2.5 Собранный микроспектрофлуориметр

В процессе анализа рассмотренных схем микроспектрофлуориметров и с учетом имеющихся в нашем распоряжении оптических элементов нами был собран микроспектрофлуориметр на основе люминесцентного микроскопа Olympus IX_71. Блок-схема установки представлена на Рис.11. А на Рис.12 приведена фотография уже собранной установки.



Рис.11 Блок- схема микроспектрофлуориметра, применяемого для спектрального анализа биологических объектов.

1.-Компьютер; 2.-Поворотное зеркало; 3.-Цифровой фотоаппарат Olympus С-5060; 4.-Коллимирующее зеркало; 5.-Призма Литтрова; 6.-Фокусирующее зеркало; 7.-Цифровой фотоаппарат Canon 300-D; 8.-Диафрагма;

Элементы 9 - 13 входят в состав люминесцентного микроскопа Olympus- IX_71; 9.-Лампа возбуждения; 10.-Зеркало; 11.-Образец; 12.-Объектив микроскопа; 13.-Светоделительная пластина



Рис. 12 Фотография собранного микроспектрофлуориметра

Свет возбуждения, испускается газоразрядной ксеноновой лампой (9). Отразившись от непрозрачного в данной оптической области делительного зеркала (13), возбуждение через объектив микроскопа (12) попадает на исследуемый образец (11). В образце, который можно также наблюдать через окуляр микроскопа, возбуждается люминесценция. Излучение люминесценции, исследуемого объекта проходит обратно через объектив микроскопа (12), прозрачное для длин волн люминесценции зеркало (13), отражается в зеркале (10) и фокусируется на цифровую матрицу фотоаппарата Olympus C-5060. Люминесцентное изображение зафиксированное фотоаппаратом направляется в компьютер для дальнейшей обработки и хранения. Таким образом, установка позволяет получить люминесцентное фотографическое изображение нанообъектов.

Для получения спектра люминесценции необходимо переместить поворотное зеркало (2) на траекторию движения исследуемого светового пучка. Исследуемый свет проходит через диафрагму (8). Эта диафрагма установлена таким образом, чтобы вырезать из всего изображения исследуемый объект, который должен находиться строго в центре кадра фотоаппарата Olympus C-5060. Размер диафрагмы должен соответствовать размеру исследуемого объекта. Сама диафрагма должна находиться в плоскости изображения объектива микроскопа. Коллимирующее зеркало (4) устанавливается таким образом, чтобы в его фокусе располагалась диафрагма (8). В этом случае коллимирующее зеркало формирует параллельный пучок света от наблюдаемого объекта и направляет его на призму Литтрова (5). После спектрального разложения призмой Литтрова выходящее излучение представляет собой параллельные пучки различных цветов, имеющих различное направление. Фокусирующее зеркало (6) предназначено для последующей фокусировки трансформированного светового пучка Таким образом, в фокальной плоскости фокусирующего зеркала формируется изображение входной щели для каждой длины волны. В фокальной плоскости мы установили цифровую матрицу фотоаппарата Canon 300D. Для точной установки матрицы применялась высокоточный микроподвижный механизм. С фотоаппарата Canon 300D снимок этого спектра попадает на компьютер (1) и в дальнейшем анализируется с помощью разработанного программного обеспечения.

2.6 Функциональная схема хемилюминометра

Рис. 13. Функциональная схема кюветного блока: 1--плата переключателей,

2--плата термостабилизации, 3--регулировка перемешивания, 4--блок ФЭУ, 5--высоковольтный источник питания ФЭУ, 6--стабилизатор питания, 7--усилитель импульсный, 8--усилитель аналоговый, 9--АЦП.

Хемилюминометр имеет следующие характеристики

* чувствительность, кв/им, определенная по вторичному стандарту ПО

------------------100000

* коэффициент усиления ----------------------- от 1 до 100

* Температура, °С, которая поддерживается в кюветом отделении при температуре окружающей среды

18±1°С ------------------------от 20 -до 42°С с шагом 2°С

* точность поддержания температуры не хуже ------- ±0,1 °С

* скорость вращения измерительной кюветы,

об/мин., ----600-1000.

В состав хемилюминометра входят:

-блок кюветный;

-приспособление святи с внешним ЭОМ (АПЦ)

-программное обеспечение

Принцип работы хемилюминометра базируется на регистрации сверхслабых световых потоков, которые постоянно возникают в биологических середах, при действии на них специфических факторов.

Световой поток от измерительной кюветы попадает на световой детектор, в качестве которого использован фотоэлектронный умножитель (ФЭУ-79). Фотоумножитель преобразовывает световой поток от исследуемой пробы в последовательность электрических импульсов, которые после преобразования и усиления в виде аналогового сигнала подаются на плату АПЦ. После преобразования в цифровой вид и обработки в соответствии с заданной программой, данные выводятся на дисплей компьютера [6].

Кюветное отделение - блок хемилюминометра, осуществляющий загрузку кюветы с исследуемым образцом и ее перемещение в рабочее положение перед фотокатодом ФРУ. Кюветное отделение также обеспечивает возможность перемешивания содержимого кюветы с образцом и возможность их термостатиравания при 37°С.

При измерении использовались кварцевые кюветы цилиндрической формы диаметра d=0,5см и высоты h=1см.

Для снятия спектра жидких объектов использовался спектрофотометр.

На рисунке изображено функциональную схему следующего.



Рис. 14 Функциональная схема спектрофотометра: 1--кюветное отделение, 2--термостат, 3--канал регистрации (фотоумножитель), 4-- преобразователь, 5--самописец, 6--фотоусилитель, 7--усилитель, 8--лазер ЛГИ-21

УФУ=140В, ФЭУ-51, ПДА-1, У=1 мВ/см, при максимальной ширене щели.

Принцип его действия мало чем отличается от рассмотренных выше. Потому детально описывать его не имеет смысла [2].

2.7 Приготовление реактивов

При исследовании спектров органелл (гепатоцитов) использовался стандартный краситель JC-1.

При исследовании спектров флуоресценции и интенсивности хемилюминесценции мы использовали фосфатный буфер и сульфат железа. Способ приготовления этих реактивов приведен ниже

Фосфатный буфер

Фосфатный буфер готовится из навесок KH₂PO₄--1,361 г и KCl --3,9144

г. в 0,5 л бидистелированой воды. К необходимому Рh=8,5 доводят с помощью таблетированного KOH. Такой рас створ не обходимо использовать на протяжении двух недель. Хранится раствор в холодильнике.

Сульфат железа

Раствор сульфата железа (0,02 мМ) готовиться путем разведения навески 0,28 г FeSO₄ в 50 мл бидистелированной воды непосредственно перед использованием. Раствор должен бать прозрачным.

Перекись водорода

Раствор перекиси водорода готовится из стандартного пергидроля, доводя эго путем разведения бидистелятом до нужной концентрации.

2% раствор получим путем разведения 2мл пергидроля в 28мл воды.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ДАННЫЕ И ИХ ОБРАБОТКА

В виду того, что выполненные преобразования люминесценции носят сложный характер, и их точное описание в наших условиях потребовало бы значительных усилий, то для получения графиков спектров люминесценции, имеющих общепринятый в спектроскопии вид, была осуществлена градуировка собранного спектрометра.

Калибровку спектрографа мы разбили на 2 части:

1. Калибровка по длине волны излучения,

2. Калибровка по интенсивности излучения

3.1 Калибровка спектрографа по длине волны

Проградуировать спектрограф, в этом случае, это, значит, указать, каким длинам волн соответствует положение каждого из чувствительных элементов - пикселя ПЗС матрицы фотоаппарата. Для градуировки можно использовать источники, в спектре которых длины волн хорошо известны.

Как эталонный градуировочный источник мы использовали лампу ДРГС-12. Она представляет собой стеклянный баллон с впаянными внутрь электродами - накалом, катодом и анодом. Анод лампы имеет небольшое круглое отверстие посередине. Отверстие служит для вывода света из области разряда; в соответствующем месте стеклянного баллона лампы имеется окошко из увиолевого стекла, пропускающего ультрафиолетовое излучение. Лампа подключаются к специальному источнику питания. Лампа имеет линейчатый спектр излучения, обусловленный квантовыми переходами в атомах ртути и гелия. Длины волн спектра излучения этой лампы в области 400 - 600 нм представлены в Таблице 1

Таблица 1. Значения длин волн в спектре излучения лампы ДРГС-12.

л, нм	Дл, нм до следующей линии	Цвет	Элемент
587,56*	8,59	желтая	He
578,97*	2,01	желтая	Hg
576,96*	30,89	желтая	Hg
546,07*	44,5	зел.-желт.	Hg
501,57	9,38	зеленая	He
492,19	0,58	зеленая	He
491,61	20,29	зеленая	Hg
471,32	24,17	голубая	He
447,15	11,32	голубая	He
435,83*	1,08	синий триплет	Hg
434,75	0,83
433,92	26,14
407,78*	3,12	фиолетовая	Hg
404,66*		фиолетовая	Hg

Мы получили изображение спектра люминесценции этой лампы (Рис. 15). Ему соответствует общепринятое графическое изображение Рис.16.

Рис. 15 Изображение спектра люминесценции лампы ДРГС-12.



Рис.16. Спектр излучения ртутной ламы. Длина волны дана в пикселях.

В нашем случае значения пока выражены в пикселях.

Применив программу, позволяющую получать в численном виде значения интенсивностей отдельно для каждого пикселя, мы определили значения калибровочной функции L(N_пик) для этих линий. Функция L(N_пик) описывает соответствие номера пикселя N_пик длине волны л(N_пик) попавшего на него излучения. Проведя в программе OriginPro аппроксимирование данных значений мы нашли вид этой функции L(N_пик). После этого значений длины волны в дальнейших измерениях будут определяться по формуле:

(3.1)

3.2 Калибровка по интенсивности

Калибровка спектрографа по чувствительности в различных областях спектра выполнялась при помощи поверенной спектральной лампы накаливания СИУ-8. Для этого мы направили излучение спектральной лампы в микроскоп. Зарегистрированную нашим прибором интенсивность сравнили со значением, приведенным в паспорте. Интенсивность света J на каждом пикселе вычислялась по известной формуле:

(3.2)

Здесь J_r, J_g и J_{b --} интенсивность зарегистрированная соответсвенно для красных (л=700нм), зеленых (л=548,1нм) и синих (л=435,2нм) пикселов Соотношение этих интенсивностей K(л), полученное из уравнения (3.3) позволит нам определить передаточную функцию для коррекции наших спектральных измерений по величине.

(3.3)

После настройки спектрометра были проведены пробные измерения на реальных объектах с целью уяснения возможностей прибора. В качестве объекта исследования были взяты гепатоциты крысы. Эти клетки печени были прокрашены растворителем JC-1. Этот растворитель имеет свойство образовывать J-агрегаты только на органеллах живой клетки, и поэтому, используется в микробиологии для контроля состояния клеток. Клетки были помещены в микроскоп. Затем было снято люминесцентное изображение клеток (Рис. 17)



Рис.17. Люминесцентное изображение клеток печени крысы покрашенных красителем JC-1

И после этого была проведена регистрация спектров клеток 1 и 2. После обработки полученной информации были получены спектры, которые после нормировки имели вид, показанный на Рис.18. На рисунке 18 видно для каждой клетки 2 полосы люминесценции, хорошо соответствующие положению по длине волны для данного красителя. Широкая линия соответствует свечению мономеров красителя, а более узкая J-агрегатам, образовавшимся на органеллах клеток. Сопоставление люминесцентного изображения с графиком говорит о полном соответствии информации двух измерений. Хорошо видно, что клетка 1 имеет лучшее “самочувствие”, чем клетка 2. Относительная оценка площади под каждой полосой позволит в дальнейшем проводить численную оценку состояния клеток с течением времени эксперимента.



Рис.18 Графики спектров исследуемых клеток

3.3 Снятие характеристик флуоресценции биообъектов

Так как мы, в этом случае, использовали вакуумный фотоумножитель, то в этом случае нет необходимости проводить калибровку спектра, а только есть необходимость в измерении параметра шума.

Для исследования использовалась сыровата крови людей (5 мл)+10 мл фосфатного буфера + 10 мл би дистилированой воды кювета с сыроватой крови выдерживалась в термостате 20 минут при температуре 38 C ^o . после этого кювета с исследуемым образцом помещалась в кюветное отделение спектрофотометра, где она облучалась параллельным пучком света лазера ЛГИ-21 (337,1 нм), интенсивность спектра флуоресценции снималась со всего объема образца. при измерении использовались кравцовые кюветы с квадратной основой (площадь основы S=0,25см), и высотой h=5 см.

3.4 Спектральные характеристики флуоресценции в норме и при патологиях

При исследовании спектра флуоресценции 6 образцов сыворотки крови было установлено что спектр имеет один пик в области 500 нм, полуширина полосы составляла 150 нм. С рисунка видно, что патологическое состояние не внесло в область пика никаких изменений. Также оно не повлияло на полуширину полосы. Но существенные изменения проявились в изменении интенсивности исследований в области пика: при туберкулезе она в 1,5-2 раза больше от излучения сыроватки крови здоровых людей, а при онкологических заболеваниях в 1,4-1,8 раз меньше.

Рис. 19 Спектры флуоресценции сыворотки при патологических состояниях и в норме ( зависимость интенсивности от длинны волны)

Форма спектра во всех случаях имела лоренцовский вид. Это означает, что характер спектра при норме и при патологиях имеет одинаковый характер. Отличия по интенсивности могут быть объяснены только за сет отличий между количеством центров люминесценции в исследуемых пробах. Центрами люминесценции могут бать липиды на поверхности клеточных мембран. Не исключается также влияния на хемилюминесценцию антиоксидантов, так как они уменьшают количество центров флуоресценции.

Такие различия квантовых выходов для реакций рекомбинации обусловлена спектроскопическими отличиями частиц, которые принимают участие в излучении -продуктов рекомбинации радикалов RO² и соответственно радикалов R. Первые представляют собой кислородосодержащие молекулы (кетоны, альдегиды и др.), которые люминесцируют в ближней и ультрафиолетовой области, другие люминесцируют намного хуже.

Соответственно продукты реакции квадратического обрыва цепи имеют возможность рамного эффективнее преобразовывать энергию в свет, чем другие реакции рекомбинации. Чем больше концентрация кислорода, тем больше вклад этого процесса в обычную рекомбинацию и тем выше должна быть интенсивность излечения.

Стоит отметить, что если в случае с клетками для изучения спектра мы использовали красители, и спектр соответствовал спектру красителя, то в этом случае у нас использовался фосфатный буфер и сульфат железа, которые не имеют люминесценции в этой области спектра. То есть мы можем говорить о собственной флуоресценции объекта.

3.5 Спектральные характеристики жирорастворимых витаминов

Для этого исследования мы использовали жирорастворимые витамины А- ретинол, Е- токоферол, Д₂ - купленные в аптеке. Эти исследования проводились с целью нахождения различий в спектрах, так как в первом экспериментальном блоке на этом приборе особых различий не было найдено. В измерительную кювету вводилось 15 мл аптечного раствора, после этого кювета с исследуемым образцом помещалась в кюветное отделение спектрофотометра, где она облучалась параллельным пучком света лазера ЛГИ-21 (337,1 нм), интенсивность спектра флуоресценции снималась со всего объема образца.

Результаты эксперимента приведены ниже

Рис. 20 Зависимость интенсивности флуоресценции от длинны волны для жирорастворимых различных витаминов.

Эксперименты показывают четкие различия между спектрами. Эти различия могут определяться не только различными спектрами витаминов, но и различными спектрами жирных растворителей, которые обязательно входят в состав витаминов этой фармацевтической группы.

3.6 Хемилюминесцентные характеристики сыворотки крови при различных патологиях

Исследования инициированной хемилюминесценции проводились за модифицированной методикой Владимирова [10]. Кювета, сыворотки крови и все реактивы выдерживались в термостате при температуре t=38 C ^o. Потом в кювету вводилось 2 мл сыворотки крови , 0,4 мл фосфатного буфера и 0,4 сульфата железа при концентрации 0,02мМ. Потом кюветное отделение закрывалось и начиналось снятие анализа. На 10 секунде в кюветное отделение вводился 0,2 мл H₂ O₂ (2%). Снятие сигнала после этого продолжалось еще 60 с.

При снятие неинициированного излучения, проводилось только термостатирование кюветного отделения и исследуемой пробы при температуре t=38 C ^o.

На рисунках 21-24 приведены типичные кривые инициированной и неинициированной хемилюминесценции в норме и при патологическом состоянии.

Рис. 21 Характеристика инициированной хемилюминесценции при раке печени

Рис. 22 Характеристика не инициированной хемилюминесценции при раке печени

Рис. 23 Характеристика инициированной хемилюминесценции почти здорового человека



Рис. 24 Характеристика неинициированной хемилюминесценции почти здорового человека

Результаты показывают, что при раке печени на графике кинетики инициированой хемилюминесценции возникает второй максимум. Процесс можно поделить на два процесса.

Рис. 25.Представление инициированной хемилюминесценции рис.21 с помощью двух процессов.

Первый процесс характерен процессу, который протекает в норме. Он характеризируется быстрой вспышкой на 10-11 с и медленным, экспоненциальным угасанием свечения. Второй характеризируется медленной вспышкой на 26 секунде. Результирующая кривая является огибающей этих двух процессов. Это означает, что при раке печени появляется дополнительный процесс оксидации, а также образовываются дополнительные два вида радикалов которые не рекомбинируют между собой. Некоторые автора считают, что этот процесс можно объяснить тем что антиоксиданты за время реакции окисления липидов, могут окислятся более одного раза [9,7]. То есть окисленные антиоксиданты восстанавливаются при окислении собой липидов и могут опять окислятся и.т. д. Тем они тормозят скорость окисления липидов и должны уменьшать интенсивность ХЛ. Но в нашем случае наблюдается противоположный результат. Интенсивность 1 максимума при патологии достигает 5,03 мV, а при норме только 0,946 мV. Площадь под графиком, которая должна быть пропорциональна количеству радикалов про раке печени 99,6 мV*с, в то время как у почти что здорового человека она составляет 17,57 мV*с.

При анализе неинициированной хемилюминесценции мы видим, что средняя интенсивность при патологическом процессе (S/T) равняется 0,121, а в норме 0,0845. Это означает, что в данном случае мы не можем такое поведение кривых объяснить это наличием антиоксидантов.

ВЫВОДЫ

В работе было изучено и проведено сравнение трех разных оптических методов изучения биообъектов. Построен прибор для снятия спектроскопических характеристик гепатоцитов. Проведено анализ физических закономерностей спектрофотометрии и хемилюминометрии. Эксперимент показал, что при использовании мегапиксельных умножителей необходимо пользоваться красителями. Результаты, полученные этим методом являются информативными, но показывают спектры свечению мономеров красителя и J-агрегатам, образовавшимся на органеллах клеток.

Флуоресценция (в качестве умножителя использовалась вакуумная аппаратура), также показала свою информативность. Спектры сыворотки крови показывают собственную флуоресценцию. Не смотря на то что, спектры флуоресценции сыворотки крови отличались только, интенсивностью, спектры жирорастворимых витаминов имели различные форму, что указывает на достоверность экспериментов.

Инициированная хемилюминесценция также несет значительную информацию про патологическое состояние. Проведенные эксперименты указывают на невозможность объяснить второй максимум кривых инициированной хемилюминесценции с помощью неоднократного окисления антиоксидантов.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Карнаухов В.Н. Люминесцентный анализ клеток. Аналитическая микроскопия,2002.

2. Зайдель А.Н., Островская Т.В., Островский Ю.И. Техника и практика спектроскопии.

3. Ельяшевич М.А.Атомная и молекулярная спектроскопия. М., Физматгиз, 1962.

4. Скворцов Г.Е., Панов В.А., Поляков Н.И., Федин Л.А. Микроскопы. Л., “Машиностроение”, 1969.

5. Серхслабые свечения в биологии //Труды Московскогообщества испытателей природы.- Т.39.-. -М.-«Наука».-1972.-271с.

6. Скибида И.П., Сахаров А.М., Эмануэль О.Н. Гомогенно-каталитическое окисление органических соединений.Активация молекулярного кислорода.//Итоги науки и техники.Серия "Кинетика и катализ". М.: ВИНИТИ. -1986. - Т.15.- С.113-118.

7. Абрамова Ж. И., Оксенгедлер Г. И. Человек и противоокислительные вещества.//К.: Наука.-1985.- 230с.

8. Серкиз Я. И., Чеботарёв Е. Е., Бара бой В. А. Хемилюминесценция крови в экспериментальной и клинической онкологии Київ: Наукова думка -1984.-134с.

9. Фархутдинов Р.Р., Фатихов Р.Г., Бикмухаметова Х.С., Галеев Ф.С. Хемилюминесценция крови в диагностике воспалительных заболеваний органов брюшной полости//Клиническая медицина.- 1985.- № 9.- C. 111-114.

10. Конев С.В., Волотовский И.Д. Фотобиология, Минск: БГУ им.В. И, Ленина, -1979.- 385 с.

Размещено на Allbest.ru