Исследование изменений метаболизма эритроцитов донорской крови после взятия ее из организма

В свете рассмотренных выше цепочек причинно-следственных связей протекания процессов в крови, изменение кинетики энергетического метаболизма эритроцитов, в рамках нашей модели (рис.8), представляется смещением кривой MN на фазовой плоскости в кислую сторону. Если такое смещение имеет место, то нарушение согласования будет проявляться в появлении колебаний параметров эритроцитов и связанных с этим изменений концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов. Наиболее значимо для нас колебание рН плазмы крови и цитоплазмы эритроцитов, так как эти колебания неизбежно вызывают быстрые неравновесные процессы ассоциации и диссоциации осмотически активных частиц. Следствием протекания осмотических процессов, в свою очередь, являются изменения концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов, которые можно наблюдать, и по ним судить о появлении таких колебаний. Сродство отдельных соединений друг к другу и, следовательно, способность образовывать комплексы, может сильно зависеть от величины рН.

Таким образом, согласно нашей модели после взятия пробы крови рН плазмы устанавливается на более низком уровне, чем in vivo. Возрастание осмолярности плазмы крови вследствие деятельности пептидаз приводит к новому осмотическому равновесию, которому соответствует меньший объем эритроцитов и более высокая концентрация АТФ. При этом нарушается согласование метаболических процессов эритроцитов, что сопровождается колебаниями основных параметров рН, nАТФ. Рассмотренные причинно-следственные связи протекающих неравновесных процессов показывают, что при этом должны наблюдаться колебания концентрации глюкозы в плазме крови и объема эритроцитов. Временной ход величин этих параметров можно наблюдать на опыте.

Итак, процессы устойчивого подкисления цитоплазмы, напрямую не связанные с окислительными процессами утилизации глюкозы, способствуют переходу метаболизма эритроцитов в низкоэнергетическое состояние после взятия пробы крови.

Дальнейшие события могут развиваться по двум сценариям. В первом случае: подкисление цитоплазмы эритроцитов не достигает критического уровня, указанного в нашей модели (рис. 8). Тогда метаболизм эритроцитов останется на уровне, близком к in vivo, то есть будет соответствовать высокой концентрации АТФ, высокой величине трансмембранного потенциала и более низкому значению рН плазмы по отношению к рН in vivo. Но из-за рассогласования процессов неизбежны колебания основных параметров рН и nАТФ, а как их следствие, колебания измеряемых величин - концентрации глюкозы в плазме и объема эритроцитов. Кроме того, высоким значениям концентрации АТФ будут соответствовать высокие значения трансмембранного потенциала и низкие значения неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для кислорода.

Во втором случае: если рН цитоплазмы достигнет критически низкого уровня, то состояние метаболизма эритроцитов может потерять устойчивость. Тогда метаболизм эритроцитов перейдет в новое состояние, характеризующееся низкой концентрации АТФ, низкой величиной трансмембранного потенциала и меньшей скоростью подкисления цитоплазмы эритроцитов, чем в первом рассмотренном случае. Из-за рассогласования процессов неизбежны колебания основных параметров рН и nАТФ, и как их следствие, колебания измеряемых величин концентрации глюкозы в плазме и объема эритроцитов. Кроме того, низким значениям концентрации АТФ будут соответствовать низкие значения трансмембранного потенциала и высокие значения неспецифической проницаемости мембран для кислорода по сравнению с первым рассмотренным случаем.

Важным выводом теоретического исследования нашей качественной модели энергетического метаболизма эритроцитов является возможность перехода системы на другой устойчивый уровень вследствие протекания в ней естественных релаксационных процессов непосредственно после взятия пробы крови из организма. Поэтому в первую очередь необходимо проверить это положение. Основными критериями для установления состояния метаболизма, в котором находится эритроцит, являются различия следующих параметров в различных состояниях:

1. рН;

2. уровень глюкозы;

3. показатель гематокрита - объем

Различия в величинах этих параметров необходимо устанавливать, анализируя их временной ход после взятия пробы крови, так как мы не знали, осуществляется ли указанный переход вообще. Если переход происходит, то в какой момент времени. Надежно обнаружив и установив, что этот переход уже произошел и система близка к стационарному состоянию, то подтверждением будут различия в величине неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для двух установившихся вариантов устойчивого метаболизма.

Для того чтобы производить сравнения нужно получить пробу крови с состоянием метаболизма эритроцитов, близким к in vivo. Для этого необходимо устранить первопричину нарушения метаболизма эритроцитов - осмотическое неравновесие, возникающее после взятия пробы крови из организма. Для этого можно использовать препараты, ингибирующие ферментативный распад соединений в плазме крови (антипептидаз).

Для надежности полученных результатов при сравнении следует также получить пробу с заведомо низким энергетическим метаболизмом, добавляя в кровь препараты, ингибирующие гликолиз. Мы применяли этиловый спирт.

Объем исследований позволяет достигнуть поставленной цели и надежно установить возможность существования второго устойчивого состояния, либо его отсутствия.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

§ 3.1 Цели экспериментальных работ

· Регистрация осмотического сжатия эритроцитов пробы крови, непосредственно после ее взятия из организма, которое дает начало неравновесным процессам установления нового уровня метаболизма эритроцитов.

· Регистрация колебательных процессов при установлении нового уровня метаболизма, обусловленных рассогласованием процессов, определяющих кинетику гомеостатирования основных параметров эритроцитов.

· Регистрация факта совершившегося перехода метаболизма эритроцитов из состояния с высокой концентрацией АТФ в состояние с низкой его концентрацией по выявлению отличий параметров различных проб крови.

Для достижения поставленных целей были проведены следующие экспериментальные работы:

1. Наблюдение временного хода концентрации глюкозы n_гл в плазме пробы крови, которое позволило по изменениям величины n_гл судить о скорости синтеза АТФ в эритроцитах, а также о протекании осмотических процессов в пробе крови, которые происходят на временах меньших характерного времени прохождения глюкозы в эритроцит (10 мин).

2. Наблюдение временного хода показателя гематокрита Н пробы крови, которое позволило по изменениям величины Н судить о протекании осмотических процессов в пробе крови, идущих с характерными временами выше и сравнимыми с 15 мин.

3. Наблюдение временного хода показателя кислотности рН плазмы пробы крови, которое позволило по изменению величины рН судить об изменении интенсивности энерговыделений в цитоплазме эритроцитов, изменении величины трансмембранной разности потенциалов и, следовательно, об изменении неспецифической проницаемости мембран эритроцитов.

4. Измерение неспецифической проницаемости мембран эритроцитов, которое позволило по величине этого параметра судить о величине трансмембранной разности потенциалов и, в конечном итоге, об изменении уровня метаболизма эритроцитов и изменении концентрации АТФ.

§ 3.2 Используемые приборы и установки

1. Для измерения концентрации глюкозы в плазме крови использовался глюкометр IME-DC с одноразовыми полосками, принцип действия которого основан на измерении электропроводности пробы крови. Время одного измерения ~ 40 сек.

Подготовка глюкометра к экспериментам включала проверку его работоспособности согласно инструкции. До проведения эксперимента брали каплю крови из пальца здорового человека на специальную полоску. Затем с помощью прибора определяли концентрацию глюкозы в плазме крови этой капли. Если показания прибора попадали в физиологический диапазон значений измеряемой величины, то считалось, что прибор работоспособен.

2. Для измерения показателя гематокрита пробы крови использовалась гематокритная центрифуга СМ-70 sky line. Частота вращения - 5000 об/мин, время центрифугирования - 5 мин.

Подготовка гематокритной центрифуги СМ-70 sky line. Для работы центрифуги использовались гепаринизированные капилляры длиной 75 мм, объемом - 60-75 мкл. Для закупорки одной стороны капилляров использовался пластилин.

3. Для измерения показателя кислотности рН использовался рН-метр с водородным электродом. Время одного измерения ~ 5мин.

Для подготовки к эксперименту была снята калибровочная кривая рН-метра. Для этого использовались три стандартных раствора с известным рН: рН₁=10,01; рН₂=4,01; рН₃=7,01. Калибровочная кривая представлена на рис. 13. Она построена по трем точкам, которые получены для каждого из буферов путем усреднения по 5 измерениям рН. Погрешность каждой экспериментальной точки не превышает 1%.

4. Для измерения величины неспецифической проницаемости использовалась установка КИНОКС, которая включает в себя прибор КИНОКС (схема его действия представлена на рис. 14) и персональный компьютер.



Размещено на http://allbest.ru/

4

Принцип действия прибора «КИНОКС»

В приборе КИНОКС наблюдается процесс обмена кислородом между цитоплазмой эритроцита и плазмой крови, в которую, в свою очередь, кислород поступает из контактирующей с кровью газовой среды. Основным параметром, регистрируемым прибором, является степень насыщенности крови кислородом, определяемая оптическим путем. В результате находят зависимость этой величины от времени. В результате анализа полученных зависимостей можно судить о кислородной проницаемости мембран эритроцитов крови [17, 18].

Основные узлы и элементы прибора «КИНОКС»:

1. Оптоэлектронный блок, включающий в себя светодиоды, работающие в красной и инфракрасной областях спектра (на длинах волн 0,65 мкм и 0,96 мкм соответственно), и фотодиод.

2. Кювета, выполненная из прозрачного материала (оргстекла).

3. Механическая мешалка с двумя лепестками, выполненными из гибкого пластика, толщину и жесткость которых можно варьировать.

4. Шаговый двигатель, с помощью которого вертится мешалка.

5. Термостат, позволяющий поддерживать температуру кюветы на уровне 27 ?С.

В кювете имитируются процессы кислородного обмена между эритроцитами и тканями-потребителями кислорода. При этом взаимодействие эритроцитов со стенками кюветы и лепестками мешалки имитирует взаимодействие со стенками капилляров. Степень этого взаимодействия определяет величину неспецифической проницаемости мембран эритроцитов.

На рис. 15 представлена типичная кривая зависимости степени насыщенности крови кислородом от времени. Производная по времени в каждой точки данной кривой прямо коррелирует с величиной неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для кислорода.

Размещено на http://allbest.ru/

4

Подготовка установки КИНОКС проводилась без использования пробы крови. Проверка его работоспособности включала запуск вращения мешалки. Если мешалка работает, то прибор готов к проверке действия программы управления экспериментом. При включении программы на дисплее ЭВМ должны появляться горизонтальные линии. Если прибор работоспособен, то эти линии со временем удлиняются и срабатывает команда на окончание работы прибора, когда заканчивается время, указанное программе.

Инструментальная погрешность отдельного измерения, оцененная в более ранних исследованиях, составляет менее 1%.

§ 3.3 Используемые материалы

В исследованиях использовалась цельная кровь, взятая из вены здорового человека в 4 шприца, по 9мл в каждый. До взятия крови в каждый из шприцов были добавлены следующие вещества:

№1. гепарин - 1мл;

№2. гепарин - 1 мл, стандартный раствор антипептидаз объемом 50, 250 и 500 мкл для различных серий экспериментов;

№3. гепарин - 1 мл, стандартный раствора антипептидаз объемом 250, 500 и 1000 мкл для различных серий экспериментов;

№4. гепарин - 1мл, в первой серии экспериментов - 1 мл цитрата натрия; во второй и третьей серии экспериментов - этиловый спирт объемом 500 мкл и 100 мкл соответственно.

Из шприцов подготовленная таким образом кровь, выливалась в пробирки с соответствующей нумерацией.

Для подготовки этих проб крови использовались следующие растворы:

· раствор Рингера (300 мОсм):

Дистиллированная вода 100 мл;

NaCl6,8 г/л * 100 мл = 0,68 г;

KCl0,22 г/л * 100 мл = 0,022 г;

CaCl₂0,11 г/л * 100 мл = 0,011 г;

NaHCO₃ 0,17 г/л * 100 мл = 0,017 г.

· раствор цитрата натрия (300 мОсм):

Дистиллированная вода 50 мл;

Цитрат Na(50 г / 100 %) * 3,8 % = 1,9 г.

§ 3.4 Методики проведения экспериментальных работ

· Получение временного хода концентрации глюкозы для каждой пробы, приготовленной по описанию в § 3.3 «Используемые материалы», включало в себя получение 10-12 экспериментальных точек за 3 часа. Перед началом эксперимента концентрацию глюкозы измеряли в капле крови, взятой из пальца того же человека. Это измерение производится гораздо быстрее, чем аналогичное измерение для пробы крови, взятой из вены. Поэтому полученное значение концентрации глюкозы в плазме крови, взятой из пальца, можно считать наиболее близким к in vivo. В сериях экспериментов интервалы между получаемыми точками варьировались в зависимости от поставленной цели. Когда требовалось убедиться в наличии колебаний в пробе крови, вызванных быстрыми осмотическими процессами, происходящими за время, меньшее характерного времени прохождения глюкозы в эритроцит (10 мин) [19], то интервалы устанавливались менее 10 мин. Когда этого не требовалось, то интервалы устанавливались большие.

Так как показания глюкометра иногда были нестабильны и наблюдались выбросы (как в сторону уменьшения, так и в сторону увеличения показаний), то для устранения ошибок для каждой точки проводилось по 2 измерения, а если показания прибора при этом не совпадали в определенных пределах, то проводили и третье измерение. В этом случае при формировании экспериментальной точки, усредняя ее по измеренным величинам, выброс не учитывался. Одно измерение концентрации глюкозы занимало ~40 сек, следовательно, получение одной экспериментальной точки, как правило, ~80 сек, а при наличие выброса ~120 сек.

Средняя ошибка одного измерения концентрации глюкозы определялась на стабилизированной крови посредством пяти измерений концентрации глюкозы в ней, и вычислялась по формуле (5):

,

где - значение концентрации глюкозы в каждом из пяти измерений, - среднее значение концентрации глюкозы по пяти измерениям, n - количество измерений.

· Методика наблюдения временного хода показателя гематокрита в пробах крови. Гематокритная центрифуга позволяет проводить измерение для 12 капилляров. Как правило, одновременно получали экспериментальные точки для 4 проб крови, при этом центрифугировали по 3 капилляра для каждой из проб. Если одновременно экспериментальная точка определялась для двух проб, то центрифугировали по 6 капилляров для каждой пробы крови. Усреднением по измеренным значениям (3-м или 6-ти капиллярам) показателя гематокрита получали экспериментальную точку и оценивали среднюю ошибку измерения по формуле (5).

Одно измерение показателя гематокрита занимало не менее 20 минут, поскольку включало набор крови в капилляры - 8-10 минут, центрифугирование - 5 минут, измерение длины столба осевших эритроцитов и полной длины столба крови в капилляре - 5 минут. Поэтому за 3 часа наблюдений получали 7-8 экспериментальных точек. Таким образом, получали ход величины показателя гематокрита, усредненный по возможным быстрым осмотическим колебаниям объема эритроцитов, если такие были.

· Методика наблюдения временного хода показателя кислотности рН в пробах крови. Одно измерение рН в плазме пробы крови занимало ~ 1 мин. Подготовка рН-метра к измерению рН следующей пробы крови занимало ~ 2 мин. За 3 часа наблюдений для каждой пробы крови было получено 6-8 точек.

· Методика измерения неспецифической проницаемости мембран эритроцитов проб крови для кислорода. С помощью прибора КИНОКС были выполнены отдельные измерения для регистрации факта перехода метаболизма эритроцитов из состояния, близкого к in vivo, в состояние с низкой концентрацией АТФ. В первой и второй серии экспериментов проницаемость мембран эритроцитов не измерялась. По данным этих серий было выяснено, через какое время t после взятия крови из организма параметр (концентрация глюкозы) относительно стабилизируется. В третьей серии первое измерение проницаемости проводилось через это время t для каждой из проб, а второе ее измерение проводилось через 3 часа после начала эксперимента. Характерное время получения кривой оксигенации составляло ~ 8 мин.

Инструментальная погрешность отдельного измерения, оцененная в других исследованиях, составляла менее 1%. Случайный разброс от образцов крови получен в предыдущих исследованиях с данным прибором, составляет несколько больше (1-2%).

§ 3.5 Результаты экспериментов и их обсуждение

Для регистрации осмотического сжатия эритроцитов пробы крови - были получены временные ходы концентрации глюкозы и показателя гематокрита в пробе крови, подготовленной по описанию пробы №1 в § 3.3 «Используемые материалы». Измерения указанных характеристик проводились параллельно в течение 3-х часов после взятия пробы крови из организма. Методика проведения этих экспериментов описана в § 3.4 «Методики проведения экспериментальных работ» в пунктах 1, 2.

Типичный результат первых опытов (рассмотрено более 10 проб крови от различных доноров), полученных ранее сотрудниками нашей группы [20], представлен на рис. 16. На нем показан временной ход концентрации глюкозы (верхняя кривая) и временной ход показателя гематокрита (нижняя кривая) пробы крови.



Размещено на http://allbest.ru/

4

Из графика видно, что начальная экспериментальная точка во всех опытах измерения концентрации глюкозы, полученная в пробе крови, оказывалась выше, чем в пробе крови, взятой непосредственно из пальца (она показана на оси ординат, где представлены значения концентрации глюкозы). Первая экспериментальная точка из пробы была получена через 3-4 минуты после измерения концентрации глюкозы в плазме крови, полученной из пальца. Погрешность измерения концентрации глюкозы была посчитана по формуле (5) и ее значение не выходит за размеры точки на графике.

Временной ход показателя гематокрита, как видно из рис. 16, в пределах погрешности меняется незначительно. Следовательно, по этой характеристике нельзя судить о первоначальном изменении объема эритроцитов.

Теоретический анализ показывает, что первоначальное осмотическое сжатие эритроцитов имеет место из-за распада пептидов в плазме пробы крови, осуществляемого пептидазами. Однако в представленном эксперименте это сжатие не наблюдалось. Было сделано предположение о том, что осмотические процессы настолько быстры, что мы не успеваем их увидеть за время, прошедшее от взятия крови из вены до первого измерения (не менее 2-х минут).

Для того чтобы убедиться в правильности этого предположения, была проведена отдельная серия опытов. Были получены временные ходы концентрации глюкозы в пробах крови, подготовленных по описанию проб №1, №2 (с 50 мкл антипептидаз) в § 3.3 «Используемые материалы». Антипептидазы ингибируют ферментативный распад пептидов на отдельные аминокислоты, тем самым увеличивая время, за которое происходит этот распад.

Типичный результат показан на рис. 17 приведены результаты такого опыта. Временной ход показателя гематокрита не приводится из-за его не информативности, так как время одного измерения больше характерного времени протекания быстрых осмотических процессов, описанных выше.

гемоглобин эритроцит метаболизм энергетический

Размещено на http://allbest.ru/

4

На рис. 17 представлены временные ходы концентрации глюкозы в плазме пробы крови: 1 - без добавления антипептидаз, 2 - с добавлением антипептидаз. Видно, что кривая 2 имеет «провал» в значениях концентрации глюкозы в первый час наблюдения. Ход кривой 1 не отличался от хода кривых в экспериментах, сделанных ранее.

Такое уменьшение концентрации глюкозы в пробе крови с применением антипептидаз свидетельствует о наличии сжатия эритроцитов. Таким образом, наше предположение о том, что ферментативный распад пептидов в плазме крови вызывает осмотическое сжатие эритроцитов и, что эти процессы происходят очень быстро (за время меньшее 5 мин), верно. Такое первоначальное осмотическое сжатие может дать начало неравновесным процессам, впоследствии приводящим к установлению нового уровня энергетического метаболизма.

В опытах, ставящих своей целью регистрацию колебательных процессов, были получены временные ходы концентрации глюкозы в пробах крови, подготовленных по описанию проб №1, №2 (с 50 мкл антипептидаз), №3 (250 мкл антипептидаз), №4 (с цитратом натрия) в § 3.3 «Используемые материалы». Время наблюдения колебаний продолжалось в течение 1 часа. Чтобы получить осмотические колебания, предсказанные теоретическим анализом, получали экспериментальные точки через максимально короткий промежуток времени для всех 4-х пробирок параллельно (раз в 2 минуты). Временные ходы концентрации глюкозы для 4 проб показаны на рис.18 (а, б, в, г) в течение одного часа. Во всех 4-х пробах крови наблюдались осмотические колебания.



Таким образом, из этих экспериментов видно, что в пробах крови происходят быстрые колебательные процессы, связанные с рассогласованием процессов энергетического метаболизма, как это предсказано теоретическим анализом.

Для того, чтобы определить оптимальное время после взятия крови из организма для проведения измерения неспецифической проницаемости эритроцитарных мембран для кислорода, была проведена следующая серия экспериментов. Были получены временные ходы концентрации глюкозы в пробах крови, подготовленных по описанию проб №1, №2 (с 250 мкл антипептидаз), №3 (500 мкл антипептидаз) в § 3.3 «Используемые материалы». Полученные кривые представлены на рис. 19 (а, б, в).



Из рисунков видно, что через час после взятия крови из организма происходит относительная стабилизация концентрации глюкозы в плазме проб крови, когда колебания этого параметра становятся много меньше колебаний, происходящих в первый час наблюдений. Таким образом, проницаемость в следующей серии опытов необходимо измерять через час после взятия крови из организма. Следующая серия экспериментов ставила своей целью регистрацию факта совершившегося перехода метаболизма эритроцитов из состояния с высокой концентрацией АТФ в состояние с низкой его концентрацией по выявленным отличиям параметров различных проб крови. Теоретический анализ показывает, что этот переход должен совершиться быстрее в пробах, в которых нет антипептидаз, по сравнению с пробами, в которых они есть. Были получены временные ходы концентрации глюкозы и показателя кислотности рН в пробах крови, подготовленных по описанию проб №1, №2 (с 500 мкл антипептидаз), №3 (1000 мкл антипептидаз), №4 (с этиловым спиртом) в § 3.3 «Используемые материалы». В данной серии использовался спирт из-за того, что он лучше проходит в эритроциты, чем цитрат натрия. Наблюдения временных ходов концентрации глюкозы и рН для каждой пробы проводились параллельно.

Дополнительно через час после начала наблюдений и по окончании эксперимента (через 3 часа после взятия крови из организма) измерялась величина неспецифической проницаемости мембран для кислорода с помощью прибора КИНОКС каждой пробы.

Временные ходы концентрации глюкозы приведены на рис. 20 (а, б, в, г).



Размещено на http://allbest.ru/

4

Характер хода кривых концентрации глюкозы в данной серии экспериментов существенным образом не отличался от ходов кривых, полученных в предыдущих опытах, но есть отличия в мелких деталях.

На рис. 21 представлены временные ходы показателей кислотности рН для всех проб.

Размещено на http://allbest.ru/

4

Наиболее значимыми являются начальные точки, полученные через 10-20 минут после взятия крови из организма. За это время произошло подкисление плазмы за счет выхода ионов Н⁺ из эритроцитов (кислые продукты гликолиза, накапливаемые в цитоплазме, выходят в плазму крови). С другой стороны, происходит подщелачивание плазмы крови за счет распада бикарбонатов и выхода образующегося СО₂ в атмосферу, поскольку специальных мер для задержки его мы не предпринимали. Перемешивание крови в пробах производилось с одинаковой интенсивностью. Видно, что начальные точки значений рН для пробы крови без добавления антипептидаз и с добавлением спирта практически совпадают. Начальные точки для проб с добавлением антипептидаз существенно ниже по рН, чем начальные точки, полученные для остальных двух проб (1 и 4). Этот факт свидетельствует о том, что переход уже совершился в 1-й и 4-й пробе крови. Такой переход во второй и третьей пробе не произошел, так как состояние метаболизма эритроцитов в этих пробах наиболее близко к in vivo (за счет замедления неравновесных осмотических процессов). Это соответствует предположению, сделанному в теоретическом анализе, о том, что рН нового состояния метаболизма эритроцитов выше, чем в состоянии in vivo.

Еще до измерения проницаемости было замечено, что при перемешивании крови для предотвращения оседания эритроцитов, кровь в 1-й и 4-й пробе быстрее насыщалась кислородом, чем во 2-й и 3-й пробе. Об этом мы судили по цвету крови в пробирках: в 1-й и 4-й - алая, во 2-й и 3-й - темная. На фотографии, сделанной в день эксперимента, это хорошо было видно (см.фото1).

Размещено на http://allbest.ru/

4

Последующее определение проницаемости мембран подтвердило, что величина проницаемости мембран эритроцитов в пробах 1, 4 значительно выше, нежели чем во второй и третьей.

На рис. 22 представлен временной ход величины степени насыщения крови кислородом для 3-х проб крови (2,3,4). Номера кривых соответствуют номерам проб крови.

Размещено на http://allbest.ru/

4

Как известно из работ Фока М.В. [17, 18] по мере насыщения крови кислородом на заключительном этапе процесса оксигенации проницаемость мембран эритроцитов резко уменьшается. Сравнение степени насыщения проб крови было затруднено тем обстоятельством, что 1 и 4 пробы были уже в значительной мере насыщены кислородом. В то время как кровь во 2-й и 3-й пробе была практически не оксигенирована. Поэтому сравнение проницаемости проводилось при одной и той же степени насыщения крови кислородом, что и представлено на рис. 22. Временной ход степени насыщения первой пробы кислородом не представлен на данном графике, так как эта проба крови находилась в насыщении кислородом, и уровень сигнала находился на более высоком уровне, что препятствовало сравнению. Значимы начальные участки кривых, чем больше угол наклона кривой к горизонтальной оси, тем выше проницаемость мембран для кислорода.

Результат сравнения говорит о том, что проницаемость мембран эритроцитов 1-й и 4-й пробы выше, нежели чем для 2-й и 3-й. Совокупность результатов в этой серии экспериментов позволяет нам утверждать, что переход состояния метаболизма эритроцитов в пробах 1-й и 4-й уже произошел, и мы наблюдали следствия этого перехода. Состояния метаболизма эритроцитов пробы 2-й и 3-й практически соответствует состоянию in vivo. Интенсивность энерговыделения при утилизации глюкозы эритроцитами в 1-й и 4-й пробе ниже и, следовательно, подкисления крови существенно ниже, чем в пробах 2 и 3. Значит, в 1-й и 4-й пробе метаболизму эритроцитов соответствует состояние с низкой концентрацией АТФ, а метаболизму в пробах 2 и 3 - состояние с высокой концентрацией АТФ, как и было предсказано теоретическим анализом.

§ 3.6 Выводы

Итак, в данной работе теоретически и экспериментально доказано существование двух устойчивых состояний метаболизма эритроцитов. Низкоэнергетическое состояние наблюдалось in vitro. Высокоэнергетическое состояние подробно рассмотрено в других работах, и наиболее полно в работе Атауллаханова Ф.И.

Для теоретического исследования возможности существования второго устойчивого состояния энергетического метаболизма эритроцитов в данной работе была выбрана физическая модель, соответствующая состоянию крови in vivo. При анализе кинетики гомеостатирования основных параметров эритроцитов согласно этой модели были выяснены условия, при которых может происходить переход метаболизма эритроцитов из одной устойчивой точки в другую. Выявлены процессы, протекающие при взятии крови из организма, способствующие указанному переходу. Ведущим процессом, обуславливающим переход эритроцитов в новое низкоэнергетическое состояние, является их осмотическое сжатие в результате деятельности в плазме крови протеолитических ферментов - пептидаз. Обнаружены колебательные процессы в цельной крови после ее взятия из организма, как это предсказывал теоретический анализ. Был зарегистрирован факт совершившегося перехода в экспериментах по выявленным отличиям параметров проб крови, в которых, по нашему мнению, этот переход мог произойти, от тех проб, в которых искусственно этот переход с помощью добавления соответствующих доз антипептидаз был задержан.

Показано, что переход метаболизма эритроцитов в низкоэнергетическое состояние при длительном хранении консервированной крови неизбежен. Так как в эритроцитах в результате их энергетического метаболизма непрерывно накапливаются кислые продукты, и цитоплазма эритроцитов подкисляется. По достижению критически низкого уровня значения кислотности рН, неизбежно происходит быстрый переход в низкоэнергетическое состояние. При этом в эритроцитах и плазме крови протекают быстрые неравновесные процессы, которые мы наблюдали на опыте. Однако изучение этих переходных процессов не являлось предметом данного исследования.

Обнаружено, что нарушение устойчивости высокоэнергетического состояния происходит менее чем за 10 минут. Вещества, ингибирующие гликолиз, могут ускорять процессы потери устойчивости высокоэнергетического состояния, в то время как добавки, ингибирующие первичный рост осмолярности, затягивают процессы перехода. Подробное изучение переходных процессов не являлось предметом нашего исследования.

Таким образом, по нашему мнению, поставленная цель полностью достигнута, и доказательство представлено в полном объеме.

§ 3.7 Некоторые практически важные замечания

С позиций результатов, полученных в данной работе, стратегия разработки методов, улучшающих функциональные характеристики крови при ее консервации, и разработанные методом проб и ошибок методики сводятся к тому, чтобы как можно большее время сохранить высокую концентрацию АТФ, замедляя переход метаболизма эритроцитов из высокоэнергетического состояния в низкоэнергетический. Добавление аденозина в консервированную кровь и хранение эритроцитарной массы отдельно от плазмы, улучшившие показатели функциональной способности эритроцитов, продлевают промежуток времени до указанного перехода. Конечно, кровь, находящаяся в низкоэнергетическом состоянии, не способна в полной мере выполнять свою основную транспортную функцию. Однако при хранении такая кровь значительно медленнее подкисляется. Поэтому нам кажутся перспективными разработки методик, переводящих эритроциты в высокоэнергетическое состояние непосредственно перед переливанием.

Заключение

Переливание крови в медицинской практике распространено очень широко, потребность в донорской крови непрерывно возрастает. Зачастую от наличия крови, годной к переливанию, особенно в больших объемах, зависит жизнь пациента. Поэтому любые продвижения в исследованиях поддержания функциональной способности эритроцитов в донорской крови чрезвычайно актуальны. В этом заключается ценность данной работы.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Физиология в рисунках и таблицах: вопросы и ответы./ Под ред. В. М. Смирнова. М.:Медицинское информационное агентство, 2007

2. ЛевтовВ.А., Регирер С.А., Шадрина Н.Х. Реология крови. М.: Медицина, 1982;

3. Нормальная физиология человека./ Под ред. академика РАМН Б.И. Ткаченко. М.: Медицина, 2005

4. Иржак Л. И. Гемоглобины и их свойства. М.: Наука, 1975;

5. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин и обратимое присоединение кислорода. М.: Сов. Наука, 1957;

6. Блюменфельд Л.А. Гемоглобин.// Соросовский образовательный журнал. - 1998. - №4;

7. Зенгбуш П., Молекулярная и клеточная биология в 3-х томах. Под ред. В.А. Энгельгарда М.: Мир, 1982;

8. Гааль Э., Медьеши Г., Верецки Л. Электрофорез в разделении биохимических макромолекул. - М.;

9. Фок М.В. Некоторые аспекты биохимической физики, важные для медицины. М.:Физматлит, 2007;

10. Фок М.В., Зарицкий А.Р. Авторегуляция, как основа гомеостаза клеток. М.: Космосинформ, 1997;

11. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Зарицкая Г.А., Переведенцева Е.В. Авторегуляция неспецифической проницаемости мембраны эритроцита. М.: Наука, 1999;

12. Ataullakhanov FI, Vitvitsky VM. What determines the intracellular ATP concentration. Biosci Rep. 2002; 22(5-6):501-11. Review.

13. Атауллаханов Ф.И. Регуляция метаболизма в эритроцитах.// Диссертация на соискание ученой степени д. ф.-м. н. М.: 1982;

14. Кайманчиков Н.П., Сельков Е.Е. Автокатализ в стехиометрической модели энергетического метаболизма. - Биофизика, 1976, т.21, с.220-226;

15. Зарицкий А.Р., Пронин В.С. Биофизика основных режимов клеточного метаболизма. Функциональные режимы клетки: состояние покоя и активность. М.// Краткие сообщения по физике ФИАН №12, 2006, с. 8-18

16. Виноградова М.А., Зарицкий А.Р., Пронин В.С., Распопов Н.А., Фок М.В. Необратимое изменение метаболизма эритроцитов как основная причина возникновения стресса у больного при переливании ему консервированной донорской крови. Краткие сообщения по физике ФИАН 35(6), 39 (2008).

17. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Зарицкая Г.А., Переведенцева Е.В. Биофизическая кинетика переноса кислорода кровью// Успехи физических наук. 1994. Т. 164, № 3;

18. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Прокопенко Г.А. Динамика оксигенации эритроцитов in vitro// Биофизика. 1988. Т. 33, вып. 4.

19. Фок М.В., Зарицкий А.Р., Переведенцева Е.В. и др. Исследование диффузии глюкозы через мембрану эритроцитов// Биофизика. 1994. Т. 39, вып. 5.

20. С.П. Баранов, М.А. Виноградова, А.Р. Зарицкий, М.Н. Маслова, В.С. Пронин, Н.А. Распопов, Д.А.Семёнов, Л.Л. Чайков, М.Н.Черноусова. Исследование процессов утилизации глюкозы и проницаемости эритроцитарных мембран in vitro. М. // Краткие сообщения по физике ФИАН, № 11, 2008, с. 42-51.

Размещено на Allbest.ru