Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«КУБАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

(ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра биохимии и физиологии

ДОПУСТИТЬ К ЗАЩИТЕ В ГАК

Заведующий кафедрой - канд. биол.

наук, доцент ________ В. В. Хаблюк

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА БАКАЛАВРА

Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Работу выполнил Г. А. Набережных

Факультет биологический

Направление 06.03.01 Биология

Научный руководитель,

д-р биол. наук,

проф Н. В. Ковалюк

Нормоконтролёр,

доцент, канд. биол.

наук Н. Н. Улитина

Краснодар 2015



РЕФЕРАТ

Данная работа выполнена на 47 листах машинописного текста. Содержит 13 таблиц и шесть рисунков. Для выполнения данного исследования было использовано 35 литературных источников.

молочная продуктивность, ГОЛШТИНСКИЙ СКОТ, генечские маркеры, полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ГЕН BoLA DRB3, ГЕН КАППА-КАЗЕИН, аЛЛели, ЧУВСТВИТЕЛЬНЫЕ, УСТОЙЧИВЫЕ, НЕЙТРАЛЬНЫЕ

Цель работы - выявить генотип по локусам BoLA DRB3 и каппа - казеина оптимальный в отношении продуктивных показателей и резистентности к лейкозу у коров черно-пестрой голштино-фризской породы.

Работа проводилась на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 17.06.14 г. по 27.07.14 г. и с 02.07.14г. по 12.10.14 г.

Объектом исследования были коровы голштинской породы. Материалом для исследований служила кровь коров.

В институте выполнен ПЦР-анализ образцов на наличие полиморфизма в генах BoLA DRB 3 и каппа-казеин. По результатам анализа определена частота встречаемости генотипов и установлена связь с ними продуктивных качеств.



СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Современное состояние молочной продуктивности крупного рогатого скота

1.2 Краткая характеристика голштинских коров

1.3 Аналитический обзор генетических маркеров молочной продуктивности

1.3.1 Структура и полиморфизм гена BoLA DRB3

1.3.2 Структура и полиморфизм гена каппа-казеина

2. Материал и методы исследования

2.1 Материал исследования

2.2 Выделение ДНК

2.3 Проведение полимеразной цепной реакции

2.4 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции

2.5 Электрофорез

3. Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

3.1 Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA-DRB3 в исследуемом стаде

3.2 Качественные и количественные показатели молочной продуктивности чёрно-пёстрых голштинских коров и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3

3.3 Частота встречаемости генотипов по гену каппа-казеина и взаимосвязь генотипа с показателями молочной продуктивности у чёрно-пёстрых голштинских коров

3.4 Повышение частоты встречаемости оптимального в хозяйственном отношении генотипа

Заключение

Список использованных источников



ВВЕДЕНИЕ

В результате экономических преобразований в сельском хозяйстве России, за последние 20 лет, произошли радикальные перемены, носящие в основном негативный характер. Во всех отраслях животноводства, в том числе и молочном скотоводстве, резко снизилось количество животных, что привело к снижению их продуктивности, ухудшению показателей воспроизводства, увеличению подверженности к заболеваниям, рождению молодняка с пониженной жизнеспособностью, как в ранние, так и в более поздние периоды роста и развития, что, в свою очередь, привело к значительному экономическому спаду отрасли.

Традиционные зоотехнические методы оценки сельскохозяйственных животных, основанные на анализе фенотипических признаков, не всегда обеспечивают объективность суждения о селекционной перспективности животных и не могут в полной мере удовлетворить требования, предъявляемые к селекции.

Большинство хозяйственно-полезных признаков имеют непрерывную фенотипическую изменчивость и находятся под контролем многих генетико-физиологических систем, а также различных факторов внешней среды. В связи с этим методы биохимической и молекулярной генетики, основанные на использовании генетических маркеров, находят все большее применение в практической селекции.

Беспрецедентные возможности открыло использование ДНК-маркеров для генетического маркирования локусов, сцепленных с хозяйственно-ценными признаками.

Генетические маркеры - это нуклеотидные последовательности, чье положение (локализация) определено в хромосоме или участке хромосомы.

Использование генетических маркеров молочной продуктивности в практической селекции крупного рогатого скота, позволит более достоверно оценивать генетический потенциал пород, популяций и отдельно взятых особей, контролировать селекционные процессы и корректировать их направленность.

Так зарубежными исследователями был выявлен ген BoLA DRB3, который является одним из ключевых генов, определяющих первичный иммун-ный ответ организма на вирусную инфекцию. Разные аллели этого гена играют не одинаковую роль в формировании устойчивости КРС к персистентному лимфоцитозу, вызываемому вирусом лейкоза КРС [Xu, Van Eijk., Park, 1993].

В нашей стране Г. Е. Сулимова и др. (1995) провели исследования, профинансированные Фондом фундаментальных исследований Российской академии, и установили на большой выборке животных различных пород (черно - пестрой, айрширской и горбатовской) достоверную взаимосвязь между генотипом и устойчивостью к лейкозу.

А в работе «Associations of the bovine major histocompatibility complex DRB3 (BoLA DRB3) wish production traits in Canadian dairy cattle» [Sharif, 1999] на значительной выборке показана достоверная взаимосвязь наличия BoLA DRB3*8 аллели и повышенного уровня молочной продуктивности.

Таким образом, становится актуальным провести подобное исследование в условиях Краснодарского края, определить насколько в этом регионе КРС устойчив к заболеванию лейкозом и как BoLA DRB 3 генотип влияет на молочную продуктивность.

Не менее интересные и значимые в хозяйственном отношении исследования проводились и в области изучения аллельного полиморфизма гена каппа-казеина, его влияния на молочную продуктивность, качественные показатели молока и сыропригодность.

Проведенные исследования показывают, что количество сыра, полученного из молока коров с генотипом АА по гену каппа - казеина на 10% меньше, чем из молока коров с генотипом ВВ, молочная продуктивность ниже в среднем на 150 кг за лактацию, кроме того, жирность молока коров с генотипом АА ниже в среднем на 0,2-0,5 % [Иолчеев, Сельцов, 2001].

По результатам проведенных Н. Юхмановой и Л. Калашниковой [2004] исследований на животных красно-пестрой породы можно сделать вывод, что в исследуемой популяции не установлено прямолинейной зависимости между генотипом по локусу каппа-казеина и удоем. В то же время аллельные варианты гена каппа-казеина оказывают влияние на качественные показатели молока и его сыропригодность.

В связи с выше изложенным актуально провести исследования по изучению аллельного полиморфизма гена каппа-казеина в условиях Краснодарского края и именно на черно-пестрой голштино-фризской породе, так как она в этом отношении изучалась меньше всего.

Цель нашего исследования - выявить оптимальный генотип по локусам BoLA DRB3 и каппа - казеина в отношении продуктивных показателей и резистентности к лейкозу у коров черно-пестрой голштино-фризской породы.

Для достижения цели нами были поставлены следующие задачи:

1) установление частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA DRB3 у коров черно-пестрой голштино-фризской породы;

2) изучение качественных и количественных показателей молочной продуктивности чёрно-пёстрых голштинских коров и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3;

3) установление частоты встречаемости генотипов по гену каппа-казеина и изучение взаимосвязи генотипа с показателями молочной продуктивности у чёрно-пёстрых голштинских коров;



1. Аналитический обзор

1.1 Современное состояние молочной продуктивности крупного рогатого скота

Молочное скотоводство - наиболее сложная отрасль сельскохозяйственного производства, требующая системного подхода. Успешное её развитие определяется многими факторами: ценность разводимых пород, условия содержания и использования животных, их здоровье, качество производимой продукции и ряд других. Рассмотрим более подробно некоторые факторы и условия, за счёт которых возможно развивать молочное скотоводство в дальнейшем. И, прежде всего, необходимо выявить причины, из-за которых молочное скотоводство оказалось в кризисном состоянии.

В современном скотоводстве насчитывается примерно 300 пород крупного рогатого скота, наиболее широко распространённых в мире (всего их насчитывается более 1080). Однако анализ динамики среднегодового удоя на корову в нашей стране показал, что он характеризуется низкой молочной продуктивностью скота молочных пород отечественного молочного скотоводства.

У коров значительно выражена возрастная изменчивость молочной продукции. Молочная продуктивность коров первого и второго отелов ниже, чем взрослых. Установлено, что удой коров за одну лактацию составляет 75%, а за две - 85% от удоя взрослых коров. Самые высокие удои обычно получают за пятую-шестую лактации. Снижение молочной продуктивности коров в связи со старением начинается с восьмой-девятой лактации.

На величину продуктивности, наряду с другими причинами, существенное влияние оказывает яловость коров. Яловость - это экономическое понятие, означающее неполное получение приплода в маточной группе стада за истекший год. Яловостью коров также считают отсутствие оплодотворения по истечении трёх месяцев физиологического срока после родов, или через 45-60 суток после наступления половой зрелости организма [Кравченко, 1973].

Кроме того, нельзя забывать, что полноценное кормление - основа повышения продуктивности скота. Дефицит кормов и рост цен на них привели к росту себестоимости и снижению рентабельности производства молока в сельхозпредприятиях [Богданов, 1990].

Ещё одной проблемой молочного скотоводства является качество молока. Лактация у коров длится в среднем около 300 дней. За это время качество молока существенно меняется, по крайней мере, три раза. Впервые пять-семь дней после отела из вымени выделяется молозиво, предназначенное для телёнка. Далее следует второй, длительный период, когда молоко имеет нормальный и обычный состав и, наконец, наступает третий период за 10-15 дней перед запуском коровы, молоко в этот период называется стародойным [Борисовец, 1978].

В стародойном молоке содержание жира, белков и минеральных веществ повышается, а содержание молочного сахара понижается. Изменяются и органолептические свойства молока: оно приобретает горьковато-солёный вкус. Молоко, полученное от коровы впервые пять-семь дней после отела (молозивное) и за восемь-десять дней до запуска, молочными заводами не принимается. Но в настоящее время сложилась такая ситуация, что молоко, полученное от коров во второй период лактации, когда оно имеет обычный состав и хорошие органолептические показатели, характеризуется невысокими качественными показателями. Такое молоко никак не может быть переработано в молочную продукцию высокого качества, даже с учётом суперсовременных фильтров очистки. В молоке остаются токсины (продукты жизнедеятельности бактерий) в том числе и термоустойчивые формы, которые попадают в готовую продукцию, тем самым ухудшая вкусовую и питательную ценность молочного продукта. Причина, по которой на ферме производят молоко с зашкаливающими контрольными показателями - это неудовлетворительное санитарно-гигиеническое состояние вымени в технологическом процессе доения, отсутствие грамотной и профессиональной работы специалистов по целенаправленной профилактике маститов у коров.

Молочное скотоводство сегодня остается одной из ведущих подотраслей животноводства и его развитие имеет важное значение не только в обеспечении продовольственной независимости страны, но и в социальном аспекте

Максимальный уровень производства молока в России был достигнут в 1990 году. Тогда во всех категориях хозяйств было произведено 55,7 млн. т молока Упор делался на крупные животноводческие комплексы с промышленной технологией производства. В сельхозпредприятиях они давали более половины всего объема производимого молока. Однако необходимо отметить, что средний надой молока на корову в целом по России в тот период составлял всего 2781 кг.

Последующий период развития молочного скотоводства можно условно разделить на три этапа: первый - с 1990 по 1995 год характеризовался обвальным падением производства молока, особенно в сельхозпредприятиях, второй - с 1996 по 2001 год характеризовался снижением темпов падения, и третий с 2001 по настоящее время - это период стабилизации и частичного роста.

Средний удой молока на корову в сельхозпредприятиях в 2008 году превысил уровень 1990 года на 1243 кг и составил 4024 кг молока. В результате реализации приоритетного национального проекта «Развитие АПК» и Государственной программы развития сельского хозяйства на 2008-2012 гг., положено начало создания новой базы молочного скотоводства. За три года введено в эксплуатацию 306 новых объектов на 168,6 тыс. коров, модернизировано и реконструировано более 1150 молочных комплексов и ферм с использованием самых современных проектов и технологий и комплектацией племенным поголовьем с высоким потенциалом продуктивности.

Только через «Росагролизинг» хозяйствами закуплено 155,6 тыс. голов племенного скота, более половины из них отечественного, а всего на молочные комплексы и фермы поставлено более 300 тыс. голов племенного скота.

В результате за три года производство молока в стране увеличилось на 1,5 млн. тонн. Причем прирост производства молока обеспечен на фоне снижения поголовья коров и ликвидации множества мелких, да и не только мелких молочно-товарных ферм.

Необходимо признать, что большинство субъектов в прошлом и в текущем году столкнулись с проблемными вопросами организационного и экономического характера, которые сдерживают дальнейший рост производства молока.

Среди основных причин снижения темпов прироста производства молока и сокращения его объемов можно выделить следующие:

Во-первых, в ряде регионов отмечен невысокий темп роста молочной продуктивности коров, а в 14 территориях - его необоснованное снижение.

По среднегодовому надою, молока на корову - главному показателю в оценке состояния молочного скотоводства, Россия заметно отстает от стран с развитым животноводством. В 32 территориях средний надой на корову составляет менее 3500 кг.

При таких показателях в современных условиях ведение интенсивного молочного скотоводства просто невозможно.

В течение 2013 года ситуация на молочном рынке оставалась одной из самых сложных, так как на фоне традиционных проблем в текущем году на отрасль продолжали негативно воздействовать последствия прошлогодней засухи. Проблемы отрасли нашли отражение в серьезном сокращении поголовья и снижении продуктивности дойного стада. В силу недостаточной достоверности статистики поголовья, содержащегося в ЛПХ, абстрагируемся от этого показателя. Согласно официальной статистике в 2013 году поголовье коров в корпоративном секторе сократилось на 2,4%. Однако следует иметь в виду, что в текущем году значительно увеличивалось поголовье мясных и помесных коров, в том числе благодаря активной государственной поддержке данного сектора. Поэтому, если исключить мясных коров из общей численности коров, сокращение поголовья дойного стада в корпоративном секторе к концу года составит целых 8%. За последнее десятилетие подобное снижение поголовья наблюдалось только один раз - в 2005 г.

Среднегодовая продуктивность коров за текущий год сократилась на 12 кг по сравнению с 2012 годом. А официальное производство сырого молока в СХО и КФХ составит порядка 15,5 млн. тонн, против 16,5 млн. тонн на конец 2012 года.

На 1 июня 2014 года в стране поголовье коров составило 96,4 % к уровню аналогичного периода прошлого года. В 2013 году этот показатель составлял 3 млн. 604 тыс. голов. На начало лета 2014 года Росстат зафиксировал в официальных материалах поголовье коров в малых, средних и крупных сельхозорганизациях, равное 3 млн. 476 тыс. голов. Значительнее всего поголовье коров сократилось в Южном, Уральском, Сибирском и Приволжском Федеральных округах.

Общее поголовье КРС по данным Росстата на 1 июня составило 8870,27 тыс. голов.

С учетом наличия поголовья коров и сложившейся тенденции его ежегодного сокращения, достижение запланированных объемов производства возможно только за счет более высоких темпов увеличения молочной продуктивности коров при условии стабилизации маточного поголовья.

Возможности для этого есть. В стране разводится достаточное количество молочных и комбинированных пород, которые характеризуются высокими продуктивными качествами.

Учитывая, что генетический потенциал коров в настоящее время реализуется далеко не полностью, возможности повышения продуктивности животных имеются практически в каждом регионе.

1.2 Краткая характеристика голштинских коров

В нашей стране происходит изменение породного состава молочного скота.

В РФ продолжается увеличение поголовья чёрно-пёстрого скота за счет голштинизации. В южных районах наиболее распространенные породы чёрно-пёстрая, костромская, холмогорская, айрширская, красная степная породы. На территории России в молочном скотоводстве элитными породами считаются Голштинская, Джерсейская, Ярославская, Айрширская на их долю приходится 15% от общего поголовья молочного стада.

Голштинская порода является одной из лучших в мире по молочной продуктивности и технологичности. В крае занимает третье место по численности [Тузов, Гнатышак, 2005]. Хотя многие зоотехники - селекционеры всё равно отдают предпочтение голштинам красно - пестрой масти [Тузов, Одабашьян, 2005], которых считают лучше приспособленными к содержанию в условиях юга страны. В настоящее время на Кубани разведением этой породой занимается более 70 хозяйств.

Животные голштинской породы имеют высокие показатели продуктивности, характеризуются специализированным молочным типом, имеют высокую скорость молокоотдачи. Эту породу также широко используют в качестве улучшающей при разведении родственных черно - пестрых пород, а также при скрещивании с молочными и молочно - мясными породами. Направление продуктивности - молочное. Взрослые коровы имеют живую массу 650 - 700 кг. Для голштинской породы характерны скороспелость, хорошая оплодотворяемость и легкий отел. При хорошем кормлении и содержании телки к пятнадцатимесячному возрасту достигают живой массы 350 - 380 кг и могут быть осеменены. В племзаводах средний удой на корову составляет 7340 кг молока, жирностью 3,82%.

1.3 Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

Изучение генетического полиморфизма стало одним из наиболее важных и плодотворных направлений, как фундаментальной генетики, так и прикладных исследований. Ряд разработок в этой области успешно используют для повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных [Глазко, 2000].

Современные методы исследований ДНК генов позволяют надежно регистрировать их полиморфизм. Результаты исследования полиморфизма ДНК и отдельных генов достаточно широко используются для повышения эффективности селекции. Они дают возможность определять с высокой степенью достоверности происхождение, типы генов, участвующих в формировании определенных видов продуктивности [Терлецкий, Дементьева, Тыщенко, 2007].

Поиск маркеров, при помощи которых возможно маркировать отдельные количественные и качественные хозяйственно - ценные признаки животных, позволит более эффективно вести целенаправленную селекцию.

В исследованиях установлено, что существует определенная взаимосвязь между полиморфными генетическими структурами и хозяйственно - полезными признаками.

В качестве перспективных генов-маркеров продуктивности коров выделяют гены CSN3 (капа-казеина), GH (гормона роста), PRL (пролактина), LGB (лактоглобулина), BoLA DRB 3 и другие.

Ген гормона роста (GH) - важнейший эндогенный фактор, обладающий лактогенным, инсулиноподобным, диабетогенным, жиромобилизирующим, и нейротропным действием. Аллельные варианты в структурной и регуляторной частях гена гормона роста интересны с точки зрения их прямого и опосредованного влияния на молочную продуктивность и качество молока.

Ген пролактина (PRL) - один из гормонов, принимающих участие в инициации и поддержании лактации у млекопитающих, и может рассматриваться как потенциальный генетический маркер молочной продуктивности крупного рогатого скота.

Бета-лактоглобулин (в-LGB) является основным сывороточным белком молока жвачных животных, он выявлен в молоке у большинства видов млекопитающих, за исключением человека, грызунов и зайцеобразных.

1.3.1 Структура и полиморфизм гена BoLA DRB3

Из всего многообразия генетических маркеров ген BoLA DRB 3, на наш взгляд, является уникальным. Во-первых, высокий уровень полиморфизма гена BoLA DRB 3 позволяет использовать его как высокоинформативный маркер для изучения генетического разнообразия пород, линий и стад крупного рогатого скота. Во-вторых, полиморфизм гена BoLA DRB 3 главного комплекса гистосовместимости, связан с формированием иммунного ответа организма на вирусные и бактериальные инфекции и актуален для рассмотрения проблем устойчивости к заболеваниям. В-третьих, вероятно из-за своей близкой локализации к некоторым продуктивным локусам, полиморфизм BoLA DRB 3 взаимосвязан с хозяйственно-полезными признаками крупного рогатого скота.

Так установлено, что ген пролактина находится в непосредственной близости с геном BoLA DRB 3 на 23 хромосоме, в большинстве случаев эти гены наследуются сцеплено [Fries, Eggen, Womack, 1993].

Система BoLA - это главный комплекс гистосовместимости у крупного рогатого скота. Так же, как и ГКГ у других видов, BoLA подразделяется на гены класса I, класса II и класса III [Удина, 2004].

Система BoLA закодирована в 23 хромосоме [Петров, 1982], содержит более 154 генов [Elsik, 2009].

Подрегион BoLA класса IIa состоит из двух кластеров генов - DR и DQ. Физическое и генетическое картирование показало, что у КРС гены DR и DQ лежат в непосредственной близости, а также тесно связаны с генами класса III и I [Scott, 1987]. В классе IIa идентифицировано 14 генов: 1 DRA, 3 DRB (DRB1, DRB2, DRB3), 5 DQA (DQA1, DQA2, DQA3, DQA4, DQA5) и 5 DQB (DQB1, DQB2, DQB3, DQB, 5 DQB5). У КРС на гаплотип экспрессирует 1 DRA, 1 DRB ген и 1-2 DQ гена. Среди этих генов, BoLA-DRА является мономорфным [Aida, 1994], в то время как гены DRB3, DQA и DQB обладают высоким полиморфизмом [Lewin, 1999].

Гены МНС класса II крупного рогатого скота экспрессируются с различной интенсивностью. Уровень экспрессии гена BoLA DRB 3 - один из самых высоких [Groenen, 1990]. Интересен и тот факт, что для этого гена характерно наличие высоко полиморфных областей. Это является косвенным доказательством значимой роли BoLA DRB 3 в развитии иммунного ответа [Miretti, Ferro, 2001].

1.3.2 Структура и полиморфизм гена каппа-казеина

Ген капа-казеина (CSN3) - обеспечивает оптимальные технологические свойства молока при производстве сыра, в связи, с чем является одним из основных маркеров племенной ценности КРС.

Общее содержание белка в молоке составляет в среднем около 3,3% (от 2,8 до 3,8%). По физико-химическим свойствам выделяют три группы белков молока: казеины, альбумины, глобулины. Если общее количество белков принять за 100%, то на долю казеинов приходится 82%, альбуминов - 12%, глобулинов - 6%. Казеины в своем составе содержат фосфор и кальций и выпадают в осадок при действии на молоко слабыми кислотами и сычужным ферментом. В свою очередь казеины подразделяются на несколько фракций: б-, в-, г-, к -казеины [Жебровский, 1973].

Гены казеинов у крупного рогатого скота локализованы в регионе q31-33 шестой хромосомы. Они образуют кластер из четырех тесно связанных генов, расположенных в следующей последовательности: бS1, в, бS2 и к. Длина всего кластера - 250 т. н.п. [Ferretti, 1990]. На рисунке 1 представлена общая геномная организация казеинов КРС [Martin, 2002].

Аллельный полиморфизм гена каппа-казеина представляет интерес как маркер качества молока, поскольку А - и В - аллели каппа-казеина не равнозначны в хозяйственном отношении [Сулимова, Шайхаев, Берберов, 1991].

Проведенные исследования показывают, что количество сыра, полученного из молока коров с генотипом АА по гену каппа - казеина на 10% меньше, чем из молока коров с генотипом ВВ, молочная продуктивность ниже в среднем на 150 кг за лактацию, кроме того, жирность молока коров с генотипом АА ниже в среднем на 0,2-0,5 % [Иолчеев, Сельцов, 2001].

Рисунок 1 ? Общая геномная организация казеинов КРС

Хотя по результатам проведенных Н. Юхмановой и Л. Калашниковой [2004] исследований на животных красно-пестрой породы можно сделать вывод, что в исследуемой популяции не установлено прямолинейной зависимости между генотипом по локусу каппа-казеина и удоем.

В настоящее время в литературе описано10 вариантов к-казеина, из которых наиболее часто встречающимися являются А и В, а среди редких аллелей - С, Е, F и G.



2. Материал и методы исследования

2.1 Материал исследования

Исследования были проведены на базе лаборатории биотехнологии Северо-Кавказского научно-исследовательского института животноводства Россельхозакадемии в период с 17.06.14 по 27.07.14 и с 02.09.14 по 12.10.14.

Объектом исследования были коровы голштинской породы. Материалом для исследований служила кровь коров. Забор крови у коров проводился в хозяйстве ЗАО «Племзавод «Колос» Каневского района, в количестве n=115. Выделение ДНК, постановка ПЦР, ПДРФ - анализа, электрофореза проводились по описанным в литературе методикам (Van Eijk, Stewart-Haynes, Lewin, 1992]. Для статистической обработки результатов применялись стандартные методики Т.Ф. Лакина [1980] с использованием программных возможностей Microsoft Exel.

Обработка данных проводилась в программе на основе шаблона Microsoft Exel (BoLA-статистика), разработанной лабораторией биотехнологии СКНИИЖ (Н.В. Ковалюк). После внесения данных по генотипам коров программа автоматически определяет частоты встречаемости генотипов (в абсолютных и относительных значениях), аллелей (по группам и разновидностям), позволяет сортировать животных по генотипам и определять достоверность различий с использованием критерия Стьюдента.

2.2 Выделение дезоксирибонуклеиновой кислоты

При выделении ДНК из образцов крови использовали наборы реагентов Diatom DNA Prep 100 ООО «Лаборатория Изоген» город Москва.

1. Первичная обработка образцов.

К 100 мкл крови добавляем 400 мкл лизирующего раствора (Lysis Reagent). Далее идёт выделение без термостатирования.

2. В пробирку с лизатом добавляем 20 мкл суспензии сорбента (диатомовые водоросли). Перед этим сорбент встряхиваем на вортексе. Ротируем 10 мин.

3. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

4. Осторожно, не задевая, осадка, удаляем супернатант с помощью водоструйного насоса. К осадку прибавляем 200 мкл лизирующего раствора.

5. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

6. Удаляем супернатант. К осадку добавляем 1 мл рабочего однократного раствора солевого буфера (десятикратный солевой буфер (1М NaCl и 1M KCl) разводим водой до 100 мл, а затем 96% этиловым спиртом до 300 мл и перемешиваем).

7. Центрифугируем десять секунд при 5000 об/мин.

8. Удаляем супернатант, к осадку добавляем 1 мл рабочего раствора солевого буфера, перемешиваем, центрифугируем десять секунд при 5000 об.

9. Удаляем супернатант. Убираем полосками фильтровальной бумаги остатки жидкости над сорбентом, меняя полоски от пробы к пробе.

10. Осадок сушим в термостате при 65 градусах Цельсия пять минут.

11. К осадку добавляем 100 мкл ЭкстраГена (10% смесь ионообменников (типа Chelex), и 0,01% тритон X-100). Пробирку с ЭкстраГеном хорошо перемешать. Ресуспендируем на вортексе и термостатируем пять минут при 65 градусах Цельсия.

12. Центрифугируем при 12000 об/мин

13. Перенести содержащую ДНК надосадочную жидкость (80 мкл) в чистую пробирку.

2.3 Проведение полимеразной цепной реакции

Полиморфизмы гена BoLA DRB3 определяли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) по методике Van Eijk M.J.T., Stewart-Haynes J.A., Lewin H.A. [1992], Сулимова, Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О., Захаров И.А. [1995], используя соответствующие праймеры.

Для амплификации участков гена использовались следующие последовательности праймеров:

HLO-30: 5' - ATС СTC TCT CTG CAG CAC ATT TCC - 3'

HLO-32: 5' - TСG CCG CTG CAC AGT GAA ACT СTC - 3'

Полиморфизмы гена каппа-казеина (CSN3) определяли с помощью полимеразной цепной реакции по методике [Сулимова, 1991], используя соответствующие праймеры.

Для амплификации участков гена использовались следующие последовательности праймеров:

SGE: 5^' - TAT-CAT-TTA-TGG-CCA-TTG-GAC-CA -3^'

SGО : 5^' - CTT-CTT-TGA-TGT-CTC-CTT-AGA-GTT -3^'

ПЦР поводили с 200 нг ДНК в конечном объеме 30 мкл.

Состав реакционной смеси:

67 мМ трис-НСl рН 8,8 (Sigma)

16,6 мМ сульфата аммония (Sigma)

0,0 l% Tween 20 (Sigma)

1,5-2,5 мМ (в зависимости от анализа) хлористого магния (Sigma)

0,2 мМ дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (по 0,05 мМ каждого) (Sigma)

20 пМ каждого праймера

3 ед. Taq - полимеразы (ООО «СибЭнзим» Москва)

В пробирки с реакционной смесью добавляли минеральное масло (ООО «Хеликон») для предотвращения испарения жидкости и помещали в термоциклер МС-2, разработанный АО «ДНК-Технология» (Москва) для проведения ПЦР. С учетом особенностей работы амплификатора МС-2 и особенностей амплифицируемых участков нами были установлены следующие режимы амплификации:

При амплификации экзона 2 гена BoLA DRB 3

95є С - 3 мин.

95є С - 1 мин.

65є С - 1 мин. 5 циклов

72є С - 1 мин.

95є С - 30 с.

65є С - 30 с. 27 циклов

72є С - 30 с.

72є С - 3 мин. 1 цикл

При амплификации участка гена каппа-казеина

95є С - 3 мин.

95є С - 30 с.

62є С - 30 с. 34 цикла

72є С - 30 с.

95є С - 1 мин.

62є С - 1 мин. 1 цикл

72є С - 3 мин.

В результате полимеразной цепной реакции получаются ПЦР-продукты с размерами: 284 пары нуклеотид для BoLA DRB3 и 228 пар нуклеотид для каппа-казеина.

Для контроля прохождения реакции и оценки качества и концентрации проводили электрофорез в 1.5% агарозном геле с использованием пятикратного трис-боратного буфера (TBE имеет состав: 54 г Трис-НСl; 27,5 г борная кислота; 2 мл 0,5 M ЭДТА, рН 8,0 доводят дистиллированной водой до одного литра) [Уильямс, Уилсон, 1978].

Приготовление 1,5% и 2% агарозного геля:

- Агароза - 1,5 г

- Доводим до 100 мл 1% TBE-буфером

- Бромистый этидий - 5 мкл

После смешивания компонентов гель нагревают до кипения и оставляют в термостате на два часа при температуре 50 градусов Цельсия, чтобы молекулы полисахарида сформировали однородную решетку геля.

Образцы ДНК смешивали с буфером для нанесения проб, содержащим 50% глицерина, 50% TBE-буфера и 0,025% бромфенолового синего. Смешанные пробы вносили в лунки геля под электрофорезный буфер. Электрофорез обычно вели при постоянном напряжении 100 V.

Гель после электрофореза высушивали и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу ДНК, испускал волны в красно-оранжевой области видимого спектра 590 нм. После визуального осмотра гель фотографировали в ультрафиолетовых лучах.

Рисунок 2 ? Электрофорез в 1,5% агарозном геле продуктов ПЦР экзона 2 гена BoLA DRB3; pUC19/Msp I- маркер молекулярных масс, К - отрицательный контроль, 1-9 - исследуемые образцы

На рисунке 2 видно, что в ПЦР с геномной ДНК из образцов крови прошла хорошо, в геле видна полоса ДНК с ожидаемым размером 284 п.о., яркость полосы свидетельствует о достаточном количестве в пробе дезоксинуклеозидтрифосфатов, Taq-ДНК-полимеразы, правильном составе буфера для полимеразной реакции.

2.4 Анализ полиморфизма длин фрагментов рестрикции

В зависимости от целей исследований ПЦР-продукты обрабатывались рестриктизами.

В работе были использованы следующие ферменты: Rsa I, Bst Y I (Psu I, Xho II, Bst X2I), Bsu R I (Hae III), Hinf I.

- Rsa I в буфере, содержащем 10 мМ трис - ацетата (рН = 7, 9), 10 мМ ацетата магния, 66 мМ ацетата калия, 0, 1мг/мл BSA;

- Bst Y I в буфере, содержащем 10 мМ трисНСl (рН 7,9), 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCl2 и 1 мМ дитиотреитола;

- Bsu R I в буфере, содержащем 10 мМ трис - НС1(рН = 8, 5), 10 мМ MgCl2, 100 мМ KCl, 0, 1мг/мл BSA;

- Hinf I в буфере, содержащем 50 мМ трис - НС1(рН = 7,6), 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ DTT.

Последовательности, узнаваемые этими эндонуклеазами:

Rsa I - 5'GT ^ AC

Bst Y I - 5' (A/G) ^ GATC (C/T) 3'

Bsu R I - 5'GG^CC 3'

Hinf I - 5'G ^ A(A,G,C,T)T C 3'

2.5 Электрофорез

Молекулярный вес продуктов ПЦР и их фрагментов, полученных после рестрикции, определяли с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (6-12 %) [Херрингтон, 1999].

Состав ПААГ:

Вода, ТБЕ-буфер, 30 % ПАА, ТЕМЕД, 10 % персульфат аммония.

Бромистый этидий не добавляли, так как он плохо связывается с гелем и при электрофорезе первым покидает гель.

Электрофорез длился 1,5 часа.

Гели окрашивали в растворе этидиум бромида (1 мкг/мл), отмывали дистиллированной водой и просматривали в ультрафиолетовых лучах, при этом краситель, интеркалирующий в молекулу, испускал излучение в красно-оранжевой области видимого спектра (590 нм). После просмотра гели фотографировали в ультрафиолетовых лучах с использованием цифрового фотоаппарата SONY DSC W15. Снимки анализировали в программах Adobe Photoshop 6.

После рестрикции амплификата гена каппа-казеина эндонуклеазой Hinf I гомозиготные животные по аллелю A (генотип AA) образуют два фрагмента величиной 135 и 93 пары нуклеотид, гетерозиготные AB - три фрагмента: 228, 135 и 93 пары нуклеотид, а несущие генотип BB - один фрагмент 228 пар нуклеотид.

На рисунке 3 показан результат электрофореза фрагментов ДНК - продуктов рестрикции гена каппа-казеина в 6% полиакриламидном геле.

Рисунок 3 ? Анализ аллельного полиморфизма гена каппа-казеина

На рисунках с 4 по 6 представлены электрофореграммы продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 размером 284 пары нуклеотидов (пн), эндонуклеазами HaeIII, BstX2I, Bst2UI, Rsa I, позволяющие определить BoLА DRB 3 генотип животного.

Рисунок 4 ? Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Hae III.

Рисунок 5 ? Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой BstX

Рисунок 6 ? Электрофореграмма продуктов рестрикции амплификата участка гена BoLА DRB 3 эндонуклеазой Rsa I

Для разных аллельных вариантов гена BoLA DRB 3 характерно образование после рестрикции продуктов амплификации наборов рестриктных фрагментов (ДНК - паттернов) (таблица 1).

Сопоставление ДНК - паттернов, полученных с использованием указанных выше рестриктаз, позволяет идентифицировать более 50 аллелей гена BoLA DRB 3 (таблица 2). Допустим, при рестрикции ПЦР - продукта эндонуклеазой Rsa I образуются фрагменты 141, 104 и 39 пн (по таблице 1 находим, что это Rsa I - паттерн g); эндонуклеазой Bst Y I - 112, 87, 85 пн (Bst Y I - паттерн е); эндонуклеазой Hae III - 167, 65, 52 (Hae III - паттерн а). Затем по таблице 2 определяем, какой аллели соответствует комбинация установленных ДНК - паттернов.

Комбинация Rsa I - паттерна g, BstY I - паттерна e и Hae III - паттерна а соответствует 11 аллели гена BoLA DRB 3. Как видно из таблицы 2 эта аллель определяет устойчивость к лейкозу.

Таблица 1 - ДНК-паттерны и соответствующие им фрагменты рестрикции

Rsa I - паттерны	Bst Y I - паттерны	Hae III - паттерны
Название	Величина фрагментов рестрикции, пн	Название	Величина фрагментов рестрикции, пн	Название	Величина фрагментов рестрикции, пн
A	78,54,50,39,33,30	a	199, 85	a	167, 65, 52
B	111, 54,50,39,30	b	284	b	219, 65
C	111, 93, 50,30	c	196, 85	c	167, 65, 49
D	143, 111, 30	d	97, 87	d	190, 65, 29
E	141, 51, 50, 39	e	112, 87, 85	e	167, 117
F	141, 54, 50, 39	f	281	f	167, 65, 48
G	141, 104, 39			g	164,65,55
H	111, 69, 54, 50			h	167,65,46
I	180, 54, 50			i	167,113.4
J	78, 93, 63, 50
K	156, 78, 50
L	234, 50
M	111, 104, 69
N	180, 104
O	284
P	111, 51,50, 39, 30
Q	141, 90, 50
R	111, 90, 50, 30
S	141, 93, 50
T	78, 69, 54, 50, 33
U	153, 78, 50
V	102,78.54,50
W	78,69,54,50.33
X	104,78,69,33

Сулимова Г.Е., Удина И.Г., Шайхаев Г.О, Захаров И.А. [1995] отмечают, что подобный метод ДНК - типирования может быть использован в сельскохозяйственной практике для генотипирования быков - производителей с тем, что бы снизить широкое распространение аллелей, обусловливающих чувствительность к лейкозу.

Таблица 2 - Таблица определения аллелей гена BoLA DRB 3 на основе данных рестрикционного анализа с использованием эндонуклеаз Rsa I, Hae III, Bst Y I и их связь с устойчивостью к лейкозу

ПЦР -ПДРФ аллели BoLA DRB 3	Название ДНК - паттернов	Отношение к лейкозу*
	Rsa I	BstY I	Hae III
1	A	a	a	Н
2	B	b	a	Н
3	B	b	b	Н
4	C	a	a	Н
5	R	c	c	Н
6	D	a	a	Н
7	E	c	c	Н
8	f	a	a	Ч
9	f	d	a	Н
10	f	b	a	Н
11	g	e	a	Р
12	h	a	a	Н
13	h	b	a	Н
14	h	b	b	Н
15	i	b	a	Н
16	j	b	d	Ч
17	k	b	b	Н
18	l	b	f	Н
19	s	b	b	Н
20	l	b	b	Н
21	l	b	e	Н
22	m	b	a	Ч
23	n	b	a	Р
24	n	b	b	Ч
25	o	a	a	Н
26	o	a	b	Н
27	o	b	f	Н
28	o	b	b	Р
29	p	c	c	Н
30	q	c	c	Н
31	i	b	f	Н
32	m	a	a	?
33	n	b	f	?
34	l	a	b	Н
35	c	b	b	Н
36	l	b	a	Н
37	o	b	a	Н
38	b	d	a	Н
39	t	b	a	Н
40	u	b	a	Н
41	a	b	a	Н
42	h	b	f	Н
43	k	b	f	Н
44	k	b	i	Н
45	s	d	b	Н
46	v	b	a	Н
47	w	a	a	Н
48	w	b	a	Н
49	w	b	e	Н
50	x	b	a	Н
51	g	a	a	Н
52	s	d	a	Н
53	y	b	a	Н
54	j	d	b	?

Статистическая обработка результатов производилась как по стандартным методикам Н.А. Плохинский (1969), Н.А. Плохинский (1970); Е.К. Меркурьева (1979); Т.Ф. Лакин (1980), так и с использованием программных возможностей.



3. Генетические маркеры молочной продуктивности крупного рогатого скота

3.1 Частоты встречаемости аллелей и генотипов по гену BoLA-DRB3.2 в исследуемом стаде

По гену BoLA-DRB3.2 было прогенотипировано 115 коров черно - пестрой голштинской породы.

Распределение генотипов представлено в таблице 3.

Таблица 3 ? Частота встречаемости генотипов по локусу BoLA DRB 3

Генотип BoLA DRB3	Коровы (n=115)
	Кол-во животных данного генотипа	% животных данного генотипа
(Ч/Ч)	30	26,1
(Ч/У)	30	26,1
(Ч/Н)	30	26,1
(У/У)	5	4.3
(Н/Н)	10	8,7
(Н/У)	10	8,7

Из таблицы 3 видно, что наиболее многочисленными оказались группы животных, относящиеся к (Ч/Ч), (Ч/У) и (Ч/Н) генотипам, т.е. генотипам, в состав которых обязательно входят чувствительные аллели.

Соответственно в распределении аллелей гена BoLA DRB 3.2 наблюдается смещение в сторону чувствительных (Ч) аллелей - 52,2% (таблица 4).

Подсчет частот встречаемости аллелей проводился по формуле:

P(A) = (2+)/2n, (1)

где P - частота встречаемости аллели; А - аллель; N₁ - число гомозигот по исследуемому аллелю; N₂ - число гетерозигот; n - объем выборки.

Таблица 4 ? Частота встречаемости аллелей по локусу BoLA DRB 3

Частота встречаемости аллелей, N=115	Процент аллеля, %	Количество носителей	Процент носителей аллеля, %
Н	26,1	50	43,5
Ч	52,2	90	78,3
У	21,7	45	39,2

На сегодняшний день известно 54 аллели гена BoLA DRB3.2, из них три аллели (*11, *23, *28) имеют статус устойчивых (У), четыре (*8, *16, *22, *24) - чувствительных (Ч), а остальные сорок семь аллелей относятся к нейтральным по отношению к лейкозу КРС. Таким образом, теоретически аллели должны иметь следующие частоты встречаемости: (У) - 5,6 %, (Ч) - 7,4 %, (Н) - 87,0 %. Но мы наблюдаем совершенно иное распределение в исследуемом стаде - смещение в сторону Ч - аллелей и элиминацию 60 % Н - аллелей. При сопоставлении эмпирических частот с ожидаемыми мы можем установить достоверность или случайность наблюдаемого между ними расхождения с помощью критерия І, предложенного К. Пирсоном в 1900 г.

(p - pґ)І

І = ? ---- (2)

pґ

Этот критерий представляет сумму квадратов отклонений эмпирических частот (p) от частот ожидаемых (pґ), отнесенную к ожидаемым частотам (pґ) (формула 2) [Лакин, 1980] (таблица 5).



Таблица 5 ? Расчет критерия І в исследуемом стаде

Аллели	Частоты	(p- pґ)	(p - pґ)І	(p - pґ)І/ pґ	І
	эмпирические (p)	ожидаемые (pґ)
Н	26,1	87,0	-60,9	3708,81	42,63	360,13
Ч	52,2	7,4	44,8	2007,04	271,22
У	21,7	5,6	16,1	259,21	46,28

Таблица 6 ? Частоты встречаемости отдельных аллелей BoLA DRB3 в стаде и исследуемой выборки

Статус аллели по отношению к лейкозу КРС	Аллель BoLA DRB3	Частота встречаемости аллелей в выборке (N=115)
		%	носителей, N
Ч	8	6,2	13
	16	17,1	31
	22	15,8	32
	24	13,6	29
У	11	6,5	15
	23	14,5	29
	28	0,9	2
	3	3,0	7
	7	0,9	2
	9	0,4	1
	10	6,9	15
	12	3,9	7
	13	0,4	1
Н	14	0,4	1
	15	0,9	2
	18	0,4	1
	25	5,2	11
	26	0,9	2
	27	2,1	4

В нашем случае фактически полученная величина І равна 360,13, что во много раз превышает критическое значение І = 5,99, для 5 % - го (Р = 0,05) уровня значимости. Таким образом, нулевая гипотеза, т.е. предположение о том, что расхождение между эмпирическими и ожидаемыми частотами носит случайный характер, опровергается. Это говорит о том, что в результате искусственного отбора действовали довлеющие факторы, которые и привели к такому резкому смещению генного равновесия в сторону чувствительных аллелей.

Из 54 известных аллелей гена BoLA DRB3 в исследуемом стаде (N=115) было обнаружено девятнадцать аллелей. Причем известные на сегодняшний день чувствительные (BoLA DRB3*8, 16, 22, 24) и устойчивые (BoLA DRB3*11, 23, 28) аллели все встретились в исследуемом стаде, а нейтральные аллели встретились частично. Из таблицы 3 видно, что самыми распространенными из чувствительных аллелей являются BoLA DRB3*22 (15,8 %),*16 (17,1 %) и *24 (13,6 %), из устойчивых - *23 (14,5 %), из нейтральных - *3 (3,0 %), *10 (6,9 %), *25 (5,2 %).

3.2 Качественные и количественные показатели молочной продуктивности черно - пестрых голштинских коров и их взаимосвязь с генотипом по гену BoLA DRB 3

В настоящее время черно-пестрый голштинский скот - самый распространенный в мире. Этому способствует его высокая продуктивность, хорошая пригодность к машинному доению и приспособленность к промышленной технологии содержания. Голштино-фризский скот широко используется для разведения во всех зонах России, что говорит о высокой продуктивности и адаптационной способности этой породы [Сошенко, Сафонова, Кухарская, 2005].

Но внутри породы, или даже одного стада, показатели молочной продуктивности варьируют. Нами была изучена продуктивность в исследуемой выборке (n=115), состоящей из шести групп, сформированных по итогам генотипирования по гену BoLA DRB3.

Часто выборочные характеристики не совпадают по абсолютной величине с соответствующими генеральными параметрами. Величина отклонения выборочного показателя от его генерального параметра называется статистической ошибкой этого показателя, или ошибкой репрезентативности. Эти ошибки возникают в процессе отбора вариант из генеральной совокупности и к ошибкам измерений отношения не имеют. Величина ошибки репрезентативности измеряется средним квадратическим отклонением (), и чем сильнее варьирует признак, тем больше величина этого показателя.

О близости выборочной средней к генеральному параметру можно судить по отношению ошибки репрезентативности к сопровождаемой ею средней величине (Cs). Точность средних показателей, которыми оцениваются результаты наблюдений, считается вполне удовлетворительной, если коэффициент Cs не превышает 3-5%.

Таблица 7 ? Количественные показатели молочной продуктивности

I лактация
Генотип	Количество измерений	Продуктивность, кг/сут., ±	Cs (%)	Продуктивность, (кг/305 дн. лактации)
(Ч/Ч), N=30	235	24,8** ± 0,62	2,5	7398
(Ч/У), N=30	225	26,0 ± 0,69	2,6	7685
(Ч/Н), N=30	222	23,9*** ± 0,80	3,3	7141
(У/У), N=5	30	25,5 ± 1,39	5,4	7604
(Н/Н), N=10	62	26,5 ± 1,09	4,1	7860
(Н/У), N=10	57	24,5* ± 0,84	3,4	7306
Итого, N=115	831	25,0±0,35	1,4	7447
II лактация
(Ч/Ч), N=26	239	24,1*** ± 0,91	3,7	7203
(Ч/У), N=28	268	26,2 ± 0,63	2,4	7831
(Ч/Н), N=23	211	23,9*** ± 1,04	4,3	7143
(У/У), N=5	42	25,2 ± 1,06	4,2	7532
(Н/Н), N=8	80	26,0 ± 0,98	3,7	7771
(Н/У), N=9	90	24,4** ± 0,67	2,7	7293
Итого, N=99	930	24,9 ± 0,40	1,6	7442

Примечание: здесь и далее: * - p<0.05; ** - p<0.01; ***- p<0.001. Достоверность различий определялась относительно группы Ч/У.



Данные, приведенные в таблице 7 , по I и II лактациям исследуемых животных показывают превосходство по количественным показателям молочной продуктивности в группах Ч/У, У/У и Н/Н, но так как две последние группы довольно малочисленны по своему составу и, к тому же, имеют одни из самых высоких показателей репрезентативных ошибок (по I лактации: У/У - 1,39; Н/Н - 1,09; по II лактации: 1,06 и 0,98 соответственно), целесообразным будет определение достоверности различий выборочных средних, используя критерий Стьюдента, относительно группы Ч/У.

Таким образом, группа Ч/У (26,0-26,2 кг/сут) превосходит по молочной продуктивности группы Ч/Ч (24,8-24,1 кг/сут), Ч/Н (23,9 кг/сут) и У/Н (24,5-24,4 кг/сут), достоверно от них отличаясь и имея при этом наименьшее значение ошибки репрезентативности (0,63-0,69). В пересчете на 305 дней лактации животные генотипа Ч/У дают молока на 287-544 кг больше в I лактации и на 628-688 кг больше во II лактации, в отличие от животных генотипов Ч/Н и Ч/Ч. Животные с генотипом Ч/Ч имеют не самые низкие показатели молочной продуктивности, но во II лактации они немного снижаются (24,8 24,1 кг/сут), видимо, вследствие более частого поражения инфекционными заболеваниями. Наименьшая молочная продуктивность отмечена в группе животных с генотипом Ч/Н (23,9 кг/сут), причем эти животные изначально имеют низкий продуктивный потенциал и, к тому же, чаще остальных подвергаются выбраковке по причине инфекционных заболеваний.

Качественные показатели молока показаны в таблице 14.

При исследовании качественных показателей молочной продуктивности достоверных отличий установлено не было, за исключением двух моментов: во II лактации достоверно отличались показатели содержания в молоке белка в группах Ч/У (2,99 г/л) и Н/Н (2,91 г/л) и лактозы Ч/У (4,52 г/л) и У/У (4,42 г/л).

Была исследована связь молочной продуктивности и отдельных генотипов.

Таблица 8 ? Качественные показатели молочной продуктивности

I лактация
Генотип	Качественные показатели молочной продуктивности
	Жир, % ±	Белок, г/л ±	Лактоза, г/л ±	Сухое в-во, г/л ±
(Ч/Ч), N=30	3,43 ± 0,18	2,90 ± 0,08	4,53 ± 0,03	11,84 ± 0,25
(Ч/У), N=30	3,33 ± 0,24	2,79 ± 0,12	4,52 ± 0,04	11,67 ± 0,28
(Ч/Н), N=30	3,52 ± 0,19	2,79 ± 0,08	4,52 ±0,04	11,82 ± 0,22
(У/У), N=5	3,35 ± 0,38	2,69 ± 0,12	4,52 ± 0,09	10,85 ± 1,53
(Н/Н), N=10	3,52 ± 0,33	2,71 ± 0,12	4,55 ± 0,03	11,79 ± 0,35
(Н/У), N=10	3,85 ± 0,53	2,88 ± 0,13	4,54 ± 0,07	12,29 ± 0,62
Итого, N=115	3,46 ± 0,10	2,82 ± 0,05	4,52 ± 0,02	11,78 ± 0,14
II лактация
(Ч/Ч), N=26	3,44 ± 0,14	2,95 ± 0,05	4,50 ± 0,02	11,71 ± 0,12
(Ч/У), N=28	3,28 ± 0,13	2,99 ± 0,04	4,52 ± 0,02	11,38 ± 0,48
(Ч/Н), N=23	3,46 ± 0,16	2,96 ± 0,08	4,50 ± 0,03	11,73 ± 0,14
(У/У), N=5	3,03 ± 0,36	2,94 ± 0,21	4,42** ± 0,08	11,16 ± 0,25
(Н/Н), N=8	3,55 ± 0,39	2,91* ± 0,07	4,50 ± 0,04	11,79 ± 0,37
(Н/У), N=9	3,57 ± 0,43	2,95 ± 0,20	4,53 ± 0,08	12,03 ± 0,44
Итого, N=99	3,41 ± 0,08	2,96 ± 0,03	4,50 ± 0,01	11,64 ± 0,14
P<0.05; ** - P<0.01; Достоверность различий определялась относительно группы Ч/У.

Определены среднесуточные удои по каждому Ч/Ч генотипу, за исключением генотипов 16*22, 8*8 и 8*22, как редко встречаемых. Признак варьировал в пределах 22,6 - 28,2 кг/сут. Но так как коэффициент Cs (точность средних показателей) для групп животных с генотипами 16*8, 22*22, 24*24 и 24*8 превышал допустимый предел 5%, то при установлении достоверности отличий эти группы во внимание не брались. А между группами с генотипами 16*16, 16*24 и 22*24 достоверных отличий выявлено не было.



Таблица 9 ? Показатели продуктивности животных генотипов Ч/Ч по локусу BoLA DRB 3

Показатели	Генотип Ч/Ч по локусу BoLA DRB3
	16*16	16*24	16*8	22*24	22*22	24*24	24*8
Количество измерений	63	32	22	40	32	14	14
Среднесуточный удой, кг (M ± m)	25,3±0,98	25,3±1,04	22,6±2,0	24,9±1,17	22,8±1,80	28,2±4,76	22,9±2,67
Cs (%)	3,8	4,1	8,8	4,6	7,8	16,8	11,6

Подобные расчеты были проведены и для групп Ч/У и Ч/Н.

Таблица 10 ? Показатели продуктивности животных генотипов Ч/У по локусу BoLA DRB 3

Показатели	Генотип Ч/У по локусу BoLA DRB3
	22*23	23*24	16*11	24*11	22*11	16*23	11*8
Количество измерений	47	67	23	22	22	15	11
Среднесуточный удой, кг (M ± m)	24,8±1,65	26,3±1,17	25,4±1,34	26,5±1,46	25,4±2,25	28,6±2,53	28,7±1,95
Cs (%)	6,6	4,4	5,2	5,5	8,8	8,8	6,7

В группе Ч/У среднесуточная продуктивность варьирует в пределах 24,8 - 28,7 кг, но достоверность отличий между подгруппами различных генотипов Ч/У определить не представляется возможным по причине высоких значений коэффициента Cs.

Таблица 11 ? Показатели продуктивности животных генотипов Ч/Н по локусу BoLA DRB 3

Показатели	Генотип Ч/Н по локусу BoLA DRB3
	22*25	16*10	10*24	16*26	25*16	12*22	22*3
Количество измерений	29	23	21	15	15	13	14
Среднесуточный удой, кг (M ± m)	28,4±1,45	23,8±1,59	25,6±2,09	28,3±2,12	22,0±3,23	23,1±1,90	25,4±2,14
Cs (%)	5,1	6,6	8,1	7,4	14,6	8,2	8,4

Среди генотипов группы Ч/Н признак продуктивности сильно варьирует в пределах 22,0 - 28,4 кг/сут. Но высокие значения коэффициента Cs не позволяют определить достоверность отличий по молочной продуктивности между группами животных, относящихся к различным генотипам Ч/Н.

Таким образом, можно предположить, что отдельные генотипы достоверно на молочную продуктивность не влияют.

3.3 Частота встречаемости генотипов по гену каппа-казеина и взаимосвязь генотипа с показателями молочной продуктивности у чёрно-пёстрых голштинских коров

Изучаемая выборка коров (n=115) была также исследована по гену каппа - казеина и по итогам генотипирования разделена на три группы - АА, АВ и ВВ. Были определены частоты встречаемости каждого генотипа. В свою очередь, каждая из групп была разбита на подгруппы в зависимости от принадлежности к тому или иному генотипу по BoLA DRB3.2, в каждой из которых были посчитаны среднесуточные показатели молочной продуктивности, данные представлены в таблице 12.