Размещено на http://www.allbest.ru/

Распределение рецепторов гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в головном мозге при эпилепсии

Реферат

мозг рецептор ксф

Целью исследования явилось изучение локализации рецептора гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в разных зонах головного мозга крысы линии Крушинского - Молодкиной.

Поставленная цель обусловлена тем, что несмотря на то, что в исследованиях нескольких зарубежных и российских авторов локализация рецепторов к Г-КСФ была определена, определение места локализации рецепторов проводилось лишь на уровне идентификации клеток, количественная и качественная оценка не проводилась.

До настоящего времени недостаточно детально исследовано точное распределение рецепторов в пределах поверхности клетки.

Большинство исследований, целью которых было определение точной локализации рецепторов на клетках головного мозга, проводились на фоне наличия какой-либо патологии.

При этом нет точной информации о том, является ли наличие рецепторов к Г-КСФ нормой, либо же отмечается только при патологии.

В рамках исследования выявлено, что у крыс линии КМ количество клеток в головном мозге несущих на своей поверхности рецептор ГКСФ значительно выше чем у контрольной группы крыс - Wistar.

Наибольшее различие крыс линии КМ от линии Wistar наблюдается по чувствительным к Г-КСФ структурам в головном мозге, у крыс линии КМ количество положительно окрашенных (чувствительных к Г-КСФ) клеток в целом больше. При этом присутствуют зоны, такие как моторная кора и обонятельные луковицы, где повышение более существенно по отношению к базовому уровню.

Прикладное значение результатов исследования состоит в том, что на основе выявленных особенностей локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы в норме и патологии, в дальнейшем возможна разработка фармацевтических препаратов для лечения и купирования эпилепсии и расстройств эпилептоидного типа, а также онкологических заболеваний (при купировании негативных последствий химиотерапии).

В рамках работы проведен анализ и систематизация теоретических исследований в области локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге, выявлены места локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы.

В исследовании особенностей локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы в норме и патологии на основе распределения CD 114 позитивных клеток, что позволит уточнить возможные очаги локализации рецепторов и в мозге человека.

Обозначения и сокращения

АЭ - аудиогенная эпилепсия.

ГАМК - г-Аминомасляная кислота

Г-КСФ - Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (сокращение в отечественных и зарубежных исследования соответственно).

ГМ-ГФС - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор.

КСФ - колониестимулирующие факторы.

МСК - мезенхимальные стволовые клетки.

КМ - Кушинского-Молодкиной (линия лабораторных животных).

рГ-КСФ - рекомбинантный Г-КСФ.

ЦНС - центральная нервная система.

TBS - Triangle Biomedical Sciences.

MI - первичная моторная кора.

М2 - моторная кора.

SI - соматосенсорная область.

CorA - миндалевидное тело лимбическая система -- Corpus amygdaloideum

PB - Базально-латеральная часть -- pars basolateralis

Co - Корково-медиальная (обонятельная) часть -- pars conticomedialis (olfacorius)

Hp - Гиппокамп аммонов рог -- Hippocampus

GD - зубчатая извилина -- Gyrus dentatus

Sc - Основание гиппокампа -- Subiculum

Nb - Базальные ганглии -- Nuclei basales

CS - полосатое тело -- Corpus striatum

NC - хвостатое ядро -- Nucleus caudatus

Cer - большой мозг -- Cerebrum

Rhi - обонятельный мозг -- Rhinencephalon

Bo - обонятельная луковица -- Bulbus olfacrorius

SP - переднее продырявленное вещество -- Substantia perforata

To - обонятельный тракт -- Tractus olfactorius

Vl - Боковой желудочек -- Ventriculus lateralis

LB - Лобная доля -- Lobus frontalis

GP - Прецентральная извилина -- gyrus precentralis

Gfs Верхняя лобная извилина -- Gyrus frontalis superior

Gfm - Средняя лобная извилина -- Gyrus frontalis medius

Gfi -Нижняя лобная извилина -- Gyrus frontalis inferior

LP - Теменная доля -- Lobus parietalis

Pre - Предклинье -- Precuneus

LO - затылочная доля -- Lobus occipitalis

LT - височная доля -- Lobus temporalis

Gts - верхняя височная извилина -- Gyrus temporalis superior

Ld - Островковая доля -- Lobus insularis

Epi - надбугорье -- Epithalamus

Corp - шишковидное тело -- Corpus pineale (glandula pinealis)

Hyp - гипофиз -- Hypophysis

NH - нейрогипофиз -- Neurohypophysis

MC - Mesencephalon (средний мозг)

Rho - Rhombencephalon (ромбовидный мозг)

Cer - мозжечок -- Cerebellum

Введение

Колониестимулирующие факторы относятся к семейству цитокинов, а основная функция их состоит в том, что они осуществляют связь между иммунной, нервной, эндокринной, кроветворной и другими системами организма и служат для их вовлечения в организацию и регуляцию единой защитной реакции. Например, при развитии системной воспалительной реакции цитокины воздействуют практически на все органы и системы организма, участвующие в регуляции гомеостаза, сказываясь, в том числе, и на поведенческих реакциях.

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (далее - Г-КСФ; Г-КСФ) - природный фактор роста, который специфически воздействует на гемопоэтические клетки - предшественники нейтрофильного ростка и регулирует некоторые функции зрелых нейтрофилов, включая хемотаксис, миграцию и образование супероксида[Дыгай А.М., Жданов В.В. 2010].

Г-КСФ обладает рядом свойств, которые позволяют использовать его в терапии ряда заболеваний головного мозга, в том числе ишемических нарушений, нейродегенеративных заболеваний. Реализация данного эффекта возможна в первую очередь благодаря возможности Г-КСФ проявлять свои свойства в тех или иных отделах головного мозга, что обеспечивается наличием специфических рецепторов.

В ряде независимых исследований было показано, что рецепторы Г-КСФ могут находится не только в мозжечке (клетки Пуркинье), но и в других структурах и участках головного мозга, в частности, в субвентрикулярной зоне и гранулированной зубчатой фасции гиппокампа, в обонятельных луковицах (митральные клетки), тегментальной области среднего мозга, в лобной доле коры больших полушарий, энторинальной коре, в коре заднего и промежуточного мозга, таламусе, а также в стволе головного мозга.

Существуют данные, что рецептор Г-КСФ присутствует также и на мембранах эндотелиальных клеток, пирамидальных нейронов, глиальных клеток, астроцитах, эпендимальных клеток, но при этом конкретные зоны мозга не указываются.

Несмотря на то, что в исследованиях нескольких зарубежных и российских авторов локализация рецепторов к Г-КСФ была определена, однако установление места локализации рецепторов проводилось лишь на уровне идентификации клеток, количественная и качественная оценка не проводилась. До настоящего времени недостаточно детально исследовано точное распределение рецепторов в пределах поверхности клетки. Большинство исследований, целью которых было определение точной локализации рецепторов на клетках головного мозга, проводились на фоне наличия какой-либо патологии. При этом нет точной информации о том, является ли наличие рецепторов к Г-КСФ нормой, либо же отмечается только при патологии.

На основании степени разработанности темы, цель работы - изучить локализацию рецептора к гранулоцитарного колониестимулирующего фактора в разных зонах головного мозга крысы линии Крушинского - Молодкиной.

Для реализации поставленной цели необходимо решить несколько задач:

1) Провести анализ и систематизацию данных исследований российских и зарубежных авторов, в которых установлены места локализации рецепторов к Г-КСФ (теоретическая часть).

2) Изготовить препараты разных зон головного мозга крыс линии Wistar и крыс линии Крушинского-Молодкиной, провести иммуногистохимическое окрашивание рецепторов к Г-КСФ.

3) Определить локализацию CD 114 позитивных клеток по атласу головного мозга крыс.

4) Дать сравнительную характеристику распределения CD 114 позитивных клеток в головном мозге крысы Крушинского-Молодкиной.

Объект исследования в работе - места локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы.

Предмет исследования - особенности локализации и распределения рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы в норме и патологии.

Теоретическая значимость исследования состоит в том, что в рамках работы проведен анализ и систематизация теоретических исследований в области локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге, выявлены места локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы.

Практическая значимость исследования состоит в том, что на основе выявленных в рамках исследования особенностей локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы в норме и патологии, в дальнейшем возможна разработка фармацевтических препаратов для лечения и купирования эпилепсии и расстройств эпилептоидного типа, а также онкологических заболеваний (при купировании негативных последствий химиотерапии).

Новизна исследования состоит в том, что в работе особенностей локализации рецепторов к Г-КСФ в головном мозге крысы в норме и патологии на основе распределения CD 114 позитивных клеток, что позволит уточнить возможные очаги локализации рецепторов и в мозге человека.

Структура работы включает в себя введение, основную часть, заключение, список использованной литературы.

1. Обзор литературы

1.1 История открытия Г-КСФ

В середине 1960-х годов исследователи Bradley и Metcalfe (Melbourne, Australia), и Ichikawa, Putznik и Sachs (Rehobot, Israel), проводя независимо друг от друга исследования, обнаружили вещество, в дальнейшем получившее название колониестимулирующий фактор (КСФ)[ Bradley TR, Metcalf D. 1966; Ichikawa Y, Pluznk DH, Sachs L. 1966].

В процессе проводимых в Мельбурне исследований, ученые предпринимали попытки получить лимфоидные лейкозные клетки мыши путем внесения их на питательную среду (агар агар) с содержанием культур клеток костного мозга [Metcalf D. 1990]. В результате того, что в качестве компонента питательной среды были использованы именно клетки костного мозга, ученым удалось выявить следующую закономерность: колонии клеток костного мозга начинали расти, стимулируемые, вероятно, определенным веществом, которое диффундировало из нанесенного на них слоя лейкозных клеток. На основе проведенных наблюдений были сделаны выводы о том, что рост и дифференцировка определенных тканей и клеточных линий могут быть стимулированы колониями гранулоцитов и макрофагов, выделяющими особый фактор. Этому фактору было дано название «Колониестимулирующий фактор» (КСФ).

Параллельно в Израиле Sachs, Ichikawa и Putznik проводили исследования регуляции клональной дифференцировки клеток крови. Изначально в исследовании использовалась жидкая среда, но в дальнейшем, исследуемый материал был перенесен на полутвердую среду, содержащую агар, для облегчения дальнейшей дифференцировки и выделения отдельных клонов клеток[Ichikawa Y, Pluznk DH, Sachs L. 1966]. Результаты их исследований были идентичны с результатами, полученными учеными Мельбурнской группы, но в отличие от последних, Sachs и соавторы в качестве питательной среды использовали эмбриональные клетки мыши. Они обнаружили, что фактор, содержащийся в супернатанте жидких культур других типов клеток способен стимулировать дифференцировку эритробластических островков. Они назвали данный фактор «Mashran-gm». Название происходит от иврита «посылать вперед», а также сокращений: гранулоциты (g) и макрофаги(m)[ Sachs L. 1990].

Следующие двадцать лет многие ученые выделяли и исследовали КСФ в попытках понять его физиологическую роль. Ввиду того, что в исследуемых тканях и биологических жидкостях содержание колониестимулирующего фактора было невелико, перед исследователями вставали определенные трудности. Вывод о том, что уровень КСФ повышался при инфекциях и после введения эндотоксина и изменялся обратно пропорционально уровню нейтрофилов, свидетельствует о том, что в регулировании выработки и работы нейтрофилов, КСФ играет ведущую роль [Foster R, Metcalf D, Robinson WA, Bradley TR. 1968; Metcalf D, Stanley ER. 1969; Dale DC, Brown CH, Carbone P, Wolff S.M. 1971; Metcalf D. 1987].

В современном представлении, колониестимулирующие факторы (КСФ) - это представители группы цитокинов, осуществляющие регуляцию деления, дифференцировки костно-мозговых стволовых клеток и предшественников клеток крови, а также способные стимулировать дифференцировку и функциональную активность некоторых клеток вне костного мозга[Гомазков О.А. 2006].

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор - основной гемопоэтический фактор роста, регулирующий гранулоцитопоэз, и широко используемый сегодня в медицине при лечении нейтропений различной этиологии. Физиологическое действие Г-КСФ опосредовано клеточным рецептором (Г-КСФР), который высокоспецифичен и формирует активные гомоолигомерные комплексы после связывания с лигандом.

Учитывая физиологическое действие гранулоцитарный колониестимулирующий фактор является основным гемопоэтическим фактором роста, обеспечивающим пролиферацию, дифференцировку и созревание миелоидных предшественников нейтрофильных гранулоцитов и стимулирующим различные функции созревших нейтрофилов, что позволяет увеличить продолжительность жизни последних. Исходя из этого, Г-КСФ играет важную роль в регуляции гранулоцитопоэза как в состоянии нормы, так и в условиях патологии, при его экстренной активации, например, при инфекционных заболеваниях [Avalos ea 1996, Welte ea 1996].

Прикладное значение исследования Г-КСФ и рецепторов к нему, безусловно, очень велико. Так, например, получение рекомбинантного Г-КСФ (рГ-КСФ) человека позволило создать на его основе новые эффективные терапевтические средства.

Сегодня рГ-КСФ находит обширное применение при целом ряде заболеваний, сопровождающихся инфекционными осложнениями и/или миелосупрессией, например при химио- и радиотерапии онкологических заболеваний, остром миелолейкозе, СПИДе различной иэтиологии, тяжелой хронической нейтропении, апластической анемии, миелодиспластическом синдроме, а также при трансплантации костного мозга [Welte ea 1996 ].

Физиологическое действие Г-КСФ опосредовано его взаимодействием с высокоспецифическим рецептором, экспрессируемым на поверхности нейтрофилов, их предшественников и отдельных видов лейкозных клеток [Avalos ea 1996 ], и гомоолигомеризацией рецептора [ Hiraoka ea 1994 , Horan ea 1997 , Horan ea 1996 ].

На современном этапе достигнуты существенные успехи в выяснении механизма взаимодействия Г-КСФ с рецептором, структуры лигандрецепторного комплекса и молекулярной организации рецептора.

1.2 Основные характеристики и классификация КСФ

Колониестимулирующие факторы представляют собой вещества полипептидной природы (низкомолекулярные белки), продуцируемые клетками иммунной системы, в состав которых вариабельно может входить более 100 аминокислотных остатков. Колониестимулирующие факторы функционально необходимы для осуществления обмена информационными сигналами между клетками иммунной системы и клетками других органов и тканей и функционируют в виде системы взаимосвязанных медиаторов [Волкова М.А. 1998].

К концу 1970-х годов было выделено несколько типов КСФ. Вещество, первоначально обнаруженное в пробе мочи человека, классифицировалось как гликопротеин [Stanley ER, Hansen G, Woodcock J, Metcalf D. 1975].

Аналогичное вещество было обнаружено в супернатанте клеточной линии фибробластов мыши [Stanley ER, Heard PM. 1977]. Свойством данного вещества было стимулирование роста и дифференцировки моноцитов и макрофагов, за что он получил название «Колониестимулирующий фактор» (КФС).

Из легочной ткани мышей, которым вводили эндотоксин, был выделен второй фактор, стимулирующий образование колоний макрофагов и гранулоцитов. Данный фактор был назван гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГM-ГФС) [Burgess AW, Camakaris J, Metcalf D. 1977].

Третий фактор был обнаружен в сыворотке крови мышей, которым был введен эндотоксин. Однако ввиду того, что он не был нейтрализован антителами ни к M-КСФ, ни к ГМ-КСФ и стимулировал образование и рост колоний, содержащих преимущественно нейтрофилы - он получил название «гранулоцитарный колониестимулирующий фактор» (Г-КСФ) [Cutler RL, Metcalf D, Nicola NA, Johnson GR. 1985].

В таблице 1.1 приводится характеристика наиболее значимых представителей группы цитокинов.

Таблица 1.1 - Классификация и характеристики колониестимулирующих факторов

Цитокины	Клетки - продуценты	Клетки - мишени	Рецептор	Биологические эффекты
Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, GM-CSF	Т-лимфоциты, моноциты, фибробласты, клетки эндотелия	Макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, Т-клетки, дендритные клетки, гемопоэтические клетки.	GM- CSF R б/в	Способствует росту и дифференцировке полипотентных гемопоэтических клеток-предшественников; стимулирует физиологическую активность нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов и макрофагов; поддерживает содержание сурфактанта
Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, G- CSF	Моноциты, фибробласты, клетки эндотелия	Нейтрофилы, эозинофилы, Т-клетки, гемопоэтические клетки	G- CSF R (1 цепь)	Увеличивает продукцию нейтрофилов; ускоряет созревание и дифференцировку предшественников нейтрофилов; усиливает физиологическую активацию зрелых нейтрофилов
Макрофагальный колониестимулирующий фактор, M-КСФ, КСФ-1	Моноциты, фибробласты, клетки эндотелия	Макрофаги, гемопоэтические клетки	c-Fms	Модулирует физиологическую активность моноцитов и макрофагов; стимулирует моноцитопоэз

Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор человека (Г-КСФ) является О-гликозилированным 19,6 кДа гликопротеином, биологически активным в мономерной форме, и состоит из 207 аминокислот. Для биологической активности Г-КСФ не требуется сахарная часть. Рецептор Г-КСФ - CD114, мембранный белок типа I, из 836 аминокислот [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. 2011].

Механизм гемостимулирующего действия Г-КСФ основан на прямой активации пролиферации и дифференцировки клеток нейтрофильного ряда. Однако сегодня в исследованиях не представлено сведений, которые позволили бы сделать однозначный вывод о том, как именно сбалансированы факторы. Кроме того, неизвестны возможности опосредованного действия гемопоэтина на элементы системы кроветворения, несмотря на большое количество работ, посвященных его влиянию на иммунокомпетентные клетки.

Повышение числа мигрирующих из костного мозга в ответ на введение препарата Г-КСФ циркулирующих лимфоцитов, моноцитов и эритроцитов имеет кратковременный эффект. Однако длительности эффекта достаточно для воздействия на клетки-мишени в организме. Специфические биологические свойства фактора послужили основанием для клинического применения его в качестве корректора нейтропении разного генеза.

Указанное действие Г-КСФ обусловило его прикладное применение в медицине. Так, например, особенно широко в клинической практике при лечении больных онкологическими заболеваниями методами химиотерапии, применяются два фактора, стимулирующие образование нейтрофилов (угнетаемых препаратами химиотерапии), - ГМ-КСФ и Г-КСФ.

При этом, оптимальные схемы их применения в клинической практике на данный момент не разработаны, исследования в данной области продолжаются. Американское общество по клинической онкологии и Европейская согласительная конференция собирали специальные экспертные комиссии для анализа клинических данных и выработки указаний (протоколов лечении) по клиническому применению препаратов Г-КСФ.

За счет того, что Г-КСФ стимулирует пролиферацию и дифференцировку поздних клеток-предшественников в нейтрофилы, при использовании его рекомбинантных препаратов (ленограстима, филграстима) удается сократить длительность нейтропении, вызванной цитостатиками.

Связывание Г-КСФ с рецептором и гомоолигомеризация рецептора - это ключевые процессы в образовании активного комплекса in vivo и передаче сигнала с поверхности клетки в ядро. Учитывая это, исследование сайтов и особенностей взаимодействия Г-КСФ и его рецептора имеет важное значение для понимания механизма действия Г-КСФ, и конструирования на его основе белков с измененными свойствами.

Указанные исследования дали толчок целому ряду прикладных разработок препаратов на основе Г-КСФ.

Интересно, что, согласно ряду исследований, препараты Г-КСФ переносятся легче, чем препараты ГМ-КСФ[Carobrez A.P., Bertoglio L.J. 2005], что обуславливает актуальность анализа возможности и потенциала использования препаратов на основе Г-КСФ.

1.3 Препараты на основе Г-КСФ

В США в 1991 году был разработан и разрешен для клинического применения первый препарат Г-КСФ «Филграстим». Активность действующего вещества была практически идентична природному Г-КСФ, а период полувыведения составлял 3,5-4 часов [Souza L.M., Boone T.C.,Gabrilove J.et al. 1986].

Применение в клинической практике Филграстима показало, что времени полувыведения для эффективного действия препарата недостаточно. Это привело к необходимости увеличения активности действующего вещества и времени его циркуляции в организме.

В 1993 году в Европе и Японии был зарегистрирован новый препарат на основе Г-КСФ - «Ленограстим». По сравнению с Филграстимом, Ленограстим был в большей степени идентичен природному Г-КСФ, а время нахождения его в организме было увеличено до 24-х часов [Heuser M.,Ganser A. 2005].

Дальнейшие разработки были направлены на увеличения периода нахождения препарата в организме, и в 2002 году было одобрено введение в клиническую практику нового препарата «Пегфилграстим». Он был создан путем присоединения к филграстиму полиэтиленгликоля, конъюгация с которым увеличила время циркуляции препарата в плазме крови до 42-х часов [Lord B.I.,Woolford L.B.,Molineux G. 2001; Molineux G. 2003; Khoury H.J.,Loberiza F.R. Jr,Ringden O. et. al. 2006].

Лекарственные препараты на основе гемопоэтических ростовых факторов начали применять в онкологии и гематологии. В частности, Г-КСФ традиционно используют для восстановления количества нейтрофилов после химиотерапии или трансплантации костного мозга [Khoury H.J.,Loberiza F.R. Jr,Ringden O. et. al. 2006; Khoury H.J.,Loberiza F.R. Jr,Ringden O. 2006; Lofts F.J.,Pettengell R. 1998; Metcalf D. 2008]. Кроме того, его препараты применяются в качестве средств вторичной профилактики нейтропении и для предупреждения инфекций [Annemans L., Van Overbeke N.,StandaertB.,Van Belle S. 2005; Du X.L.,Lairson D.R., Begley C.E., Fang S. 2005]. В дополнение к этому Г-КСФ также обладает свойствами модулирующих цитокинов реакции воспаления [Bozar M.,Aslan B.,Kalaci A. et. al. 2005].

1.4 Клинические эффекты

При анализе клинических эффектов Г-КСФ стоит обратить внимание на ряд патологических состояний, при которых препарат на его основе применяется наиболее часто в медицинской практике.

Цитостатическая болезнь является одной из причин расстройства центральной гемодинамики и микроциркуляции. Она развивается на фоне применения цитостатиков в терапии различного рода патологий, в первую очередь онкологических заболеваний [Скрыпник К. А., Косоруков В. С. 2011; Кононенко И. Б., Манзюк Л. В., Снеговой А. В., Сельчук В. Ю. 2013; Garcнa-Carbonero R, Mayordomo JI, et al. 2011].

Негативным последствием воздействия цитостатиков, содержащихся в большинстве препаратов для химиотерапии, является снижение синтеза элементов системы крови. Они нарушают последовательность биохимических процессов на уровне считывания ДНК, угнетая такие ферменты как: дигидрофолатредуктазу (которая участвует в восстановлении тетрагидрофолиевой кислоты, необходимой для синтеза пуриновых и пиримидиновых оснований - участников процессов транскрипции и трансляции), глутамин-5 фосфорибозилпирофосфатаминотрансферазу (через гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу - угнетает синтез пуриновых оснований).

Воздействуя таким образом на гемопоэтические островки костного мозга (эритроцитарный, гранулоцитарный, лимфоцитарный, моноцитарный и мегакариоцитарный), они снижают синтез элементов системы крови. Одним из результатов данных нарушений является тромбоциитопения и нарушение гемостатического потенциала крови (через снижение тромбопластина, фактора виллебранда и других), что в конечном итоге ведет к развитию геморрагического синдрома.

Одним из крайних проявлений геморрагического синдрома является геморрагический инсульт, поскольку также нарушается питание и самих сосудов[Chikahiko Sakamoto, Kenichi Suzuki, FumihikoHato, Mika Akahori, Taro Hasegawa, Masayuki Hino, Seiichi Kitagawa 2003; Rainer K., Nils H., Christian U., and Stefan S. 2010].

Применение при химиотерапии препаратов Г-КСФ эффективно ввиду того, что он стимулирует экспрессию клеток костного мозга и снижает вероятность негативных последствий, вызванных снижением элементов системы крови. Введение Г-КСФ приводит к активации пролиферации гранулоцитарных предшественников, которая осуществляется как путем непосредственного воздействия на кроветворные элементы, так и через неадгезирующие клетки кроветворного микроокружения за счет повышения продукции последними гемопоэтических ростовых факторов.

При введении препаратов на основе Г-КСФ скорость восстановления гранцулоцитопоэза увеличивается. Ускорение процессов дифференцировки родоначальных элементов гранулоцитарного ростка обусловлено, в свою очередь, активацией формирования гемопоэтических островков гранулоцитарного типа, вследствие увеличения содержания в костном мозге предшественников стромальных механоцитов. Введение препарата Г-КСФ приводит к увеличению числа мигрирующих из костного мозга лимфоцитов, моноцитов и эритроцитов. Хотя этот эффект кратковременный, его длительности достаточно для воздействия на клетки-мишени в организме[Галоян А.А. 2004; Егоров В.В., Иванов А.А., Пальцев М.А. 2003; Козлов В.А., Труфакин В.А., Карпов Р.С. 2004].

Помимо коррекции дефицита тех или иных фракций клеток крови, Г-КСФ также обладает свойствами нейропротектора. Он способен останавливать процессы апоптоза в различных клетках, в том числе и в нейронах. Дегенерация нервной ткани - одна из центральных проблем в неврологии, ведь программируемая смерть нейрона - ключевое звено подавляющего большинства неврологических заболеваний, в том числе и нейродегенеративных. Инициатором апоптоза нервной ткани в большинстве случаев является нарушение КОС, развивающееся при различных состояниях от анемии до гипоксемии. Реализуемый в большинстве случаев митохондриальный сигнальный путь апоптоза включает в себя цепь реакций, которые начинаются с апоптотических Bcl-2-белков -- Bax и Bak. Они встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются, увеличивая ее проницаемость, благодаря чему в цитозоль клетки в большом количестве выходят белки апоптоза: цитохром с, каспазы ?2, ?3 и ?9 и белок AIF, которые запускают апоптоз. Г-КСФ вмешивается в механизмы увеличения проницаемости мембраны митохондрий, фосфорилируя белки Bax и Bak. Это приводит к тому, что проницаемость мембраны снижается, и апоптоз не запускается. Также Г-КСФ способен инактивировать один из важных элементов апоптоза - Каспазу - 3. Эти эффекты позволяют использовать Г-КСФ в лечении нейродегенеративных заболеваний[Владимирская Е.Б., Масчан А.А., Румянцев А.Г. 1997; Maianski NA, Mul FP, van Buul JD et al. 2006].

Сходное по структурным преобразованиям нервной ткани с нейродегенеративными заболеваниями, гипоксическое состояние также сопровождается дегенерацией нейронов. Механизм повреждения нервной ткани в данном случае основан на нарушении окисления глюкозы - одного из важнейших этапов процесса энергообеспечения нейрона. В результате длительно текущего снижения парциального давления кислорода в крови развивается состояние, названное энцефалопатия. Развивающаяся в процессе моделирования тяжелой гипоксии энцефалопатия проявляется грубыми нарушениями психоневрологического статуса. При этом активизируются мезенхимальные стволовые клетки костного мозга, однако миграции их в кровь не происходит[Коршунов А.М., Преображенская И.С. 1998; Скулачев В.П. 2000].

Отсюда следует что мезенхимальные стволовые клетки (МСК) костного мозга в репарации участков нервной системы роли не играют. Однако, параллельно активации МСК костного мозга, в субэпиндемальной зоне боковых желудочков также происходит активация подобной системы, названной системой «глубокого резерва» головного мозга. Она представляет собой скопление (пул) нейральных прекурсов, обладающих способностью мультипотентных стволовых клеток. Не смотря на то, что собственных возможностей данных клеток недостаточно для полной репарации поврежденной ткани, существует возможность активизировать их пролиферацию, тем самым, увеличив их количество, ускорить процессы регенерации поврежденных участков нервной ткани. Этому способствует наличие на мезенхимальных стволовых клетках рецепторов. Выявлены также и биологически активные факторы, взаимодействующие с данными рецепторами, и через них влияющие на пролиферацию стволовых клеток и их дифференцировку. Одним из данных факторов является Г-КСФ[Гомазков О.А. 2006].

В ранних исследованиях Г-КСФ [Kuga ea 1989] установлено с помощью мутагенеза in vitro, что большинство мутаций, которые локализованны во внутренней и С-концевой областях молекулы, нарушают активность Г-КСФ. Например, делеция (выпадение) десяти С-концевых остатков (165-174) приводила к потере биологической активности Г-КСФ. И напротив, у мутантов без N-концевых четырех, пяти, семи АКО активность Г-КСФ не изменялась. Однако данные о роли N-концевых АКО противоречивы, так как позднее обнаружено [Yamasaki ea 1998] и снижение биологической активности Г-КСФ при увеличении N-концевой делеции по 11 АКО включительно.

Рядом исследователей получен модифицированный по N-концу Г-КСФ, белок KW-2228 , в котором Thr-1, Leu-3, Gly-4, Pro-5 и Cys-17 Г-КСФ дикого типа заменены на Ala, Thr, Туг, Arg и Ser, соответственно. В ходе последующих исследований, что модифицированный по N-концу Г-КСФ обладает более высокой пролиферативной активностью, повышенными устойчивостью и термостабильностью в плазме крови при 37 С^о [Kuga ea 1989, Okabe ea 1990, Suzuki ea 1992].

На современном этапе определены домены цитоплазматической области рецептора, которые отвечают за пролиферацию, дифференцировку и созревание нейтрофильных клеток. Определены отдельные пути передачи сигнала от Г-КСФ в ядро клетки и идентифицированы сигнальные белки, участвующие в передаче сигнала. Наиболее важные из них - это тирозинкиназы, Jakl, Jak2, Tyk2, Syc, Lyn и Hck, белки семействя транскрипционных факторов Stat и компоненты пути передачи сигнала Ras-Map.

В нескольких исследованиях современных авторов представлен ряд данных о механизмах активации, физиологической и биохимической роли различных сигнальных белков и регуляции гранулоцитопоэза[Коршунов А.М., Преображенская И.С. 1998; Скулачев В.П. 2000].

Обнаружены точечные мутации в гене Г-КСФР, которые вызывают укорачивание рецептора к Г-КСФ, снижение чувствительности и нарушение созревания гранулоцитов при тяжелой хронической нейтропении при предрасположенности к острому миелолейкозу.

В нескольких независимых друг от друга исследованиях выявлено, что молекулярный механизм этих нарушений состоит в повышенной активации белка Stat5. Так, у пациентов, имеющих тяжелую хроническую нейтропению, не поддающуюся лечению при помощи препаратов на основе Г-КСФ, обнаружена точечная мутация во внеклеточной области рецептора, которая приводит к снижению активации Stat5.

Безусловно, дальнейшие структурно-функциональные исследования Г-КСФ, его рецептора, сигнальных белков, определение индуцированных генов приведут к более глубокому пониманию как исследователями, так и практикамимеханизма действия Г-КСФ, установлению причин нарушения гранулоцитопоэза при различных заболеваниях и их целенаправленному лечению.

При изучении эффектов Г-КСФ при гипоксических состояниях выявлено, что его назначение существенно корригировало или полностью отменяло появление признаков патологии ЦНС. Предположительно курсовое введение препарата на основе Г-КСФ способно предотвращать повреждение нервных тканей в результате тех или иных патологических эффектов.

Возвращаясь к патофизиологии нарушений нервной ткани, стоит отметить схожесть патологических процессов в моделях разных заболеваний. Основными патологическими звеньями в данном случае являются: нарушение сосудистого русла, деградация нейронов, нарушения энергообеспечения нервной ткани.

Данные изменения присущи как нейродегенеративным заболеваниям, так и сосудистым нарушениям в головном мозге, что в итоге характеризуется одинаковой картиной повреждения нервной ткани. Данные черты имеют место также и при эпилепсии, хоть и играют вторичную роль в патологии данного заболевания. Одним из основных механизмов развития дегенерации нейронов при эпилепсии (как и при большинстве нейродегенеративных заболеваний) является их гибель в результате апоптоза.

Механизм запуска апоптоза идентичен описанному выше, то есть в патогенезе эпилепсии реализуется митохондриальный сигнальный путь. Помимо этого пути также реализуются и рецептор-зависимый и рецепторно-плазмолемный пути, но в меньшей степени. Каскад реакций начинается с апоптотических Bcl-2-белков -- Bax и Bak, которые встраиваются в наружную мембрану митохондрий и олигомеризуются, увеличивая ее проницаемость, благодаря чему в цитозоль клетки в большом количестве выходят белки апоптоза: цитохром с, каспазы ?2, ?3 и ?9 и белок AIF, которые запускают апоптоз. Сосудистые нарушения же являются одним из этиологических факторов развития эпилептического статуса[Дудина Ю.В. 2005; Зенков Л.Р. 2002].

Для доказательства эффективности препарата Г-КСФ, а также для обоснования теории миграции клеток в головной мозг на фоне воспалительных и нейродегенеративных заболеваний, проводились исследования по выявлению и функциональной активности рецепторов Г-КСФ на тканях различных структур головного мозга.

При эпитопном картировании молекулы Г-КСФ с помощью нейтрализующих моноклональных антител (моАТ) установлено, что остатки 20-46 и СООН-концов участвуют в связывании Г-КСФ с рецептором [ Layton ea 1991].

Позже, при сравнении кристаллических структур Г-КСФ человека, быка и собаки, а также структуры и данных по мутагенезу гормона роста идентифицированы консервативные АКО, расположенные на поверхности Г-КСФ, и предсказано, что они могут формировать два активных сайта связывания с рецептором[Fujii ea 1997].

Наиболее детальный структурно-функциональный анализ Г-КСФ впервые осуществлен [Reidhaar-Olson ea 1996] при использовании метода аланинсканирующего мутагенеза поверхностных АКО, который дает возможность идентифицировать остатки, участвующие в функционировании белка.

Эксперименты по установлению связывающей и пролиферативной активностей 58 мутантов Г-КСФ идентифицировали девять АКО, формирующих два сайта связывания с рецептором, из которых Lys40 и Phel44 в сайте 1 и Glul9 в сайте 2 наиболее важны. Кроме того, Val48 и Leu49 в сайте 1 и Leul5, Aspl 12 и Leul24 в сайте 2 также важны для биологической активности и олигомеризации рецептора. Исследование теми же методами 28 мутантов Г-КСФ установило, что в связывании с Г-КСФР участвуют пять заряженных АКО в спиралях А и С, наиболее важный из которых - Glul9, что соответствует сайту 2.

Установлено что, именно наличие рецепторов в кровеносных сосудах мозга позволяет Г-КСФ проникать даже через неповрежденный гематоэнцефалический барьер, а также способствовать ангиогенезу и восстановлению эндотелиального покрова после инсульта (равно как и после инфаркта миокарда), благодаря чему площадь ишемизированной зоны заметно уменьшается.

При этом экспрессия Г-КСФ в условиях ишемии усиливается. Кроме того, Г-КСФ стимулирует нейрогенез (в частности, было отмечено усиление миграции прогениторных нервных клеток в ишемизированную зону при введении Г-КСФ) и оказывает антиапоптогенное действие на клетки нервной ткани, таким образом существенно улучшая протекание долгосрочной реабилитации после инсульта, вызванного в эксперименте у крыс. Более того, выполнение курса инъекций Г-КСФ (курс продолжительностью 10 дней, дозировка Г-КСФ - 10 мкг/кг) после инсульта (даже если препарат начинает вводиться только через 7 дней [Bussolino F. et al. 1991]) позволяет со временем добиться заметного улучшения не только на клеточном, но и на поведенческом уровне [Симбирцев А.С.2004; Achilli F. et al. 2010; Bashkatova V.G. 2008].

В рамках этого, исследование локализации и распределения рецепторов к Г-КСФ более репрезентативно на ткани мозга с очагами эпилепсии, что и обусловило выбор лабораторных животных.

1.5 Рецепторы Г-КСФ

Обнаружение рецепторов к Г-КСФ и ГМ-КСФ на фибробластах костной ткани, эндотелиоцитах и кератиноцитах позволило выяснить, что данные факторы способны вызывать миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, стимулировать восстановление механически поврежденного монослояэндотелиоцитов [Самотруева М.А., Теплый Д.Л., Тюренков И.Н. 2009].

В период эмбрионального развития рецепторы к Г-КСФ обнаруживаются на клетках самых разных тканей и органов, например, в капиллярах желудочков сердца, яичек, в гломерулах почек, в стенках кровеносных сосудов, на мышечных клетках, в хрусталике глаза и в развивающейся сетчатке. Рецепторы к Г-КСФ широко представлены и в развивающейся нервной системе, хотя там они преимущественно располагались на поверхности астроцитов [Симбирцев А.С. 2004].

В ЦНС взрослых особей рецепторы к Г-КСФ обнаруживаются у пирамидных клеток 5 слоя коры, клетках Пуркинье и ядрах мозжечка, в базальных ядрах, СА3 зоне гиппокампа, энторинальной коре, обонятельных луковицах. Также рецепторы к данному фактору присутствуют в областях, связанных со взрослым нейрогенезом: субгранулярной, субвентрикулярной зонах и зубчатой извилине [Симбирцев А.С.2004; Achilli F. et al. 2010; Bashkatova V.G. 2008].

О важнейшей роли эндогенного Г-КСФ свидетельствует тот факт, что у мышей с его недостатком инсульт развивался на значительно большей площади, и приводил к куда более тяжелым последствиям, чем у нормальных животных. В то же время, при своевременном введении Г-КСФ этого удавалось избежать [Carobrez A.P., Bertoglio L.J. 2005].

При инсульте одним из основных факторов, запускающих апоптоз, является оксид азота, и антиапоптогенная активность Г-КСФ в данном случае реализуется за счет подавления данным цитокином активности каспазы-3 и поли-АДФ рибозной полимеразы, активируемых NO [Bashkatova V.G. 2008].

Вышеуказанные данные позволили провести ряд клинических испытаний Г-КСФ на небольших группах людей, перенесших инсульт. В результате безопасность препарата была подтверждена [Carobrez A.P., Bertoglio L.J. 2005], и теперь требуются новые исследования, чтобы подтвердить эффективность применения Г-КСФ в лечении инсульта у человека.

При моделировании инфаркта у животных было показано, что введение Г-КСФ препятствует развитию дисфункции желудочка, индуцируя образование сосудов и кардиомиоцитогенез в ишемизированной зоне. Последовавшие за этим клинические испытания подтвердили безопасность применения Г-КСФ у пациентов, перенесших инфаркт, а в некоторых исследованиях было отмечено и ослабление повреждения миокарда вследствие получения пациентом курса Г-КСФ [Ihle J., Witthuhn B., Quelle F., Yamamoto K., Silvennoinen O. 1995].

Таким образом, Г-КСФ является основным фактором роста, отвечающим за регуляцию гранулоцитопоэза. Физиологические эффекты Г-КСФ опосредуются различными доменами цитоплазматической области рецептора после его связывания с внеклеточной областью и гомоолигомеризации рецептора, что обуславливает актуальность проведения дальнейших исследований в направлении изучения локализации рецепторов к Г-КСФ.

2. Материалы и методы исследования

На основании этого исследование проводилось на крысах двух линий Wistar, которая является контрольной, и Крушинского-Молодкиной (КМ), у которой присутствует врожденная патология (эпилепсия).

Крысы выведенной в МГУ в конце 1940-х гг. линии Крушинского-Молодкиной (КМ) предрасположены к аудиогенной эпилепсии (судорожным припадкам в ответ на сильный звук, АЭ). Линия поддерживается в инбредном состоянии (более 50 поколений инбридинга) и характеризуется почти 100% пенетрантностью и экспрессивностью - тонические судороги максимальной интенсивности развиваются практически у всех животных каждого поколения. Припадки АЭ (интенсивность которых оценивается в условных баллах), имеют определенные преимущества перед фармакологически и/или электрически вызванными судорогами, поскольку их можно вызывать повторно, а также оценивать эффекты длительных воздействий. Аудиогенные судорожные припадки имеют стволовую локализацию и отличаются от моделей типа «киндлинга» по фармакологической чувствительности. Для крыс КМ характерно быстрое (5-7 с) развитие клонико-тонических судорог, а также развитие постиктальной каталепсии.

Многократная серийная (18-20 дней) экспозиция крыс КМ действию звука вызывает у них появление «миоклонических» судорог, имеющих «лимбическую» локализацию, сходную с таковой судорожных моделей по типу «киндлинга». Длительная (15 мин) экспозиция крыс КМ действию звука по специальной схеме с чередованием 10 с периодов сильного и слабого звука вызывает у них нарушения мозгового кровообращения, внешне проявляющиеся в виде парезов и параличей конечностей. При АЭ (в том числе и у крыс КМ) обнаружено снижение функции ГАМК-ергической и повышение активности глутаматергической систем стволовых структур мозга, а также сдвиги в обмене катехоламинов. Ранее картина физиологических и нейрохимических изменений при АЭ у крыс КМ проводилась в сопоставлении с реакцией на звук у крыс исходной линии Вистар, однако в настоящее время на основе популяции гибридов КМ х Вистар выведены (более 30 поколений) две новые линии с максимальной интенсивностью судорог АЭ (линия «4») и с отсутствием реакции на звук (линия «0»). Эти три линии (КМ, «4» и «0») имеют близкий генетический фон. Результаты, полученные с использованием крыс трех генотипов (КМ, «4» и «0»), имеющих сходный генетический фон, показали важность учета влияния этого фактора, например, при исследовании «коморбидности» АЭ и других патологических состояний. Подобной «триады» линий в других лабораториях мира, исследующих АЭ, не существует.

Крысы линии Wistar - аутбредные белые крысы. Эта линия была разработана Вистаровским институтом в 1906 г. для использования в биологических и медицинских исследованиях и является первой линией крыс, выведенной в качестве модельного организма в то время, когда лаборатории использовали преимущественно домовых мышей. Более половины всех лабораторных линий крыс произошли от первой популяции. На данный момент крысы Вистар являются наиболее популярными крысами в лабораторных исследованиях. Они характеризуются широкой головой, длинными ушами и имеют длину хвоста, которая всегда короче длины тела.

В каждой группе по 7 особей, в возрасте 6-7 месяцев, массой от 270 ± 300г.

Эксперимент в рамках практической части исследования был выполнен в соответствии с рекомендациями международных этических комитетов по гумманному обращению с лабораторными животными.

У каждой особи был изъят головной мозг, и условно поделён на 7 секций, после чего помещался в раствор формальдегида на сутки.

Деление на области представлено на рисунке 2.1.



Рисунок 2.1. - Деление на области головного мозга лабораторных животных в процессе исследования

Подготовка образцов ткани головного мозга для гистологического исследования произведена на автоматическом процессоре Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин состоящий из: 6 банок спирта, 3 банок ксилола и 3 парафина.

Дальше заливались в блоки и нарезались на микротоме 3-5 мкм(микрометров). После на сутки препараты помещались в сухожаровой шкаф. Срезы были окрашены в соответствии с протоколом Biossantibodies проведения иммуногистохимических исследований.

Протокол .

1.Депарафинилизация (2 банки ксилола-2 мин, 3 банки спирта - 2 минуты, - 2 минуты)

2. Цитратный буфер - 15 минут

3. - 2 минуты

4. Обводим срезы гидрофобным карандашом

5.TBS 2 раза - 2 минуты

6. - 15 минут

7. - 2 минуты

8. TBS 2 раза - 5 минут

9.BlokAid - 40 минут

10.p.ab (50 мкл) - на 14 часов

11.TBS 3 раза - 5 минут

12. Scabantirab - 50 минут (на водяной бане 37?С)

13.TBS 3 раза - 5 минут

14.Sr-Str - 30 минут

15.TBS 3 раза - 5 минут

16.DAB - 5 минут

17. - 5 минут

18.Гематоксилин - 7 минут

19. проточная вода - 5 минут

20. Спирт 2 раза - 2 минуты

21. Ксилол 2 раза - 2 минуты

Далее при помощи микроскопа Leica DM 5000B определены позитивно окрашенные клетки и их количество в единице площади в 5-ти полях зрения при увеличении микроскопа х400 - рисунок 2.2.

Рисунок 2.2. - Микрофотография среза головного мозга (7-секция, Wistar)

Локализация CD 114 позитивных клеток относительно структур головного мозга, в которой находятся рецепторы, установлена по атласу Theratbrain.

Также были сделаны микрофотографии препаратов при помощи программы «ВидеоТесТМорфология 5.0». Вычисления и статистическая обработка результатов исследований выполнены с помощью программного пакета MicrosoftEcxel.

Определены средние арифметические значения в группах, ошибки средних арифметических.

А также была использована программа Статистика для определения достоверности отличий групп от контрольной по критерию Манна-Уитни.

Результаты анализировали с использованием однофакторного дисперсионого анализа, показали достоверные различия между группами (при P?0,05).

3. Результаты и их обсуждение

В результате исследований выявлено, что повышение плотности количества клеток несущий на себе рецептор Г-КСФ не равномерно по мозгу. Сильнее выражено окрашенных клеток в растральной части мозга, при этом, при анализе препаратов затылочной части ниже и можно отметить схожесть препаратов по плотности клеток, несущих рецептор к Г-КСФ - рисунок 3.1.

Рисунок 3.1. - Сравнительный анализ плотности количества клеток несущих на себе рецептор Г-КСФ у двух линий лабораторных животных различия достоверны (P?0,05) по сравнению с группой Wistar.

Можно отметить по рисунку 3.1 общую закономерность более высокой плотности клеток, несущих рецептор к Г-КСФ у группы животных КМ.

Также в ходе исследования выявлено, что коэффициенты Pir1,M1,Cpu,TeA,MoCb, 6bCd приблизительно одинаковые (что говорит о базовом уровне повышения по мозгу) - рисунок 3.2.



Рисунок 3.2. - Сравнительный анализ коэффициентов Pir1,M1,Cpu,TeA,MoCb, 6bCd

По рисунку 3.2 можно заключить, что количество окрашенных клеток возросло на 50 %.

При этом, при исследовании зафиксированы зоны которые составляют исключение из общей картины. Это Mi, Gro, M2.

Mi, Gro, которые являются структурами обонятельных луковиц в них содержание положительно окрашенных клеток у КМ выше чем у Wistar в 2-4 раза - рисунок 3.3.

Рисунок 3.3. - Сравнительный анализ зон мозга с различных содержанием клеток, чувствительных к Г-КСФ

Такое различие чувствительности клеток к Г-КСФ в отдельных зонах на данном этапе объяснить не представляется возможным (объяснений указанного результата не представлено и в иных исследования, рассмотренных в ходе работы).

Вторая зона (М2 - моторная кора) у исследуемой линии крыс КМ показывает плотность клеток выше базового уровня на 2- 2,5 раза это М2. Это связано с тем, что экспериментальная группа крыс КМ отбирались по признаку реагирования на звук судорожными припадками и такие крысы пускались в размножение (при формировании линии).

Искусственный отбор на звук сопровождался с постоянным провоцировании припадков, в ходе которых происходит изменение в моторной коре, где впоследствии развивается вторичный очаг эпилептических судорог. Это различие является следствием искусственного отбора.

Коэффициент соотношения числа плотности окрашенных клеток разных структур у исследуемых линий крыс представлен в таблице 3.1.

Таблица 3.1. - Коэффициент соотношения числа плотности окрашенных клеток разных структур Знаком «+» отмечены положительно окрашенные клетки- чувствительные к Г-КСФ

Отдел/ зона	Структуры	Wistar	КМ
CB	9a, bCb	-	+
CB	7Cb	-	+
CB	9c, Cb	-	+
CB	MoCb	+	+
CB	6bCb	+	+
CB	Crus1	+	+
CB	PlF	+-	+
CTX	MO	-	+
CTX	SiBF	-	+
CTX	SiFL	-	+
CTX	AuD	-	+
CTX	V1	-	+
CTX	V2L	-	+
CTX	MEnt	-	+
CTX	Au1	-	+
CTX	VO	+	-
CTX	TeA	+	+
CTX	M1	+-	+
CTX	M2	+-	+
HPF	GrD6	-	+
HPF	CA1	-	+
HPF	CA2	-	+
HPF	Py	-	+
HPF	PoD6	-	+
HPF	GrD6	-	+
HPF	DS	-	+
HPF	VS	-	+
HY	HDB	-	+
HY	VDB	-	+
HY	MS	-	+
HY	MPA	-	+
HY	LPO	-	+
HY	MEE	-	+
HY	Mel	-	+
HY	SO	-	+
HY	VMPO	-	+
MB	LPA6	-	+
MB	SNR	-	+
MB	PPTg	-	+
MB	Mlf	-	+
MB	Dscp	-	+
MB	Scp	-	+
MB	PAG	-	+
MB	PN	-	+
MB	3N	-	+
MB	Mlf	-	+
MB	InC	-	+
MB	Su3	-	+
MB	SPTg	-	+
MOB	Pir2	-	+
MOB	APir	-	+
OLF	Pir1 (MOB)	+-	+
MY	Me5	-	+
MY	Sp5l	-	+
MY	LPGi	-	+
MY	Sp5	-	+
MY	Pr5VL	-	+
MY	Tz	-	+
MY	SPO	-	+
MY	MSO	-	+
MY	LSO	-	+
OLF	OV	+	-
OLF	Mi	+	+
OLF	Gro	+	+
P	PnO	-	+
P	RtTg	-	+
PAL	MCPO	-	+
PAL	STlA	-	+
PAL	EGP	-	+
TH	VP	-	+
TH	MDM	-	+
TH	MDC	-	+
TH	VA	-	+
TH	Rt	-	+
TH	PP	-	+
TH	PMCo	-	+
TH	SG	-	+
TH	Re	+	-
STR	CPU	+	-

Из таблицы 3.1 можно отметить, что у двух линий крыс существует ряд принципиально расхожих зон головного мозга по критерию плотности клеток, несущих рецепторы к Г-КСФ. Более наглядно данные, представленные на микрофотографиях препаратов мозжечка крыс двух исследуемых линий - рисунок 3.4 и рисунок 3.5.



Рисунок 3.4. - Микрофотография окрашенных клеток у контрольной группы крыс - линии Wistar (препарат ткани мозжечка)

Рисунок 3.5. - Микрофотография окрашенных клеток у экспериментальной группы крыс - линии КМ (препарат ткани мозжечка)

Таким образом, можно отметить по итогам исследования качественные различия в локализации и плотности клеток, несущих на себе рецепторы к Г-КСФ в головном мозге исследуемых линий крыс.

Вышеуказанные особенности дают основания полагать, что препарат Г-КСФ, успешно применяющийся при моделях нейродегенеративных заболеваний и инсульте, также может быть эффективен при коррегировании эпилептических припадков.

Это подтверждает тот факт, что важнейшим физиологическим эффектом Г-КСФ является активация пролиферации гранулоцитарных предшественников, которую гемопоэтин осуществляет как путем непосредственного воздействия на кроветворные элементы, так и через неадгезирующие клетки кроветворного микроокружения за счет повышения продукции последними гемопоэтических ростовых факторов. Г-КСФ связывается с рецептором и индуцирует димеризацию последнего с последующей трансдукцией сигнала роста и дифференцировки. Г-КСФ активирует JAK-семейство киназ, которые вызывают фосфорилирование тирозина фактора транскрипции STAT3.

После этого STAT3 стимулирует пролиферацию и индуцирует дифференцировку гранулоцитарных предшественников [Кетлинский С.А., Симбирцев А.С. 2011; Bussolino F. et al. 1991].

Кроме того, Г-КСФ также может запускать Ras/MAPK и PI3K/протеин-киназу в сигнальные пути [Carobrez A.P., Bertoglio L.J. 2005]. Это ведет к ускорению восстановления гранулоцитопоэза. Ускорение процессов дифференцировки родоначальных элементов гранулоцитарного ростка обусловлено в свою очередь активацией формирования гемопоэтических островков гранулоцитарного типа вследствие увеличения содержания в костном мозге предшественников стромальных механоцитов.