Метод фиксации потенциала

Эксперимент с фиксацией потенциала, понятие тока утечки. Токи ионов натрия и калия. Удобные фармакологические средства, позволяющие избирательно блокировать натриевые или калиевые токи. Зависимость ионных токов от мембранного потенциала, их инактивация.

Рубрика Биология и естествознание
Вид контрольная работа
Язык русский
Дата добавления 26.10.2009
Размер файла 39,6 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

12

Метод фиксации потенциала

План

Эксперимент с фиксацией потенциала

Емкость и ток утечки
Токи ионов натрия и калия
Избирательные яды для натриевых и калиевых каналов
Зависимость ионных токов от мембранного потенциала
Инактивация натриевого тока
Натриевая и калиевая проводимость как функция потенциала
Количественное описание натриевой и калиевой проводимостей
Реконструкция потенциала действия

Эксперимент с фиксацией потенциала

Метод фиксации потенциала (voltage clamp) был разработан Колем и его коллегами, и усовершенствован Ходжкином, Хаксли и Катцем. Все, что нам необходимо знать для того, чтобы понять сами эксперименты, это то, что метод позволяет практически мгновенно установить нужный уровень мембранного потенциала и зафиксировать его на этом уровне, измеряя при этом мембранный ток. Ток, протекающий через мембрану при скачкообразном изменении потенциала с уровня покоя (-65 мВ) на деполяризованный уровень (-9 мВ). Ток, возникающий в ответ на скачок потенциала, имеет три стадии:

(1) короткий выброс выходящего тока, длящийся всего несколько миллисекунд,

(2) ранний входящий ток

(3) поздний выходящий ток.

Емкость и ток утечки
Первоначальный кратковременный выброс тока представляет собой емкостной ток, обусловленный изменением заряда на мембране в результате изменения мембранного потенциала. Если усилитель обратной связи способен проводить большие токи, то емкостной ток длится очень недолго. На практике выброс емкостного тока длится около 20 мс, и за ним следует небольшой, но устойчивый выходящий ток.
Этот выходящий ток, протекающий через проводимости, активные при потенциале покоя, называется током утечки. Большей частью это ток ионов калия и хлора, который имеет линейную зависимость от величины смещения потенциала фиксации от потенциала покоя и наблюдается на всем протяжении скачка потенциала. Большую часть времени, однако, этот ток замаскирован другими, гораздо большими по величине ионными токами.
Токи ионов натрия и калия
Ходжкин и Хаксли показали, что вторая и третья стадии тока обусловлены сначала входом ионов натрия, а затем выходом ионов калия из клетки. Им также удалось выделить индивидуальные компоненты тока и рассчитать их величину и временной ход. Одним из удобных способов добиться этого послужило удаление из раствора большей части ионов натрия и замена их на ионы холина (которые не проходят через мембрану). Снизив содержание внеклеточного натрия, удалось добиться того, что натриевый равновесный потенциал сравнялся с деполяризованным мембранным потенциалом (-9 мВ ). Таким образом, суммарный ток натрия равнялся нулю. Остался только калиевый ток. Натриевый ток был получен путем вычитания калиевого компонента из суммарного тока.
Избирательные яды для натриевых и калиевых каналов
Со времен первоначальных опытов Ходжкина и Хаксли были найдены удобные фармакологические средства, позволяющие избирательно блокировать натриевые или калиевые токи. Особенно удобным средством блокирования натриевых токов оказался тетродотоксин (ТТХ) и его фармакологический спутник сакситоксин (STX). ТТХ представляет собой сильный яд, содержащийся в яичниках и других органах рыбы фугу. В своем обзоре Као описывает захватывающую историю этого яда, начинающуюся с его открытия китайским императором Шун Нунгом (2838-2698 до н. э). Император лично испробовал 365 различных веществ, составляя свою фармацевтическую коллекцию, и прожил на удивление долго. STX синтезируется морским планктоном и накапливается в питающихся планктоном моллюсках, таких как аляскинский Saxidomus. По силе действия этот яд сравним с ТТХ; употребление в пищу всего одного такого моллюска (сырым или в вареном виде) может привести к смертельному исходу.
Важное преимущество ТТХ для нейробиологических опытов заключается в высокой избирательности его действия. Мур, Нарахаши и их коллеги в своих экспериментах на аксоне кальмара показали, что ТТХ в концентрации всего 1 мкмоль или ниже избирательно блокирует потенциалзависимые натриевые каналы. Изменение потенциала фиксации аксона, обработанного ТТХ, не приводит к возникновению входящего натриевого тока, но лишь выходящего калиевого. Величина и временной ход калиевого тока не изменяются в присутствии ТТХ. Внутриклеточное введение ТТХ в аксон никак не действует на ток. Эффект STX ничем не отличается от эффекта ТТХ. Оба токсина связываются с одним и тем же посадочным местом, расположенным во внешнем устье канала, через которое проходят ионы натрия, и физически перекрывают им проход через мембрану.
Для калиевых каналов, участвующих в потенциале действия, также было найдено несколько блокирующих их веществ. Так, в аксоне кальмара и миелинизированном аксоне лягушки, как показали Армстронг, Хилле и их коллеги, тетраэтиламмоний (TEA, в концентрациях выше 10 ммоль) блокирует потенциалзависимые калиевые каналы.
В аксоне кальмара TEA необходимо добавлять во внутриклеточный раствор, поскольку он блокирует внутреннее устье канала; в других препаратах, таких как перехват Ранвье лягушки, TEA эффективен и при внеклеточной аппликации. Другие соединения, такие как 4-аминопиридин (4-АР) или диаминопиридин (DAP), блокируют калиевые каналы в миллимолярных концентрациях как снаружи, так и изнутри клетки.
Зависимость ионных токов от мембранного потенциала
Установив природу раннего и позднего компонента тока, Ходжкин и Хаксли исследовали зависимость натриевого и калиевого токов от мембранного потенциала. Скачок потенциала на -85 мВ приводит лишь к возникновению небольшого входящего тока, как и следовало ожидать на основании свойств мембраны в состоянии покоя. Каждый из небольших деполяризационных скачков производит сначала входящий ток, а затем более продолжительный выходящий. С увеличением величины деполяризационных скачков ранний ток уменьшается, при деполяризации на +52 мВ он равен нулю, а при еще более положительных значениях деполяризации меняет знак и становится выходящим.
Потенциалзависимость ранней и поздней составляющих тока.
Максимальная амплитуда раннего тока и амплитуда уровня плато позднего тока расположены по оси ординат, а потенциал фиксации, который устанавливался скачком с уровня потенциала покоя -- по оси абсцисс. При гиперполяризующих скачках нет разделения на ранние и поздние токи; мембрана отвечает на скачок потенциала как простой резистор. Поздний ток также ведет себя как резистор, поскольку деполяризация активирует выходящий ток, однако по мере увеличения уровня деполяризации величина тока начинает значительно превосходить величину, ожидаемую на основании свойств мембраны в покое. Это объясняется активацией потенциалзависимой калиевой проводимости, пропускающей дополнительный ток. Поведение раннего тока значительно более сложно. Как уже было отмечено, он сначала возрастает, а затем убывает по мере увеличения деполяризации, становится равным нулю при потенциале +53 мВ, а затем и вовсе меняет знак. Потенциал реверсии расположен близко к равновесному потенциалу для натрия, чего и следовало ожидать для тока ионов натрия.
Интересной особенностью потенциалзависимости раннего тока является то, что в диапазоне потенциалов от --50 до +10 мВ ток растет с ростом деполяризации. Величина натриевого тока зависит от натриевой проводимости (gNa), а также от движущей силы для ионов натрия (Vm -- Е). Можно было бы предположить, что благодаря этому ток будет уменьшаться по мере приближения мембранного потенциала к натриевому равновесному потенциалу, т. е. произойдет уменьшение движущей силы. Однако этого не происходит по причине резкого увеличения натриевой проводимости с возрастанием деполяризации, которое перевешивает эффект снижения движущей силы. Таким образом, натриевый ток INa = gNa(Km - ENa) возрастает. Этот участок потенциалзависимости раннего тока называется «участком проводимости с отрицательным углом наклона».
Инактивация натриевого тока
Из опытов Ходжкина и Хаксли очевидно, что временной ход натриевого и калиевого токов весьма различен. Развитие калиевого тока замедлено по сравнению с натриевым, однако по достижении своего максимального уровня калиевый ток остается на нем довольно долго. Напротив, натриевый ток растет гораздо быстрее, но затем спадает до нуля, несмотря на то, что мембрана все еще деполяризована. Такой спад натриевого тока называется инактивацией.
Ходжкин и Хаксли детально изучили процесс инактивации натриевого тока. В частности, они исследовали влияние гиперполяризующих и деполяризующих пре-импульсов на пиковую амплитуду натриевого тока, возникающего в ответ на последующую деполяризацию. Мембранный потенциал скачкообразно переведен с -65 на -21 мВ, в результате чего возникает натриевый ток величиной приблизительно 1 мА/см2. Когда деполяризации предшествует гиперполяризация величиной --13 мВ, пиковое значение тока возрастает. Деполяризующие преимпульсы, напротив, снижают амплитуду натриевого тока. Воздействие деполяризующих и гиперполяризующих пре-импульсов зависит от времени воздействия: короткие импульсы длиной в несколько миллисекунд неэффективны. В данном эксперименте длительность пре импульсов была достаточной (30 мс) для достижения максимального эффекта.
Результаты представлены количественно в виде зависимости пикового натриевого тока от потенциала пре-импульса. Пиковый ток выражен в долях амплитуды контрольного тока. При деполяризующем пре-импульсе порядка --30 мВ натриевый ток был снижен до нуля, т. е. инактивация была полной. Гиперполяризующие пре-импульсы до -95 мВ и ниже вызвали увеличение натриевого тока на 70 %. Ходжкин и Хаксли выразили этот диапазон значений натриевого тока от нуля до максимума одним параметром (h), принимающим значение от нуля (полная инактивация) до 1 (отсутствие инактивации), как показано на правой оси ординат на рис. 6.6Е. В данных экспериментах инактивация при потенциале покоя была около 40 % максимального значения. Последующие эксперименты показали, что натриевые каналы всех нейронов демонстрируют ту или иную степень инактивации в покое.
Натриевая и калиевая проводимость как функция потенциала
Измерив таким образом величину и временной ход натриевого и калиевого токов как функции мембранного потенциала Vm и определив равновесные потенциалы ENa и Ек, Ходжкин и Хаксли получили возможность рассчитать величину и временной ход изменений натриевой н калиевой проводимостей, используя приведенные ранее соотношения
На рис. 6.7А показаны результаты пяти скачков потенциала. Как gNa, так и gк возрастают с увеличением деполяризации. Временной ход натриевой проводимости совпадает с натриевым током, однако ее потенциалзависимость существенно отличается от токовой. Проводимость равномерно нарастает с увеличением деполяризации, в то время как величина натриевого тока сначала возрастает, а затем убывает по мере увеличения деполяризационных скачков. Чем ближе мембранный потенциал во время деполяризации к натриевому равновесному потенциалу, тем меньше натриевый ток. В результате входящий ток уменьшается, несмотря на то, что проводимость растет.
Вывод:
Результаты опытов Ходжкина и Хаксли показали, что деполяризация мембраны аксона вызывает три процесса:
(1) активацию натриевой проводимости,
(2) ее последующую инактивацию
(3) активацию калиевой проводимости.
Количественное описание натриевой и калиевой проводимостей
На основе полученных экспериментальных данных Ходжкин и Хаксли разработали математическую модель, способную точно описать временной ход изменений натриевой и калиевой проводимостей, происходящих в ответ на деполяризующий скачок потенциала. Если рассматривать калиевую проводимость, то логическим следствием изменения потенциала должно быть возникновение движущей силы, способной переместить один или несколько зарядов внутри потенциалзависимого калиевого канала, который в результате должен открыться. При условии, что речь идет об одном-единственном процессе, кинетика изменений калиевой проводимости должна описываться уравнением первого порядка, т. е. возрастание проводимости в ответ на деполяризацию должно быть экспоненциальным.
Вопреки таким рассуждениям, процесс увеличения калиевой проводимости начинается с задержкой и протекает по S-образной кривой . Благодаря наличию этой задержки, а также тому, что увеличение калиевой проводимости возникает только в ответ на деполяризацию, но не гиперполяризацию, этот ионный канал получил название задержанного выпрямления (delayed rectifier). Ходжкин и Хаксли нашли способ для точного математического описания процесса увеличения калиевой проводимости, сделав допущение о том, что для открытия канала необходима активация четырех процессов первого порядка (например, перемещение четырех заряженных частиц внутри мембраны). Другими словами, S-образную кривую можно описать суммой четырех экспонент. Таким образом, калиевую проводимость можно представить как
где g K(max) -- максимальная проводимость для данного скачка потенциала, а n -- возрастающая экспоненциальная функция, принимающая значения от 0 до 1: n = 1 -- е-t/?n.
Зависимость gK(max) от потенциала.
Временная константа экспоненты, n, также зависит от потенциала: чем больше деполяризация, тем быстрее возрастает проводимость. При температуре 10° С n принимает значения в диапазоне от 4 мс для небольших деполяризаций до 1 мс для деполяризации до нуля мембранного потенциала.
Временной ход возрастания натриевой проводимости также имеет форму S-образной кривой, но описывается экспонентой, возведенной в третью степень. Напротив, спад натриевой проводимости в результате инактивации происходит по моноэкспоненциальной кривой. Для каждого конкретного скачка потенциала, общий временной ход изменений натриевой проводимости представляет собой результат наложения процессов активации и инактивации:
где gNa(max) -- это максимальный уровень, которого натриевая проводимость достигла бы при отсутствии инактивации, a m = 1 -- е--t/n Процесс инактивации представлен не нарастающей, а спадающей экспонентой, представленной как h = е--t/?h. Как и в случае калиевой проводимости, gNa(max) зависит от потенциала, также как и временные константы активации и инактивации. Временная константа активации натриевой проводимости m гораздо короче калиевой, и при 10° С принимает значения от 0,6 мс (при значениях потенциала близких к потенциалу покоя) до 0,2 мс при нулевом мембранном потенциале. Временная константа инактивации h близка по значению константе n
Реконструкция потенциала действия
Эмпирически полученные формулы, отражающие зависимость натриевой и калиевой проводимостей от потенциала и от времени, позволили Ходжкину и Хаксли предсказать временной ход всего потенциала действия и происходящих при этом изменений проводимостей. Начав с деполяризующего скачка потенциала, лишь немного превышающего пороговое значение, они рассчитали все последующие изменения мембранного потенциала с шагом 0,01 мс. Так, они подсчитали, как в течение первых 0,01 мс после деполяризации до -45 мВ изменятся gNa и gк, каково будет увеличение INa и IK, и, наконец, каким будет в результате воздействие суммарного тока на Vm. Зная значение Vm в конце первого отрезка времени в 0,01 мс, они повторили те же вычисления для следующего промежутка, затем для следующего, и так далее, на протяжении всех фаз нарастания и спада потенциала действия (исключительно трудоемкая процедура, если учесть, что ни компьютеров, ни даже калькуляторов в те времена не было!).
Результаты расчетов с удивительной точностью повторили форму реального потенциала действия аксона кальмара. Экспериментально измеренный и рассчитанный потенциалы действия при трех различных уровнях деполяризации. Для того, чтобы по достоинству оценить значимость этих достижений, нужно иметь в виду, что параметры, использовавшиеся для расчетов, были получены в совершенно неестественных условиях, при которых потенциал последовательно фиксировался на разных уровнях.
Литература:
1. Малиновский А.А. Тектология. Теория систем. Теоретическая биология.
2. Человеческий потенциал: опыт комплексного подхода. Ред. Фролов И.Т.
3. Золотов Ю.А., Иванов В.М., Амелин В.Г. Химические тест-методы анализа.

Подобные документы

  • Количественное описание механизмов, участвующих в генерации потенциала действия. Натриевые и калиевые токи, соотношение натрия и калия на фазе роста потенциала клетки. Положительная и отрицательная обратная связь во время изменений проводимости.

    контрольная работа [27,7 K], добавлен 26.10.2009

  • Ионные токи, протекающие через мембрану клетки. Мембранный потенциал для модели идеальной клетки. Формула потенциала покоя и постоянного поля. Равновесие ионов хлора. Электрическая модель мембраны. Участие ионных каналов в формировании потенциала покоя.

    реферат [224,2 K], добавлен 24.10.2009

  • Понятие равновесного мембранного потенциала. Механизмы прохождения ионов через поверхностную мембрану клетки. Принцип работы натрий-калиевого насоса. Характерные черты потенциалзависимых и рецепторуправляемых ионных каналов. Способы их активации.

    реферат [413,1 K], добавлен 19.08.2015

  • Основные факторы, влияющие на степень проводимости и проницаемости ионного канала, значение концентрации ионов калия в данном процессе. Метод определения потенциала, необходимого для уравновешивания эффекта реальной разницы концентраций ионов калия.

    реферат [46,7 K], добавлен 24.10.2009

  • Регуляции биологических систем. Функции клеточной мембраны. Пассивный, активный трансмембранный транспорт. Изменение проницаемости ионов натрия и калия при развитии потенциала действия. Распространение возбуждения по немиелинизированному нервному волокну.

    презентация [3,2 M], добавлен 21.03.2014

  • Строение и классификация нейронов. Структура и функция цитоплазматической мембраны нейронов. Сущность механизма возникновения мембранного потенциала. Природа потенциала действия между двумя точками ткани в момент возбуждения. Межнейронные взаимодействия.

    реферат [27,0 K], добавлен 10.07.2011

  • Изучение программы Виргилио Лью и Роберта Букчина о неидеальном осмотическом поведении гемоглобина. Построение математической модели динамики изменения объема и потенциала клетки (липосомы) в зависимости от концентраций вне- и внутриклеточных ионов.

    курсовая работа [586,8 K], добавлен 15.03.2012

  • Свойство мембранной клетки проводить ионные токи и накапливать заряд на своей внешней или внутренней поверхности, емкость мембраны. Нарастание и спад потенциала, время, необходимое для достижения его устойчивого состояния, сенситизация и S интернейроны.

    реферат [157,7 K], добавлен 26.10.2009

  • Кальциевые потенциалы действия. Описание процессов активации и инактивации каналов. Вклад открытых калиевых каналов в реполяризацию. Результаты экспериментов на аксоне кальмара с фиксацией потенциала. Роль кальция и натрия в возбуждении мембраны клетки.

    контрольная работа [140,6 K], добавлен 26.10.2009

  • Программное обеспечение для осуществления моделирования биохимических и генетических процессов в клетке. Математическая модель динамики изменения объема и потенциала эритроцита. Симуляция гибели эритроцита методом фиксации трансмембранного потенциала.

    дипломная работа [1,3 M], добавлен 26.05.2012

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.