температуре 40 С подсчитывают число выросших колоний. Если выросло большое количество колоний, то дно чашки делят на секторы и подсчет ведут в каждом отдельном секторе. Результаты подсчета выражают в количестве бактерий на 1 см³ анализируемой воды с учетом посеянного объема.

2.2.8 Приготовление бактериальной суспензии

Стерильную жидкую синтетическую среду разливают в стерилизованные конические колбы по 100 см³.

Для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, делают посев на скошенный агар.

Подготовленные таким образом культуры инкубируют в термостате 24 ч при температуре (385)С, по окончании чего в пробирки с микроорганизмами вводят 5 см³ соответствующей жидкой синтетической среды, осуществляя процесс механического воздействия. Приготовленную таким образом бактериальную суспензию вносят в колбы, содержащие по 100 см³ соответствующей жидкой синтетической среды.

Культивирование микроорганизмов проводят в термостате при температуре 385С, с переменным механическим воздействием, осуществляемом на Shaker Type, с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 2 ч в сутки.

2.2.9 Определение протеолитических свойств микроорганизмов

Протеолитические свойства проявляются выделением во внешнюю среду протеолитических ферментов, которые расщепляют белки до промежуточных продуктов (пептоны, полипептиды, аминокислоты) или до продуктов конечного распада (индол, сероводород, аммиак и др.)

Для выявления протеолитических ферментов исследуемую культуру засевают в питательную среду, содержащую тот или иной белок (МПЖ, молоко и др.)

Посевы в МПЖ культивируют 5...7 суток при комнатной температуре, так как желатин расплавляется в термостате. Микробы, обладающие протеолитическими свойствами, разжижают желатин. Многие протеолитические микроорганизмы дают разный характер разжижения: послойное (идущее ровно, сверху вниз), воронкообразное, кратерообразное, реповидное, в форме чулка и т. д.; микроорганизмы, не обладающие протеолитической способностью, дают в МПЖ рост без разжижения желатина.

2.2.10 Определение индолообразования

Определение индола проводят по методу Морелли, путем использования полосок фильтровальной бумаги, смоченных горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты (12 %-ным) и высушенных термостате. Бумажки помещали под пробку в пробирку с бульонной культурой. Культуру выращивают в течении трех суток в термостате, после чего определяют резуьлтаты взаимодействия продуктов жизнедеятельности микроорганизмов с щавелевой кислотой. Положительная реакция - порозовение нижней части бумажки.

2.2.11 Обнаружение сероводорода

Для обнаружения сероводорода делается посев уколом (внутрь столбика) по стенке в агар с ацетатом свинца (МПА с 5 % пептона и 0,25 % ацетата свинца) или в пробирку с МПБ, в которую под пробку над средой помещается полоска стерильной фильтровальной бумаги, пропитанной раствором ацетата свинца. Если исследуемая культура при разложении белка выделяет сероводород, то появляется темно-бурое окрашивание (почернение) по месту укола в плотной среде или на фильтровальной бумажке (в МПБ).

2.2.12 Определение аммиака

Определение аммиака начинают с того, что под пробирку с бульонной культурой помещают розовую лакмусовую бумажку, культуру термостатируют при 37⁰С в течение 1...3 суток. При наличии аммиака лакмусовая индикаторная бумажка приобретает синюю окраску.

2.2.13 Определение редуцирующей способности

Редуцирующую способность определяют посевом культуры на молоко с метиленовым синим. К стерильному молоку добавляют по капле 1 %-ный водный раствор метиленового синего до голубого окрашивания. После культивирования засеянного материала бактерии, обладающие редуцирующей активностью, обесцвечивают лакмусовое молоко (под редукцией понимают химический процесс, заключающийся в отщеплении от вещества кислорода или присоединении к нему водорода).

2.2.14 Определение каталазы

Для определения каталазы в 3...5 суточную бульонную культуру, выращенную в пробирке, вносят 1 см³ 3 %-ного раствора пероксида водорода. При наличии фермента каталазы обнаруживают обильное выделение пузырьков отщепленного кислорода, т.е. образуется так называемая “пенистая шапка”.

2.2.15 Определение сахаралитической способности («пестрый» ряд)

Микроорганизмы характеризуются неодинаковой способностью использовать различные соединения углерода для конструктивного и энергетического обмена. Для идентификации большинства гетеротрофных микроорганизмов необходимо определить, какие углеродсодержащие вещества обеспечивают рост данного организма и какими изменениями среды сопровождается его рост.

Как правило, используют следующие углеводы: арабинозу, ксилозу, глюкозу, фруктозу, галактозу, сахарозу, лактозу, мальтозу и спирты - глицерин и маннит.

Готовят среду основного состава на водопроводной воде (г/дм³): пептон - 5,0; гидрофосфат калия (К₂НРО₄) - 1,0 и индикатор Андреде: кислый фуксин - 0,5; вода - 100 см³; нормальный раствор гидроокиси натрия - 16,4 см³.

Среду разливают в пробирки по 9 мл в каждую и стерилизуют при 1 атм. Углеводы и спирты рекомендуется стерилизовать отдельно при давлении 0,5 атм в виде 10 %-ных водных растворов и добавлять после стерилизации к стерильной среде в количестве 1 %. Растворы дисахаридов лучше стерилизовать фильтрованием, чтобы избежать их гидролиза при высокой температуре.

Среды с углеводами и спиртами засевают одновременно 0,1-0,2 мл суспензии клеток изучаемого микроорганизма и ставят в термостат. Если микроорганизм развивается быстро, то результаты можно регистрировать через 48-96 часов, а если медленно - через 7-10 суток.

Визуально по помутнению среды, образованию плёнки, осадка отмечают рост или его отсутствие на всех использованных средах. Рост на средах с этими соединениями может приводить к накоплению органических кислот, нейтральных продуктов и газов. Образование кислот отмечают по изменению рН среды; образование газов - по появлению на поверхности среды пены или в толще среды “глазков”, или по “газовкам” (маленьким пробиркам - ампулам, опускаемым на дно пробирок с жидкой средой и направленным закрытым концом вверх). При рН 6,0 индикатор Андреде жёлтого, а при рН 7,0 синего цвета (соответственно при восстановлении цвет раствора меняется от соломенного до розового - малинового).

Результаты сравнивают с контрольной средой, не содержащей ни углеводов, ни спиртов.

На основании полученных результатов делают заключение о том, какие углеводы и спирты использует изучаемый организм.

Также могут использоваться среды Гисса с индикатором Андреде, полужидкие среды с индикатором “ВР” (водно-голубой краситель, обесцвеченный розоловой кислотой) и различные индикаторы: нейтральный красный, лакмус, фуксин основной и т.д.

2.2.16 Определение липолитической активности

Липолитические свойства культуры исследуются на среде определённого состава (бульон Штерна). Готовят бульон следующим образом: к 100 см³ МПБ добавляют 1 см³ глицерина и приливают 2см³ свежеприготовленного 10 %-ного водного раствора сульфита натрия, затем по каплям 10 %-й спиртовой раствор основного фуксина (? 5 кап.).

Культуры культивируют в термостате при 37 ⁰С. Отмечают изменение цвета среды, рН (лакмусовой бумагой), помутнение, наличие хлопков.

2.2.17 Определение активной реакции среды

Активная реакция среды, т.е. степень ее кислотности или щелочности, характеризуется качественно концентрацией водородных ионов. Концентрацию ионов водорода выражают величиной рН.

Величину рН определяют потенциометрическим методом при помощи потенциометра со стеклянными электродами.

Перед началом измерений прибор включают в сеть при помощи тумблера и дают нагреваться в течение 20 минут.

Электроды перед погружением в раствор тщательно промывают дистиллированной водой и просушивают фильтровальной бумагой.

Вначале измерение проводят по шкале от 0 до 14 (грубое определение), а затем переключают прибор на более узкий интервал.

Перед измерением рН сточную воду хорошо перемешивают и измеряют температуру для введения необходимых поправок.

2.2.18 Гидролиз (омыление) жира

В фарфоровую чашку или стакан помещают 3-4 г жира, 3-4 см³ спирта (образуя гомогенную массу с жиром и щелочью) и 5-6 см³ 30%- ного раствора гидроксида натрия. Смесь нагревают на плите или спиртовке с асбестовой сеткой, постоянно перемешивая стеклянной палочкой до однородной массы. Перемешивание прекращают, нагревают еще 10 минут, без кипения смеси. Образование мыла судят по появлению пены на поверхности раствора. Омыление происходит по следующей реакции:

CH₂?O ?CO ?R₁ CH₂OH

| |

CH? O ?CO ?R₂ + 3 NaOH > CHOH + 2 R₁COONa + R₂COONa

| |

CH₂? O ?CO ?R₁ CH₂OH

2.2.19 Определение содержания несвязанных жировых веществ (ГОСТ 26129-84 Шкурки меховые и овчина шубная выделанные. Методы определения несвязанных жировых веществ)

Навеску измельченной кожевой ткани или волоса массой 0,5-0,6 г взвешенною с погрешностью не более 0,0002 г, помещают в бумажную гильзу и закрывают тампоном. Гильзу закрепляют в предварительно доведенной до постоянной массы колбе и соединяют колбу с обратным холодильником. В колбу заливают 50 см³ хлороформа или дихлорэтана. Колбу с растворителем нагревают на электрической плитке с асбестовым покрытием. Продолжительность экстрагирования при анализе кожевой ткани - 45 минут, при анализе волоса - 15-20 минут. Растворитель должен постоянно кипеть и, охлаждаясь и стекая с холодильника, попадать в центр гильзы. В дальнейшем растворитель отгоняют и колбу с жировыми веществами доводят до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 128-130?С. Продолжительность первой сушки 30 минут, последующих - по 15 минут.

Массовую долю жировых веществ вычисляют по формуле (7):

Х₁ = Ч100, (7)

где Х₁ - массовая доля жировых веществ;

m - масса колбы с экстрагированными веществами, г;

m₁ - масса пустой колбы, г;

m₂ - масса навески кожевой ткани или волоса, г

2.2.20 Отбор проб методом асимметрической бахромы

Для сопоставимости результатов исследований различных факторов или технологических параметров необходимо исключить влияние топографии шкуры, полуфабриката или кожи. В этом случае для отбора средней пробы пользуются методом ассиметрической бахромы (МАБ), который заключается в следующем. Намечают необходимое число вариантов исследования и задаются числом образцов (полосок), входящих в группу, предназначаемую для каждого варианта (обычно не менее 4). Чем больше число образцов, тем более достоверным будет среднее значение, характеризующее вариант. Размер образца предопределяется набором физико-механических или физических испытаний, которые предполагается провести, а все образцы должны уложиться в прямоугольник, вписанный в чепрачную часть рисунок 4.

5	6
4	7
3	8
2	9
1	10
5	11
4	12
3	13
2	14
1	15

Рисунок 2 - Схема отбора проб методом асимметрической бахромы

2.2.21 Определение колористических показателей волосяного покрова

Колористические показатели волосяного покрова определяются на приборе «Пульсар». Образцы тщательно расчесываются, накрывают стеклом и фотографируют. Далее работают при установлении кнопки «режим» - 3.

Предварительно прибор прогревают в течение 30 минут, затем нажатием кнопки «сброс» очищают панели вывода.

Первоначально производят калибровку прибора, для этого устанавливают «режим» - 0 (калибровка прибора); «вывод» - 0. Белую пластину помещают на место отражающего образца; черную - на место измеряемого образца, нажимают «пуск », после загорания «Б» извлекают черную пластину. Снова нажимают «пуск», загорается «I» извлекают белую пластину. Устанавливают на индикаторе «режим» - 1; «вывод» - 0 (измерение прозрачных проб) на место прозрачного образца - дистиллированную воду, нажимают пуск.

Для измерения рабочего образца устанавливают пробу. Нажимают «пуск»,

3. Экспериментальная часть

При обработке пушно-мехового и овчинно- шубного сырья на предприятиях меховой промышленности образуется значительное количество сточных вод, характер которых определяется спецификой технологических процессов, осуществляемых в конкретном производстве. Сточные воды образуются после проведения основных жидкостных процессов: отмока, обезжиривание, пикелевание, дубление, крашение и т.д.

В них содержатся химические материалы, как вносимые для проведения технологического процесса, так и образующиеся в результате переработки мехового сырья. Так, после обезжиривания шкур овчины, сточные воды наряду с поверхностно-активными веществами, формальдегидом содержат значительное количество жировых веществ.

В настоящее время все большее применение находит биологическая очистка, основанная на способности микроорганизмов использовать загрязнения в качестве источников питания в результате своей жизнедеятельности. В связи с этим, целью дипломной работы являлось изучение свойств микроорганизмов, выделенных из жировых материалов и из сточных вод после процесса обезжиривания, исследование деструкции жиров на основе метода потенциометрического титрования, а также возможности применения бактериальной суспензии этих микроорганизмов в процессе обезжиривания меховой овчины.

3.1 Изучение морфолого-культуральных свойств микроорганизмов, деструктирующих жировые вещества

Для изучения морфологических и культуральных свойств микроорганизмов методом разведений на мясопептонном агаре (МПА) и на синтетической среде Рана (п.2.2.1), в которой в качестве источника углерода служил нерпичий жир, были выделены чистые культуры микроорганизмов в чашках Петри (п.2.2.2-2.2.3). Культивирование проводили в термостате при температуре (37±0,5)?С в течение 24. Выделенные культуры были обозначены как: Нв - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; Н - микроорганизмы, выделенные из жира нерпы; В - выделенные из шерстного жира; 3,7- культуры микроорганизмов, выделенные из сточных вод после проведения процесса обезжиривания меховой овчины.

По методам Грама, Трухильо (наличие спор), Леффлера (количество жгутиков) (п.п. 2.2.4), были изучены морфологические свойства путем окрашивания и микроскопирования мазков колоний.

Результаты изучения морфолого-культуральных признаков бактерий представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Сравнительная таблица морфолого-культуральных признаков исследуемых культур

Характеристики	В	Нв	Н	3	7
Место выделения	Природные жиры: шерстный, нерпичий.	Сточные воды после процесса обезжиривания
Морфология	Коккобактерии	Палочки, сцепленные между собой
Подвижность	+	+	+	+	+
Окраска по Граму	-	-	-	-	-
Окраска по Трухильо	-	-	-	-	-
Окраска по Леффлеру	+	+	+	+	+
Края колонии	Ровные
Профиль колоний	Выпуклый
Структура колонии	Однородная
Поверхность	Гладкая
Прозрачность	Матовая
Форма колоний	Круглая

Микроскопированием окрашенных мазков выявили, что все культуры грамотрицательные, расположение жгутиков перетрихиальное, спор не имеют. Культуры типа 3, 7 представляют собой палочки, сцепленные между бактерий; культуры типа Н, Нв и В по форме были отнесены к коккобактериям - мелким палочкам, близким к овальной форме.

Все культуры имеют точечные круглые колонии грязно-белого цвета, непрозрачные, матовые, с ровными краями, структура колоний однородная, профиль выпуклый.

Для изучения подвижности микроорганизмов была рассмотрена раздавленная капля бактериальной суспензии (п.2.2.6), в результате чего отмечено хаотичное движение бактерий, обусловленное перетрихиальным расположением жгутиков.

Ферментативная способность выделенных культур была определена на основе исследований протеолитической активности (п. 2.2.9), редуцирующей способности (п.2.2.13), анализа на индолообразование (п. 2.2.10), наличие сероводорода (п. 2.2.11), аммиака (п. 2.2.12), каталазы (п.2.2.14).

Результаты исследований, представленные в таблице 2, показали положительную реакцию для всех культур на наличие аммиака, на сероводород и каталазу - отрицательные. Изучение протеолитической активности показало, что все культуры растут без разжижения желатина, не выделяют индол и не обладают редуцирующей способностью, что свидетельствует о низких протеолитических свойствах исследуемых микроорганизмов.

Для изучения биохимической активности бактерий были проведены тесты на способность микробов к ферментативному расщеплению сахаров. В качестве субстратов, для определения ферментативной активности использовались такие сахара, как мальтоза, галактоза, глюкоза, сахароза. Расщепление может происходить на альдегиды, газообразные продукты, кислоты для этого был произведен посев культур на специальные среды с углеводами (п.2.2.15).

На жидкие среды, содержащие различные сахара, был произведен посев по 0,1 см³ суспензии клеток и термостатирование в течение 48 ч при температуре (37±0,5)?С. Наблюдения показали, что уже к 24 ч окраска сред изменилась от желтой до ярко малиновой и изменение рН.

Для определения липолитической активности был произведен посев на бульон Штерна (п.2.2.16), содержащего в качестве субстрата глицерин. Посев производили следующим образом для получения биомассы исследуемой культуры микроорганизмов, производили посев на скошенную синтетическую среду и культивировали в течение 24 часов при температуре, затем производили смыв полученной биомассы 10 см³ бульона Штерна, и термостатировали при температуре (37±0,5)?С в течение 96 часов.

На протяжении от 24 до 96 часов культивирования наблюдалось изменение окраски среды, помутнение, наличие пузырьков у поверхности среды, образование осадка и пленки. Уже к 24 часам культивирования было отмечено розовение окраски для всех сред, зараженных культурами. К 48 ч характерно образование пристеночного кольца на поверхности жидкости интенсивной розовой окраски. К 72 ч наблюдалось полное обесцвечивание растворов.

На основании проведенных исследований следует отметить, что исследуемые культуры микроорганизмов обладают липолитической активностью, что связано с вовлечением нерпичьего жира (в качестве источника углерода) в конструктивный и энергетический обмен, что подтверждается переходом окраски бульона из оранжевой в красную и изменением активной реакции среды.

3.2 Изучение деструкции жиров методом потенциометрического титрования

Метод основан на исследовании взаимодействия веществ с протонами потенциометрическим титрованием.

Кривые титрования позволяют:

- определить природу и число ионогенных групп в молекуле жира

- изучить влияние добавок щелочей на ионизацию эфирных групп жира

- оценить глубину и специфичность реакций жиров с микроорганизмами

- количественно определить деструкцию жиров.

Кривые титрования показывают зависимость числа связанных протонов омыленными жирами от рН среды. Величина рН измеряется непосредственно на приборе, число связанных протонов вычисляется. Число связанных ионов определяется по разности между общим числом добавленных ионов и числом свободных ионов в растворе.

Для изучения деструкции были выбраны следующие жиры: нерпичий, сульфатированный рыбий, шерстный, свиной и Tanning oil. Навеску жира, около 1г, взвешенную на аналитических весах, помещали в коническую колбу, в которой проводили щелочной гидролиз (п. 2.2.23), количественно переносили в мерную колбу на 250 см³ и объем доводили до метки дистиллированной водой. Затем отбирали пробу разбавленного гидролизованного жира 4 см³, переносили в стакан на 50 см³ и добавляли 33 см³ дистиллированной воды, для того чтобы мембрана стеклянного электрода была погружена в раствор. Измерение проводили на приборе рН-метр «Анион 7051» путем фиксирования значений рН раствора при добавлении по 0,1 см³ 0,1 н. раствора соляной кислоты. Параллельно проводили титрование раствора чистой щелочи (5 см³ 30% раствора NaOH переносили в мерную колбу на 250 см³, доводили до метки дистиллированной водой, для анализа брали 4 см³ раствора) и воды. При титровании соли жирной кислоты раствором кислоты происходит реакция обмена с образованием кислоты и соли:

RCOONa + HCl > RCOOH + NaCl

При титровании происходит помутнение раствора в момент образования жирной кислоты.

Для построения кривой титрования проводили расчет параметров по следующим формулам:

B = (C_Н * V₁)/(V₁+V) * 1000, где (1)

B - объем HCl, который добавлен к 100 см³ воды

C_Н - нормальная концентрация кислоты

V₁ - добавленный объем,см³

V - начальный объем раствора,см³

C = (- lg B) (2)

D - экспериментальное значение рН

Строим график зависимости C от экспериментальных значений рН (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)

Для изучения деструкции жира микроорганизмами предварительно были приготовлены бактериальные суспензии в колбах Эрленмейера на основе жидкой синтетической среды (п.2.2.8), содержащей около 1 г жира, объемом 200 см³ каждая. Культивирование микроорганизмов проводили в термостате марки (ТС-80М-2) при температуре (375)С, осуществляя переменное механическое воздействие, на встряхивателе «Shaker Type-357», с частотой колебаний 200 об/мин, амплитудой 6 по 1 ч в сутки в течение 48 часов. После чего проводили гидролиз содержимого колбы (п.2.2.23), переносили в мерную колбу на 250 см³, доводили объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивали. Затем отбирали объем пробы в количестве 4 см³ в стакан на 50 см³, добавляли 33 см³ дистиллированной воды. Титровали 0,1 н раствором соляной кислоты по 0,1 см³ на приборе рН-метр «Анион 7051» при температуре 20,6 єС. При каждом объеме добавленной кислоты фиксировали значение рН и строили графики зависимости рН от объема и количество функциональных групп (N) от значений рН.

Пример расчета параметров для построения кривых титрования жира при добавлении 3 см³ кислоты (сульфатированный рыбий жир):

B = (0,1 * 3)/(3+33) * 1000 = 8,33

C = (- lg 8,33) =0,9208

D = 12,33 (экспериментальное значение рН)

F = 3мл (количество с известной концентрацией раствора реагента, добавленное к раствору жира, см³)

G = 0,057(объем HCl, который добавлен к водному раствору жира, см³)

H = (-lg G) = 1,243

Строим график зависимости lg B от экспериментальных значений рН для воды (находим формулу по линии Тренда, для подстановки в W)

Рисунок 3- Кривая титрования воды 0,1н раствором соляной кислоты

Находим значение W при подстановки значений H в формулу, полученную по линии Тренда, вместо Х

-0,1233Х+3,6351=-0,1233*1,243+3,6351=3, 658

W = 3,658

J = 12,33

K = W- J = 3,658-12,33 = -8,061

L = 8,67

M = 1

N = (0,057*1*10)/0,139 =4,1109

Остальные расчетные данные представлены в таблице 4

Для определения количества групп СООН строим графики в координатах количество функциональных групп - рН.

Рисунок 4- График зависимости количества карбоксильных групп от значений рН

Из рисунка 4 видно, что в диапазоне Рн 4,37 до 11,56 кривая представляет собой вид прямой при количестве функциональных групп равных 2. Поэтому данное значение принимаем равным 2.



Рисунок 5 - Кривая титрования раствора сульфатированного рыбьего жира соляной кислотой

Кривая титрования омыленного жира характеризуется нейтрализацией избытка щелочи, олеатов и пальмитинатов натрия. Первой вступает в реакцию соль более слабой кислоты, так как полнее идет ее гидролиз. После полного гидролиза соли слабой кислоты в реакцию вступает натриевая соль более сильной кислоты. В результате нейтрализации образуются жирные кислоты, нерастворимые в воде, что сопровождается помутнением раствора. Качественное соотношение жирных кислот в жирах определялось по положению скачка на кривой потенциометрического титрования.

На основании обработки кривых потенциометрического титрования было определено, что исследуемые жиры - нерпичий, свиной, сульфатированный рыбий, шерстный и Tanning oil G могут содержать преимущественно олеиновую пальмитиновую и изомер пальмитиновой кислот. Кроме того в них могут содержаться незначительные количества линолевых кислот, миристиновой, пальмитолеиновой, арахидоновой.

Соли жирных кислот с одинаковым числом углеродных атомов титруются в один скачок - пальмитиновая и пальмитолеиновая. На кривой титрования четко выражены скачки, соответствующие нейтрализации солей жирных кислот. Расчетные данные показали, что количество групп СООН может составлять от 1 до 3 в расчете ммоль на г жира.



Рисунок 6 - Кривые титрования омыленного сульфатированного рыбьего жира, деструктированного микроорганизмами через 48ч

Рисунок 7 - Кривые титрования омыленного нерпичего жира, деструктированного микроорганизмами через 48ч

Рисунок 8 - Кривые титрования омыленного свиного жира, деструктированного микроорганизмами через 48ч



Рисунок 9 - Кривые титрования омыленного шерстного жира, деструктированного микроорганизмами через 48ч

Рисунок 10 - Кривые титрования омыленного Tanning oil G, деструктированного микроорганизмами через 48ч

Деструкция жира под действием микроорганизмов приводит к изменению числа карбонильных групп, то есть происходит расщепление молекулы жирной кислоты, увеличение ее силы, уменьшение длины углеродной цепи, что сопровождается смещением кривой титрования в область меньших значений рН и появлением новых скачков.

Действие микроорганизмов на жир имеет дифференцированный характер. Так штамм 7 дает 3 группы СООН при действии на Tanning oil G, 2- на шерстный жир. Культуры 3 и В полнее всего подвергают деструкции сульфатированный рыбий жир, Нв - свиной жир.

Положение кривой титрования гидролизованного жира, деструктированного микроорганизмами левее, относительно необработанного жира, свидетельствует о том, что деструкция жира проходит замедленно, образованные кислоты расщепляются частично. Количество солей жирных кислот правее кривой титрования необработанного жира свидетельствует об уменьшении количества жирных кислот вследствие их деструкции и превращении в большее число кислот с короткой углеродной цепочкой вплоть до образования альдегидов и выделения углекислого газа.

Таким образом, на основании рисунков 6-10 можно сделать вывод о том, что наиболее активна в отношении деструкции жиров культура 3. Она не только обладает деструктивными свойствами, но и использует жирные кислоты в качестве источника питания в результате своей жизнедеятельности, о чем свидетельствует смещение кривых титрования вправо, относительно необработанного жира и содержание кислот после действия микроорганизмов составило 21,55%.

3.3 Проведение процесса обезжиривания меховой овчины с применением бактериальной суспензии

На данном этапе эксперимента изучалась возможность применения суспензии микроорганизмов для проведения процесса обезжиривания шкурок белки. Основываясь на предыдущем исследовании - изучение деструктирующей способности микроорганизмов была выбрана наиболее активная культура. В качестве продуцента биомассы использовали культуру 3. Количество вводимой биомассы - 10⁴ кл/см³, продолжительность культивирования бактериальной суспензии - 24 часа, количество жира, используемого в качестве источника углерода - 1 г/дм³.

Для определения свойств бактериальной суспензии готовили 1000 см³ бактериальной суспензии, и в течение 120 часов увеличивали ее объем путем введения каждые 24 часа по 200 см³ синтетической среды (п. 2.2.1). Перед каждым введением новой порции синтетической среды определяли показания: кислотность (п.2.2.11), мутность (2.2.10),, активная реакция среды (п. 2.2.16), определение общего количества микроорганизмов (КОЕ) (п.2.2.7). Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Влияние продолжительности культивирования на свойства бактериальной суспензии

Показания	0 ч	24ч	48 ч	72 ч	96 ч	120 ч
Объем бактериальной суспензии, см3	1,0	1,2	1,4	1,6	1,8	2,0
Кислотность, г/дм3	1,5	1,44	1,56	1,5	1,5	1,52
Мутность	6,0	6,4	6,6	6,6	6,8	7,4
рН	6,98	6,99	6,98	7,06	6,99	6,99

Анализируя полученные данные, можно сделать вывод о том, что при получении необходимого объема бактериальной суспензии значительных изменений в показаниях не происходило, а это значит, что система стабильна.

Для проведения процесса обезжиривания по типовой методике необходимо присутствие в рабочем растворе таких реагентов как, карбонат натрия - 0,5 г/дм³ формальдегид - 0,5 см³/дм³ и СПАВ - 4 г/дм³. Проведение процесса с применением микроорганизмов позволяет полностью исключить формальдегид, карбонат натрия.

Для проведения биотехнологического обезжиривания была приготовлена бактериальная суспензия с разными концентрациями: концентрированный раствор (100%) и с разбавлением - 75%, 50% и 25% от объема рабочей ванны.

Таким образом, было приготовлено 5 растворов различных концентраций, состав которых представлен в таблице 5.

Таблица 5 - Состав рабочих растворов

Вид раствора	Расход бактериальной суспензии от объема рабочей ванны, %
	Типовая методика
Раствор 1	100
Раствор 2	75
Раствор 3	50
Раствор 4	25

Для проведения обезжиривания образцы меховой овчины, размером 10Ч10 см были отобраны по методу асимметрической бахромы (п.2.2.22). Процесс обезжиривания меховой овчины проводили в течение 45 минут при температуре 40?С с переменным механическим воздействием на основе бактериальной суспензии без введения СПАВ, карбоната натрия и формалина. Параллельно проводили обезжиривание по типовой методике.

Перед и после обезжиривания снимали такие показания, как содержание несвязанных жировых веществ в волосе и кожевой ткани, определение колористических показателей волосяного покрова на приборе «Пульсар» (п.2.2.23).

Определение содержания жира в волосе и кожевой ткани проводили на аппарате Зайченко (п.2.2.21).

Пример расчета содержания жировых веществ в кожевой ткани до процесса обезжиривания по типовой методике:

m = 110,7364 г; m₁ = 110,6442 г; m₂ = 0,5366г

(110,7364-110,6242) Ч100%

X₁ = = 20,90%

0,5366

Остальные данные представлены в таблице 6.

Таблица 6 - Содержание жировых веществ в кожевой ткани и в волосяном покрове до и после проведения процесса обезжиривания

Вид раствора	Содержание жировых веществ в кожевой ткани, %	Содержание жировых веществ в волосяном покрове, %
	До обезжиривания	После обезжиривания	До обезжиривания	После обезжиривания
Типовая методика	20,90	12,78	11,93	5,65
Раствор1		17,15		8,35
Раствор 2		17,36		10,56
Раствор 3		18,42		11,36
Раствор 4		19,67		11,89

По приведенным в таблице данным видно, что все растворы обладают обезжиривающим действием. Наибольшим обезжиривающим действием обладал раствор приготовленный по типовой методике, чем остальные растворы, очевидно, причиной этого являлось отсутствие СПАВ в рабочем растворе, присутствие которого необходимо для обезжиривания.

При сравнении обезжиривающего действия между концентрированным и разбавленным рабочим растворами можно отметить, что разница содержания жира в волосе и кожевой ткани после проведения процесса в концентрированных и разбавленных растворах бактериальных суспензий не на много отличается. Таким образом, наиболее оптимальным вариантом проведения обезжиривания меховой овчины в присутствии микроорганизмов является состав ванны 1 (100% расход бактериальной суспензии от объема рабочей ванны).

Колористические показатели волосяного покрова определяли на приборе «Пульсар» (п.2.2.18). Результаты представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Колористические показатели волосяного покрова до и после процесса обезжиривания

Вид раствора	Белизна, баллы	Желтизна, баллы
	До обезжиривания	После обезжиривания	До обезжиривания	После обезжиривания
Типовая методика	80,21	82,48	25,62	19,64
Раствор 1	73,90	80,90	26,95	25,37
Раствор 2	60,40	69,33	49,74	30,25
Раствор 3	73,60	77,25	31,47	26,23
Раствор 4	63,75	69,21	32,15	30,37

Из таблицы 7 видно, что максимальная величина белизны и желтизны после проведения процесса обезжиривания характерна для образцов, обработанных по типовой методике. Очевидно, это связано с тем, что в обезжиривающей ванне присутствовало СПАВ в количестве 4 г/дм³, которое обладало обезжиривающим и моющим действием. При сравнении данных для растворов 1-4, содержащих только бактериальную суспензию можно сделать вывод, что максимальная величина белизны наблюдалась у образцов после процесса обезжиривания, обработанных в растворе 1 (100% расход бактериальной суспензии от объема рабочей ванны), а минимальная величина белизны у образцов после обезжиривания в растворе 4.



Рисунок 6 - Схема биотехнологического обезжиривания

4. Экономическая часть. Расчет экономической эффективности экобиотехнологического процесса обезжиривания меховой овчины

В настоящее время сложная экологическая обстановка и рыночные отношения предъявляют предприятиям легкой промышленности ряд новых требований: предприятия должны выпускать конкурентоспособную продукцию, удовлетворяющую требованиям потребителя, не оказывая при этом пагубного техногенного воздействия на экосистему.

Предприятия меховой и шубной промышленности занимают одно из первых мест в числе загрязнителей окружающей среды. На всех этапах выделки овчин образуются высокотоксичные воды, содержащие такие контаминанты, как синтетические поверхностные вещества, формальдегид, жировые вещества, минеральные кислоты и соли. В связи с этим широко проводятся научно-исследовательские работы по снижению токсичности отработанных вод после проведения различных процессов в технологическом цикле.

В данной работе предложен метод проведения процесса обезжиривания меховой овчины ферментным препаратом высокой липолитической активности, продуцируемым прокариотическими организмами. Проведение обезжиривания по указанному методу позволяет получить полуфабрикат, удовлетворяющий требованиям ГОСТа и значительно снизить токсичность образуемых сточных вод.

Экономическая эффективность данного процесса достигается за счет снижения затрат на химматериалы, транспортно-заготовительные расходы и прочие затраты.

На первом этапе были рассчитаны затраты на воду и химматериалы согласно формулы (9):

С = VЧЦ, (9)

где С - затраты на воду, руб;

V - расход материала на 1000 дм²;

Ц - цена за единицу материала, руб

Результаты расчета затрат на воду и химические материалы представлены в таблице 12. Расчеты были произведены на калькуляционную единицу, величина которой для меховой овчины составляет 1000 дм².

Таблица 5 - Затраты на воду и химматериалы на калькуляционную единицу

Наименование	Единица измерения	Расход на 1000 дм2	Цена за единицу, руб	Затраты, руб
		Типовой вариант	Новый вариант		Типовой вариант	Новый вариант
СПАВ	кг	1,890	0,378	100,00	189,00	-
Формалин	дм3	0,189	-	31,00	5,86	-
Карбонат натрия	кг	0,189	-	30,00	5,67	-
Вода	м3	0,378	0,378	6,21	2,35	2,350
Калий фосфорнокислый 2-замещенный	кг	-	0,567	156,00	-	88,452
Кальций хлористый	кг	-	0,378	52,00	-	19,656
Аммоний фосфорнокислый 1-замещенный	кг	-	0,567	91,00	-	51,597
Магний сернокислый	кг	-	0,378	38,00	-	14,364
Нерпичий жир	кг	-	0,378	50,00	-	18,900
Итого:					202,88	195,319

В представленной таблице показано, что опытный вариант проведения процесса обезжиривания при помощи микробных продуцентов значительно позволяет сократить расходы на химматериалы благодаря исключению из технологического процесса формальдегида, карбоната натрия и СПАВ. Транспортно заготовительные расходы составляют 7% от стоимости химматериалов и составляют для типового варианта - 14,2 руб, для нового варианта -13,67 руб.

Прочие затраты составляют 10-15% от суммы предыдущих изменяющихся статей затрат, таким образом, для типового варианта данная величина составила - 30,43 руб., для нового - 29,3 руб.

Изменяющиеся статьи затрат представлены в таблице 13.

Таблица 6 - Изменяющиеся статьи затрат на 1000 дм² готовой продукции

Статьи затрат	Типовой способ обработки	Предлагаемый способ обработки
Стоимость химматериалов	202,880	195,319
Транспортно-заготовительные расходы	14,200	13,670
Прочие затраты	30,430	29,300
Общий итог, руб:	247,510	238,289

Из таблицы 13 видно, что экономическая эффективность процесса обезжиривания меховой овчины с использованием бактериальной суспензии достигается за счет снижения затрат на химматериалы с 202,88 до 195,319 руб; на транспортно-заготовительные расходы с 14,2 до 13,67 руб; на прочие затраты с 30,43 до 29,3 руб. Общий итог изменяющихся статей затрат снижается с 247,51 рублей (типовой вариант) до 238,289 руб - при использовании предлагаемой методики проведения процесса обезжиривания (9,221 руб.)

При использовании данного метода остальные статьи затрат, к которым относятся затраты на основную и дополнительную заработную плату, на амортизацию зданий и оборудования и др., остаются неизменными, что обусловлено одинаковыми параметрами проведения данного процесса по разным технологиям - в обоих случаях процесс обезжиривания проводится окуночным методом с продолжительностью - 45 минут.

Годовой экономический эффект рассчитывается по формуле (10):

Э = , (10)

где Э - годовой экономический эффект, руб;

С₁ - сумма статей затрат для опытной технологии, руб;

С - сумма статей затрат по типовой методике, руб;

М_з - мощность предприятия, дм²/год.

При мощности завода 20 млн.кв.дм. составит 184420 руб, а на 1000 дм² - 9,22 рублей.

Таким образом, был произведен расчет экономической эффективности процесса, который составил 9,22 рублей на 1000 дм². Следовательно, применение микроорганизмов-деструкторов жировых веществ при проведении процесса обезжиривания позволит не только снизить токсичность образуемых сточных вод и получить полуфабрикат, удовлетворяющий требованиям ГОСТа, но и значительно сократить затраты на данном этапе выделки меховой овчины.

5. Безопасность жизнедеятельности

5.1 Характеристика естественного и искусственного освещения

Освещение рабочего места - важнейший фактор создания нормальных условий труда. Практически возникает необходимость освещения как естественным, так и искусственным светом. Первый случай характерен для светлого времени суток и при работе в помещениях, в которых имеются проемы в стенах и крыше здания, во втором случае применяются соответствующие осветительные установки искусственного света.

Естественное освещение по своему спектральному составу является наиболее приемлемым. Искусственное же, наоборот, отличается сложностью восприятия его зрительным органом человека. Это связано с тем, что суточные переходные режимы естественной освещенности имеют малую частоту при достаточно высокой (днем) или очень низкой (ночью) интенсивности светового потока, а искусственные - довольно большую частоту при недостаточной в целом освещенности. Поэтому при искусственном освещении начинают возникать неустойчивые зрительные процессы, которые из-за большой частоты сменяемости световых условий накладываются друг на друга, не давая глазу времени адаптироваться к новым условиям. От усиленной деятельности приспособительных механизмов глаза быстро утомляются, что вызывает физическую усталость организма.

Несмотря на это, искусственное освещение необходимо как важнейший фактор для приближения ночных условий труда к дневным. Основное отличие ночных условий труда от дневных состоит в том, что при ночных условиях труда отсутствует достаточная освещенность поля зрения работающих равномерно распределенным световым потоком. Стимулирующее действие света на организм при недостаточной освещенности снижается, поэтому ночные условия труда более тяжелые с физиологической точки зрения. Однако основа естественного и искусственного света общая - энергетическая, поэтому их разделение вызвано разницей в спектре и интенсивности. Последнее предположение можно принять только в первом приближении, поскольку спектр естественного света полностью не выяснен и не воспроизведен. Более реально создание световой среды, обеспечивающей психофизиологический комфорт и заданное эмоционально- эстетическое воздействие с учетом светоцветовой доминанты в поле зрения.

Обеспечение освещенности от естественного света связано с устройством проемов для пропускания света. Конструктивно проемы могут быть различными по исполнению и по местонахождению. Поэтому и характер естественного освещения имеет свои особенности: оно может быть боковым, если световые проемы (окна) расположены в наружных стенах; верхним, если световые проемы устроены в крыше; верхнее освещение осуществляется и через фонари - специальные строительные конструктивные детали на крышах или в местах перепадов высот смежных зданий. Возможно и устройство совмещенного естественного освещения путем сочетания бокового и верхнего или фонарного пропускания света в помещение.

Естественное освещение характеризуется отношением естественной освещенности, создаваемой внутри помещения светом неба (непосредственным или отраженным), к значению наружной освещенности земной поверхности от небосвода, выраженное в процентах. Это отношение принято называть коэффициентом естественной освещенности КЕО (е).

Нормирование естественной также различается по расположению проемов и в определенной степени зависит от конструктивных особенностей самих проемов и рядом расположенных строений.

Основное отличие ночных условий труда от дневных состоит в том, что при ночных условиях отсутствует достаточная освещенность поля зрения работающего равномерно распределенным световым потоком. Поэтому необходимо создать такое искусственное освещение, при котором суммарный световой поток от всех установленных в рабочей зоне светильников распределялся равномерно.

Со светотехнической точки зрения при использовании ныне существующих источников света эта задача вполне выполнима. Трудности ее решения связаны с тем, насколько правильно выбрана система искусственного освещения, т.е. каким образом, с каких мест и какого рода установками освещается данный участок. Рекомендуется следующая последовательность осуществления мероприятий по устройству искусственного освещения:

-определение площади, подлежащей освещению, т.е. участка, рабочей зоны, района ведения работ (РВР), а также площади наибольшей концентрации работ (НКР), и установление ее размеров;

-установление нормы освещенности поля зрения в зависимости от разряда с видами освещения;

-выбор системы освещения;

-выбор источников света и расчет потребного их количества;

-выполнение проекта распределения осветительных средств по участку с учетом параметров для установки (углов разворота, склонения, утоненной по конструктивным соображениям высоты подвески) и обеспечения равномерного распределения светового потока по площади.

Площадь участка, подлежащего освещению, устанавливает главный инженер предприятия; он руководствуется правилами определения рабочих зон на каждом рабочем месте и их объединения в производственную площадь или в район работ, если площадь, на которой ведутся работы, обширная и не везде одинаково загружена технологическим процессом. В последнем случае решается вопрос о необходимости освещения всей площади равномерным светом или только мест НКР с помощью общего локализованного освещения.

В зависимости от принятых главным инженером решений рассматривается задача выбора системы освещения и последующий расчет потребного количества светильников. Однако надо иметь в виду следующее: устройство рабочего освещения обязательно во всех случаях должно быть независимым от наличия аварийного освещения; аварийное освещение для продолжения работы необходимо в помещениях и на открытых пространствах, если прекращение работы в нормальном режиме из-за отсутствия рабочего освещения может вызвать взрыв, пожар, отравление людей, опасность травматизма в местах массового из скопления, а также длительное нарушение технологического процесса и др.

Аварийное освещение должно создавать освещенность, составляющую не менее 5 % от нормируемой. Кроме того, аварийное освещение необходимо устраивать для эвакуации людей в местах, опасных для прохода; в том числе в производственных помещениях, где оборудование продолжает работать в темноте, а также по направлениям эвакуации людей из производственных и общественных зданий, где пребывает больше 50 человек. Это освещение должно создавать в проходах освещенность 0,5лк в зданиях и 0,2лк вне их.

В СНиП 23-05-95 «Естественное и искусственное освещение» предусматривается разделение всех работ, даются их характеристики и устанавливаются нормы освещенности.

Искусственное освещение по конструктивному исполнению бывает общим и комбинированным, т.е. состоящим из общего освещения помещения или производственной площади и местного освещения рабочих поверхностей в поле зрения. В свою очередь, общее освещение подразделяется на общее равномерное и общее локализованное (выполненное с учетом расположения рабочих мест). Устройство только местного освещения запрещено, кроме временного (ручными светильниками), относящегося к разряду переносного. Действующими нормами (здесь и далее имеется ввиду СНиП 23-05-95) рекомендуется комбинированное освещение в местах с работами I - IV, Vа и Vб разрядов. Однако при невозможности или нецелесообразности устройства такого освещения допускается одно общее освещение, имеющее некоторые гигиенические и эстетические преимущества.

Комбинированное освещение рекомендуется там, где нужна высокая точность выполняемых работ, где возникают специфические требования к освещению (например, к направлению светового потока), где рабочие поверхности имеют ограниченную площадь или на одно рабочее место приходится большая производственная площадь. Однако, если по нормам требуется устройство дополнительного освещения на единичных рабочих местах, то это на является причиной для отнесения всей производственной площади к виду комбинированного освещения.

Во всех других случаях целесообразно устраивать одно общее освещение. Общее освещение больших производственных площадей, имеющих отдельные участки, которые характеризуются как РВР или НКР, рекомендуется устраивать локализованным к последним, имея в виду, что для остальной площади не требуется такой же, как на участках ведения работ, интенсивности освещения.

Анализ и установление видов освещения некоторым образом определяют систему освещения, так как для различных видов освещения применяются различные источники света. Последние в свою очередь, определяют условия крепления их к рабочим местам или подвеса над площадью. Однако на выбор системы освещения наиболее существенно влияют характер выполняемых работ, т.е. место, где они производятся, возможность размещения осветительных устройств на площади, подлежащей освещению.

Таким образом, выбор системы освещения предполагает решение вопроса о размещении источников света над производственной площадью. При этом часто возникает необходимость одновременного решения вопроса выбора светильников по таким основным характеристикам, как дальность действия, допустимая высота подвеса, единичная мощность и т.п.

Например, для освещения строительных площадок и карьеров используется только группа светильников, позволяющая издалека посылать световой поток на рабочую площадь, тогда как в закрытых цехах или помещениях светильники могут свободно размещаться над местами работы на конструкциях перекрытий и стен и в этом случае нужны другие виды светильников.

При проектировании искусственного освещения система освещения должна быть выбрана до подсчета числа источников света. Этот вопрос согласуется с конструктивными особенностями зданий и сооружений, влияющих и на высоту подвеса светильников, и на их число (в случаях принятия решения крепить светильники на определенные конструктивные детали, количество которых известно), и на единичную мощность. Например, при наличии 50 мест удобного крепления вместо 70 предварительно выбранных источников света, полученных по расчету, правильнее будет отдать предпочтение удобству крепления, заменив источники света на более мощные. Таким образом, система освещения будет выбрана с учетом конструктивных особенностей здания. Равным образом, при выборе системы освещения открытой площади наличие рядом стоящих высоких зданий, труб, возвышенностей предопределит места расположения источников света и в определенной степени из тип, так как возможно понадобятся светильники со значительно большим коэффициентом усиления светового потока в данном направлении.

При выборе источников света предварительно решают вопрос о его виде. Существуют следующие виды источников света (ИС): лампы накаливания, люминесцентные лампы, разрядные лампы высокого давления, ксеноновые лампы, лампы для специального облучения.

Лампы накаливания (ЛН). Этот вид ламп все еще преобладает и производится в широком ассортименте, несмотря на имеющиеся в производстве более экономичные ИС.

Отличительная особенность ЛН состоит в том, что они включаются в сеть без дополнительных пусковых приспособлений и могут работать при значительных отклонениях напряжения сети от номинального, а также практически не зависят от условий окружающей среды и температуры, компактны, световой поток их к концу срока службы снижается незначительно (приблизительно на 15%). Однако ЛН имеют относительно низкую световую отдачу и в их спектре преобладает желто-красная часть. Характеризуются ЛН номинальными значениями напряжения, мощности и светового потока. На их выбор может оказывать влияние размер ламп: полная длина L (стеклянная колба вместе с цоколем), диаметр D и высота светового центра H (от резьбового цоколя до центра нити накаливания).