Биотехнологический способ получения меченого стабильными изотопами липид-транспортирующего белка чечевицы (Lens culinaris)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

ВВЕДЕНИЕ

Растительные липид-транспортирующие белки (LTP) широко распространены в белковых профилях растений, и, как полагают, играют важную роль в выживании многих видов. LTP из различных видов растений разделяют структурное сходство и высоко консервативные мотивы, которые распознаваясь клетками иммунной системы организма обуславливают развитие симптомов аллергических заболеваний. LTP-опосредованная аллергия связана с широким спектром клинических реакций, включая оральный аллергический синдром, крапивницу, отек Квинке, анафилактический шок, респираторный дистресс, и отек голосовой щели. Компонент-специфическая диагностика играет фундаментальную роль в идентификации и характеристике LTP-опосредованной аллергии и в будущем, вероятно, сыграет существенную роль в лечении пациентов с аллергией на растительные продукты. Существующая на сегодняшний день тенденция отказа или умеренного проведения иммунотерапии фармакологическими средствами всё больше ведёт к выбору такого альтернативного подхода лечения как аллерген-специфическая терапия с применением рекомбинантных аналогов природных аллергенов. В последние годы индукция иммунной толерантности стала главной задачей профилактики в стратегии лечения многих аллергических заболеваний, в патогенезе которых наблюдается нарушение регуляции иммунной системы. Дальнейшие исследования связанные с точным количественным определением содержания LTP в пищевых продуктах и пыльце, введением в широкую медицинскую практику подкожной и сублингвальной иммунотерапии, и разработкой гипоаллергенных и иммуногенных рекомбинантных форм ведут к появлению наиболее эффективных и широкодоступных вариантов лечения аллергии, в том числе для применения их в контексте персонифицированной медицины.

Ранее в Учебно-научном центре ИБХ РАН из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris был выделен белок Lc-LTP2, относящийся к первому подклассу липид-транспортирующих белков, аминокислотная последовательность и структура кДНК, которого уже установлены. Помимо того, для проведения дальнейших структурно-функциональных исследований на основе плазмид pET и штамма Escherichia coli BL21(DE3) была разработана система для гетерологической экспрессии Lc-LTP2 в виде гибридной конструкции с тиоредоксином А и октагистидиновой последовательностью. Для исследования пространственной структуры Lc-LTP2 был получен его рекомбинантный аналог. Для дальнейших исследований структуры Lc-LTP2 и установления изотопной чистоты полученного препарата методами гетероядерной ЯМР-спектроскопии и автоматического микросеквенирования по методу Эдмана требовалось получить меченный стабильными изотопами 13C15N-Lc-LTP2.

Цель дипломной работы: явилась разработка биотехнологического способа получения рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы Lc-LTP2, тотально меченного стабильными изотопами 13C и 15N, основанного на его гетерологической экспрессии в клетках E. coli.

Для этого были осуществлены следующие задачи:

1) Подбор оптимальных условий экспрессии 13C15N-меченного рекомбинантного аналога Lc-LTP2 в клетках E. coli, трансформированных плазмидой pET-His8-TrxL-Lc-LTP2;

2) Установление идентичности очищенного рекомбинантного 13C15N-меченного Lc-LTP2 природному белку.

3) Установление степени включения изотопной метки в молекулы 13C15N-Lc-LTP2.

1. ЛИПИД-ТРАНСПОРТИРУЮЩИЕ БЕЛКИ РАСТЕНИЙ В ДИАГНОСТИКЕ И ТЕРАПИИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЙ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Cтруктурно-биохимические черты и биологические функции LTP растений

Неспецифические липид-танспортирующие белки (nsLTPs) - небольшие, основные белки, которые широко представлены в белковых профилях различных представителей высших растений. nsLTPs обладают способностью обратимо связывать и переносить различные липидные молекулы и предположительно вовлечены в межмембранный транспорт липидов на интра- и экстраклеточном уровнях. «Неспецифическими» данные белки были названы в связи с их предполагаемой способностью к мобилизации достаточно широкого спектра полярных липидов, фосфолипидов и гликолипидов, включая 4-пальмитиновую кислоту, ацильные цепи 1,2-димиристоилфосфатидилглицерина и ацетил- и олеоил-КоА, а также гидроксильные и цетоксильные группы гидрофобных мономеров кутина и суберина (например, жирных спиртов, фенолов и гидроксилированных жирных кислот), которые входят в состав внешних защитных слоёв растений, а также такие липидсодержащие соединения, как цитохром C митохондрий и простагландин B2 [1-4].

nsLTPs традиционно делятся на два основных подкласса в соответствии с их молекулярной массой: LTP1 (7 кДа) и LTP2 (9 кДа). Молекулярная масса nsLTPs может варьировать в пределах от 7 до 10 кДа, но у некоторых представителей, например, nsLTP из пшеницы, может достигать 13-15 кДа в связи с N-или С-концевыми модификациями зрелого белка [5]. nsLTPs, как правило, представляют собой основные белки с изоэлектрической точкой 8.5-12, имеющие полипептидную основу, которая на уровне вторичной структуры характеризуется наличием четырёх б-спиралей, разделенных гибкими петлями, и характерного мотива: восьми остатков цистеина (Cys) в основе структурной последовательности Cys1-Xn-Cys2-Xn-Cys3Cys4-Xn-Cys5XCys6-Xn-Cys7-Xn-Cys8, образующих четыре дисульфидных мостика[5]. Различия в количестве цистеиновых остатков были отмечены для nsLTPs из арабидопсиса, риса и пшеницы [6]. На основании расстояния между остатками Cys, а также некоторыми другими варьирующими у разных групп остатками, nsLTPs были разделены на девять подсемейств. N-концевые последовательности всех подсемейств nsLTP обнаруживают высокую степень структурной гомологии, в том числе между nsLTP из растений классов двудольные и однодольные, а именно: полную консервативность положения остатков Val и почти полное сходство относительно позиций остатков Gly, Ser и Pro, а также сохранение локализации многих гидрофобных остатков [7].

Рис. 1 - Трёхмерная структура nsLTPs. А - 4 б-спирали окрашены зелёным цветом, стабилизирующе их дисульфидные мостики - красным цветом; 1 - гидрофобная полость для связывания лиганда. B - распределение гидрофильных (синим) и гидрофобных (красным) остатков по поверхности молекулы

Почти для всех nsLTPs характерно отсутствие остатков триптофана (Trp), за исключением нескольких изоформ из арабидопсиса и риса, которые в составе цепи имеют 1-2 Trp [6]. При сопоставлении последовательностей N-концевого сегмента nsLTP1 из различных растительных источников, обнаруживается высокая консервативность позиций заряженных остатков, расположенных в виде двух консенсусных пентапептидных последовательностей: Thr/Ser-X1-X2-Asp-Arg/Lys и Pro-Tyr-X-Ile-Ser (фрагменты цепи в пределах остатков 43-47 и 81-85, соответственно), которые, по-видимому, имеют критическое значение в субстрат-специфическом связывании лиганда.

Таким образом, компактная достаточно стабильная геометрия глобулы, конфигурация б-спиралей, формирующих гидрофобную полость, с наличием в С-коневой области сайтов связывания липидов, а также слабая адсорбция этих белков в липидном бислое биомембран, обусловленная преимущественной гидрофильностью поверхностных участков молекулы. В контексте рассмотрения биологической роли, nsLTPs были отнесены к группе, так называемых, ассоциированных с патогенезом белков (Pathogenesis Related Proteins, PRP). Общепринятое название «PR-белки» предполагает, что их синтез индуцируется только патогенами. Однако эти белки образуются и в здоровых растениях при цветении, а также при различных абиотических стрессовых воздействиях (засуха, жара, холод, засоление). В 1999 году на основе аминокислотной последовательности, серологических свойств, энзиматической и биологической активности была создана унифицированная для всех растений номенклатура PR-белков, включающая 17 семейств (PR-1 - PR-17). Некоторые PR-белки имеют протеазную, рибонуклеазную, 1,3-b-глюканазную, хитиназную активности или являются ингибиторами протеаз. К группе PR-14 относятся низкомолекулярные (5-10 кДа) белки - модификаторы клеточных мембран грибов и бактерий: тионины, дефенсины и липид-транспортирующие белки.

При заражении растений патогенами увеличивается активность литического компартмента клеток растений. К литическому компартменту клеток растений относится центральная вакуоль, мелкие вакуоли - производные эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи, функционирующие эквивалентно первичным лизосомам животных (то есть как структуры, в которых содержатся гидролазы, но отсутствуют субстраты для этих ферментов), а также плазмалемма и ее производные, в том числе парамуральные тела, и внеклеточные гидролазы, локализованные в клеточной стенке и в пространстве между стенкой и плазмалеммой. В пределах данного компонента и осуществляется молекулярная функция nsLTPs, обуславливающая на макроуровне важную роль этих белков в развитии и физиологии растений.

На основе имеющихся знаний об уровнях экспрессии генов LTP на различных стадиях эмбрио- и онтогенеза растений, структуре белка и активности nsLTPs in vitro, сделаны предположения о важной роли nsLTPs в таких ключевых физиологических процессах растений, как формирование восковых и кутикулярных слоёв на поверхности различных морфологических структур растений, сопротивление абиотическим стрессовым воздействиям, эмбриогенез и устойчивость к фитопатогенным бактериям и грибам. Гены nsLTPs многих растений экспрессируются в клетках эпидермиса листовых пластинок, где восковой и кутикулярный слои, как правило, наиболее обильны. Тем не менее, описанное в ряде экспериментов, исследование белковых профилей различных тканей растений, свидетельствует о локализации nsLTPs в таких гистологических структурах, как ксилема, луб, устьица и трихомы, что может привести к обнаружению совершенно непредсказуемых функций nsLTPs.

1.2 LTP как потенциальные инициаторы аллергии

Аллергены - вещества, в основном белки, с молекулярной массой от 5 до 100 кДа, или низкомолекулярные соединения, гаптены, которые при первом поступлении в организм, предрасположенный к развитию аллергии, вызывают сенсибилизацию, то есть образование специфических IgE-антител, а при последующих - развитие симптомов аллергических заболеваний. До сих пор, в качестве аллергенов, были охарактеризованы 63 члена семейства nsLTPs, 46 из которых синтезируются в съедобных частях растений, причём почти все из них принадлежат к классу LTP1, и всего в два, предположительно, к классу LTP2 (www.allergome.org) [9]. Неспецифические липид-транспортирующие белки являются основной причиной первичной сенсибилизации пищевыми аллергенами среди взрослого населения, преимущественно популяции района Средиземного моря. Большое число аллергенов, принадлежащих к классу 1 липид-транспортирующих белков, были изолированы из представителей различных филогенетически отдалённых семейств растений. Согласно многочисленным литературным данным, наиболее клинически важные nsLTPs обнаружены в качестве пан-аллергенов преимущественно в представителях семейства Rosaceae. Подобные аллергены были изолированы из персика (Prunus persica) и яблок (Malus domestica) и обозначены как Pru p 3 и Mal d 3, соответственно. Кроме того, nsLTPs были обнаружены в абрикосе (Prunus armeniaca; Pru ar 3), вишне (Prunus avium; Pru av 3) и сливе (Prunus domestica; Pru d 3). Помимо представителей Rosaceae, аллергенные nsLTPs были также выделены из винограда (Vitis vinifera; Vit v 1), каштана (Castanea sativa; Cas с 8), фундука (Corylus avellana; Cor a 8), из кукурузы (Zea mays; Zea m 17), спаржы (Asparagus officinalis; Aspa o 1,01 и Aspa o 1,02), ячмень (Hordeum vulgare) [29], арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) [32], салата (Lactuca sativa, Lac s 1). Всего на сегодняшний день обнаружено не менее 35 видов LTPs изолированных из растений, употребляемых в пищу. Кроме того, некоторые аллергены пыльцы также относятся к подклассу LTP1. Например, Art v 3 из полыни обыкновенной, Ole e 7 из оливы европейской и из арабидопсиса (Arabidopsis thaliana), обладают 30-55% гомологией аминокислотной последовательности с некоторыми LTP1 из растительной пищи. Подобная гомология также характерна и для имеющих более крупную молекулярную массу, аллергенов растения постенница иудейская (Parietaria judaica, Par J 1[10,7 кДа] и Par J 2[11,3 кДа]), из которого LTP1 были впервые выделены.

Благодаря компактности фолда и высокой стабильности архитектуры молекулы LTP, за счёт наличия четырёх дисульфидных связей, образованных остатками цистеина, данные белки не утрачивают целостность и нативную конформацию, как при термической обработке, так и в деструктурирующих кислотно-ферментативных условиях желудочного сока, а, следовательно, сохраняется их активность и потенциальная аллергенность даже в процессе пищеварения [22]. Подобная устойчивость была недавно продемонстрирована для LTP из семян жёлтой горчицы (Sinapis alba L.) Sin a 3. является достаточно стабильным, в условиях желудочного и кишечного пищеварения in vitro и сохраняет свою IgE-связывающую способность. При обработке Sin a 3 комбинацией трипсина и химотрипсина образуются большие пептидные фрагменты, связанные дисульфидными связями. Кроме того, подвергаясь температурному воздействию, Sin a 3 частично денатурирует, за счёт локльного расплетения б-спиралей. Несмотря на конформационные изменения, Sin a 3 поддерживает IgE и IgG-связывающую способность даже после термической обработки при 95 ° С в течение 30 мин. Кроме того, при обработке в-меркаптоэтанолом, обеспечивающей разрушение дисульфидных связей, возможно, всё же сохраняется несколько участков эпитопов, распознаваемых специфическими IgEs и поликлональными IgGs [10]. Напротив, LTP персика Pru p 3 является термолабильным при нагревании при 95°С и рН 7, и достаточно стабильным, в при той же температуре и рН 3. В результате nsLTPs, будучи классическими пищевыми аллергенами I класса, могут потенциально могут являться причной симптомов орального аллергического синдрома - ОАС (Oral Allergic Syndrome, OAS), характеризующегося возникновением зуда и отечности в орофарингеальной области, умеренных аллергических реакций, таких как контактная крапивница и ангиоидема, а также симптомов тяжёлых системных реакций, таких как анафилаксия [23].

1.2.1 Место LTP растений в классификации аллергенов

В зависимости от потенциальной антител-связывающей способности выделяют мажорные аллергены, способные связывать около 50% антител (IgE) в сыворотке крови больного, и минорные, связывающие около 10% антител в сыворотке больного, имеющего сенсибилизацию к данному аллергену. В 1994 году Всемирной Организацией Здравоохранения совместно с Международным Союзом Иммунологических Сообществ (WHO/IUIS) был утверждён наиболее современный вариант номенклатуры аллергенов [31].

Существует несколько принципов, по которым группируют аллергены. Аллергены могут быть как белкового, так и не белкового происхождения. В широком смысле, семейства белковых аллергенов подразделяют на четыре основные группы, в зависимости от пути попадания аллергена в организм и природного источника, в котором исходно локализуется данный аллерген (то есть по происхождению). К группе эндоаллергенов (“indoor”), источником которых являются клещи, тараканы, частицы эпидермиса и волосяных покровов животных, а также плесневые микроорганизмы, относятся сериновые и цистеиновые протеазы, липокалины (лиганд-связывающие белки), тропомиозины, альбумины, кальций-связывающие белки, ингибиторы протеаз [34]. Экзоаллергены (“outdoor”) из пыльцы трав, деревьев и сорных растений, спор плесневых микроорганизмов - связанные с патогенезом белки растений (PR-10), пектатлиазы, в-экспансины, кальций-связывающие белки (полкальцины), дефенсины и ингибиторы трипсина [35,36,37,38]. К пищевым аллергенам растительного (из фруктов, овощей, орехов, семян) и животного (из молока, яиц, моллюсков, рыбы) относятся, главным образом липид-транспортирующие белки, профилины, запасные белки семян растений, лактоглобулины, казеин, тропомиозины, парвальбумины и некоторые другие белки [39, 40]. Инъекционные аллергены - белки, изолируемые из яда насекомых, а также и некоторые терапевтические белки (лекарственные аллергены). К ним относятся, в первую очередь, фосфолипазы, гиалуронидазы и аспарагиназа.

В зависимости от пути проникновения в организм различают аэро- (ингаляционные) аллергены, пищевые, инъекционные и контактные аллергены. Причём некоторые аллергены возможно отнести сразу к нескольким категориям данной классификации.

Растительные LTP, как правило, могут относиться к группе экзоллергенов, проникающих в организм ингаляционно при вдыхании пыльцы растений, либо пищевых аллергенов, попадающих в организм оральным путём при употреблении растительной пищи.

Общепринятым вариантом классификации белков-аллергенов растений стала наиболее очевидная система, предложенная Международным союзом иммунологических обществ Подкомитета номенклатуры аллергенов (http://www.allergen.org). Данная классификация аллергенов основана на основе гомологии аминокислотной последовательности выделенных белков с известными аллергенами и на их функциональном сходстве. Таким образом, различные классы аллергенных белков были организованы в 20 семейств аллергенов растительной пищи, в свою очередь, объединённых в надсемейства [33]. Большинство аллергенов растительной пищи принадлежат к нескольким белковым семействам и надсемействам. С использованием аннотаций к аллергенам базы данных Pfam (http://pfam.sanger.ac.uk/) и последовательностей аллергенов из баз данных PROTALL и FARRP, был проведён анализ распределения частоты встречаемости аллергенов в пределах различных белковых семейств. Базы данных FARRP и PROTALL содержат информацию о различных аллергенных белках с акцентом на пищевые аллергены, в частности база данных FARRP обеспечивает поиск сходных аминокислотных последовательностей аллергенов, а в базе PROTALL содержатся данные клинических исследований (результаты кожных проб и провокационных тестов) пищевых аллергенов [31]. Согласно проведённому in silico анализу, около 65% всех аллергенных белков относятся к четырём надсемействам: проламины, купины, гомологи основного аллергена пыльцы березы, Bet v 1 (Mal d 1 из яблок, Api g 1 из сельдерея) и профилины (Api g 4 из сельдерея) [33].

nsLTPs относятся к надсемейству проламинов, для представителей которого характерным мотивом является наличие дисульфидных связей, объединяющих б-спирали в компактную молекулу. К этому надсемейству также относятся 2S альбумины, ингибиторы б-амилазы/протеазы злаков и проламины злаков [41].

1.2.2 Иммунологическая основа аллергических реакций

Иммунологическая сущность аллергических заболеваний заключается в наличии двух фаз иммунной реакции на аллерген. На ранней фазе IgE-опосредуемого иммунного ответа происходит сенсибилизация организма по отношению к данному аллергену и пролиферация Т- и В-клеток памяти. При этом, молекула антигена захватывается и процессируется клетками популяции, так называемых, антиген-презентирующих клеток, (Atigen-Presenting Cell, APC), к которым относятся дендритные клетки, макрофаги и B-клетки. Далее антигенные детерминанты, представляющие собой короткие аминокислотные последовательности, распознаваемые IgE, экспонируются на поверхности APC в комплексе с молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса (Main Histocompatibility Complex, MHC). Т-лимфоциты могут распознавать такие комплексы при помощи Т-клеточных рецепторов (T-Cell's Receptor, TCR). Антиген-презентирующие клетки представляют процессированный антиген Т-клеткам, которые распознают этот комплекс на мембране и взаимодействуют с ним. После этого APC продуцируют дополнительные ко-стимуляторные молекулы, что приводит к активации Т-клеток. У человека, на поверхности B-лимфоцитов, активированных T-лимфоцитов, моноцитов, макрофагов и дендритных клеток также присутствуют HLA (Human Leukocyte Antigens, антигены лейкоцитов человека), относящиеся к МНС II класса. Гены HLA II класса играют ключевую роль в развитии приобретенного иммунного ответа на антигены чужеродных белков.

В недавнем исследовании было проанализировано влияние аллергена персика Pru p 3 на созревание дендритных клеток и влияние этого созревания на пролифераци. и дифференцировкe в Th1 или Th2 у пациентов с аллергией. Была использована клеточная линия дендритных клеток, полученных из моноцитов (moDCs), которая характеризуется низкой экспрессией HLA-DR и ко-стимулирующих молекул.

Было показано, что образование комплексов антигенных детерминант Pru p 3 с HLA-DR на поверхности moDCs, индуцирует созревание последних и экспрессию на ко-стимулирующих молекул CD80 и CD83. Данные маркеры moDCs взаимодействуют с?молекулой CD28, конституционно представленной на поверхности всех покоящихся CD4+ Т-клеток. При проведении LTT (Lymphocyte Transformation Test - тетст трансформации лимфоцитов), позволяющего измерить пролиферационный ответ, премированных различными дозами Pru p 3, лимфоцитов, обнаруживалось существенное увеличение продукции IL-10 и дозозависимое повышение индекса пролиферации Т-клеток, а также повышение уровня экспрессии цитокинов T-киллерами (Normal Killer, NK). Данное явление, вероятно, является следствием перекрестного реагирования moDCs и NK [11]. DC-NK-клеточное взаимодействие побуждает NK клетки продуцировать IFN-г в сочетании с высоким уровнем IL-8.

В зависимости от сигналов дифференцировки, поступающих от определённого цитокинового микроокружения, CD4 + наивные Т-лимфоциты могут дифференцироваться в Th1 -, Th2 -, Th9 -, Th17 - или Th22-типы клеток памяти или в эффекторные клетки. На основе соответствующего профиля цитокинов, эти Т-клеточные линии могут способствовать различным типам воспалительных реакций.

Th-регуляторные CD4+ клетки продуцируют IL-10 и TGF в, которые предотвращают развитие аллергической реакции, и обладают способностью подавлять индуцируемую аллергеном Т-клеточную пролиферацию и тормозить секрецию цитокинов Th1 и Th2 клетками [42].

IL-12, IL-18 и IL-17 обеспечивают дифференцировку Th0- в Th1-клетки, стимулирующие продукцию В-клетками IgG, особенно IgG4(блокирующих антител), играющих роль в клеточном иммунном ответе. Основные цитокины Th1 клеток: IFN-г (интерферон-г), и TGF в (трансформирующий ростовой фактор-в) [49].

На поздней фазе происходит дифференциация и клональная экспансия аллерген-специфических CD4+ Th2-лимфоцитов, ответственных за развитие реакций гиперчувствительности I типа и продуцирующих IL-4 и IL-13 [54]. Интерлейкины IL-13 и IL-4 являются молекулярными триггерами переключения генов иммуноглобулинов на образование В-клетками IgE [22,23], а также клональной экспансии наивных В-клеток и В-клеток памяти [27,28]. IL-4 стимулирует HLA класса II и ко-стимулирующие факторы и направляет наивные Th0 клетки по пути дифференцировки в Th2 фенотип. Антагонистом IL-4 является IFN-г, вырабатываемый Th1. Кроме того, IL-4 играет важную роль в поддержании аллергического иммунного ответа и предотвращении Т-клеточного апоптоза. Адекватным аллерген-специфическим иммунным ответом, является преимущественная выработка Th1, тогда как в случае аллергопатологии наблюдается повышенный синтез Th2 [72,73].

Аллерген-специфические IgE связываются с высокоаффинными (FcеRI) или низкоаффинными (FcеRII) рецепторами на поверхности тучных клеток и базофилов, что приводит к сенсибилизации пациента [55]. При повторном столкновении с аллергеном наблюдается перекрёстное связывание комплексов IgE/антиген с FcеRI и FcеRII, после чего происходит дегрануляция эффекторных клеток с высвобождением анафилактогенных вторичных медиаторов: вазоактивных аминов (таких как гистамин), липидных медиаторов (TGF, лейкотриены), хемокинов, интерлейкинов (IL-4, IL-5 и IL-13), гепарина и нейтральных протеаз, что приводит к процессам воспаления и повреждения тканей [20]. Данные медиаторы ответственны за развитие реакции гиперчувствительности немедленного типа. [56].

Развитие симптомов аллергии обусловлено аллерген-специфичным Т-клеточным ответом, опосредованным Т-клетками памяти. Внутри всей категории Т-клеток памяти выделяются три основных субпопуляции, различающиеся экспрессией хемокиновых рецепторов CCR7 и L-селектина (CD62L). Центральные клетки памяти TCM экспрессируют L-селектин, CCR7 и секретируют IL-2, в то время как эффекторные клетки памяти TEM секретируют IFNг и IL-4. Недавно были выделены новые субпопуляции Т-клеток памяти, экспрессирующие помимо CCR7 и CD62L, также CD27 и CD28 [74]. Центральные Т-клетки памяти отличаются тем, что присутствие антигена повышает их пролиферативную способность и запускает их дифференцировку в эффекторные Т-клетки памяти. Последние мигрируют к очагу воспаления, где секретируют цитокины запускающие Th1-иммунный ответ, а также генерацию Тh2-клеточных линий [74]. В свою очередь, Тh2 клетки продуцируют IL-4, IL-5, IL-9 и IL-13 и, вероятно, некоторые другие недавно идентифицированные цитокины, такие как IL-25, IL-31 и IL-33, способствующие доминированию Тh2 типу иммунного ответа [57-62]. Эти цитокины играют важную роль в гиперсинтезе аллерген-специфического IgE, развитии эозинофилии, повышении проницаемости эндотелия сосудов для ряда эффекторных клеток в воспаленных тканях, гиперпродукции слизи и снижении порога чувствительности при сокращении гладкой мускулатуры стенки кишечника и дыхательных путей [63].

1.2.3 «LTP-синдром»

nsLTPs хорошо известны своей ролью в инициации тяжелых системных проявлений пищевой аллергии. Множественная сенсибилизация к различным LTP-содержащим продуктам у чувствительных пациентов является следствием широкой распространённости IgE-зависимых перекрестных реакций между различными LTPs, даже из таксономически далеких видов растений и определяется термином «LTP-синдром» [44,46]. Отношения между этим синдромом и LTP-опосредованным поллинозом не совсем ясны, так как LTPs считаются истинными пищевыми аллергенами, способными вызвать иммунную реакцию, которая первично не зависит от сенсибилизации пыльцевыми LTPs. Тем не менее, были описаны случаи перекрестной реактивности между LTP персика (Pru р 3) и LTP из пыльцы полыни (Art v 3) и платана (Pla a 3) [45,47]. Было установлено, что LTP пыльцы платана (Pla a 3) является главным аллергеном у пациентов, чувствительных также к аллергену Pru p 3 и минорным аллергеном у пациентов без пищевой аллергии. Случай c Pru p 3 и LTP полыни являлся более спорным, так как, в зависимости от исследуемой популяции, в качестве основного сенсибилизирующего агента, был предложен либо пищевой аллерген Pru p 3, либо LTP из пыльцы (Art v 3). В связи с этими данными, было предположено существование двух различных вариантов LTP-синдрома, в зависимости от природы первичного сенсибилизатора: с наличием или отсутствием пыльцевой аллергии, детерминирующей первичную сенсибилизацию к LTP-содержащей растительной пище [47].

Интересным является тот факт, что ко-сенсибилизация пыльцевыми аллергенами и лабильными аллергенами растительной пищи делает проявление LTP-синдрома менее серьезными.

Так, у некоторых LTP-сенсибилизированных пациентов клиническое развитие пищевой аллергии происходит только в присутствии кофакторов, таких как, например, физические нагрузки или при наличии хронической крапивницы.

В данном случае, имеет место чрезвычайная изменчивость клинической картины заболевания, варьирующей от длительной бессимптомной сенсибилизации до тяжелой анафилаксии, в зависимости от наличия либо отсутствия кофактора [52]. В частности, кукурузная крупа, добавляемая во время пивоварения, представлять собой источник аллергена Zea m 12. Причём при диагностировании пациента с аллергией на пиво, было показано наличие толерантности иммунной системы по отношению к початкам и зёрнам кукурузы, что может свидетельствовать о роли присутствия алкоголя в пиве как ко-фактора сенсибилизации к LTP, обеспечивающего более высокий процент кишечной абсорбции аллергена, и, следовательно, развитие аллергических реакций [9].

1.3 Предсказание аллергенности LTP

Одним из первых in silico-методов предсказания аллергенов был предложен всемирной организацией здравоохранения (WHO) и продовольственной и сельскохозяйственной организацией (FAO). Согласно этому методу, белок считается аллергеном, если его последовательность из 80 аминокислотных остатков имеет гомологию выше 35 % с одним из известных аллергенов, или участок анализируемого белка протяженностью как минимум 6 аминокислотных остатков идентичен участку аминокислотной последовательности известного аллергена [68].

Существует несколько основных методов применяемых для картирования эпитопов LTPs. Кристаллография,позволяет напрямую визуализацировать взаимодействия между антигеном и антителом. Метод множественного пептидного сканирования (сканирование перекрывающихся пептидов, или PEPSCAN анализ) использует библиотеку олиго-пептидных последовательностей с перекрыающимимся и неперекрывающиеся фрагментами белка и тестирование их на способность связывать антитела. Метод фагового пептидного дисплея является наиболее эффективным для селекции и скрининга при идентификации пептидных структур, имитирующих природные эпитопы - компактные аминокислотные композиции, известные как мимотопы. В технике дисплея, как правило, используется нитевидный вирус (М13, fd и некоторые другие), которым заражается бактерия Escherichia coli. Когда ДНК, кодирующая чужеродный пептид встраивается в область генома вируса (вектор фага М13 и др.), кодирующую последовательность белка оболочки вируса (чаще всего PIII или pVIII), соответствующий последовательности слитого с белком оболочки вирусной частицы. Чужеродная последовательность экспонируется на поверхности вирусного капсида и способна взаимодействовать с различными типами аффинных молекул, то есть в случае антигенных детерминант аллергена - c моно-, олиго- и поликлональными IgE [84].

1.3.1 Локализация T-клеточных эпитопов LTP

C учетом распространенности сенсибилизации, спектра перекрёстных реакций с другими LTPs и потенциальной способности, Pru p 3 является наиболее клинически значимым аллергеном семейства nsLTPs.

Индукция аллерген-специфичных Т-клеток является необходимым условием для осуществления гуморального иммунного ответа. Установленная способность отдельных nsLTPs стимулировать Т-клетки представляет собой важный аспект механизма сенсибилизации [42]. Было показано, что Pru p 3 обладает эквивалентной IgE-реактивностью с аллергеном вишни Pru av 3, благодаря существованию у обоих белков видоспецифических Т-клеточных эпитопов, по-видимому, характерных для nsLTPs семейства Rosaceae.

В недавнем исследовании были определены 2 потенциально доминантных Т-клеточных эпитопа Pru p 3. Анализ Т-клеточных эпитопов данного аллергена был проведён в группе итальянских пациентов с клиническими случаями аллергии к Pru p 3. Для этого из их мононуклеарных клеток периферической крови были получены олигоклональные Т-клеточные линии (TCL) специфически распознающие эпитопы Pru p 3, которые стимулировали различными вариантами перекрывающихся пептидов, в сумме составляющих полную аминокислотную последовательность Pru р 3. После этого были измерены пролиферативный индекс и уровень экспрессии цитокинов этих TCL.

Присутствие Pru p 3 стимулировало экспрессию олигоклональными TCL рецепторов CD4+, CD8+ и CD30+, а также продукцию IL-4 и INF-г. После стимуляции панелью из 8 перекрывающихся пептидов (каждый из которых состоял из 16-18 аминокислот), которые в сумме охватывали всю длину аминокислотной последовательности Pru p 3. Анализ пептид-специфического Т-клеточного ответа показал, что TCLs 80% пациентов распознавали Pru p 312-27, 60% из них отреагировали на Pru p 357-72 и несколько TCLs отреагировали на Pru p 365-80 [12].

Далее в соответствии с определённым профилем цитокинов определяли фенотип клеточных линий, активированных каждым из пептидов. Как известно, тип реактивности, характерный для аэроаллергенов и пищевых аллергенов, и предполагающий сенсибилизацию к ним - Th2-фенотип. Фенотипический и функциональный анализ воздействия Pru p 3 на специфические TCLs показал типичный Th2 тип иммунного ответа (фенотип 58,6% TCLs). Вместе с тем, среди TCLs обнаруживался также достаточно высокая доля популяций клеток с фенотипом Th0 (34,5%). При взаимодействии TCL с Pru p 312-27 производится значительно меньшее количество IL-4, чем при реакции TCL на Pru p 357-72 , в связи с чем, фенотип данной TCL классифицируется как Th0. Стимуляция Pru p 357-72 связана со значительной продукцией IL-4 Т-лимфоцитами, то есть Th2 фенотипом.

Частота Т-клеточных ответов на оба этих пептида позволяет предположить, что в пределах белка их последовательности представляют собой иммунодоминантные Т-клеточные эпитопы Pru p 3.

Согласно результатам двух недавно опубликованных исследований, Pru p 365-80 был определён в качестве основного Th2 иммуногенного пептида [13, 14].

В частности, было предположено существование общего Т-клеточного эпитопа с аллергеном Cor a 8 из таксономически отдалённого вида растения Corylus avellana. В тестировании эндолизосомальной деградации Cor a 8, наиболее ранний и непрерывно вырабатываемый кластер пептидов появляется в области С-концевого участка в пределах аминокислотных остатков 54-74 и 79-91. Последним появляется кластер, охватывающий область с 31 по 54 остаток. Пептидные кластеры не были обнаружены в N-концевой области Cor a 8. Наиболее значимый кластер Cor a 8 для активации T-клеток, представленный пептидами в пределах с 54 по 74 остаток, обнаруживает сходство последовательности с соответствующей областью Pru p 3, который содержит иммунодоминантный Т-клеточный эпитоп (61-75 а.о.). При сравнении связывания главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса II с пептидами данного кластера Cor a 8 - и Pru p 3, никаких различий в связывании пептидов к распространенным МНС класс II молекул было обнаружено. Идентификация Т-клеточных эпитопов для пищевых аллергенов, которые участвуют в перекрёстных реакциях с LTPs in vitro может помочь выяснить, какие эпитопы, участвуют в сенсибилизации, приводящей к иммунному ответу.

1.3.2 Мимотопное картирование аллергенов LTP

На сегодняшний день существует несколько методов для локализации на поверхности белковой глобулы B-клеточных конформационных эпитопов, при этом зачастую некоторые их них используются одновременно, дополняя информацию об исследуемых мотивах B-клеток. В случае LTPs, наиболее интересным является выявление эпитопов общих для пары или нескольких белков и обуславливающих их перекрёстную реактивность, а также выявление индивидуальных эпитопов, инициирующих сенсибилизацию только к одному LTP. Так, экспериментальные данные недавно проведённых исследований свидетельствуют о наличии помимо общих, также и индивидуальных эпитопов у Tri a 14 и Pru p 3. Сравнение данных эпитопов проводилось посредством трёх взаимодополняющих стратегий: анализа IgE-связывающей способности пентапептидов из перекрывающихся декапептидов, иммобилизованных на мембране; характеристики мимотопов с использованием библиотеки фагового дисплея 12-аминокислотных фрагментов LTP; анализа поверхностного электростатического потенциала, свойственного аллергенным LTP.

Рис. 2 - Мимотопное картирование Pru p 3 и Tri 14. A - Аминокислоты, включённые в состав мимотопов на ленточных моделях Pru p 3 (верхний ряд) и Tri 14 (нижний ряд) в водном растворе, показывающих боковые цепи остатков в области петли между спиралями 2 и 3 (сиреневый цвет) и - Б - аминокислотные остатки мимотопов на участке неструктурированной С-концевой петли (синим цветом). Поверхностные остатки электростатического потенциала отображается на поверхностью. C - электростатический потенциал изоповерхностей -1 (красным) и +1 (синим) в пространстве вне поверхности белка

Три IgE-связывающих региона Tri a 14 были определены при IgE-иммунодетекции синтетических декапептидов: Tri a 1431-40, Tri a 1451-60 и Tri a 1466-80. При сравнении с последовательными IgE-связывающими регионами Pru p 3, а именно Pru p 311-20, Pru p 331-40 и Pru p 371-91, описанными ранее [77], обнаруживается существенное перекрывание IgE-свяывающх эпитопов, показывают, наличие двух общих регионов, участвующих в связывании IgE (Tri 1431-40 / Pru p 331-40 и Tri 1466-80 / Pru p 371-91), которые потенциально участвуют в перекрестных реакциях между данными аллергенами. В противоположность этому, Tri a 1451-60 и Pru p 311-20 представляют собой индивидуальные регионы, что частично объясняет дифференцированную сенсибилизацию данными аллергенами, описанную у некоторых пациентов.

Картина, отражающая локализацию эпитопов была дополнена при идентификации мимотопных последовательностей в обоих nsLTPs методом фагового пептидного дисплея. Таким образом, олигпептид N36R39H35D43G74S40V75L77P78Y79T80 был идентифицирован как основной мимотоп Tri a 14, который получен путём объединения перекрывающихся линейных эпитопов Tri a 1431-40 и Tri a 1466-80, определеных методом пептидного сканирования. Подобным образом ранее был охарактеризован конформационный эпитоп Pru p 3, N36L37R39R44T40D43G74V75I77S76P78Y79, [78]. Остатки, содержащиеся в эпитопах Tri a 1451-60 и Pru p 311-20, не были определены при обогащении (биопэннинге) библиотеки фагового пептидного дисплея. Картирование мимотопов Tri a 14 - и Pru p 3 привело к обнаружению ключевых сайтов связывания IgE, которые могут быть вовлечены в перекрестные реакции: N36R39T/S40D43G74 S42V75I/L77P78 Y79. Эти основные остатки, расположенные в двух отдаленных районах аминокислотной последовательности, были локализованы на пространственных моделях, что привело к выявлению двух дифференцированных поверхностных регионов с различными электростатическими свойствами. Электростатические потенциалы (ЭП) сегментов цепей Tri a 1431-40/Pru p 331-45, проявляют аналогичную положительную заряженность на сопоставимых в пределах моделей поверхностях. Напротив, сегменты Tri a 1465-80/Pru p 371-80, обладают различными ЭП. Хотя данные фрагменты довольно похожи, Tri a 14 обнаруживают, в основном, отрицательные значения ЭП тогда как Pru p 3 - нейтральный, либо положительный потенциал поверхностных участков. Кроме того, эпитопы, участвующие в развитии пищевой аллергии, по-видимому, совпадают с теми, которые связаны с другим типом сенсибилизации - осуществляемой ингаляционными аллергенами через респираторный тракт [76]. Следовательно, мимотопы Pru p 3, определенные с использованием IgE сыворотки пациентов с «астмой пекаря» практически идентичны Tri a 14. Это открытие может иметь отношение к разработке новых гипоаллергенных мутантов для использования в альтернативных стратегиях иммунотерапии. Различие ЭП описываемых синтетических пептидов в конформационных регионах Tri 1451-60 и Pru p 311-20, участвующих в IgE-связывании, может объяснить специфическую сенсибилизацию к каждому из аллергенов в отдельности.

1.4 LTP растений в диагностике и иммунотерапии аллергии

1.4.1 Экстракты и рекомбинантные формы LTP

Экстракты аллергенов из природных источников, как правило, имеют многочисленные недостатки, которые не могут быть преодолены при помощи существующих технических средств. Аллергенные экстракты содержат неопределенное количество балластных примесей, из которых некоторые обладают способностью инициировать Th2-зависимый иммунный ответ. Нередко мажорный аллерген может присутствовать лишь в небольших количествах, и его биологическая активность может характеризоваться сильной изменчивостью под влиянием побочных компонентов экстракта. В отличие от этого, искусственно синтезируемые аллергены могут быть получены с высокой степенью чистоты в виде генно-инженерно-модифицированных молекул с известными иммунологическими и биологическими характеристиками [80].

Выделение клонов кДНК кодирующих nsLTP аллергены и получение их рекомбинантных форм в гетерологичных системах экспрессии позволило использовать их в качестве аллергенных компонентов, моделирующих реакции их природных аналогов в аллергодиагностике in vitro [121]. На сегодняшний день в диагностических тестах уже используется 10 рекомбинантных форм липид-транспортирующих белков (rLTPs) из различных источников растительной пищи и пыльцы. К препаратам rLTPs, полученным с использованием прокариотической белок-синтезирующей системы Escherichia coli, относятся: rPar J 1, rPru av 3, rHev b 12, rCor a 8 и rLyc e 3. В эукариотической системе гетерологичной экспрессии Pichia pastoris были синтезированы rAmb 6, rPru p 3, rMal d 3, rCit s 3 и rFra 3. Доскональная проверка иммунологической эквивалентности соответствующему природному аналогу была выполнена для rPru p 3. Было проведено сравнение конформации и IgE-связывающей активности природного и рекомбинантного варианта Pru p 3, которое позволяет подтвердить их эквивалентность.

При диагностике аллергии, связанной с употреблением пива, в состав которого могут входить такие аллерген-содержащие компоненты, как рис, ячмень, кукуруза и пшеничный солод, учитывается тот факт что все растительные ингредиенты подвергаются процессам ферментации, температурной обработки, пастеризации, фильтрации и хранения, в следствие чего сохранение аллергенного потенциала сохраняется только у чрезвычайно устойчивых к данному физическому воздействию белков.

1.4.2 Спектр LTP, используемых в диагностических панелях аллергенов

Для северной части Европы характерны аллергические симптомы на фрукты и овощи, в частности такие аллергены как LTPs могут вызывать достаточно легко протекающие местные реакции полости рта или горла - оральный аллергический синдром, в то время как у пациентов в южной Европе чаще имеют место системные реакции, в частности анафилаксия. Объяснение этому отличию - географическое распределение профилей сенсибилизации. Статистический анализ многочисленных проведённых тестов показывает, что, в северной части Европы доминирует Bet v 1-сенсибилизация, вызванная основным аллергеном пыльцы березы. В южной части, наоборот, в диагностических тестах доминируют антитела к LTP, что указывает на преобладание в данном регионе истинной пищевой аллергии [90]. Поскольку для пациентов с поллинозом характерны сезонные проявления симптомов аллергии, то наиболее приемлемым является профилактика и лечение аллергии в сезон цветения растительного источника аллергена, предотвращение развития аллергии на растительную пищу имеет важное значение для пациентов с сенсибилизацией к LTP независимо от возможности экстракции аллергенного компонента из природного источника, то есть круглогодично [91]. Поэтому основные инструменты, для диагностирования LTP-опосредованной аллергии - одно-компонентные тест-системы с рекомбинантными аллергенами (представлены в таблице 1).

Таблица 1

nsLTPs являются одними из основных компонентов аллергодиагностических панелей, а профили их сенсибилизации имеют географические различия. В связи с этим, необходима разработка уникальных композиций LTPs для аллергологических панелей того или иного региона.

1.4.3 Механизм аллерген-специфической иммунотерапии

В соответствии с современными представлениями, ASIT имеет два различных, возможно, последовательных, механизма действия: стимулирует генерацию Т-регуляторных клеток (Treg) и переключает иммунный ответ с Тh2 на Тh1. Описано, что в условиях проведения аллерген-специфической иммунотерапии, основным источником IL-10 после повторной стимуляции аэроаллергеном является пролиферация субпопуляции аллерген-специфических Treg клеток, секретирующих IL-10 и трансформирующий фактор роста (TGF-в), вызывающих cупрессию как Тh2, так и Тh1. Treg регулируют силу иммунного ответа через влияние на функции Т-эффекторных клеток (Т-хелперов и Т-цитотоксических клеток). Эти клетки экспрессируют фактор FoxP3, контролирующий транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвующих в супрессии иммунного ответа. Тreg клетки выделяют цитокины: TGF-в, IL-10, IFN-г, IL-35, а также экспрессируют на своей поверхности рецептор CTLA-4. Мишенями действия Тreg клеток являются как Т-эффекторные клетки, так и дендритные клетки, презентирующие антиген и активирующие Т-клетки [16].

Было обнаружено, что у пациентов с аллергией на персик, взаимодействие Pru p 3 с дендритными клетками, повышает уровень продукции IL-10 и TNF-б (Tumor Necrosis Factor-б - фактор некроза опухоли б), стимулирующих активацию и созревание дендритных, которые, в свою очередь, презентируют эпитопы Pru p 3 процессированные в комплексе с IgE T-клеткам, что приводит к активации и пролиферации специфических Тh2, секретирующих провоспалительные цитокины. В то же время, у Pru p 3-толерантных индивидов, наблюдается преобладание Th0/Th1 цитокинового профиля [17].

Механизм ASIT заключается в следующем IL-2 при помощи CD25 -- рецептора Treg к IL-2 и секвестрация рецептора у эффекторных Т-клеток, что препятствует активации после связывания комплекса MHC с антигеном, так как известно, что IL-2 является основным аутокринным стимулирующим фактором, поддерживающим дифференцировку и клональную экспансию Т-клеток. Тreg клетки, взаимодействуя с рецептором CD86 на дендритных клетках при помощи CTLA-4, способны ингибировать функцию активации дендритными клетками Т-клеток [79]. В ряде исследований подтверждена важная роль в механизме ASIT специфических IgG1, IgG4, IgA, которым отводится роль блокирующих антител. В процессе ASIT возможно образование антиизотипических антител, т. е. анти-IgЕ-антител. Переключение Th2-ответа на Th1-ответ приводит к переключению с IgE-иммунного ответа на IgG-ответ или формированию Т-клеточной толерантности.

Ранние эффекты ASIT связаны с десенситизацией тучных клеток и базофилов и снижением их способности к выбросу медиаторов, затем уменьшается их содержание в тканях. Промежуточный эффект ASIT связан с иммунологическими механизмами Т-клеточной пролиферации, индукцией Тreg, секрецией IL-10 и TGF-в, супрессией Тh2-клеток и их цитокинов, и уменьшением количества Т-клеток в поздней фазе аллергической реакции. В клинических условиях, данный эффект установлен, как для подкожной, так и для сублингвальной версии иммунотерапии [95]. Последними включаются механизмы, связанные с В-клетками (начальное увеличение и последующее уменьшение продукции аллерген-специфических IgE) и эффекторными клетками воспаления. Угнетение накопления клеток воспаления (эозинофилов, нейтрофилов, базофилов, моноцитов), в свою очередь, приводит к уменьшению накопления в тканях медиаторов воспаления, высвобождаемых из этих клеток, уменьшению секреции хемотаксических посредников, инициирующих позднюю фазу аллергического воспаления и неспецифическую тканевую реактивность [95].

Совсем недавно были проведены рандомизированные двойные-слепые плацебо-контролируемые исследования активности экстракта Pru p 3 на 56 пациентах. Сублингвальная терапия в течение 6 месяцев показала повышение толерантности к Pru p 3 от трёх до девяти раз длительнее, чем при фармакотерапии.

Европейский мультицентровый консорциум легализовал сублингвальную иммунотерапию рекомбинантными гипоаллергенными LTP из видов растений семейтва Rosacea (абрикос, слива, вишня, яблоня) [92].

белок растение клетка вакцинация

1.4.4 Создание гипоаллергенных и иммуногенных аналогов LTP и перспективы вакцинации

Сущность аллерген-специфической иммунотерапии в настоящее время состоит в последовательном введение увеличивающейся дозы экстракта аллергена. Однако из-за неблагоприятного соотношения риск / польза данного подхода, ASIT не используется для лечения пищевой аллергии [107].

Аллергены в нативной конформации несут на своей поверхности весь набор IgE-эпитопов, в связи с чем, обладают полным аллергенным потенциалом и могут вызывать аллергические симптомы, стимулируя высвобождение медиаторов воспаления из тучных клеток и базофилов. Химически-модифицированные экстракты аллергенов (аллергоиды) и гипоаллергенные белки со сниженной IgE-связывающей способностью, рассматриваются в качестве вакцин нового поколения с уменьшенной вероятностью побочных реакций во время проведения ASIT, что позволяет применять увеличенные дозы аллергена, по сравнению c вакцинами на основе экстрактов нативных аллергенов [108,109].

Рекомбинантные аллергены могут быть получены в трёх основных вариациях: в виде молекул, точно имитирующих свойства природных аллергенов (т.е. рекомбинантные аллергены дикого типа), в виде модифицированных вариантов с улучшенными свойствами, такими как снижение аллергенной активности или повышение иммуногенности или в виде гибридных молекул, напоминающих эпитопы нескольких различных аллергенов [110,111]. Хотя, на данный момент, ни один рекомбинантный аллерген или его гипоаллергенный аналог не получил разрешение на коммерциализацию и введение в широкую медицинскую практику, разработка новых вакцинных препаратов с ограниченным IgE-связывающим потенциалом в настоящее время является предметом доклинических и клинических исследований [93].

На основе клонов кДНК аллергенов также возможно создание гипоаллергенных мутантных nsLTPs для потенциального применения в аллерген-специфической иммунотерапии. Гипоаллергенные изоформы и варианты могут быть получены путем разрушения конформационных IgE-связывающих эпитопов, либо посредством химической модификации или генной инженерии [97,98,99]. Иммуногенность достигается за счёт сохранения на поверхности аллергена всех необходимых детерминант для индукции и поддержания Т-клеток [100,101]. В соответствии с этим, модифицированный вариант основного аллергена берзёы Bet 1 - его денатурированная форма обладала сниженным аллергенным потенциалом, в то время как реактивность Т-клеточных линий человека и иммуногенность у мышей сохранялись [102]. Дальнейшие генетические модификации могут включать: генерацию олигомеров, гибридных аллергенов, перекомбинацию генов, фрагментацию аллергена и одну / несколько точечных мутаций [103]. Чаще всего осуществляется сайт-направленный мутагенез аминокислотных остатков критически ответственных за связывание IgE. Целью такого подхода является снижение реактивности IgE, без влияния на Т-клеточный ответ. Для трёх эпитопов Pru p 3, охватывающих остатки 11-25, 31-45, и 71-80 аминокислотной цепи, были обнаружены, схожие структурные мотивы с гевеином латекса Hev B 12 (остатки 2 -23, 27 -46 и 62-84). Кроме того, пространственное моделирование Pru p 3 позволило определить позиции критически важных для связывания IgE аминокислотных остатков R39, T40 и R44 в конце второго эпитопа (Pru p 331-45) данного аллергена. На основании этой информации был получен тройной мутант R39A/T40A/R44A. Этот потенциально гипоаллергенный вариант Pru p 3 показал 5-кратное уменьшение IgE-связывающей активности по сравнению с рекомбинантным Pru р 3, но обладал при этом более низкой биологической активностью.