Алматы, 2007

ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

АО - антиоксиданты

АОС - антиоксидантная система

БАВ - биологически активные вещества

БАД - биологически активная добавка

ГП - глутатионпероксидаза

1,1-ДМГ - 1,1-диметилгидразин

ОРЭ - осмотическая резистентность эритроцитов

ПГЭ - перекисный гемолиз эритроцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭМ - проницаемость эритроцитарных мембран

СИ - среда инкубации

СОД - супероксиддисмутаза

? - ТФ - ?-токоферол

МДА - малоновый диальдегид

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Интенсификация промышленного и сельскохозяйственного производства, нарушение природосберегающих технологий, последствия многолетних испытаний ядерного и других видов вооружений, приводят к нарушению экологического равновесия между организмом и средой его обитания и представляют серьезную угрозу для здоровья населения [1-7]. В современных условиях происходит интенсивное загрязнение окружающей среды токсичными веществами, что ведет к нарушению природного баланса [8-10]. В окружении человека насчитываются тысячи химических соединений, и их количество растет из года в год. Многие вещества, окружающие человека в быту, медицине, на производстве, в сельском хозяйстве, обладают различной степенью токсичности, что приводит к возникновению как острых, так и хронических отравлений [2,3,11-13].

Особенно остро проблема ухудшения состояния окружающей среды стоит в Казахстане, на огромных территориях которого экологическая обстановка оценивается как неблагоприятная, а в некоторых регионах - как тревожная и даже катастрофическая [4,10,14-16]. Среди большого разнообразия неблагоприятных антропогенных факторов, особо следует выделить химическое соединение 1,1-диметилгидразин (1,1-ДМГ), используемое как один из основных компонентов азотоводородного ракетного топлива [14,17-22]. Развитие авиакосмической промышленности, и, особенно, аварии, имеющие место при запусках космических аппаратов, приводят к выбросам ракетного топлива в окружающую среду [14,23-26]. При падении первых ступеней космических ракет на землю в них остается до 3т недогоревшего топлива [14,26], что представляет чрезвычайную опасность для населения районов, прилегающих к космодрому «Байконыр». 1,1-диметилгидразин относится к группе экологических токсикантов из-за значительной стабильности в почве и растениях, неограниченной растворимости в воде, высокой летучести, способности к миграции и накоплению во всех средах, включая продукты растительного и животного происхождения [19,22,27-29]. 1,1-диметилгидразин - высокотоксичное соединение [14,21,22,26], вызывающее острые и хронические формы интоксикации с преимущественным поражением центральной нервной системы, печени, крови, а также других органов человека [16,19,30-34]. Установлены его мутагенные и канцерогенные свойства [35-40].

Биотрансформация гидразинов может не приводить к детоксикации этих соединений, как прежде считали, эти вещества, в свою очередь, могут проявлять токсические эффекты [41]. При этом создаются условия для длительного комплексного поступления малых количеств токсиканта в организм, что оказывает неблагоприятное воздействие на здоровье людей [19]. В организм гидразин и его производные могут проникать различными путями, и их относительная токсичность не зависит от способов поступления [18]. При этом метаболизм гидразина в организме животных и человека до конца не изучен, поэтому, данная проблема остается открытой [17].

Среди многочисленных неорганических соединений естественного происхождения особую опасность для здоровья населения представляют широко распространенные в окружающей среде соли тяжелых металлов [42-46]. Свинец и ртуть наряду с кадмием, входят в так называемую, «большую тройку». Свинец занимает приоритетное положение в связи с его большой распространенностью, политропностью действия, высокой токсичностью и выраженным кумулятивным свойством. Одним из основных источников выбросов свинца в атмосферу являются антидетонационные добавки к бензину. Другими источниками поступления свинца в атмосферу являются производство красок, полиграфическое дело, сжигание каменного угля и т.д. [44-46]. Ртуть относится к тиоловым ядам и вступает в химическое взаимодействие с сульфгидрильными группами белков [45,46], которым принадлежит исключительная роль в осуществлении биохимических процессов и поддержании жизнедеятельности. Пары ртути, проникая в организм, поражают желудочно-кишечный тракт, почки, нервную систему с характерным развитием психических и двигательных расстройств [43,47,48]. Проблема ртутного загрязнения является одной из актуальных проблем для нашей страны [49-50].

Большинство описанных в литературе исследований, касающихся действия токсикантов на организм, посвящены влиянию отдельных соединений, и недостаточно сведений о сочетанном влиянии веществ. Тогда как в повседневной жизни человек подвергается воздействию комплекса токсикантов, а совместный эффект нескольких соединений может существенно отличаться от их изолированного воздействия [51]. Сочетанное действие 1,1-ДМГ с другими токсикантами, к примеру, ионами тяжелых металлов, исследовано недостаточно.

Неблагоприятное действие токсических веществ проявляется на различных структурных уровнях организма, начиная с молекулярного и клеточного [52]. Биологическим мембранам принадлежит ключевая роль в обеспечении и регуляции физиологической активности клеток. В них осуществляются важнейшие биохимические реакции [53]. Это чрезвычайно активные, постоянно функционирующие ферментативные комплексы, обеспечивающие такие проявления жизнедеятельности, как передача нервного импульса, дыхание, иммунитет, пищеварение и другие процессы [53].

Одним из механизмов токсического действия химических соединений является образование свободных радикалов и интенсификация окислительных процессов [52]. Свободные радикалы постоянно образуются в организме как часть нормального метаболизма [54]. Однако при повышенном образовании радикалов и нарушении баланса между оксидантной и антиоксидантной системами, свободные радикалы вызывают повреждение различных биомолекул, в том числе липидов, составляющих основу биологических мембран [55]. Нарушение свойств биологических мембран приводит к развитию различных патологических состояний [55].

Свободнорадикальные процессы лежат в основе многих патологических состояний, и использование антиоксидантов является одним из перспективных путей повышения резистентности организма [54,55]. Среди множества соединений, обладающих антиоксидантными свойствами, особое место занимают витамины С и Е [54,55]. По физико-химическим свойствам витамин С является водорастворимым и выполняет свои функции в водном окружении, а витамин Е - жирорастворимым и соответственно проявляет свои свойства в липидном окружении [54,55]. При этом характер их взаимодействия говорит о том, что особые перспективы представляет их совместное использование [56]. На фоне многочисленных исследований по оценке витаминной обеспеченности проблеме микроэлементозов уделяется недостаточное внимание [57]. Между тем микроэлементы играют важную роль в системе антиоксидантной защиты [58]. Один из важных микроэлементов для организма, селен, входит в состав фермента глутатионпероксидазы [58], утилизирующей потенциально опасную перекись водорода [54].

В настоящее время при исследовании биологических мембран часто используют эритроциты как модель, отражающую состояние мембран всего организма [59].

В связи с вышеизложенным представляет интерес исследование механизма изолированного и совместного действия 1,1-диметилгидразина и ионов тяжелых металлов (Pb2+ и Hg2+) на состояние мембран эритроцитов. Кроме того, перспективным является использование витаминов (С, Е), микроэлементов (селен) для повышения резистентности биологических мембран при действии токсических веществ.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение изолированного и сочетанного действия 1,1-диметилгидразина и ионов свинца и ртути на состояние мембран эритроцитов и возможности повышения резистентности мембран с помощью биологически активных веществ (витаминов С, Е, селенита натрия и препарата «Селевит»).

Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие задачи:

Изучить изолированное и сочетанное действие 1,1-диметилгидразина, Pb2+, Hg2+ на резистентность мембран эритроцитов в условиях in vitro.

Исследовать влияние витаминов С, Е и селенита натрия на резистентность мембран эритроцитов в условиях in vitro.

Изучить эффект сочетанного действия 1,1-диметилгидразина и биологически активных веществ (витаминов С, Е и селенита натрия) на мембраны эритроцитов в условиях in vitro.

Исследовать в условиях in vivo роль препарата «Селевит» в повышении резистентности мембран эритроцитов к действию 1,1-диметилгидразина.

Научная новизна. Впервые получены экспериментальные данные о сочетанном действии 1,1-ДМГ, Pb2+ и Hg2+ на состояние мембран эритроцитов в условиях in vitro. Показано, что 1,1-ДМГ, ацетат свинца и хлорид ртути оказывают повреждающее действие на эритроцитарную мембрану, а при сочетанном действии эти соединения оказывают более выраженный токсический эффект.

Выявлено, что витамины С, Е и селенит натрия повышают резистентность мембран эритроцитов в условиях in vitro.

Установлено, что в условиях in vitro витамины С, Е и селенит натрия оказывают протекторный эффект на мембрану эритроцитов от повреждающего действия 1,1-ДМГ, а сочетанное действие этих биологически активных веществ более эффективно по сравнению с их изолированным влиянием.

Впервые показано, что в условиях in vivo препарат «Селевит» защищает мембрану эритроцитов от повреждающего действия 1,1-диметилгидразина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В условиях in vitro повреждающий эффект 1,1-диметилгидразина, ацетата свинца и хлорида ртути на резистентность мембран эритроцитов выше при их сочетанном действии по сравнению с их изолированным влиянием.

2. Биологически активные вещества (витамины С, Е, селенит натрия) в условиях in vitro повышают устойчивость мембран эритроцитов.

3. В условиях in vitro витамины С, Е и селенит натрия снижают повреждающий эффект 1,1-диметилгидразина. Протекторный эффект выше при совместном использовании этих биологически активных веществ по сравнению с их изолированным действием.

4. Препарат «Селевит» в условиях in vivo снижает повреждающий эффект 1,1-диметилгидразина.

Теоретическая и практическая ценность диссертации.

Использованный в работе комплексный подход при определении влияния токсикантов и биологически активных веществ на мембраны эритроцитов позволяет выявить характер происходящих в мембране изменений, взаимные изменения параметров состояния мембран при действии токсических и протекторных соединений, и может быть рекомендован в качестве экспериментальной модели для исследования свойств новых потенциальных мембранопротекторов и токсикантов.

Результаты исследований влияния 1,1-ДМГ, Pb2+, Hg2+ на мембраны эритроцитов полезны для понимания механизмов токсического действия соединений при их изолированном и совместном воздействии на биологическую систему, а также могут быть использованы для разработки методов диагностики, профилактики, лечения токсических отравлений и в качестве скрининг-теста при определении степени повреждающего эффекта неблагоприятных факторов окружающей среды.

Полученные результаты совместного использования витаминов С, Е и селенита натрия для снижения эффекта 1,1-диметилгидразина вносят вклад в более глубокое понимание межвитаминных взаимоотношений при действии токсических соединений.

Данные, полученные при исследовании роли препарата «Селевит» в снижении повреждающего действия 1,1-диметилгидразина, позволяют рекомендовать использование этого препарата для повышения резистентности организма при действии неблагоприятных факторов окружающей среды.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: III международной научной конференции молодых ученых и студентов, посвященной памяти М.А.Айтхожина (Алматы, 2003); 31 Конгрессе Федерации Европейских Биохимических Обществ «Molecules in Health & Disease» (Стамбул, 2006), Международном симпозиуме «Физиология и патология лимфатической системы» (Алматы, 2006), международной научно-практической конференции «Современные проблемы сохранения биоразнообразия», посвященной 90-летию со дня рождения академика НАН РК Т.М.Масенова (Алматы, 2006), научно-теоретическом семинаре Института физиологии человека и животных ЦБИ МОН РК (Алматы, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, перечень которых приводится в конце автореферата.

Связь данной работы с другими НИР и различными государственными и международными программами. Работа выполнена в рамках программы МНТЦ (2003-2006, К-452.1) и программы фундаментальных исследований Института физиологии человека и животных ЦБИ МОН РК (2006-2008, № госрегистрации, 0106РК00409).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 110 страницах, состоит из введения, обзора данных литературы, главы с описанием методов исследования, 4 глав с изложением результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и списка цитированных источников, включающего 308 работ. Работа иллюстрирована 45 рисунками и содержит 2 таблицы.

1 ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ТОКСИКАНТЫ И РОЛЬ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ПОВЫШЕНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА

1.1 Гидразины, окружающая среда и здоровье человека

Гидразины - химические соединения, которые содержат 2 атома азота, соединенные одиночной ковалентной связью. Они схожи по химической структуре и реактивности. На рис.1 представлены структурные формулы наиболее известных гидразинов.

H H H3C H H3C СH3

> N - N < > N - N < > N - N <

H H H3C H H H

гидразин 1,1-диметилгидразин 1,2-диметилгидразин

Рисунок 1 - Структурные формулы гидразинов.

1,1-диметилгидразин (1,1-ДМГ) - производное гидразина, так же известное под названиями несимметричный диметилгидразин, димазин, является одним из основных компонентов азотоводородного ракетного топлива [17]

Помимо 1,1-ДМГ, существует огромное число производных гидразина, большинство из которых вредны для здоровья людей. Исследование 98 гидразинов показало, что 84 из них являются канцерогенами [60]. Это означает, что население в различной степени находится под воздействием этих вредных для здоровья агентов. Следовательно, гидразины, подобно полициклическим ароматическим углеводородам, N-нитрозосоединениям и ароматическим аминам, представляют большой риск окружающей человека среде.

1,1-диметилгидразин при комнатной температуре - бесцветная жидкость, с неприятным аммиачным запахом, легко испаряется и в воздухе находится в паро-газовой фазе. Химическая формула: N2С2H8. Молекулярная масса - 60. Удельный вес - 0,78. Температура кипения - 63?С, замерзания - минус 57?С. Легко адсорбирует из воздуха влагу. Хорошо растворим в воде, водных растворах кислот, спиртах, углеводородах, эфирах [17]. 1,1-диметилгидразин - высокореакционное соединение, легко вступающее во взаимодействие с множеством реагентов различной природы. 1,1-ДМГ вступает в окислительно-восстановительные реакции, реакции комплексообразования и реакции с органическими соединениями, содержащими карбоксильную группу. Как органическое основание с сильно выраженными восстановительными свойствами, несимметричный диметилгидразин легко окисляется кислородом воздуха и другими окислителями (калий марганцовокислый, калий йодид, окись ртути, перекись водорода, азотная и азотистая кислоты, хлор, гипохлорид) [17,61]. При этом в зависимости от условий (температура, продолжительность окисления, наличие каталитически активных металлов) образуются диметиламин, тетраметилтетразен, нитрозодиметиламин, метилендиметилгидразин, формальдегид и другие продукты окисления [17-19,62-64]. 1,1-ДМГ при взаимодействии с кислотами образует соли [17,61].

Гидразины производятся из химических веществ, таких как аммиак, диметиламин, перекись водорода, мочевина, гипохлорит натрия. Большинство методов получения гидразина основано на кетазиновом процессе - одной из разновидностей реакции Рашига [17]. 1,1-ДМГ получают каталитическим гидрированием нитрозодиметиламина, получаемого из диметиламина, и взаимодействием хлорамина, получаемого из хлора и аммиака, с диметиламином в присутствии щелочи [17,18,62].

Помимо использования в качестве основного компонента ракетного топлива гидразины используются в качестве ингибитора коррозии, окислителя в гальванопластике, воспламенителя взрывчатых веществ, форсажного горючего, катализаторов полимеризации, фармацевтических препаратов, для восстановления металлов, в качестве антиоксидантов в нефтяной промышленности, как промежуточные продукты при синтезе сельскохозяйственных химикатов (малеиновый гидразид), вспучивателей для производства пластмасс, лекарственных средств (изониазид, гидралазин), флюсов, применяемых при пайке (гидразинбромид и гидразинхлорид) и в фотографии [17,18].

Один из основных путей попадания 1,1-диметилгидразина в окружающую среду - в результате его использования в качестве ракетного топлива, хотя аварийные выбросы 1,1-ДМГ могут возникать при хранении, переработке, транспортировке, а также при неправильном удалении отходов [17,18]. Большое количество ракетного топлива попадает в окружающую среду при авариях ракет-носителей [23,24]. В результате испарения 1,1-ДМГ концентрация его в воздухе может достигать 4 мг/м3 на расстоянии 2 км по ветру от места разлива [17]. Человек может подвергаться воздействию 1,1-ДМГ на предприятиях по его производству, а также по производству его солей и дериватов, при испытании двигателей и в местах запуска ракет, а также в тех местах, где базируются или заправляются самолеты [17,18]. Концентрации 1,1-ДМГ на предприятиях по его производству могут составлять в нормальных условиях 0,35 мг/м3, а иногда достигают 1,18 мг/м3. Рабочие тех предприятий, на которых используются паровые котлы высокого давления, подвергаются потенциальной опасности воздействия сравнительно разбавленных растворов 1,1-ДМГ. Вода из систем центрального отопления является потенциальным источником воздействия 1,1-ДМГ на человека [18]. 1,1-ДМГ присутствует в недостаточно очищенных лекарственных препаратах или в медикаментах с истекшим сроком годности (изониазид, гидралазин) [17,65-67]. 1,1-ДМГ может также образовываться в процессе метаболизма этих лекарственных препаратов [68,69]. 1,1-ДМГ может воздействовать на людей при курении или вдыхании сигаретного дыма (23-43 нг/сигарету) [17,70].

1,1-ДМГ легко сорбируется поверхностями строительных конструкций и вследствие десорбции может явиться причиной вторичного загрязнения воздушной среды [18,22].

Предельно допустимые концентрации 1,1-ДМГ в воздухе - 0,001 мг/м3, в воде - 0,02 мг/л [71].

Исследования, проведенные в районах падения отделяющихся частей ракетоносителей, показывают, что для каждого типа ландшафта характерны свои условия миграции гидразинов [17,20,61,72]. Концентрации 1,1-ДМГ сосредоточены в местах стока талых, грунтовых и подземных вод, в понижении рельефа [72]. В этих местах отмечается высокое содержание 1,1-ДМГ в растениях, что связано с хорошей растворимостью в воде и усвояемостью растениями [20,72]. Бедность плодородного слоя почв азотосодержащими веществами, структурные особенности 1,1-ДМГ, наличие в составе молекулы активных атомов азота способствуют включению его в метаболические процессы в растениях [72]. Следует отметить, что в отличие от гидразина, 1,1-ДМГ обладают в достаточной степени высокой кумулятивностью и стабильностью в объектах окружающей среды, что приводит к тяжелым последствиям для здоровья населения и животного мира по трофической цепи (почва - вода - растения - животные - человек) [27-29,73].

До 40% 1,1-ДМГ, в зависимости от типа почв, могут сохраняться до 1 года и более. Известен случай, когда 1,1-диметилгидразин обнаружен через 9 лет после аварийного пролива (20 тонн) не только в поверхностных, но и в глубоких слоях грунта [73].

В почве гидразины при аэробных условиях адсорбируются и подвергаются разложению на поверхности глиноземов [17]. Они подвергаются метаболизму главным образом до азота нитрифицирующей бактерией Nitrosomas [74]. Гидразины могут восстанавливаться до аммиака нитрогеназой, выделенной из азотфиксирующей бактерии Azobacter vinelandii [75].

В воздушной среде 1,1-ДМГ быстро разлагается в результате реакций с гидроксильными радикалами, озоном и диоксидом азота [17]. Время полужизни 1,1-ДМГ, связанное с гидроксильными радикалами составляет около 3 часов, с наличием озона - приблизительно 1 час. Время существования 1,1-ДМГ в загрязненной воздушной среде несколько минут, в чистом воздухе приблизительно 1 час. В результате этих реакций образуются диазен, пероксид водорода, а также небольшие количества закиси азота и аммиака [17].

В водной среде основными факторами, способствующими абиотической деградации гидразинов, являются присутствие некоторых ионов металлов, органического материала в целом и некоторых органических окислителей в частности, содержание кислорода, повышенная жесткость и высокие значения рН [76]. Гидразин подвергается биодеградации микроорганизмами, присутствующими в активном иле [77,78].

1,1-ДМГ представляет опасность при любых путях поступления в организм (через желудочно-кишечный тракт, органы дыхания, кожу, слизистые) [14]. В ряде исследований на животных показано, что острая летальность наступает после воздействия гидразинов большинством из путей.

Исследования рабочих, подвергавшихся ингаляционному воздействию 1,1-ДМГ, выявили изменения, указывающие на гепатотоксический эффект, следовательно, печень является мишенью для гидразинов. Имеются данные, что 1,1-диметилгидразин оказывает сильное сенсибилизирующее действие на кожу [1]. Выявлено, что повторные воздействия на кожу вызывают эпителиоидную саркому [79].

Исследования на животных показывают, что 1,1-ДМГ одинаково быстро всасывается в кровь и легко распределяется в тканях независимо от способа воздействия [62,80-84]. Адсорбция и распределение 1,1-ДМГ зависят от вида животных. Так, у крыс, после введения 1,1-ДМГ (11-60 мг/кг массы тела), определялись низкие уровни 1,1-ДМГ (приблизительно 0,1-3,1 % дозы) в тканях без предпочтительной аккумуляции 1,1-ДМГ в каком-либо органе [77,78]. Тогда как у кроликов после введения внутривенно или внутрибрюшинно 1,1-ДМГ самые высокие концентрации определялись в печени (8,9 %) и толстой кишке (11,6 %), а уровень в других тканях варьировал в пределах 0,02- 4,18 % дозы [83].

Выведение 1,1-ДМГ происходит преимущественно с мочой и выдыхаемым воздухом [62]. Так у крыс, которым вводили 1,1-ДМГ в дозе 0,78-80 мг/кг массы тела, через 53 часа, приблизительно 76 % дозы выводились с мочой и 23 % дозы выводились с выдыхаемым воздухом [85].

Типы механизмов, вовлеченных в метаболизм гидразинов, и образованные метаболиты не зависят от способа воздействия [17]. Процесс биотрансформации 1,1-ДМГ осуществляется в основном в печени [18]. Соединения, генерируемые метаболизмом 1,1-ДМГ, могут быть свободными радикалами. Микросомы печени и гепатоциты крыс способны метаболизировать 1,1-ДМГ с образованием метил-радикалов. Присутствие ионов меди также может содействовать образованию свободных радикалов. При метаболических превращениях гидразинов образуется значительное количество азота, которое выводится через легкие [18,86]. Из метаболитов 1,1-ДМГ, выделяемых с мочой, 40-60% составляет ацетилированные производные 1,1-ДМГ, 3-10% - глюкозогидразон, 20-25% - тетраметилтетразен, углекислота, метан и другие соединения [18]. Эти данные показывают, что 1,1-ДМГ подвергается деметиляции. Большинство метаболических превращений катализируется монооксигеназами, локализованными в мембранах эндоплазматического ретикулума [17,62]. Так, в экспериментах in vitro было показано, что при добавлении флавин-содержащего ингибитора монооксигеназы (метимазол) снижается деметиляция 1,1 ДМГ и образование метил-радикалов [87].

По-видимому, липооксигеназа и циклооксигеназа также могут быть вовлеченными в метаболизм 1,1 ДМГ, так как при добавлении ингибиторов липооксигеназы и циклооксигеназы (индометацин и эйкозатетрановая кислота) снижалось образование формальдегида микросомами толстой кишки крыс, а при добавлении жирных кислот - повышалось [87].

Для обезвреживания реакционно-способных продуктов биотрансфор-мации 1,1-ДМГ особое значение имеют глутатион-зависимые ферментные системы [88]. 40-60% метаболитов, выделяемых с мочой, составляют ацетилированные производные гидразиновых соединений, а ацетилирование часто является четвертым этапом глутатионовой конъюгации [62].

Вследствие биотрансформации молекулы 1,1-ДМГ становятся более полярными, уменьшается их растворимость в липидной фазе, что способствует быстрому выведению из организма [18].

Эти данные показывают, что в метаболизм 1,1 ДМГ могут быть вовлечены по меньшей мере две независимые ферментные системы и одна неферментная [87].

1,1-ДМГ чрезвычайно токсичен для животных и человека [18]. При острых отравлениях на первый план выступают симптомы поражения ЦНС (судорожный эффект) и в меньшей степени - печени [33]. При хронических отравлениях преобладают признаки поражения печени, при этом страдают центральная нервная, сердечно-сосудистая, выделительная, кроветворная системы [18]. Токсичность 1,1-ДМГ в значительной степени зависит от вида животного, в то же время внутри одного вида токсичность практически не зависит от путей введения. Порог острого действия 1,1-ДМГ для мышей - 15 мг/м3, порог хронического ингаляционного действия 1,1-ДМГ - 0,17 мг/м3 [18]. В таблице 1 приведены данные по чувствительность различных видов животных к гидразину и его производным при разных путях воздействия.

Картина острого отравления у животных характеризуется нарушениями крово- и ликворообращения в головном мозге, дистрофическими и некробиотическими изменениями нейронов, распространенными изменениями сосудистой системы (дистония стенок сосудов внутренних органов, повышение их проницаемости). В печени возникает белковая и жировая дистрофия. В миокарде и почках наблюдаются дистрофические изменения и нарушения гемодинамики. В пульпе селезенки повышается количество железосодержащего пигмента [18,62].

При хронических отравлениях производными гидразина наибольшие изменения развиваются в печени. Нарушаются ее антитоксическая, экскреторная и белковообразовательная функции. Кроме того, страдают функции центральной нервной системы, обмен веществ (углеводный, жировой), сердечно-сосудистая, эндокринная и другие системы [18]. В периферической крови определяется тенденция к полиглобулии (начальная стадия гиперкомпенсированного скрытого гемолиза). В костном мозге наблюдается некоторое усиление миелопоэза с преимущественной активацией эритропоэза [18]. Результаты патологоанатомического исследования: мелкокапельное и пылевидное ожирение печени, снижение содержания гликогена; белковая дистрофия миокарда и почек; слабые структурные изменения клеток центральной нервной системы, в том числе нейронов вегетативных ганглиев [62,89].

Таблица 1 - Чувствительность различных видов животных к гидразину и его производным, LD50, мг/кг [Белов, 1999].

Существует, по меньшей мере, два определенных механизма действия гидразинов: один, включающий прямое связывание гидразинов, имеющих свободные аминогруппы, (гидразин и 1,1-ДМГ) с ключевыми молекулами клетки, и другой, включающий образование реактивных видов, таких как свободнорадикальные соединения или ионы метилдиазония как результат метаболизма [90].

Среди множества биохимических процессов, нарушаемых гидразинами, можно выделить круг реакций, имеющих непосредственную связь с возникновением и развитием ведущих эффектов отравления. К ним в первую очередь следует отнести энзимы, катализирующие процессы окисления, переаминирования, дезаминирования и фосфорилирования. Блокирование названных ферментов опосредовано взаимодействием гидразинов с кофакторами [91]. Связываясь с производными витамина В6 и образуя гидразоны, 1,1 ДМГ способен ингибировать реакции, которые требуют витамин В6 как кофактор. Эти реакции включают реакции трансаминирования, декарбоксилирования и другие преобразования аминокислот, метаболизм липидов и нуклеиновых кислот и фосфорилирование гликогена. Нехватка витамина В6 может вызывать судороги, дерматиты и анемию. Кроме того, некоторые авторы предположили, что для образования гидразона необходимы свободные аминогруппы, как в гидразине и 1,1-ДМГ. Это объясняет тот факт, почему судороги отмечаются при воздействии гидразина и 1,1-ДМГ, а не 1,2-ДМГ. Необходимо отметить, что пиридоксин (одна из форм витамина В6) обычно используется для лечения людей, подвергшихся воздействию гидразина или 1,1-ДМГ [87].

В последние годы в литературе появились сообщения, касающиеся новых молекулярных критериев оценки токсического действия производных гидразина, которые, на наш взгляд, дополняют уже известные механизмы токсичности. Установлено, что под влиянием гидразинов увеличивается концентрация супероксидных радикалов в клеточных мембранах, причем оно достигается двумя путями -- в результате окислительного метаболизма производных гидразина и в результате ингибирования кислород-детоксицирующей системы микросом, которое в конечном итоге также приводит к увеличению генерации супероксидных радикалов [31]. В свою очередь эти радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях производных гидразина, могут давать различные токсические эффекты, в том числе и усиливать процессы ПОЛ.

Гидразин и его производные вмешиваются в реакции с одноэлектронным переносом и как следствие нарушают процессы микросомального метаболизма и перекисного окисления липидов [18]. Во время метаболизма 1,1-ДМГ происходит образование свободных радикалов, включающих метильные, ацетильные, гидроксильные и водородные радикалы. Многочисленные пути, как ферментные, так и неферментные, по-видимому, вовлечены в образование свободных радикалов. Поражение гемоглобина связано со свободными радикалами, из чего следует, что свободные радикалы могут быть вовлечены в анемические эффекты гидразинов. Образование реактивных видов во время метаболизма гидразинов может также объяснить их генотоксический эффект, такой как образование аддуктов ДНК и РНК in vivo. Показано, что гидразины вызывают мутацию тимидина и индукция мутации коррелирует с токсичностью гидразинов [92]. Аддукты ДНК и РНК вполне могут быть ответственны за мутацию генов, наблюдаемых в ряде исследований in vitro, и могут также служить началом заболевания раком, вызываемыми гидразинами in vivo [87].

Анализ последствий воздействия компонентов ракетного топлива на состояние здоровья населения и лиц, имевших контакт с токсичными составляющими ракетного топлива, показал, что прослеживается высокий риск возникновения хронических заболеваний, болезней органов дыхания, сердечно-сосудистой системы, крови и кроветворных органов, печени, злокачественных новообразований, иммунно-генетической системы и других болезней [90,93-95].

Таким образом, из литературных данных следует, что 1,1-ДМГ оказывает неблагоприятное влияние на организм человека и животных. 1,1-ДМГ - высокотоксичное соединение, обладает канцерогенным и мутагенным эффектом, способен образовывать при окислении другое соединение - нитрозодиметиламин, обладаюший большим токсическим действием.

1.2 Свинец и здоровье человека

Свинец является одним из наиболее токсичных металлов и включен в списки приоритетных загрязнителей рядом международных организаций, в том числе Всемирной Организацией Здравоохранения, Американским агентством по контролю за токсичными веществами и заболеваниями (CDC), и другими аналогичными государственными организациями в различных странах [96]. По классификации Международного Агентства по Исследованию Рака свинец и его неорганические соединения относятся к группе 2Б (возможные канцерогены для человека) [97]. В земной коре содержится сравнительно немного свинца - в тысячи раз меньше, чем алюминия или железа. Однако он стал известен человеку еще в глубокой древности - примерно за 7000-5000 лет до н.э. В отличие от многих других металлов, свинец имеет низкую температуру плавления (327°С) и находится в природе в виде довольно непрочных химических соединений. Это определяло возможность даже случайного его получения. Несмотря на использование свинца в течение такого продолжительного периода, все еще наблюдаются случаи отравления этим металлом [98]. Причем человек может подвергаться значительному воздействию свинца, занимаясь деятельностью, которая не считается потенциально опасной с этой точки зрения [99].

Содержание свинца в окружающей среде растет сейчас небывало быстрыми темпами в результате деятельности человека. В воздухе большинства европейских городов содержание свинца обычно колеблется от 0,15 до 0,5 мкг/м3. Вне городской черты средняя концентрация свинца составляет обычно меньше 0,15 мкг/м3 [100,101]. По некоторым данным, повышение содержания свинца в количестве более 250 мкг/м2 в сутки увеличивает его концентрацию в крови.

Ежегодное мировое потребление свинца составляет около 3 млн.тонн, из которых 40% используют для производства аккумуляторных батарей, 20% -- тетраэтилсвинца (ТЭС) и тетраметил свинца, антидетонационных добавок к бензину, 12% -- в строительстве, 6% -- для производства оболочки кабелей в электротехнической промышленности [102]. Значительные количества его расходуются для изготовления припоев. На химических заводах и предприятиях цветной металлургии распространена освинцовка внутренней поверхности камер и башен для производства серной кислоты, труб, травильных и электролитных ванн. Подшипниковые антифрикционные сплавы свинца с другими металлами можно встретить во многих машинах и механизмах. Вместе с сурьмой и оловом он входит в состав типографского сплава--гарта, из которого изготовляют шрифты для книг, газет и журналов. Основное оборудование в сернокислотной промышленности - камеры, промывные башни, желобы, трубы, холодильники, детали насосов - все это изготовляется из свинца или свинцом облицовывается. В стекольной и керамической промышленности этот металл необходим для производства хрусталя, специальных глазурей. Окислы и соли свинца применяют в лакокрасочной промышленности (свинцовые белила, свинцовый крон, сурик). В медицине соединения свинца используют как вяжущие, болеутоляющие и противовоспалительные средства. Уксуснокислый свинец, например, известен как «свинцовая примочка». При производстве гликохолевой и таурохолевой кислот для медицины используют уксуснокислый свинец. Но главная работа свинца в медицине связана с защитой врачей от постоянного рентгеновского облучения. Свинцовые экраны применяют в атомной энергетике, в ядерной технике. От радиоактивного излучения защищает и стекло, в состав которого входят окислы свинца. Также свинец используется в полупроводниковой промышленности, лазерной технике, в гальванотехнике, в огнестрельном оружии, виниловых мини-жалюзи, в качестве инициирующих взрывчатых веществ (азид и тринитрорезорцинат свинца (ТНРС)) [103].

В настоящее время ежегодные промышленные и транспортные выбросы свинца превышают 400 тысяч тонн, угрожая здоровью миллионов людей, особенно детей [97]. Основными источниками поступления свинца в окружающую среду и его воздействия на здоровье людей, как взрослых, так и детей, являются выбросы промышленных предприятий, использование этилированного бензина в автотранспорте, применение в консервной индустрии свинецсодержащих припоев, свинцовой глазури, которой покрывают керамическую и стеклянную посуду для хранения напитков, применение свинцовых материалов в водопроводных системах производство красок, в состав которых входят свинцовые пигменты (свинцовый сурик, желтый крон, типографские краски), а также поверхности, покрытые такой краской, например, подоконники, перила, двери, мебель, металлические конструкции [96,104].

В воду свинец может попадать из загрязненных им почв. В свинцовых трубах и других местах, где возможен контакт этого металла с водой и кислородом воздуха, идут процессы окисления:

2Pb + O2 + 2H2O = 2Pb (OH)2.

В подщелоченной воде свинец может накапливаться в значительных концентрациях в результате образования растворимых плюмбитов:

Pb(OH)2 + 2OH- = PbO22- + 2H2O.

Если в воде присутствует СО2, то это приводит к образованию довольно хорошо растворимого гидрокарбоната свинца [102].

Значительные количества свинца выбрасываются автомобильными двигателями с выхлопными газами. Концентрация свинца в воздухе некоторых городов ежегодно увеличивается на 5% [102]. За год только над океанами и морями северного полушария выпадает около 50 тысяч тонн этого металла, образующегося главным образом из добавок к бензину (меньше 1 грамма на литр). Свинец «автомобильного происхождения» был обнаружен даже в снегах Арктики. Во многих странах концентрация свинца в бензине снижена до 1-0,3 г/л. Однако даже 1 г свинца способен загрязнить на уровне ПДК около 1 400 000 м3 воздуха [102].

Главными источниками поступления свинца в организм человека являются почва (пыль и пищевые цепочки), атмосферный воздух, загрязненные и консервированные пищевые продукты [96]. Выполненные специалистами свыше 500 тысяч анализов пищевых продуктов показывают, что в 3,5 % проб присутствует свинец в количествах, превышающих предельно допустимые [104]. Источником воздействия свинца на маленьких детей являются присыпки, газеты и журналы с цветной печатью, т.к. в цветных типографских красках содержатся высокие концентрации свинца [104]. Кроме того, могут представлять серьезную опасность аккумуляторные батареи, вода из свинцовых труб и кранов в старых водопроводных системах.

Все растворимые соединения этого элемента ядовиты. Свинец снижает резистентность организма и повышает смертность экспериментальных животных [105]. Причем органические соединения свинца более токсичны. Поступающий даже в малых порциях в организм свинец задерживается в нем и постепенно замещает кальций, который входит в состав костей, становясь постоянным источником отравления [102]. Так же свинец накапливается в теле и поверхностных тканях. Это приводит к хроническим заболеваниям. Клинические проявления свинцового токсикоза многочисленны. В первую очередь поражаются органы кроветворения (анемия микроцитарная, нормохромная, морфологически неотличимая от железодефицитной анемии), нервная система, наблюдаются двигательные расстройства (полиневриты, параличи, порезы), гормональные и обменные изменения, которые ведут к нарушениям детородной и менструальной функции, расстройствам обмена веществ; желудочно-кишечные расстройства -- изжога, тошнота, свинцовые колики; изменения сердечно-сосудистой системы (аритмия, повышение кровяного давления); нарушения почечных функций, приводящие к недостаточности работы почек [97,104].

Прямым и самым оптимальным из имеющихся индикаторов степени воздействия свинца на организм является содержание свинца в крови [96,102]. Полагают, что свинец в крови даже в низких концентрациях может способствовать рождению младенцев с небольшим весом [106]. Свинец, при концентрации в крови выше 200 мкг/л, оказывает воздействие на нейропсихологическое развитие детей, вызывая умственную отсталость, заболевания мозга. При увеличении уровня свинца в крови отмечается субъективное повышение напряженности, депрессии, усталости [107], нарушается речевая, зрительная и слуховая функции. Ухудшение памяти, внимания наблюдаются при содержании свинца в крови выше 500 мкг/л [108-111]. Эффекты воздействия свинца на центральную нервную систему, которые оценивались по нейроповеденческим признакам, наблюдаются при его концентрации ниже 200 мкг/л. При содержании свинца в крови 100-150 мкг/л, наблюдаются снижение «показателя интеллекта» (IQ) [112,113]. В некоторых эпидемиологических исследованиях обнаружено влияние свинца на умственные способности при его содержании в крови менее 100 мкг/л. Однако в других исследованиях изменения в познавательных способностях не обнаружены при концентрации свинца в крови 400 мкг/л [114,115], но при содержании свинца 300 мкг/л было обнаружено снижение скорости нервной проводимости [116,117]. Опыты на животных подтверждают данные о том, что свинец является причиной указанных изменений [113]. Отмечается увеличение случаев заболеваний раком при воздействии свинца [118,119]. Однако, эти данные считаются недостаточными, чтобы признать канцерогенный эффект свинца [120]. Свинец вызывает симпатическую гиперактивность и повышенную чувствительность ?- и дофаминергических рецепторов [121,122]. Некоторые исследования показали линейную связь между уровнем креатинина в плазме и уровнем свинца в крови выше 400 мкг/л [123-125].

Соединения свинца (Pb2+) нарушают обмен веществ и являются ингибиторами ферментов [102]. Механизм токсического действия свинца, как и других тяжелых металлов, заключается в блокировании функциональных SH-групп белков. Наиболее сильному воздействию свинца подвержена гидратаза ?-аминолевулиновой кислоты, катализирующая процесс формирования протобилиногена и гемсинтетазы, связывающих железо в протопорфирин [97]. Так, при содержании свинца в крови 200--300 мкг/л наблюдается повышение уровня свободного протопорфирина в эритроцитах, а ингибирование дегидрогеназы ?-аминолевулиновой кислоты наблюдается при концентрации свинца в крови около 100 мкг/л [126]. При концентрациях свинца в крови около 400 мкг/л наблюдается снижение уровня гемоглобина [127].

Установлено, что в местах расположения свинцовых производств наблюдаются существенные отклонения в состоянии здоровья населения в целом, и детей в особенности [104]. По сравнению с взрослыми дети в десять раз более чувствительны к действию свинца [104]. При этом на здоровье негативно влияют не только высокие, но и постоянно действующие низкие концентрации свинца. Для взрослых следует рассматривать критическое воздействие свинца на повышение уровня свободного протопорфирина в эритроцитах, тогда как для детей решающими факторами являются снижение умственной деятельности, ухудшение слуха и нарушения в метаболизме витамина D [128,129]. Измеряемые в настоящее время базовые уровни свинца в крови, обусловленные минимальным антропогенным фактором, составляют от 10 до 30 мкг/л. Как выявили различные международные экспертные группы, минимальное неблагоприятное действие свинца на маленьких детей начинается с уровня 100--150 мкг/л. Хотя нельзя исключить, что действие свинца может происходить и при меньших значениях.

Основным источником попадания свинца в организм является воздух. Врачи-гигиенисты и инженеры по охране труда постоянно следят за тем, чтобы содержание свинца в воздухе не превышало допустимой нормы-- 0,00001 миллиграмма на литр. Хотя концентрация свинца в воздухе, равная 1 мкг/м3 непосредственно дает вклад в его концентрацию в крови, равную примерно 19 мкг/л у детей, и около 16 мкг/л у взрослых.

Поступление свинца в организм с пищей составляет 200-300 мкг/сут. Количество поступающего свинца зависит от возраста, пола, места проживания, профессии. При пероральном поступлении соединений свинца из желудочно-кишечного тракта всасывается около 10 % введенного свинца. Поступивший в кровь свинец быстро распределяется по органам, затем происходит перераспределение. Образуются два обменных пула свинца: быстрый - кровь, мягкие ткани и медленный - скелет [46].

У человека и млекопитающих основным путем выведения свинца из тканей являются почки. Выведение свинца из организма имеет двухфазный характер. Время полувыведения из крови и мягких тканей составляет 20 дней. Из скелета - 20 лет [46].

Введение свинца в желудок крысам в течение 8 недель приводит к значительному накоплению свинца во всех отделах мозга [130]. Перекисное окисление липидов во всех исследованных образцах после действия свинца усиливается и наблюдается линейная корреляция между увеличением ПОЛ и уровнем свинца в ткани. Усиление ПОЛ сопровождается значительным угнетением активности антиоксидантных ферментов: СОД, каталазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы.

Действие свинца приводит также к ингибированию мембраносвязанного фермента ацетилхолинэстеразы, при этом также наблюдается линейная корреляция между увеличением ПОЛ и снижением активности ацетилхолинэстеразы. Эти результаты показывают, что свинец оказывает нейротоксический эффект посредством окислительного повреждения мембран. Изучение механизмов токсического действия свинца на печень выявило, что в печени тоже наблюдается значительная аккумуляция свинца, которая приводит к усилению липидной пероксидации и ингибированию активности антиоксидантных ферментов [131]. Следовательно, свинец усиливает окислительное повреждение мембран, и таким образом нарушает клеточные функции, повреждение клеточных мембран является в данном случае следствием отравления свинцом.

1.3 Ртуть и ее соединения

Ртуть является тяжелым металлом, который встречается в окружающей среде в различных формах. Наиболее важными с токсикологической точки зрения является металлическая форма, также называемая элементной формой, дивалентные неорганические формы и метилртуть. Пары ртути распределяются в атмосфере и с осадками попадают в почву и водоемы [48]. Неорганическая ртуть в водной среде, особенно кислой, подвергается бактериальному преобразованию до метилртути, которая более токсична, чем элементная форма ртути [48,132,133]. Расчеты ученых показали, что в ближайшие 50 лет выбросы ртути в атмосферу удвоятся [134].

Все соли ртути ядовиты и это требует большой осторожности при работе с ними. Ртуть относится к первой группе чрезвычайно токсичных веществ. Пары ртути в 7 раз тяжелее воздуха. Они хорошо поглощаются всеми предметами окружающей среды (цементные, деревянные конструкции, штукатурка, ковры, меховые изделия, ткани, мебель и др.). Десорбция осуществляется медленно и резко увеличивается с повышением температуры [135]. Ртуть - единственный металл, находящийся в жидком состоянии в условиях, которые мы называем нормальными [136]. Ртуть - в 13,6 раза тяжелее воды, температура плавления -- 38,9°С [135,136]. У ртути довольно большой коэффициент температурного расширения - всего в полтора раза меньше, чем у воды, и на порядок, а то и два больше, чем у обычных металлов [137].

Человек подвергается воздействию соединений ртути в основном из трех источников: пресноводная рыба, содержащая высокие концентрации метилртути, амальгамы, используемые в стоматологии и вакцины, в которые добавляется этилртуть, а также вдыхая пары ртути из атмосферы [43,48,138-142]. Пары ртути быстро входят в клетку ввиду хорошей растворимости в липидах [143]. Метилртуть проникает через мембраны, образуя водорастворимые комплексы, чьи структуры напоминают структуры эндогенных веществ, переносимых посредством определенных транспортных систем [143].

Соединения ртути, особенно ртутьорганические, токсичны [135]. Жидкая ртуть опасна, прежде всего, своей летучестью: если хранить ее открытой в лабораторном помещении, то в воздухе создается парциальное давление ртути 0,001 мМ. Это много, тем более, что предельно допустимая концентрация ртути в промышленных помещениях 0,01 мг на м3 воздуха [137]. Безопасная доза, рекомендованная Всемирной Организацией Здравоохранения равна 430 нг/кг/день [142,143], однако некоторые ученые считают, что безопасная доза должна быть 60-110 нг/кг [142]. Летальная доза солей двухвалентной ртути около 1 г [135].

При отравлении ртутью и ее соединениями поражаются почки [48,135,137]. Ртуть действует и на центральную нервную систему, в основном на мозг [47,48,132]. Дети в 5-10 раз более чувствительны, чем взрослые [47,132]. Метилртуть легко проникает через плаценту и в высоких дозах может причинять серьезное повреждение развивающемуся мозгу [47]. У детей, подвергавшихся внутриутробному воздействию ртути, может наблюдаться задержка развития [48,142], отмечаются серьезные повреждения мозга [132]. Органические соединения ртути, в основном метилртуть, аккумулируются в эритроцитах и особенно много в головном мозге.

Высокое сродство связывания иона Hg2+ с тиоловыми или сульфгидрильными группами белков, как полагают, является основным механизмом биологического действия ртути [144-146]. В результате действия ртути, возможно, происходит инактивация различных ферментов, структурных белков, или транспортных процессов [147]; или изменение проницаемости клеточных мембран [148]. Ртуть может взаимодействовать так же и с другими участками белков, например, амино- или карбоксильными группами. Исследованы разнообразные изменения, вызванные действием ртути, включая повышение окислительного стресса, увеличение проницаемости гемато-энцефалического барьера, нарушение синтеза белка, репликации ДНК, разрушение мембран, ухудшение иммунного ответа, нарушение гомеостаза кальция. Ртуть действует на активность ферментов микросом печени [149]. Интраперитональное введение ацетата ртути 6,2 мкмоль/кг/день в течение 6 дней или введение разовой дозы 15,68 мкмоль/кг приводило к повышению веса почек и значительному снижению содержания цитохрома P-450.

Посредством изменения тиолового статуса внутри клетки, ртуть может содействовать окислительному стрессу, перекисному окислению липидов, митохондриальной дисфункции [150]. HgCl2 вызывает деполяризацию внутренней мембраны митохондрий, с последовательным увеличением образования H2O2 [151]. Было предположено, что изменения кальциевого гомеостаза митохондрий может усилить, вызванный Hg2+ окислительный стресс в клетках почек, в результате которого происходят многочисленные биохимические изменения биомолекул [152].

Взаимоотношение между связыванием тиолов и клеточной дисфункцией или повреждением недостаточно ясно. Было предположено, что ртуть или метилртуть входят в проксимальные трубчатые эпителиальные клетки и, пройдя через базолатеральную мембрану, ртуть взаимодействует с тиол-содержащими соединениями, преимущественно с глутатионом и металлотионеионом. Это взаимодействие вызывает изменения в проницаемости мембран к ионам кальция и ингибирование функций митохондрий. В почках, повреждение эпителиальных клеток происходит как результат повышения образования свободных радикалов и перекисного окисления липидов [153]. Кроме того, предполагается, что ртуть приводит к истощению клеточных механизмов защиты против окислительного повреждения, таких как глутатион, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза [153].