Гидробиологические методы рыбохозяйственных исследований

Пробы большого объема или небольшие пробы при отсутствии банок можно хранить в мешочках из ткани, помещенных в большие емкости с 4 - 10%-ным раствором формалина. В каждую банку или мешочек с пробой обязательно вкладывается этикетка.



4.3 Разборка бентосных проб, расчет численности и биомассы

Дночерпательные пробы обычно содержат некоторое количество постороннего материала. Целесообразно сначала выбрать животных из грунта, а затем производить их разборку по систематическим группам. Зафиксированный материал промывают водой для уменьшения неприятного запаха формалина. Выборку крупных животных производят визуально прямо из кюветы, затем материал порциями переносят в чашку Петри (диаметр 80 - 100 мм) и просматривают под бинокуляром для выборки мелких организмов. Животных помещают в банки с 4%-ным раствором формалина.

При большом объеме пробы донной фауны допускается частичная разборка для количественного учета массовых форм с пересчетом полученных данных на весь объем пробы.

В лаборатории выбранные животные из дночерпательных проб подвергаются разборке по систематическим группам до уровней типа, класса или отряда с последующим более детальным определением систематического положения животных до уровня рода и вида, за исключением трудноопределяемых групп организмов.

При разборке количественных проб представители каждой группы просчитываются, а затем в зависимости от их количества помещаются в банки или маленькие пробирки, снабженные этикетками, кратко повторяющими этикетки, которые были вложены на месте сбора материала.

При пересчете животных за единицу принимается целое животное. У двустворчатых моллюсков за целый экземпляр следует считать обломки обеих половин раковины с кусочками тканей на них у замкового края раковины.

Определение постоянного веса зафиксированного в формалине материала обычно производят через четыре месяца после момента фиксации.

Взвешивание следует проводить после одноминутной обсушки маленьких навесок материала на фильтровальной бумаги. Животных после обсушки помещают в предварительно взвешенный бокс, и определяют вес на аналитических весах. При небольшом объеме материала удобно и быстро производить взвешивание без бюкса на торзионных весах с точностью до 1 мг.



5. Методы изучения перифитона

Под перифитоном понимают сообщества, обитающие на твердом субстрате за пределами специфического придонного слоя воды. Сюда входят как сообщества на предметах, введенных в воду человеком (суда, буи, свайные сооружения, трубопроводы, причалы и т. д.), так и сообщества на естественных субстратах: крупных камнях и корягах мелководья, сообщества на макрофитах [13].

Изучение перифитона при биологическом анализе имеет первостепенное значение [14]. Это объясняется тем, что организмы, его составляющие, характеризуют условия именно данного пункта, а не занесены случайно из других мест.

5.1 Методика отбора проб перифитона с естественных субстратов

На месте отбора проб отмечается характер обрастания: цвет, пышность развития, характер субстрата, на котором развиваются организмы перифитона, расстояние места отбора проб от берега, глубина, на которой находится субстрат, температура воды, скорость течения.

На разных створах отбор проб желательно производить с одних и тех же субстратов для того, чтобы в дальнейшем получить сопоставимые результаты.

Наиболее пригодными для сбора перифитона являются нейтральные субстраты (камни, бетонные сооружения).

Сбор обрастаний с поверхности твердых предметов (плотин, камней, мостов и т. п.) производят с помощью скребка, ножа, скальпеля, пинцета или обычной столовой ложки с заточенным краем. Отбор необходимо производить очень осторожно, так как частицы бетона, камней, крупного минерального детрита могут затруднить дальнейший просмотр пробы.

Небольшое количество материала помещают в банку с водой с таким расчетом, чтобы количество воздуха над пробой составляло не менее половины объема сосуда.

Пробы обрастаний необходимо обрабатывать непосредственно после отбора или в срок, гарантирующий сохранность живого материала ( приблизительно в течение 6 ч после отбора проб, сохраняемых при температуре 5 - 10°С).

5.2 Методика отбора проб перифитона с помощью искусственных субстратов

В связи с чрезвычайной гетерогенностью распространения перифитона количественный учет на естественных субстратов очень затруднен. Поэтому для получения количественных характеристик обрастаний часто применяют искусственные субстраты, впервые введенные в гидробиологические исследования Гентшелем [15], а в СССР С. Н. Дуплаковым [16].

Искусственные субстраты используют при определении продуктивности перифитона, выяснении скорости заселения субстрата, изучении динамики популяции перифитона, установлении нижней границы его распространения, выяснении отдельных физико - химических факторов, лимитирующих развитие перифитона.

В качестве искусственных субстратов рекомендуется использовать предметные стекла из некоррозионного стекла. Стекла укрепляют вертикально, в текучих водоемах параллельно течению для того, чтобы избежать оседания на них детрита, грязи, мусора и пр. Укрепление стекол можно осуществлять разными способами. Удобно использовать для этих целей пенопластовые поплавки, резиновые пробки, в прорези которых вставляют стекла. Поплавки одевают на трос, несущий на нижнем конце груз для заякоривания, а на верхнем - поплавок, ограничивающий глубину погружения. Глубина погружения определяется в зависимости от прозрачности воды. Нижняя граница распространения перифитона совпадает со значением 1 - 1,5 прозрачностей. Оптимальным является горизонт 0,5 м от поверхности [17].

Длительность экспозиции стекол определяется географическим положением, качеством воды изучаемого водного объекта, сезоном года, целью исследования.

При исследовании качества воды установку с искусственным субстратом погружают в воду и начинают анализ приблизительно через две недели, т. е. когда сформируется сообщество. Если водоем сильно эвтрофирован или температура воды высока (выше 25°С), формирование сообщества может идти интенсивно и через 1 - 2 месяца количество аккумулированных веществ будет весьма значительно. В таком случае, чтобы избежать отслаивания оброста ставят новую установку.

При изучении биоценотических связей исследования начинают с первых же суток погружения стекол, прослеживая все стадии процесса сукцессии.

Извлекать стекло из установки следует очень осторожно, не вынимая всю установку из воды. Стекло помещают в банку с определенным количеством воды.

В лаборатории стекло просматривают под бинокуляром, поместив его в чашку Петри так, чтобы оно было покрыто водой. Крупные организмы (личинки насекомых, моллюски и пр.) просчитывают во всей пробе. Если оброст не очень густой, непосредственно на стекле просчитывают прикрепленные формы простейших. Затем оброст тщательно смывают кисточкой или зубной щеткой в определенный объем воды. Подвижные мелкие организмы (простейшие, коловратки) считают в камере Богорова. Если в пробе очень много организмов, для подсчета берут не всю пробу.

Для количественного учета водорослей взвесь смытного в определенный объем воды оброста тщательно перемешивают и берут из нее несколько миллилитров для последующего подсчета. Подсчет производят в счетных камерах (Нажотта, Горяева). В. Г. Девяткин [18] рекомендует применять поэтапную обработку проб в камерах разного объема для учета форм разного размера.

Численность водорослей подсчитывают по формуле:

Где - объем воды со взвесью оброста, - объем просмотренной части пробы, в которой обнаружено n клеток водорослей, - площадь субстрата пробы.

Биомассу определяют "объемным" методом, так же как для фитопланктона (см. пункт 1.2).

Полученные данные по численности выражают в кл/мм², по биомассе - в г/м².

5.3 Этикетирование проб

Каждая проба перифитона должна быть этикетирована и записана в полевой дневник. На этикетке указывают название водоема, номер створа, дату отбора, местоположение створа, температуру воды, скорость течения, характер субстрата, глубину (м), на которой на которой находится субстрат, расстояние от берега.

В дальнейшем при обработке проб данные из полевого дневника переносят в рабочий журнал (см. приложение 3).



5.4 Обработка проб

В лаборатории отработанные пробы из банок переливают в кристаллизаторы или чашки Петри и производят разборку материала.

Если в пробе есть крупные организмы (личинки хирономид, пиявки, моллюски, олигохеты и т. д.), их отбирают в отдельную склянку и фиксируют, так же как бентосные пробы, 70% спиртом или 40% нейтрализованным формалином до концентрации 4%. Видовой состав определяют по различным определителям.

Определение видового состава микроскопических организмов начинают с простейших и коловраток (особенно панцирных), требующих прижизненного наблюдения. От действия консервирующих веществ они или совершенно разрушаются, или деформируются столь сильно, что определение их становится практически невозможно.

Материал, помещенный в чашку Петри, просматривают под бинокуляром. Простейших и коловраток отлавливают с помощью пипетки с оттянутым концом. Отловленный организм помещают на предметное стекло в небольшую каплю воды и покрывают покровным стеклом с пластилиновыми ножками. Чтобы приостановить или замедлить быстро двигающиеся организмы, к препарату добавляют каплю клея из айвовых косточек, либо наркотизирующего вещества - хлороформа или кокаина. Для лучшего наблюдения простейших и коловраток их окрашивают, добавляя витальные красители: метиленовый синий, нейтральный красный и другие.

Для идентификации коловраток используют определители составленные Л. А. Кутиковой [19], К. Вульфертом [20].

Растительный состав перифитона можно определять в фиксированной пробе, но желательно, особенно для первого ознакомления, смотреть нефиксированный материал, определяя вначале нежные формы (жгутиковые,вольвоксовые, эвгленовые и т. п.). В качестве консерванта применяют раствор Люголя в модификации Г. В. Кузьмина. В качестве консерванта можно применять и формалин, но действие его на клетку очень "жесткое" и приводит к ее деформации, затрудняя определение [21].

Для определения видового состава рекомендуется использовать определители, составленные О. А. Коршиковым [22], Е. К. Косинской [23], Л. И. Курсановым [24] и др.

Определение бактерий ввиду чрезвычайной трудности не входит в задачу исследователя перифитона. Однако такие виды, как Sphaerotilus natans, Zoogloea ramigera и некоторые другие образуют иногда крупные колонии, покрывая обширные площади, и в этом случае их можно идентифицировать и учитывать при определении видового состава перифитона.

Пробу просматривают до тех пор, пока перестанут встречаться новые виды. Обычно просмотреть 3 - 4 препарата. Параллельно с определением видового состава оценивают частоту встречаемости каждого вида по глазомерной шкале:

9 - очень часто ( в каждом поле зрения много),

7 - часто (в каждом поле зрения),

5 - нередко (не во всех полях зрения),

3 - редко (в немногих полях зрения),

2 - очень редко (в каждом препарате единично),

1 - единично (единичные экземпляры в пробе).

Все данные обработки проб заносят в рабочий журнал.



6. Методы определения первичной продукции и деструкции органического вещества

Первичная продукция - это продукция органического вещества, образованного растительными клетками в процессе фотосинтеза. Именно в результате фотосинтеза с использованием солнечной энергии и биогенных элементов растительные клетки синтезируют органическое вещество в водоемах, которое становится органической пищей для животных организмов разных трофических уровней. Таким образом, уровень первичной продукции определяет уровень биологической продуктивности водоема в целом.

Методы измерения первичной продукции в водоемах начали разрабатываться в начале ХХ в. Был предложен ряд методических разработок - измерение первичной продукции по изменению биомассы за определенный период времени, по изменению концентрации кислорода в воде [25], активной реакции среды - рН [26], по изменению концентрации биогенных элементов [27, 28], потребляемых в процессе фотосинтеза и др.

В настоящее время для определения первичной продукции фитопланктона относительно хорошо разработан скляночный метод в кислородной и радиоуглеродной модификации, а так же хлорофильный метод [29, 30, 31, 32].

6.1 Скляночный метод измерения первичной продукции и деструкции

6.1.1 Общие положения

Использование склянок для измерения фотосинтеза фитопланктона по разнице кислорода, образованного в результате фотосинтеза за определенный период времени, впервые было предложено Граном и Руудом [33] и детально разработано Г. Г. Винбергом [34]. Позже была разработана радиоуглеродная модификация скляночного метода [35], обладающая более высокой чувствительностью по сравнению с кислородной. Для измерения продукции макрофитобентоса был так же использован принцип склянок - изолированные емкости большого объема (до 30 - 50 л), в которые помещали экземпляры крупных талломных водорослей и высших водных растений [36, 37].

Кислородная и радиоуглеродная модификация скляночного метода основаны на валовом уравнении фотосинтеза

в котором количество потребленной углекислоты или количество выделившегося при фотосинтезе кислорода пропорционально количеству образованного органического вещества. При отсутствии света реакция идет в обратном направлении - процесс дыхания (деструкции), разложения органического вещества с потреблением кислорода и выделением углекислоты.

6.1.2 Продукционные склянки

Для кислородной и радиоуглеродной модификации используют одинаковые склянки из белого стекла с притертыми стеклянными пробками. Если имеется возможность, то лучше использовать склянки из кварцевого стекла, которое не влияет на проникающую солнечную радиацию. Удобно использовать в качетсве продукционных склянок плоские микробиологические матрицы, а так же стандартные химические склянки - кислотницы. Объем продукционных склянок составлет 100 - 500 мл в зависимости от продуктивности водоема. Обычно используют продукционные склянки следующих объемов: 100 мл для эвтрофных водоемов, 100 - 250 мл для мезотрофных водоемов, 250 - 500 мл для олиготрофных водоемов.

Перед измерением продукции все продукционные склянки должны быть точно оттарированы по объему. Для определения деструкции используются темные склянки. Для этого светлые склянки необходимо покрасить черной краской и обернуть фольгой.

6.1.3 Техника экспонирования склянок

Для измерения первичной продукции на различных горизонтах обычно ставят 2 - 3 светлых склянки и одну темную. Для крепления плоских склянок удобно использовать специальный плотик, изготовленный из прозрачного оргстекла (рис 12). Для крепления круглых продукционных склянок используют металлическую крестовину, на которой склянки крепят за горлышки в вертикальном положении. Плотики и крестовины со склянками крепят на тросе с помощью лебедки опускают на соответствующие горизонты. Экспонировать склянки можно и со специального буя, к которому прикрепляется трос с плотиками или крестовинами.

Рис. 12. Продукционный плот 1 - крепежный замок, 2 - металлическая штанга, 3 - пенопластовый фиксатор, 4 - основа плота, 5 - продукционная склянка, 6 - гнезда, 7 - вырез для троса, 8 - трос.



6.1.4 Время экспозиции

Длительность экспонирования продукционных склянок с фитопланктоном является важным методическим моментом при измерении первичной продукции. Фитопланктон в склянках находится в "изолированных условиях" и при длительном экспонировании происходят резкие изменения среды (повышение рН, пересыщение кислородом, потребление биогенных элементов и т. д.), которые будут существенно отличаться от естественной среды водоема. В этом случае может возникнуть большая ошибка в измерении первичной продукции и деструкции. В различных методических пособиях указывается разное время экспозиции - от нескольких часов до суток. Однако последние работы показывают, что оптимальное время экспонирования должно составлять 2 - 6 часов. Экспонировать склянки с пробами необходимо или в первую половину дня (до полудня) или во вторую половину дня (после полудня).

6.1.5 Выбор горизонтов экспонирования

Для расчета первичной продукции в столбе воды (под 1 м²) необходимо отбирать пробы и экспонировать их в продукционных склянках на нескольких глубинах фотического слоя. Нижняя граница фотического слоя, где первичная продукция равна деструкции (компенсационная точка), соответствует глубине, куда приникает 1% поверхностной солнечной радиации. Горизонты измерения первичной продукции должны соответствовать глубинам, куда проникает 100, 75, 50, 25, 10 и 1% поверхностной солнечной радиации. Если фотический слой небольшой (до 5 м), то склянки необходимо ставить через каждый метр (0,0, 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 4,0, 5,0 м).



6.2 Кислородная модификация скляночного метода

Кислородная модификация, или кислородный метод, позволяет измерить как первичную продукцию (светлые склянки), так и деструкцию (темные склянки) и таким образом рассчитать валовую и чистую продукции.

Для измерения кислорода, растворенного в воде, используют титриметрический метод Винклера [38].

6.2.1 Приготовление реактивов

1. Раствор хлористого марганца (MnCb₂ 4H₂O): 420 г хлористого марганца растворить в 1 л свежепрокипяченной дистиллированной воды. Соль должна быть ч. д. а. и не содержать примесей железа.

2. Щелочной раствор иодида калия (KI): а) растворить 500 г аналитически чистого NaOH в 500 мл дистиллированной воды, б) растворить 500 г KI в 500 мл дистиллированной воды, в) смешать растворы NaOH и KI. При образовании осадка раствор отстаивают в течение суток, а затем осторожно сливают в другую склянку.

3. Раствор тиосульфата натрия (0,01_нNa₂S₂O₃ 5H₂O). Растворяют 248 г кристаллического тиосульфата натрия ч. д. а. в 1 л свежепро -кипяченной дистиллированной воды. Раствор готовят в количестве 3 - 5 л и хранят в хорошо закрытых темных склянках.

4. Индикаторный раствор крахмала. 2 г крахмала суспендируют в 300 - 400 мл дистиллированной воды. Добавляют 20%-ный растовр NaOH, осторожно перемешивая до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Отстаивают раствор 2 часа и добавляют концентрированную HCl до кислой реакции, 2 мл ледяной уксусной кислоты (CH₃COOH) и доводят раствор до 1 л дистиллированной водой. Хороший раствор крахмала должен давать чистую синюю окраску.

5. Раствор иодистого калия (KI). Готовят 10%-ный раствор KI из чистой соли, растворяя в свежепрокипяченной дистиллированной воде. Раствор KI хранят в склянке, обернутой черной бумагой или окрашенной черной краской.

6. Раствор двухромовокислого калия (0,02_HK₂Cr₂O₇) 0,09808 г точно отвешенного K₂Cr₂O₇ растворяют в 1 л свежепрокипяченной дистиллированной воде в мерной колбе.

6.2.2 Подготовка к отбору проб

Перед измерением первичной продукции продукционные склянки, батометр и посуда для анализа должны быть тщательно вымыты и высушены. Перед постановкой опыта продукционные склянки и реактивы для фиксации кислорода должны быть помещены в специальные ящики. Склянки расставить в порядке отбора проб с горизонтов. На каждый горизонт необходимо четыре склянки - одну для определения начальной концентрации О₂, две светлые и одна темная для экспонирования проб.

6.2.3 Отбор, экспонирование и фиксация проб

а. В точке отбора проб измеряют прозрачность воды с помощью белого диска и определяют глубину фотического слоя или производят измерения количества проникающей солнечной радиации с помощью подводного пиранометра. При этом глубина, куда проникает 1% падающей солнечной радиации будет соответствовать нижней границе фотического слоя.

б. Отбор проб проводят с соответствующих горизонтов серией батометров объемом не менее 1 л. При этом из одного батометра одновременно отбирают пробы на гидрохимический анализ, а так же на качественный и количественный анализ фитопланктона.

в. Непосредственно после отбора проб батометры устанавливают в специальные держатели и немедленно начинают заполнять продукционные склянки. Перед заполнением каждая склянка споласкивается исследуемой пробой. Склянки заполняют доверху, переливая часть пробы. Склянку закрывают и помещают на соответствующий горизонт (две светлые и одну темную) и отмечают время начала экспозиции.

г. После того как склянки поставлены на экспонирование, сразу фиксируют все пробы для определения начальной концентрации О₂ на всех горизонтах. После экспозиции фиксируют остальные пробы. Кислород фиксируют, добавляя в склянки поочередно 1 мл MnCl₂ и 1 мл щелочного раствора KI. 2 мл потерянной пробы учитываются при последующем расчете. После фиксации склянку закрывают и энергично переворачивают несколько раз до тех пор, пока осадок не будет равномерно распределен по всему объему склянки. После этого пробы помещают в темное место для отстаивания осадка (от 3 ч до 1 суток).

6.2.4 Титрование проб и расчет содержания кислорода в пробе

После того как пробы отстоялись, осадок растворяют, добавляя 1- 3 мл концентрированной H₂SO₄. Закрывают склянку пробкой и перемешивают пробу до полного растворения осадка. Затем отбирают часть пробы из склянки (50 или 100 мл) в зависимости от объема склянки или берут всю пробу и переливают ее в коническую колбу. Титруют стандартным растовром тиосульфата до соломенно - желтой окраски. Затем добавляют 1 - 2 мл крахмала (появляется синяя окраска) и титруют тиосульфатом до полного обесцвечивания. Объем тиосульфата, пошедшего на титрование, записывают в соответствующую таблицу, (см приложение 4). Из одной склянки необходимо оттитровать по 2 - 3 повторности.

Количество кислорода (мгО₂/л), растворенного в воде, рассчитывают по формуле



где - количество тиосульфата, ушедшего на титрование, - нормальность тиосульфата, - поправка на нормальность тиосульфата, 8 - эквивалентная масса кислорода, - объем титрованной пробы, 2 - количество утерянной пробы, 1000 - пересчет на 1 л пробы.

6.2.5 Определение поправочного коэффициента нормальности Na₂S₂O₃

В коническую колбу объемом 100 - 150 мл добавляют 10 мл 10% иодистого калия, 35 - 50 мл дистиллированной воды, 15 мл 0,02_HK₂Cr₂O₇ и 10 мл HCl (2:1). Тщательно перемешивают и дают постоять 2 - 3 мин.

После этого раствор титрируют тиосульфатом до соломенно - желтой окраски. Затем добавляют 1 мл раствора крахмала и титруют до полного обесцвечивания. Поправочный коэффициент на нормальность тиосульфата рассчитывают по формуле

Где и - объемы тиосульфата и двухромовокислого калия. Определение поправочного коэффициента следует проводить перед каждой серией определений.

6.2.6 Расчет первичной продукции

Если - начальное содержание О₂ в склянке перед экспонированием, - количество О₂ в светлой склянке после экспонирования, - количество О₂ в темной склянке после экспонирования, - время экспозиции (ч), то первичную продукцию [мгО₂(лч)] вычисляют по следующим формулам:

1) валовая продукция



2) чистая продукция

3) деструкция

6.3 Радиоуглеродная модификация скляночного метода

Определение первичной продукции радиоуглеродным методом основано на включении в растительную клетку в процессе фотосинтеза углекислоты, меченной по углероду. Впервые для определения первичной продукции он был применен в морских исследованиях [35], а затем и на пресных водах [39,40]. Радиоуглеродный метод обладает высокой чувствительностью (в 100 раз чувствительнее кислородного метода), поэтому широко используется для измерения первичной продукции в водах с низкой продуктивностью - в океанических водах и олиготрофных водоемах суши. Существенными недостатками метода являются его относительно низкая точность (ошибка до 40%) и невозможность определения значений деструкции. Для определения первичной продукции радиоуглеродным методом используют светлые и темные склянки, как и для кислородного метода. Однако в отличие от кислородного метода, темные склянки в радиоуглеродном методе используют для определения нефотосинтетической фиксации изотопа углерода растительными клетками, которую вычитают из активности светлых склянок.

Выбор горизонтов для экспонирования проб и время экспонирования аналогичны скляночному методу в кислородной модификации.



6.3.1 Приготовление раствора изотопа

Заводская фасовка меченого углерода изготавливается в виде карбоната или бикарбоната натрия (реже калия). Раствор изотопа готовят в лаборатории непосредственно перед серией измерений первичной продукции в полевых условиях. Для растворения соли изотопа используют свежепрокипяченную и охлажденную дистиллированную воду. В мерную колбу непосредственно перед растворением изотопа добавляют несколько крупинок сухой щелочи для предупреждения потери изотопа из раствора. Приготовленный раствор изотопа разливают в стеклянные ампулы и запаивают с целью продолжительного хранения изотопа. Для последующего длительного хранения ампул с изотопом их необходимо простерилизовать. Для стерилизации ампулы помещают в сосуд с сильно окрашенным раствором метиленовой сини и автоклавируют при 50,5 кПа в течение 1 ч. При автоклавировании плохо запаянные ампулы окрашиваются в синий цвет и отбраковываются.

6.3.2 Добавление изотопа в продукционные склянки, экспонирование, фиксация

Для измерения первичной продукции на одном горизонте используют обычно две светлые и одну темную склянки.

Изотоп добавляют в склянки перед заполнением их пробами с фитопланктоном с помощью дозатора (рис. 13) или шприцем с пипеткой. Эту операцию следует проводить тщательно, поскольку на этом этапе возможна наибольшая ошибка. Количество добавляемого в банки изотопа должно соответствовать концентрации изотопа в склянке, равной (1,85 - 7,4)х10⁵ Бк/л. По окончании экспозиции пробы фиксируют 40%-ным формалином (0,5 - 1 мл на 100 - 250 мл пробы). Затем пробы отфильтровывают на мембранные фильтры.



Рис. 13. Дозатор

1 - ограничитель, 2 - пружина, 3 - гайка, регулирующая объем пробы.

6.3.3 Фильтрование проб, обработка и хранение фильтров

Фильтр Зейтца изготавливают из стойкого к окислению материала - пластмассы, латуни. В отличие от заводского фильтра, данная конструкция фильтра Зейтца (рис. 14) более удобна для работы и его легко изготовить в токарной мастерской. Опорную подложку лучше изготовить из крупнопористого стеклянного фильтра, можно так же использовать металлическую сеточку. Для одновременного фильтрования нескольких проб удобно смонтировать вакуумную фильтровальную установку (рис. 15), которая состоит из цилиндра, на котором установлено 5 - 10 фильтров Зейтца. В стационарных условиях установка может работать с помощью водоструйного вакуумного или электрического вакуумного насоса. В полевых условиях рабочий вакуум создается с помощью ручного насоса Камовского.



Рис. 14. Фильтр Зейтца

1 - прижимная шайба, 2 - стакан, 3 - подложка из металлической сетки, 4 - резьба для прижимной шайбы, 5 - основа фильтра.

Рис.15. Фильтровальная установка

1 - слив, 2 - к вакууму, 3 - вакуумные краны, 4 - фильтры Зейтца, 5 - цилиндр - приемник.

Мембранные фильтры для фильтрования фитопланктона должны быть с определенным размером пор. Удобно использовать мембранные фильтры производства ЧССР (тип "Сынпор") или ультрафильтры Мытищинской фабрики. Для определения первичной продукции фильтрование проб проводят на фильтрах с размерами пор 0,5 - 1,0 мк, что соответствует № 4 и 5 фильтров типа "Сынпор". Перед использованием мембранные фильтры необходимо прокипятить в дистиллированной воде.

Перед фильтрованием мембранные фильтры маркируют соответствующим номером шариковой ручкой или карандашом, затем взвешивают на аналитических весах с точностью дл сотых миллиграмма. Фильтрование пробы ведут при вакууме (20 - 30 кПа).

После фильтрования влажный осадок с фитопланктоном содержит частицы раствора изотопа, сорбированного на поверхности клеток, который может внести большую ошибку в счет активности фильтров. Поэтому после фильтрования фильтры помещают в эксикатор с концентрированной соляной кислотой и сашки Петри, проложенные фильровальной бумагой. Время обработки соляной кислотой 1 - 4 мин.

После обработки кислотой фильтры помещают в эксикатор с высушивающей смесью следующего состава: нетронная известь+силикагель+щелочь (1:1:1). Щелочь помещают в эксикатор в чашке Петри и заменяют по мере ее оплывания. Время высушивания фильтров составляет, как правило,24 ч. После высушивания фильтры повторно взвешивают.

6.4 Определение общего содержания углекислоты в воде

Для расчета первичной продукции необходимо знать общее содержание минерального углерода по всех формах углекислоты. Существует несколько методов определения общего содержания углерода в воде. Наиболее простые из них - титриметрический метод и метод расчета по концентрации водородных ионов (рН), температуре и карбонатной щелочи.

6.4.1 Титриметрический метод определения общего содержания углекислоты в воде

Принцип метода. Углекислота в воде присутствует в трех формах: свободной (СО₂), карбонатной () и бикарбонатной (НС). Соотношение этих трех форм в воде зависит от рН (табл. 3).



Таблица 3 Зависимость содержания различных форм производных угольной кислоты (%) от рН (при 25°С)

Форма	рН
	4,0	5,0	6,0	7,0	8,0	9,0	10,0	11,0
Свободная	99,5	95,4	67,7	17,3	2,0	0,2	-	-
Карбонатная	0,5	4,6	32,3	82,7	97,4	62,5	62,5	14,3
Бикарбонатная	-	-	-	-	0,6	5,7	37,5	85,7

Как видно из табл. 3, рН=8,3 является границей существования свободной углекислоты и карбонатов, поэтому при доведении пробы воды до рН=8,3 все формы углекислоты переходят в бикарбонаты, которые и определяют прямым титрованием соляной кислотой.

0,1 н. раствор NaOH готовят на свежепрокипяченной и охлажденной дистиллированной воде. Так как щелочь содержит некоторое количество карбонатов, то после растворения необходимо ее декантировать в склянке с притертой пробкой в течение суток. После этого раствор осторожно перелить в другую склянку, не взмучивая осадок. Готовят 200 - 400 мл раствора NaOH.

0,05 н. раствор HCl готовят на 1 л свежепрокипяченной дистиллированной воды.

Раствор фенолфталеина готовят на свежеепрокипяченной дистиллированной воде и хранят в колбочке с пипеткой.

Смешанный индикатор получают (метилрот, метилоранж и мителенблау), приготавляя каждый индикатор отдельно, а затем сливают в пропорции 1:1:1.

Ход определения. В коническую колбу отбирают 100 мл исследуемой пробы и добавляют 2 - 3 капли фенолфталеина. Затем осторожно по капле добавляют 0,1 н. NaOH до появления розовой окраски. Если рН исследуемой пробы 8,3, то розовая окраска появляется непосредственно после добавления фенолфталенина. В этом случае щелочь в пробу не добавляют. После появления розовой окраски добавляют по каплям 0,05 н. HCl до исчезновения окраски, а затем 5 - 10 капель смешанного индикатора и оттитровывают с помощью бюретки 0,05 н. HСl до появления ярко - розовой устойчивой окраски. Расчет общего содержания углекислоты в пробе (мгС/л) проводят по формуле

где а - объем 0,05 н. HCl, пошедший на титрование,мл; 0,6 - эквивалент углерода (при титровании 1мл 0,05 н. HCl соответствует 0,6 мгС/л); V - объем титруемой пробы, мл; 1000 - пересчет на 1 л.

6.4.2 Определение общего содержания углерода в воде по рН, температуре и карбонатной щелочи

Необходимыми характеристиками анализа вод являются рН, температура и щелочность, в частности карбонатная щелочь. Наличие таких данных позволяет расчетным путем определить содержание карбонатного углерода (С_к), растворенного в воде, по следующей формуле:

где А - карбонатная щелочь, мг-экв/л; а_н - концентрация активных ионов водорода; К₂ - вторая кажущаяся константа диссоциации углекислоты в воде при данной температуре [38] (табл. 4).

Таблица 4

t воды, °С	К210-9	t воды, °С	К210-9
0	0,023	16	0,038
2	0,025	18	0,040
4	0,027	20	0,042
6	0,029	22	0,044
8	0,030	24	0,046
10	0,032	26	0,048
12	0,034	28	0,050
14	0,036	30	0,051

6.5 Расчет первичной продукции

Расчет первичной продукции [мгС/(лч)] проводят по формуле

где - активность в светлых склянках за вычетом фона, имп/мин; - активность в темных склянках за вычетом фона, имп/мин; С_к - концентрация минерального углерода, мг С/л; R - исходная активность раствора изотопа имп/мин; К_с - коэффициент самопоглощения; 1,05 - дискриминационный коэффициент.

6.6 Расчет первичной продукции за день и под 1 м² водной поверхности

Имея значения первичной продукции в мг О₂/(лч), в мг/С(лч) или под 1 м² водной поверхности и зная длину светового дня для исследуемого района (по актинометрическим таблицам, можно рассчитать величину первичной продукции за световой день:

где - Т - дина светового дня, из которой вычитают 2 ч (исходя из положения, что в течение часа после восхода солнца и за 1 ч до захода солнца угол падения солнечных лучей на водную поверхность очень мал и количество проникающей в водную толщу солнечной радиации практически равно нулю и фотосинтез не происходит).

Первичная продукция под 1 м² водной поверхности служит характеристикой продуктивности всего столба воды в исследуемом районе водоема. Рассматриваемую величину получают построением кривой вертикального распределения первичной продукции. Затем определяют площадь, которую очерчивает эта кривая и площадь, соответствующую продукции в 1 м³ столба воды. Находят отношение всей площади к площади 1 м³. Умножив продукцию, содержащуюся в 1 м³ столба воды, на полученное отношение, получим значение первичной продукции во всем исследованном столбе воды, т. е. под 1 м³ водной поверхности.

6.7 Сравнение результатов кислородного и радиоуглеродного методов

Первичная продукция может быть выражена различными единицами, в частности единицами О₂ или С. Для сопоставления значений первичной продукции, измеренной разными методами, например количество О₂ в единицах углерода, используют следующее выражение: 1 мг связанного С/м³ = 1 мг освобожденного О₂/л = 0,375 мг О₂/л. Для перевода в другие единицы, например в джоули, необходимо пользоваться табл. 5

Таблица 5 Взаимоэквивалентные величины, рассчитанные по балансовому уравнению фотосинтеза [41]

Характе - ристика	О2	CO2	С, мг	Глюкоза, мг	Энергия, Дж
	мг	мл	мг	мл
1 мг О2	-	0,6997	1,375	0,6997	0,3750	0,9375	14,71
1 мл О2	1,4292	-	1,9652	1,0000	0,5359	1,3399	21,02
1 мг CO2	0,7273	0,5089	-	0,5089	0,2727	0,6818	10,70
1 мл СО2	1,4292	1,0000	1,9652	-	0,5359	1,3399	21,02
1 мг С	2,6667	1,8660	3,6667	1,8660	-	2,5000	39,22
1 мг глюкозы	1,0667	0,9464	1,4667	0,7464	0,4000	-	15,69
1 Дж энергии	0,0680	0,0475	0,0934	0,0475	0,0255	0,0637	-



6.8 Хлорофилльный метод определения первичной продукции и биомассы фитопланктона

Наличие хлорофилла в клетках является необходимым условием фотосинтеза. Большое число работ показывает закономерную связь между количеством хлорофилла растительных клеток и их продукцией и биомассой.

Следует отметить, что хлорофильный метод измерения первичной продукции и определение биомассы фитопланктона является весьма приближенным. Поэтому его использование для определения первичной продукции рекомендуется только в том случае, если по каким-либо причинам невозможно измерение скляночным методом.

6.8.1 Расчет первичной продукции

Для расчета первичной продукции хлорофильным методом необходимо знать следующие величины:

1. Z - С_z - концентрация хлорофилла "а" на определенной глубине;

2. Зависимость интенсивности фотосинтеза от световых условий (относительный фотосинтез) (R_z);

3. Распределение солнечной радиации по глубине ( коэффициент экстинкции) К;

4. Ассимиляционное число (АЧ);

5. I - количество дневной солнечной радиации, падающей на водную поверхность в течение светового дня.

Значение R_z находится из графика (рис. 16), рассчитанного Райтером и Енчем [42].



Рис. 16. Соотношение между общей дневной радиацией (I), падающей на поверхность, и дневным относительным фотосинтезом R на поверхности и на глубинах, где интенсивность света составляет соответствующий процент падающей радиации.

АЧ - это количество углекислоты, ассимилируемой в еденицу времени (в час, сутки и т. д.) в процессе фотосинтеза при световом насыщении одной весовой единицей хлорофилла, иначе говоря, АЧ - это отношение фотосинтеза при световом насыщении к количеству хлорофилла "а". Обычно АЧ выражают в г С/ч хлорофилла "а". Если нет возможности определить АЧ для исследуемого водоема, то можно использовать среднее значение АЧ = 3,7 гС/ч [43, 44]. Первая продукция [мг С/(м³день)] на каждом отдельном горизонте рассчитывается по формуле:

6.8.2 Расчет биомассы фитопланктона

Ориентировочный расчет биомассы фитопланктона по концентрации хлорофилла "а" проводят исходя из того, что, согласно Г. Г. Винберга, [41] хлорофилл "а" составляет 2,5% сухой биомассы или 6,75% содержания органического углерода. Поэтому при пересчете хлорофилла "а" в биомассу, выраженную в единицах углерода (мкг С/л), используют формулу



Принимая, что сухая биомасса составляет примерно 0,1 сырой массы фитопланктона, можно рассчитать по хлорофиллу "а" сырую массу фитопланктона (мкг/л) по формуле



7. Оценка качества воды

7.1 Метод Пантле и Букка для оценки качества вод по фитопланктону

Одним из методом качества воды является метод индикаторных организмов Пантле и Букка в модификации Сладечека [45, 46]. Этот метод дает возможность представить результаты биологического анализа численными значениями и обеспечивает тем самым возможность сравнения состояния водоемов различных районо.

Индекс сапробности вычисляется по формуле

Где s - индикаторная значимость каждого вида (определяется по спискам сапробных организмов, h - величина, которая находится из шестиступенчатой шкалы значений частоты (табл. 6) и определяет относительное количество видов.

Перевод ценных данных абсолютной численности в частоту встречаемости h обусловлен трудоемкостью вычислений. В тех же случаях, когда работа с большими числами не представляет затруднений (наличие калькуляторов) следует использовать данные абсолютной численности фитопланктона. Таким образом, для определения индекса сапробности необходимо знать значение индикаторной значимости каждого встреченного в пробе вида фитопланктона и его количественное развитие в данной пробе. Индекс сапробности вычисляют с точностью до 0,01. Для ксеносапробной зоны он находится в пределах 0 - 0,50, олигосапробной - 0,51 - 1,50, в-мезосапробной - 1,51 - 2,50, б-мезосапробной - 2,51 - 3,50, полисапробной - 3,51 - 4,00.



7.2 Оценка качества воды по показателям зоопланктона

Сообщество зоопланктонных организмов служит характеристикой состояния среды. Отдельные виды этих организмов используются для индикации качества воды. Прежде всего к индикаторам загрязнения следует отнести коловраток и простейших. Что касается группы ракообразных, то их довольно крупные размеры, значительная легкость при отборе проб и последующей обработки создают ряд преимуществ в использовании этих организмов в качестве непосредственных индикаторов загрязнения. Однако следует отметить, что большинство ракообразных приурочено не столько к разной степени загрязнения, сколько к трофическому типу водоемов.

Задачей первостепенной важности является уточнение списков видов - индикаторов зоопланктона для каждого региона Росии.

С помощью зоопланктеров, в частности веслоногих ракообразных, возможно определение последствий разового или прерывистого загрязнения.

Оценка качества воды или степень загрязнения вод по гидробиологическим показателям производится двумя путями:

1. По результатам сравнения населения на участках загрязненных с участками контрольными, т. е. с теми, где загрязнение отсутствует;

2. По индикаторным организмам.

Оба этих подхода используются при оценке качества воды по зоопланктонным организмам. Первый метод требует от исследователя четкости в выборе участков обследования. Необходимо, чтобы сопоставляемые участки водоема были достаточно сравнимы ( одинаковые биотопы, скорость течения и т. д.).

В первом случае оценка качества воды производится на основании анализа материала по качественному и количественному развитию зоопланктона. Учитывается численность, биомасса зоопланктеров, общее число видов, число видов в основных группах (ротатории, кладоцеры, копеподы), соотношение основных групп по численности, массовые виды и их процент общей численности. Принимается во внимание наличие того или иного вида или группы зоопланктона и в то же время, и даже в большей степени, отсутствие вида или группы. Учитывается изменение в структуре зоопланктонного сообщества, нарушение в соотношении между основными группами.

Сравнение исследованных участвок водоема можно производить по показателям, предложенным М. Б. Ивановой [47]:

1. Отношение числа видов кладоцер к числу видов копепод;

2. Соотношение численности (средних по всем пробам) этих групп.

Наиболее разработанной системой оценки степени загрязнения вод по индикаторным организмам является система сапробности Кольквитца - Марссона [48, 49]. Сущетвует ряд методов представления результатов биологического анализа, позволяющих оценить среднюю сапробность биоценоза. Одним из методов наиболее удобным при анализе зоопланктонного сообщества, является метод Пантле и Букка [50, 51]. Целью метода является обеспечение возможности сравнения результатов исследования состояния водоемов различных районов. Количественная оценка гидробионтов по методу Пантле и Букка учитывает относительную частоту встречаемости организмов h и отношение отдельных видов к пяти известным степеням системы сапрбности s. Обе эти величины входят в формулу для вычисления индекса сапробности

Величина h находится из шестиступенчатой шкалы значений частоты и определяет относительное количество видов ( табл. 6)



Таблица 6 Соотношение значений относительного обилия и частоты встречаемости организмов

Частота	Количество экземпляров одного вида, % общего количества экземпляров	h
Очень редко	<1	1
Редко	2 - 3	2
Нередко	4 - 10	3
Часто	10 - 20	5
Очень часто	20 - 40	7
Масса	40 - 100	9

Индекс сапрбности в олигосапробной зоне равен 0,50 - 1,50 (чистые воды), в в-мезасапробной зоне - 1,51 - 2,50 (воды умеренного загрязнения), б-мезосапробной зоне 2,51 - 3,50 (тяжело загрязненные), полисапробной зоне 3,51 - 4,50 (очень тяжело загрязненные).

По методу Пантле и Букка предполагается, что каждый индикаторный вид встречается лишь в одной зоне загрязнения, что не соответствует действительности. Сладечек [52] предложил модификацию этого метода, изменив значение индексов сапробности индикаторных видов, предложенных Пантле и Букком. Эти значения индекса сохраняются у тех видов, которые встречаются в одной зоне загрязнения. Если вид встречается в двух или большем числе зон, значение индекса изменяется на десятые, а иногда на сотые доли единицы. Значение индексов сапробности животных и растений S опубликованы в книге Сладечека [52].

Метод Пантле и Букка в модификации Сладечека более универсален и прост, чем система Зелинки и Марвана [53] и Ротштайна [54], требующие громоздких расчетов. При использовании метода Пантле и Букка следует иметь ввиду, что индикаторное значение видов может быть разным в различных климатических зонах.

Все необходимые характеристики для оценки качества вод по зоопланктонному сообществу заложены в форме отчетности "Зоопланктон".



Заключение

Применение гидробиологических методов позволяет непосредственно выяснить состав и структуру сообществ гидробионтов.

Использование методов изучения фитопланктона позволяет оценить качественный и количественный состав растительного планктона, а так же рассчитать количество первичной продукции потребляемой гетеротрофами. Наиболее простой и часто применяемый метод оценки количества первичной продукции считается "Скляночный метод в кислородной модификации", но так как он менее чувствителен, то в водоемах с низкой продуктивностью применяют "Скляночный метод в радиоуглеродной модификации". Так же, изучая количество растительного планктона и высшей водной растительности, определяют количество растворенного в воде кислорода. Как известно, кислород необходим для дыхания всех живых существ на земле. Наиболее применим этот метод для пресных водоемов, где содержание кислорода напрямую зависит от количества автотрофных организмов.

Методы для определения структуры и количества зообентосных и зоопланктонных организмов одинакового применимы как для пресных, так и для морских водоемов. Для изучения зообентоса пресных водоемов применяются упрощенные конструкции по сбору проб, это объясняется тем что, такие водоемы имеют более однородную структуру рельефа дна, происхождения грунта и т. д., по сравнению с морскими водоемами. Преимуществом пресных водоемов считается так же меньшее количество отбора проб при исследовании зоопланктона.

Гидробиологические методы применяемые при рыбохозяйственных исследованиях позволяют оценить качественный и количественны состав водных организмов, оценивать качество вод и донных отложений, как среды их обитания. Сравнив качественный состав и количественную структуру сообществ донных организмов, можно сделать выводы о качестве водной среды. Если в водоеме много чувствительных к загрязнению организмов и они разнообразны - водоем чист, и - наоборот, присутствие большого числа толерантных организмов свидетельствует о неблагоприятной экологической обстановке. Так как основной поток энергии в водной экосистеме идет через планктонную сеть пелагиали, в которой трансформируется до 99% энергии, гидробиологические исследования позволяют определить трофические связи гидробионтов и устанавливать направление изменения водных биоценозов. Гидробиологические методики позволяют определить совокупный эффект комбинированного воздействия загрязняющих веществ и определять экологическое состояние водных объектов и экологические последствия их загрязнения. Загрязняющие вещества накапливаются как в самой воде, так и в донных отложениях, телах гидробионтов и других водных организмов. Совместное нахождение нескольких вредных веществ способно усилить или ослабить пагубное воздействие на организмы и экосистему в целом.



Список использованных источников

1. Константинов А. С. Общая гидробиология. М., 1986

2. Биология океана. Под ред. М. Е. Виноградова в 2х томах. М.: Наука, 1977

3. Киселев И. А. Планктон морей и континентальных водоемов. - Л.: Наука, 1969. - 657 с.

4. Кузьмин Г. В. Фитопланктон. - В кН: Методика изучения биогеоценоза внутренних водоемов. М., Наука, 1975, с. 73 - 87.

5. Киселев И. А. Планктон морей и континентальных водоемов. - Л.: Наука, 1969, т. 1, с. 658.

6. Жадин В. И. Методы гидробиологического исследования. - М.: Высшая школа, 1960, с. 189.

7. Киселев И. А. Методы исследования планктона. - В кН.: Жизнь пресных вод СССР. - М. - Л.: Изд-во АН СССР, 1956, Т. 4, вып. 1, 183 - 265.

8. Кожова О. М., Мельник Н. Г. Инструкция по обработке проб планктона счетным методом. - Иркутск; 1978, с. 3 - 18.

9.Киселев. И. А. Изучение планктона водоемов. - В кн.: В помощь работающим на полезащитных лесных полосах. М. - Л. Изд. АН СССР, 1950, с. 40.

10. Балушкина Е. В., Винберг Г. Г. Зависимость между массой тела планктонных ракообразных. В кн.: Экспериментальные и полевые исследования биологических основ продуктивности водоемов. Л., Изд. АН СССР. 1979, с. 58 - 72.

11. Балушкина Е. В., Винберг Г. Г. Зависимость между массой тела планктонных ракообразных. В кн.: Общие основы изучения водных экосистем. Л., Наука, 1979, с. 169 - 172.

12. Вудивисс Ф. Совместные англо-советские биологические исследования в Ноттингеме в 1977 г. - В кн.: Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Труды советско-английского семинара. Л.: Гидрометеоиздат, 1977. с. 132 - 161.

13. Дуплаков С. Н. Материалы к изучению перефитона. - Труды Лимнологической станции в Косине, 1933, вып 16. - 160 с.

14. Абакумов В. А. Контроль качества вод по гидробиологическим показателям в системе гидрометеорологической службы СССР. - В кн.: Научные основы контроля качества поверхностных вод по гидробиологическим показателям. Труды советско-английского семинара. - Л.: Гидрометиоиздат, 1977, с. 93 - 100.

15. Hentschel A. Biologische Untersuchungen uber den tierischen und pilanzlichen Bewuchs in Hamburger Hafen. - Mitt. aus dem Zoologishen Museum. Hamburg, 1916 Bd 30, S 111.

16. Дуплаков С. Н. Исследование процесса обрастания в Глубоком озере. - Труды гидробиологической станции на Глубоком озере. 1925, т. 6, вып. 2, 3, с. 20 - 35.

17. Дуплаков С. Н. Некоторые наблюдения над вертикальным распределением обрастания в глубоком озере. - Труды гидробиологической станции на Глубоком озере, 1928, т. 6, вып. 4, с. 20 - 40.

18.Девяткин. В. Г. Динамика развития альгофлоры обрастаний в Рыбинском водохранилище. - Труды ИБВВ АН СССР. Рыбинск, 1979, № 42/45, с. 78 - 108.

19. Кутикова Л. А. Коловратка фауны СССР (L.) Rotatoria. - Л.: Наука, 1970, - 744 с.

20. Wulfert K. Die Radertiere (Rotatoria). Wittenberg, 1969. - 112 S.

21. Кузьмин Г. В. Фитопланктон

22. Коршиков О. А. Визначник прiсноводных водоростей. УРСР. - Киев. Изд. АН УССР, 1953, т. 5 . - 437 с.

23. Косипская Е. К. Десмидиевые водоросли. - В кн.: Флора споровых растений СССР . М. - Изд. АН СССР, 1960, вып. 1. - 706 с.

24. Курсанов Л. И., Наумов Н. А. Определитель низших растений. М.: Изд. АН СССР, 1953, т. 1. - 396 с.; т. 2. - 310 с.

25. Бруевич С. В. Определение продукции органического вещества в море. - В кн.: Акад. Вернадскому к 50-летию научн. Деятельности. 1936, с. 281 - 300.

26. Verduin J. Photosynthesis in naturally reared aquatic communities. - Plant Physiol., 1951, N 26, p. 45 - 48.

27. Ketchum B. H., Redfield A. C. Some physical and chemical characteristics of alga growth in mass culture. - J. Cellul. and Compar. Physiol., 1949, vol. 3, p. 281 - 299.

28. Riley G. A. Plankton studies. - Long Island Bull. Bingham Oceanogr. Collect., 1941, vol. 7, N 3, p. 1 - 93.

29. Методическое пособие по определению первичной продукции органического вещества в водоемах радиоуглеродным методом/ Под ред. Г. Г. Винберга и др. - Минск. Изд. БГУ, 1969, с. 1 - 26.

30. Руководство по методам биологического анализа морской воды и донных отложений/ Под ред. А. В. Цыбань. - Л.: Гидрометеоиздат, 1980, с. 106 - 121.

31. Федоров В. Д. О методах изучения фитопланктона и его активности. - М., Изд. МГУ, 1979, с. 62 - 129.