Характеристика моноклональных антител к рекомбинантным белкам pseudomonas aeruginosa

Размещено на http://www.allbest.ru/

Характеристика моноклональных антител к рекомбинантным белкам pseudomonas aeruginosa



Оглавление

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика Pseudomonas aeruginosa

1.1.1 Основные факторы патогенности синегнойной палочки

1.1.2 Разработка вакцин против P. aeruginosa

1.2 Гибридомная технология. Моноклональные антитела

2. Материалы и методы

2.1 Оборудование и материалы

2.1.1 Клеточные линии

2.1.2 Антигены и антитела

2.1.3 Оборудование

2.1.4 Реактивы

2.2 Методы

2.2.1 Получение рекомбинантного белка OprF-ЭTA

2.2.2 Индукция экспрессии рекомбинантного белка OprF-aTox

2.2.3 Получения клеточного лизата штамма Е.coli PA-OPRF-ЭTA после экспрессии рекомбинантного гена

2.2.4 Хроматографическая очистка рекомбинантного белка OprF- ЭTА

2.2.5 Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.2.6 Иммунодот вариант иммуноферментного анализа

2.2.7 Цитотоксический тест

2.2.8 Нейтрализация цитотоксичности

3. Оценка взаимодействия моноклональных антител с рекомбинантными белками Pseudomonas aeruginosa

3.1 Получение рекомбинантных форм OprF-aTox

3.2 Тестирование первичных гибридных культур в ИФА

3.3 Тестирование МА в иммунодот варианте иммуноферментного анализа

3.4 Определение цитотоксичности рекомбинантного ЭТА

3.5 Определение токсиннейтрализующей активности моноклональных антител

4. Обсуждение

Заключение

Список литературы



Список сокращений

АЖ - асцитная жидкость

Ат - антитела

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПТГ - изопропил-в-D-галактопиранозид ИФА - иммуноферментный анализ

КББ - Карбонат-бикарбонатный буфер

КЖ - культуральная жидкость

ЛПС - липополисахарид

ПС - полисахарид

МА - моноклональное антитело

НЦТ - нейтрализация цитотоксичности

ПХ - пероксидаза корня хрена

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПК - сыворотка плода коровы с/н - супернатант

ТМБ - 3,3',5,5'-тетраметилбензидин

ЦТ - цитотоксичность

ЭТА - экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa

СНО - линия клеток яичника китайского хомячка

DMEM - среда Игла в модификации Дульбекко eEF2 - эукариотический фактор элонгации

Ig - иммуноглобулин

LB - cреда Лурия-Бертани

Opr - белок наружной мембраны

PA - Pseudomonas aeruginosa

PBS - фосфатно-солевой буферный раствор

ПААГ - полиакриламидный гель

Tris - трис(гидроксиметил)аминометан



Введение

Актуальность проблемы

Синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) - условно-патогенный микроорганизм, который и в настоящее время продолжает остаться одним из главных возбудителей внутрибольничных инфекций. Синегнойная палочка вызывает такие виды нозокомиальных инфекций, как инфекции мочевыводящих путей (11--18%), пневмонии (21--39,7%), инфекции области хирургического вмешательства (5--13,8%), гнойно-септические инфекции у новорождённых и др. [1, 2] Течение таких инфекций может проходить как в острой, так и в хронической форме. По данным многоцентровых европейских исследований P. aeruginosa является возбудителем в 30% случаев госпитальных инфекций в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) [3, 4]. В России синегнойная палочка на втором месте после кишечной, среди микроорганизмов, вызывающих госпитальные инфекции в ОРИТ [5, 6, 7].

Частота развития синегнойной инфекции связана с увеличением количества иммунокомпрометированных больных и больных находящихся в группе риска, в результате травм, хирургических вмешательств, обширных лучевых и термических поражений, диагностических манипуляций, онкологических процессов и нерационального использования антибиотиков [8, 9]. Уникальная способность P. aeruginosa приспосабливаться к различным условиям среды и формирование биопленок позволяют возбудителю персистировать внутри больничных отделений достаточно длительное времени. Трудность борьбы с синегнойной инфекцией также обусловлена высоким уровнем резистентности к антибиотикам, химиотерапевтическим препаратам, а также антисептикам и дезинфектатам, передающейся с плазмидами. Поэтому остается актуальность разработок и создание эффективных иммунопрепаратов для профилактики и терапии заболеваний, вызываемых P. aeruginosa [11, 12].

На сегодняшний день важными направлениями для эффективного лечения и профилактики оппортунистических инфекций, вызванных P. aeruginosa являются: 1) создание вакцинных препаратов,

2) усовершенствование методов ранней диагностики заболевания.

В последние десятилетия были предложены различные вакцины и моноклональные антитела для активной и пассивной вакцинации против Р. aeruginosa. Тем не менее, в настоящее время в клинической практике не зарегистрировано ни одного эффективного препарата, предназначенного для иммунопрофилактики и иммунотерапии синегнойных инфекций.

Сложности, возникающие перед разработчиками иммунопрепаратов против P. aeruginosa связаны с тем, что патогенез синегнойной инфекции, обусловлен воздействием ряда повреждающих факторов. Выделение наиболее значимых факторов при разработки вакцинных препаратов представляется сложной задачей.

На начальном этапе инфекционного процесса, происходит инвазия возбудителя в клетки хозяина, поверхностные антигены бактериальной клетки при этом играют важную патогенетическую роль, так как имеют основное значение в стимуляции врожденного и адаптивного иммунитета [12].

В настоящее время зарубежными и отечественными учеными получено, очищено и иммунологически исследовано большинство белковых компонентов клеточной стенки P. aeruginosa [13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20]. При изучении поверхностных белков выявлено, что наибольшей иммуногенностью обладают некоторые белки наружной мембраны (Opr - outer protein). Особый интерес представляет белок F наружной мембраны (OprF), участвующий в формировании пор возбудителя. Для представителей рода Pseudomonas. аминокислотная последовательность OprF является высококонсервативной

Ранее в ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» получены рекомбинантные формы белка OprF P. aeruginosa, эти белки обладали иммуногенными свойствами, сыворотки к ним обладали бактериостатическим эффектом, что было показано in vitro. [22]

Различными исследователями показано, что одним из основных факторов патогенности P. aeruginosa является экзотоксин А (ЭТА), который продуцируется большинством (до 90%) клинических штаммов. В основе действия механизма ЭТА лежит ферментативный гидролиз НАД и риболизирование фактора элонгации (eEF-2), приводящих к нарушению белкового синтеза в клетках эукариот и последующей клеточной смерти. ЭТА ингибирует пролиферацию гранулоцитов, макрофагов и антигенпрезинтирующих клеток. [22, 23, 24] Действуя на клетки эукариот экзотоксин А, также изменяет проницаемость клеток-мишеней и нарушает в цитохромной системе транспорт электронов [25].

Новые возможности для углублённого изучения ЭТА и других антигенов открылись с использованием специфических моноклональных антител, как наиболее перспективного инструмента.

Сейчас на основе экзотоксина А разработаны разные варианты вакцин: обезвреженная культуральная токсинсодержащая жидкость [26, 27]; рекомбинантные варианты токсина, экспрессируемые E.coli [28]; фрагменты ЭТА [29], ЭТА, несущий точечную мутацию в активном центре домена III [30, 31].

В настоящее время при создании вакцинных препаратов все больше используют методы генной инженерии, суть которых заключается во встраивании генов, отвечающих за синтез протективных антигенов в возбудителях, в геном непатогенной бактерии (в основном Escherichia coli) [32, 33]. В результате культивирования полученных штамм-продуцентов, в большом количестве синтезируется протективный антиген (рекомбинантный белок), который подвергается очистке и затем может быть использован для создания вакцины.

Так как обычные способы не дали возможность получить реактогенный препарат в ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» получена рекомбинантная плазмидная ДНК pPA-OPRF-ETA кодирущая синтез рекомбинантного белка OprF-aTox Pseudomonas aeruginosa, включающей аминокислотные последовательности белка F наружной мембраны и экзотоксина A P. aeruginosa, который рассматривается как возможный компонент в составе будущей вакцины.

Цель работы: Изучение иммунобиологических и иммунохимических свойств моноклональных антител к рекомбинантным белкам P. aeruginosa.

Задачи исследования:

1. Получить рекомбинантный белок OprF-aTox.

2. Оценить взаимодействие моноклональных антител, полученных при использовании спленоцитов мышей, иммунизированных рекомбинантным белком OprF- aTox, с рекомбинантной конструкцией OprF- aTox и рекобинантными белками OprF и ЭTA в твердофазном ИФА и в иммунодот-варианте ИФА.

3. Исследовать токсиннейтрализующие свойства моноклональных антител in vitro.

Научная новизна и теоретическая значимость

Охарактеризована панель моноклональных антител к рекомбинантному слитому белку OprF-aTox. Оказалось, что 5 антител были направлены к aTox,

2 антитела только к OprF, 2 не направлены ни к aTox, ни к OprF, 3 направлены к aTox и OprF.

Практическая значимость

Моноклональные антитела к рекомбинантному белку OprF-aTox могут быть использованы для выявления сразу ЭТА и OprF, а также слитного белка OprF-aTox, что открывает перспективы для создания диагностической тест- системы.



1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика Pseudomonas aeruginosa

Cинегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) -- грамотрицательная бактерия, размером 1-3 мкм, подвижная, с 1-2 полярно расположенными жгутиками, не образующая спор. В мазках чистых культур располагается одиночно, попарно или в виде коротких цепочек. При определенных условиях может продуцировать капсулоподобную внеклеточную слизь полисахаридной природы, покрывающую тонким слоем микробную клетку.

Рисунок 1 - Pseudomonas aeruginosa

Pseudomonas aeruginosa - выраженный хемоорганотроф, облигатный аэроб с окислительным типом обмена веществ, факультативный анаэроб (денитрификатор). В качестве источника энергии использует СО или Н2. Синтезирует вещество триметиламин, придающий культурам запах жасмина или туалетного мыла. P. aeruginosa не нуждается в факторах роста[34].

P. aeruginosa обладает выраженной протеолитической и низкой сахаролитической активностью. Продуцирует бактериоцины (пиоцины), белки, угнетающие рост и развитие микроорганизмов аналогичного или генетически близкого вида [35]. Характерным признаком, имеющим важное диагностическое значение, является образование пигментов (встречается у 70-80% клинических изолятов). Pseudomonas aeruginosa продуцирует водорастворимый феназиновый пигмент пиоцианин, окрашивающий питательную среду и отделяемое ран пациентов в сине-зеленый цвет. Также большинство культур образует зеленый флюоресцирующий в УФ-лучах пигмент флюоресцеин или пиовердин. Некоторые штаммы могут синтезировать другие пигменты. Непигментированные штаммы встречаются у 8,3-18 % изолятов [36, 37].

Рисунок 2 - Пигменты пиоцианин и флюоресцеин P. aeruginosa

P. aeruginosa распространена повсеместно. Обитает во влажных условиях, встречается в почве и воде, на растениях, в кишечнике человека и животных, на коже и слизистых (у 3-5 % здоровых людей).

Широкое распространение обусловлено сохранением жизнеспособности и способности к размножению даже при минимальном содержании питательных веществ, широком температурном диапазоне (4- 42°С) и значении pH 4,5-9,0. P. aeruginosa выживает в большинстве дезинфектантах и антисептических растворах, используемых в медицине [38].

P. aeruginosa -- условно-патогенный микроорганизм, но в организме человека или животного с ослабленным иммунитетом он способен вызывать гнойно-воспалительный процесс. Изучение этого микроорганизма началось с 1862 г., когда Luke описал раневую инфекцию с характерной сине-зеленой окраской гноя. В чистой культуре P. aeruginosa была выделена и описана в 1882 г. C. Gessard. Начиная с 70-х гг. ХХ века Pseudomonas aeruginosa признается одним из главных возбудителей внутрибольничных инфекций [39, 40, 41].

1.1.1 Основные факторы патогенности синегнойной палочки

В отличие от большинства других представителей рода Pseudomonas обладает многочисленными факторами патогенностями, способствующих адгезии, инвазии и персистенции в тканях, цитотоксичности и стимуляции системного воспалительного ответа.

Благодаря наличию специальных адгезинов, таких как пили, и вспомогательных компонентов P. aeruginosa способна, образуя слизистую капсулу полисахаридной природы, выделяя большое количество полисахарида альгината, против которого не синтезируются антитела, связываться и прикрепляться к различным поверхностям. Адгезия происходит на рецепторах эпителия слизистых оболочек или гликопротеидах соединительной ткани поврежденной кожи.

Распространение по внеклеточным пространствам обеспечивают секретируемые вне клетки белки, обладающие ферментативной активностью - протеазы (LasB-эластаза, LasA-эластаза и щелочная протеаза). Роль щелочной протеазы в инвазии P. aeruginosa неизвестна. LasA-эластаза и LasB-эластаза способны разрушать эластин фибрин и коллаген, а также инактивирует гуморальные защитные факторы организма - IgG и IgА, компоненты комплемента, лизоцим и гамма-интерферон [42]. Фосфолипаза С также вызывает лизис эукариотических клеток, в результате образования пор в цитоплазматической мембране клеток организма [43]. Нейрамидаза, является регулирующим ферментом, усиливает действие других токсинов и создает условия для распространения инфекции из возникшего очага.

Факторами, непосредственно влияющими на формирование локального и системного воспаления, являются ЛПС, экзотоксины, флагеллин, фосфолипаза С, нитратредуктаза и пиоцианин. Большинство из них инициируют секрецию ключевого провоспалительного медиатора - фактора некроза опухоли (TNF) [44, 45].

Важным свойством P. aeruginosa является наличие у них межклеточной сигнальной системы (продукция внеклеточных сигнальных молекул) «феномен кооперативной чувствительности» или «quorum sensing». Эта система регулирует плотность клеток бактериальной популяции и отвечает за контроль продукции многих внеклеточных факторов патогенности, что обеспечивает бактериям преодоление защитных сил организма при инфекции. Под ее контролем находится синтез всех экзотоксинов, а также образование биопленки, структура и физиологические свойства которой обеспечивают повышение устойчивости к антибиотикам, антисептикам, дезинфектантам и влиянию со стороны иммунной системы и других факторов организма [46].

Рисунок 3 - Факторы патогенности P.aeruginosa, связанные с клеткой

Мембраны патогенных микроорганизмов, помимо других функций, защищают клетки от неблагоприятного воздействия внешней среды. У грамотрицательных бактерий проницаемость наружной мембраны обеспечивается системой водонаполненных каналов, образованных порообразующими белками (поринами). Они могут выступать как эффекторы патогенеза, подавляя отдельные стадии иммунной защиты хозяина и обеспечивая выживания патогена в организме [47]. У P. aeruginosa белок наружной мембраны F (OprF) является консервативным и наиболее иммунологически активным. Доказано, что OprF участвует в адгезии на эукариотических клетках и образовании биопленок в анаэробных условиях. OprF является основным пориновым белком, ответственным за транспорт беталактамных антибиотиков через наружную мембрану [48, 49].

Возможность поражения P. aeruginosa различных органов и ткани и проявление токсических свойств обусловлено также выделением экзотоксинов и высвобождением при гибели бактериальной клетки эндотоксинов. Экзотоксины представлены продуктами жизнедеятельности бактерий, среди них большое значение имеют:

Экзоэнзим S (экзотоксин S) - термолабильный белок, обладающий, АДФ-трансферазной активностью, воздействует на фактор элонгации I и вызывает ингибирование синтеза белка. Оказывает иммуносупрессивное действие.

Цитотоксин вызывает выраженные структурные изменения в клетках и повышает проницаемость клеточных мембран. Токсин синтезирует 96,7% патогенных штаммов P. aeruginosa.

Одним из наиболее значимых факторов патогенности P. Aeruginosa принято считать экзотоксин А (ЭТА).

ЭТА продуцируют in vitro 87-89 % клинических изолятов P. aeruginosa, около 90 % штаммов содержат ген ЭТА [50, 51].

В 1966 году Liu P. из слюны человека выделил высокотоксигенный штамм PA 103 P. aeruginosa, после чего начались исследование ЭТА. Его роль в патогенности бактерии открыта в исследованиях Iglewski и Kabat в 1975 г. Авторы обнаружили, что ЭТА катализирует АДФ-рибозилирование эукариотического фактора элонгации 2 (eEF-2), и таким образом нарушает белковый синтез в эукариотических клетках. [22].

С момента открытия ЭТА доказана его токсичность и определены летальные дозы in vitro для широкого ряда клеток млекопитающих многих видов [52, 53, 54]. За последние десятилетия ЭТА был изолирован, очищен и охарактеризован [55, 56, 57, 58, 59, 60].

Экзотоксин А, в отличие от других токсинов P. aeruginosa, секретируется во внеклеточную среду и, действуя дистанционно, проникает в клетки-мишени рецептор-опосредованным эндоцитозом, протеолитически расщепляется и попадает в цитозоль клетки

ЭТА продуцируется P. aeruginosa в виде одной полипептидной цепи. Его молекула имеет трехдоменную структуру: I домен участвует в специфическом связывании c эукариотической клеткой, II домен отвечает за перенос токсина через мембрану в клетку, III домен, обладает токсической активностью, катализирует инактивацию eEF-2, при помощи АДФ- рибозилирования, что приводит к ингибированию белкового синтеза и клеточной смерти [61, 62].

Рисунок 4 - Схематическое изображение структуры молекулы экзотоксина А P. aeruginosa

Считается, что ЭТА играет существенную роль в развитии инфекционного процесса. Но на сегодняшний день окончательно не известно, в какой степени ЭТА ответственен за негативные реакции, вызываемые P. aeruginosa, т.к. синегнойная палочка обладает множеством других факторов патогенности, а продукция самого токсина является непостоянной и зависит от условий внешней среды.

1.1.2 Разработка вакцин против P. aeruginosa

Активная иммунизация является одним из эффективных средств защиты против условно патогенных микроорганизмов, в том числе,

P. aeruginosa. Основываясь на данных о факторах патогенности и антигенных структурах, для борьбы с синегнойной инфекцией разрабатывались и испытывались в экспериментах и клинических исследованиях разные типы вакцин.

Первая успешная попытка иммунизации кроликов и морских свинок против синегнойной инфекции была сделана более 100 лет назад A. Charrin (1884), что стало началом создания вакцин.

На сегодняшний день испытаны различные кандидаты в вакцины против P. aeruginosa на основе цельных убитых формалином клеток [63], ЛПС [64, 65], полисахаридов (ПС) [66], белков жгутиков и наружной мембраны [67, 68, 69, 70, 71, 72], пилей [73], живых аттенуированных штаммов P. aeruginosa, экспрессирующих антигены P. aeruginosa и ДНК последовательностей [74, 75].

Вакцина из ЛПС P. aeruginosa (Pseudogen) создана на основе очищенных липополисахаридных препаратов из семи иммунотипов синегнойной палочки, выделенных Фишером (Fisher) в 1971 году [76].

На основе белков наружной мембраны на людях испытаны две вакцины: рекомбинантная вакцина OprF/I, созданная ранее в Германии и вакцина CFC-101, полученная обычной экстракцией микробных клеток P. aeruginosa в Кореи [69, 77].

На основе очищенного белка жгутика P. aeruginosa создана моновалентая вакцина [67].

Проведены многочисленные исследования по созданию ряда ДНК- вакцин против P. aeruginosa; на основе плазмид, содержащих различные гены, однако до сих пор ни один препарат не предложен для исследования на людях [78, 79, 80].

Применение ЭТА P. aeruginosa в качестве иммуногена стало возможным после разработки метода его детоксикации. Препараты на основе экзотоксина А, созданные еще в прошлом веке для лечения и профилактики синегнойной инфекции, представляли собой атоксичные формы белка, полученного очисткой культуральной токсинсодержащей среды, с последующей химической обработкой [26].

Для формирования противосинегнойного иммунитета в нашей стране разрабатывались такие препараты как: поливалентная синегнойная корпускулярная вакцина, представляет собой цельные, убитые эктерицидом клетки самых распространенных в клинике штаммов P. aeruginosa [81]; пиоиммуноген - вакцина, содержащая водорастворимый комплекс антигенов слизи и клеточной оболочки, изолированный из инактивированных культур

P. aeruginosa [82]; псевдомонас - вакцина [83, 84], а также препараты на основе экзотоксина А P. aeruginosa - анатоксин синегнойной палочки [85, 86].

Пациенты с тяжёлыми формами синегнойной инфекции не могут подвергаться активной вакцинации из-за серьёзных нарушений иммунной системы, или, когда иммунный ответ может оказаться неэффективным. В таких случаях рекомендована пассивная иммунотерапия. Препараты нормального иммуноглобулина человека, содержащие специфические антитела против P. aeruginosa, нейтрализуют действие ЭТА и обладают протективной активностью [87, 88]. Однако не используются для пассивной терапии из-за проблем, связанных с варьирующим титром антител к антигенам P. aeruginosa среди доноров человеческой плазмы.

Исходя из данных литературы, наиболее перспективными оказались многовалентные конъюгированные генно-инженерные вакцины. Это связано с тем, что при их разработке учитываются наиболее иммуногенные компоненты P. aeruginosa, в них отсутствуют антигены, не участвующие в иммунном ответе. В таких вакцинах используется сразу несколько антигенных компонентов, что позволяет на разных стадиях инфекции воздействовать на патоген.

На сегодняшний день создание эффективных вакцин против P. aeruginosa остаётся нерешённой задачей.

1.2 Гибридомная технология. Моноклональные антитела

Одним из основных достижений биотехнологии в области медицины является создание новых высокоэффективных лекарственных средств с использованием методов генной и клеточной инженерии. Создание иммунопрепаратов и диагностических тест-систем является одним из перспективных направлений разработки биотехнологических препаратов. Наиболее перспективной является гибридомная технология получения моноклональных антител, т.е. антител, продуцируемых потомками одной- единственной клетки. Препараты на основе моноклональных антител получили широкое распространение в иммунотерапии и иммунодиагностике различных заболеваний, в том числе синегнойной инфекции.

Технология получения гибридом -- клеток, продуцирующих моноклональные антитела -- была разработана в 1975 году Ц. Мильштейном и Дж. Келлером, к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител.

Принцип данной технологии заключается в создании гибридной клетки, получаемой путем слияния антитело-продуцирующего В-лимфоцита и опухолевой клетки миеломного или плазмацитомного ряда. Образующиеся при этом гибридные клетки (гибридомы) могут сохранять качества родительских клеток обоих типов: с одной стороны - способность к неограниченной пролиферации, с другой - способность к синтезу специфических антител. Моноклональные антитела (МА) являются продуктом секреции одной антитело-продуцирующей клетки, либо ее потомков (клона), образовавшихся в процессе деления этой клетки.

На первом этапе осуществляется иммунизация самок мышей линии BALB/c антигенами (рекомбинантными белками) Pseudomonas aeruginosa внутрибрюшинно. Затем от иммунизированных мышей стерильно забирали селезенки и получали взвесь клеток, содержащие лимфоциты.

Слияние иммунных спленоцитов мышей линии BALB/с и клетками злокачественной миеломы мыши осуществляется с помощью специального агента, приводящего к изменению мембран, формированию цитоплазматических контактов и формированию дикарионов. Келлер и Мильштейн осуществляли гибридизацию с помощью вируса Сендай (Sendai), но этот метод имел ряд недостатков, связанных с воспроизводимостью результатов и жизнеспособностью гибридов. Альтернативным агентом является полиэтиленгликоль (ПЭГ или PEG). На сегодня разработан более современный способ слияния клеток - подвергнуть их воздействию электрических импульсов. При слиянии образуется гетерогенная популяция клеток, состоящая из: не слившихся клеток лимфоцитов и миеломы, из гибридов лимфоцит+лимфоцит и миелома+миелома, и из гибридов лимфоцит+миелома, из которых лишь часть жизнеспособна и стабильно продуцирует антитела нужной специфичности.

Отбор продуктивных гибридных клеток проводится при длительной инкубации (2-3 недели) первичной культуры в ГАТ-среде (НАТ-среде), содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Миеломные клетки не могут выживать в присутствии аминоптерина, так как он блокирует основной путь синтеза нуклеотидов. Спленоциты могут преодолевать действие ингибитора, используя для синтеза нуклеотидов гипоксантин и тимидин, но они достаточно быстро умирают. Только гибридома выживает в виде культуры в среде ГАТ, так как эти клетки обладают одновременно бессмертием миеломных клеток и способностью клеток селезенки приспосабливаться к аминоптерину.

Затем гибридные культуры культивируются в 96 луночных планшетах в СО2-инкубаторе. Контроль роста гибридных культур осуществляется визуально при помощи инвертированного микроскопа. Гибридомы, продуцирующие специфические антитела, отбираются после выявления антителопродукции методом иммуноферментного анализа (ИФА) и переносятся в чашки Петри больших размеров, содержащие фидерные (подкормочные) клетки.

Клонирование проводится методом предельных разведений. Принцип метода состоит в том, чтобы суспензию клеток развести в ростовой среде до такой концентрации, чтобы при посеве клеток на планшет на каждую лунку приходилось бы по одной клетке.

Гибридомы-продуценты моноклональных антител культивируются in vitro и in vivo. Постепенно по мере роста в питательной среде культуры клеток пересеиваются с меньших объёмов на большие для наработки гибридных клеток, продуцирующих антитела. Во время культивирования отбираются пробы для тестирования с целью определения стабильности антителопродукции.

Для культивирования гибридных клеток in vivo, они вводятся мышам линии BALB/с внутрибрюшинно. На 10-20 день собираются асцитные жидкости, содержащие моноклональные антитела.

Рисунок 5 - Схема получения моноклональных антител

Главной заслугой Мильштейна и Келлера явилась непосредственно разработка методики, а также возможность использования получаемых гибридом для широкомасштабного производства моноклональных антител [89].

В 1980 г. Карло М. Кроче с сотрудниками (США) создали внутривидовую человеческую гибридому, продуцирующую антигены, путем слияния В лимфоцитов миеломного больного с периферическими лимфоцитами от больного с подострым панэнцефалитом. В последующие годы были получены другие линии клеток-носителей, однако наиболее распространенным типом гибридом являются гибридомы на основе мышиных клеток.

Моноклональные антитела (МА) высокоспецифичны, они направлены против одной антигенной детерминанты. Возможно получение нескольких моноклональных антител на разные антигенные детерминанты, в том числе сложные макромолекулы. Свойства МА позволяют изучать структуры и биологические функции антигенов, как потенциальных компонентов вакцинных препаратов, являются основой для создания диагностических и профилактических препаратов и используются в разработке диагностических тест-систем.

В начале 80-х годов появились первые публикации о получении МА к различным антигенам P. aeruginosa. На сегодняшний день получены моноклональные антитела к большинству из них: ЛПС, белкам наружной мембраны и ЭТА [90, 91, 92, 93].

Использование МА позволило дополнить сведения о структуре и функциях многих антигенов P. aeruginosa, что способствовало разработке новых способов идентификации данного микроорганизма. Благодаря свойствам МА, на их основе можно создать высокоспецифичные иммунодиагностические реагенты [94].

Получение и изучение МА к различным антигенам наружной мембраны синегнойной палочки ведется наиболее активно, так как данные антигенные компоненты обеспечивают устойчивость бактерии к различным факторам среды, формируют каналы проницаемости клеточной стенки для различных веществ, в том числе лекарственных препаратов.

Изучение состава О-антигена ЛПС P. aeruginosa с помощью МА позволило серотипировать штаммы бактерии, подтвердив наличие серотип - специфических вариантов макромолекулы. В настоящее время для серотипирования P. aeruginosa используется схема, созданная Международным Комитетом по Систематической Бактериологии (IATS) из 20 серогрупп, которым соответствует около 20 определенных форм ЛПС.

Созданные субсеротип-специфические моноклональные антитела, способны выявлять специфические последовательности липида А синегнойной палочки [91], могут также использоваться для создания единой панели МА, с целью идентификации и диагностики P. aeruginosa.

Отечественными учеными получена панель МА к поверхностным антигенам клеточной стенки синегнойной палочки. В иммуноферментном и иммунофлуоресцентном анализах панель позволяет с высокой специфичностью, проводить экспресс выявление P. aeruginosa в пробах из объектов внешней среды и биологического материала при исследовании инфицированных животных [95].

Также проведены многочисленные исследования для изучения белков наружной мембраны с помощью МА. Были получены моноклональные антитела к порообразующего белку OprF, на их основе были созданы и протестированы тест-системы [96], идентифицирующие P. aeruginosa.

Так как одним из основных факторов патогенности синегнойной палочки является ЭТА, изучению его структуры и получения МА посвящено много работ. На сегодняшний день получены моноклональные антитела ко всем доменам ЭТА (Iа, Ib, II, III) [97, 98, 99, 100, 101]. Однако методов выявления ЭТА и тест-системы для определения токсигенности изолятов Pseudomonas aeruginosa нет.

Данные литературы подтверждают возможности использования МА для обнаружения, идентификации и серотипирования штаммов P. aeruginosa, а также выявления факторов вирулентности бактерии.

В ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» РАМН получены моноклональные антитела к рекомбинантному белку OprF-aTox. Предполагается использование полученных антител для стандартизации получения препарата рекомбинантного белка OprF- aTox и, возможное их использование как терапевтического препарата, с условием их гуманизации.

Исходя из данных литературы, наиболее перспективными оказались многовалентные конъюгированные генно-инженерные вакцины. В первую очередь это связано с тем, что при их разработке учитываются наиболее иммуногенные компоненты P. aeruginosa и в то же время отсутствуют антигены, вызывающие различные нежелательные реакции, и не участвующие в иммунном ответе. Кроме того в вакцинах такого типа используется сразу несколько антигенных компонентов, что позволяет воздействовать на патоген на различных стадиях инфекции.

Несмотря на значительные успехи в различных областях медицины, проблема внутрибольничных инфекций, вызванных P. aeruginosa ещё далека от разрешения. Возбудитель быстро вырабатывает резистентность к антибиотикам различных классов, в связи с этим обычная терапия часто не приводит к положительным результатам.

В России не зарегистрировано иммунопрепаратов для предупреждения и лечения инфекций, вызываемых P. аeruginosa. Разработанные на сегодняшний день экспериментальные вакцины и моноклональные антитела протестированы только в доклинических испытаниях, лишь часть из них достигла клинической фазы. Но ни одна из этих вакцин не получила коммерческого разрешения для терапии синегнойной инфекции.

Важной задачей является создание иммунопрепаратов для стандартизации вакцины против P. аeruginosa, а именно моноклональных антител и создание на их основе теста для стандазации компонентов вакцины.



2. Материалы и методы

2.1 Оборудование и материалы

2.1.1 Клеточные линии

В работе использованы клеточные линии из коллекции лаборатории гибридом ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» СНО -- линия клеток яичника китайского хомячка

2.1.2 Антигены и антитела

Материалами исследований явились: экзотоксин А Pseudomonas aeruginosa («Sigma» кат. № P0184); рекомбинантные белки P. aeruginosa, полученные в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории протективных антигенов «ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова»: рекомбинантный ЭТА, моноклональные антитела к рекомбинантным белкам aTox, OprF и OprF-aTox.

2.1.3 Оборудование

В работе были использованы: автоматические пипетки (Biоhit, Eppendоrf); пипеточный дозатор midi plus (Biohit); программируемая центрифуга Avanti j-e (Bеckman cоultеr); вортекс Biovortex V1 (Biosan); настольная центрифуга 5720 (Eppеndоrf); магнитная мешалка MSH 300 (Biosan); весы электронные GX-600 (AND); рН-метр PB-11 (Sartorius); шейкер-инкубатор ST-3L Sky line (Elmi); орбитальный шейкер-инкубатор ES20 (Biosan); ферментер Анкум 2М (Россия); хроматографическая система BioLogic LP (BioRad); планшетный спектрофотометр Multiskan Ascent (Thermo labsystems). синегнойный антитело микроорганизм

2.1.4 Реактивы

Канамицин, перекись водорода, карбонатно-бикарбонатный буфер (КББ), акриламид, бромфеноловый синий, глицерин, трис- гидроксилметиламинометан Tris (Helicon) Среда Лурия-Бертани LB («Amresco», Am-J106-2,0), изопропил-в-D-галактопиранозид (ИПТГ) («Thermo scientific», кат. № R0393), мочевина («Amresco», кат. № Am-O378-5.0), Ni-агароза, PBS («Amresco», кат. № Е404-200), Tween-20 («Promega», кат. № H5151), антивидовые антитела к иммуноглобулинам G, M и А мыши меченые пероксидазой хрена («Имтек», кат. № P-RAM Iss), ТМБ (НПО «Био Тест Системы»), обезжиренное молоко («AppliChem», кат. № 271-045-3), имидазол («Quagen», кат. № 1000658), нитроцеллюлозная мембрана («Bio- Rad», кат 162-0147), RPMI-1640 (ФГУП «Предприятие по производству вирусных и бактериальных препаратов института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова»)

2.2 Методы

2.2.1 Получение рекомбинантного белка OprF- aTox

Гибридный рекомбинантный OprF-aTox белок, включающий аминокислотные последовательности белка F наружной мембраны и экзотоксина A Pseudomonas aeruginosa получили выращиванием соответствующего бактериального продуцента в соответствии с методикой, разработанной в лаборатории протективных антигенов «ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова». Штамм бактерий Еscherichia coli PA-OPRF-ЭTA, был получен трансформацией родительского штамма бактерий Escherichia coli BL21(DE3) плазмидной ДНК рРА-OPRF-ЭTA [102].

Получение рекомбинантного белка OprF- aTox проводили в три этапа. На первом этапе осуществляли культивирование штамма Е.coli PA-OPRF- ЭTA и индукцию экспрессии гена рекомбинантного белка. Второй этап включал в себя получение клеточного лизата штамма Е.coli PA-OPRF-ЭTA после экспрессии рекомбинантного гена. На третьем этапе проводили хроматографическую очистку рекомбинантного белка OprF- aTox.

2.2.2 Индукция экспрессии рекомбинантного белка OprF-aTox

Единичной колонией штамма-продуцента E. coli PA-OPRF-ЭTA инокулировали 5 мл жидкой питательной среды Luria Bertani (LB) с содержанием антибиотика канамицина и культивировали в термостатируемом шейкере в течение 8 ч при температуре 37 °С и скорости перемешивания 250 об./мин, а затем пересевали на больший объем.

Культивировали посевной материал штамма Е. coli PA-OPRF-ETA в жидкой питательной среде Luria Bertani (LB), объемом 500 мл и содержащей 50 мкг/мл канамицина, в термостатируемом шейкере при температуре 37 °С и скорости перемешивания 250 об./мин в течение 12 ч. Затем полученную культуру пересевали в 10 л среды LB и выращивали в ферментёре при температуре 37 °С, концентрации растворенного кислорода 30% и перемешивании 300 об./мин до достижения оптической плотности значения

0,6 при длине волны 600 нм, после добавляли ИПТГ (Изопропил-в-D-1- тиогалактопиранозид) и культивировали ещё 4 ч.

2.2.3 Получения клеточного лизата штамма Е.coli PA-OPRF-ЭTA после экспрессии рекомбинантного гена

Бактериальную массу методом микрофильтрации концентрировали до объема 1,5 л с использованием фильтрационной мембраны и осаждали центрифугированием со скоростью вращения 3000 об./мин в течение 10 мин. Лизис осадка бактериальной массы проводили в растворе, содержащем 8 М мочевины, 0,1 М NaH2PO4 и 0,01 М Tris (pH=8,0) в шейкере со скоростью вращения 250 об./мин при комнатной температуре в течение 12 ч. Затем лизат освобождали от нерастворенных клеточных фрагментов центрифугированием со скоростью вращения 15000 об./мин при комнатной температуре в течение часа. Супернатант переносили в чистую колбу.



2.2.4 Хроматографическая очистка рекомбинантного белка OprF -aTox

Электрофорез белков проводили в 12 % полиакриламидном геле. К пробе, содержащей анализируемые белки, добавляли равный объем 2-х кратного Sample буфера (100 мМ Tris-HCl (pH 6,8,) 200 мМ 2- меркаптоэтанол, 20 % глицерин, 0,2 % бромфеноловый синий), затем кипятили 5 мин. После образцы вносили в лунки, образованные концентрирующим гелем (2,5 мл буфера Tris-HCl pH 6,8 (Tris 3,94 г, ДСН 0,1 г на 100 мл воды), 0,5 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида и 2 мл воды. Разделяющий гель получали полимеризацией раствора, имеющего состав: 3,5 мл 30 % раствора акриламида/бисакриламида, 4,5 мл буфера Tris- HCl pH 8,8 (Tris 11,8 г, ДСН 0,2 г, на 100 мл воды) и 1,5 мл воды.

Электрофорез проводили в трис-глициновом буфере (Tris-base 3 г, глицин 14,4 г, ДСН 1 г на 1 л воды) в камере VE-1 (Helicon) при величине силы тока 15 мА. Электрофорез останавливали при достижении краской нижней границы геля. Белки в геле окрашивали с помощью раствора Кумасси (0,25 % кумасси R-250; 45,4 % этанол; 9 % уксусная кислота) в течение 1-2 ч, а затем отмывали в водном растворе 7 % уксусной кислоты и 25 % этанола до обесцвечивания геля.

2.2.5 Иммуноферментный анализ (ИФА)

В основе ИФА лежит принцип специфического взаимодействия между антигеном и соответствующим ему антителом.

Предварительно в лунки 96-луночного планшета вносили по 100 мкл растворов антигенов в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). В качестве антигена, сорбированного на планшет, использовали рекомбинантный ЭТА, белок OprF, слитный рекомбинантный белок ЭТА и OprF. Все антигены вносили в концентрации 5 мкг/мл. Сорбция проводилась в течение ночи при температуре 4°С.

Сенсибилизированные планшеты трижды отмывали буфером PBS c 0,05 % Tween, после чего в лунки вносили по 100 мкл супернатантов растущих гибридных культур в разведении 1/10. Планшеты инкубировали в термостате в течение 1 ч, после чего трижды омывали PBS c 0,05 % Tween. Затем в лунки вносили по 100 мкл конъюгата антител к мышиным Igs c пероксидазой хрена с разведением 1/2000 (рабочее разведение). Инкубировали в термостате 50 мин при температуре 37°С. После снова промывали PBS c 0,05 % Tween 3 раза, после третьего раза промывали дистиллированной водой. После этого в лунки вносили по 100 мкл готовой субстратной смеси ТМБ + Н2О2, а планшеты на 8 мин помещали в темноту. Затем во все лунки планшетов вносили по 50 мкл 1М серной кислоты для остановки изменения окраски. Оптическую плотность в пробах определяли на вертикальном фотометре при длине волны 450 нм.

Результаты анализа антигенной активности рекомбинантного ЭТА, белка OprF, слитного рекомбинантного белка ЭТА и OprF в ИФА определяли по средним значениям титров антител.

2.2.6 Иммунодот вариант иммуноферментного анализа

Реакцию проводили в пластиковых пробирках на 10 мл. На нитроцеллюлозную бумагу наносили ToxA и OprF в нативной форме (в PBS) и в денатурированной так, чтобы каждое пятно содержало по 0,25 мкг белкового препарата.

Для приготовления денатурированной формы белков к пробам добавляли равный объем 2-х кратного Sample буфера (100 мМ Tris-HCl (pH 6,8), 200 мМ 2-меркаптоэтанол, 20 % глицерин, 0,2 % бромфеноловый синий), кипятили 5 мин и наносили на нитроцеллюлозу.

После нитроцеллюлозную мембрану высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 1 ч и инкубировали в растворе 3% обезжиренного молока в PBS при температуре 4 °С всю ночь или 2 ч при температуре 37 °С.

Затем в пробирки добавляли буфер (1% обезжиренное молоко в PBS, 1/100 часть лизата, 1/15 моноклональных антител) объемом 7 мл и опускали нитроцеллюлозную мембрану. Инкубировали в течение 1 ч при температуре 37 °С в термостатируемом шейкере при слабом покачивании (80 об/мин). После мембрану промывали в растворе 0,5 % молока в PBS с 0,5% tween 3 раза.

Инкубацию с вторичными антителами, мечеными пероксидазой хрена проводили в тех же условиях в течение 1 ч. Отмывку проводили по описанному выше методу.

Окрашивание мембраны проводили в растворе диаминобензидина (0,1 г диаминобензидина, 30 мкл 30% перекиси водорода и 50 мкл 1 мМ имидазола в 10 мл 50 мМ Tris-HCl (pH 7.5)).

2.2.7 Цитотоксический тест

Для постановки цитотоксического теста использовали линию клеток яичника китайского хомячка (СНО). Клетки СНО предварительно размораживали, промывали и культивировали в стеклянных чашках Петри на среде RPMI с добавлением 5 % СПК и L-глутамина.

Для постановки теста в лунки 96-луночного культурального планшета вносили 200 мкл питательной среды, содержащей 104 клеток СНО, где содержались различные дозы рекомбинантного экзотоксина А (ЭТА1 - 150 мкл/мл, ЭТА2 - 105мкл/мл и ЭТА3 - 10,5 мкл/мл) в объеме 50 мкл. В качестве отрицательного контроля использовали среду RPMI с клетками. Культивирование проводили в термостате при температуре 37 °С в атмосфере с 5% СО2. Результаты оценивали по истечению 3-х дней под инвертированным микроскопом. Интенсивность токсического эффекта оценивали визуально.

За минимальную цитотоксичную дозу принимали разведение ЭТА, при котором гибель клеток составляла не менее 50 %.



2.2.8 Нейтрализация цитотоксичности

Протективную активность моноклональных антител оценивали in vitro на культуре клеток CHO.

В лунки 96-луночного планшета вносили пробы супернатантов и асцитных жидкостей гибридных культур, содержащих моноклональные антитела в объёме 100 мкл. Затем в каждую лунку вносили 4 минимальные цитотоксичные дозы рекомбинантного ЭТА в объёме 50 мкл, после в лунки вносили суспензию клеток СНО с концентрацией 104 клеток в 100 мкл среды. Клетки культивировали в термостате при температуре 37 °С в атмосфере с 5% СО2. В качестве отрицательного контроля использовали среду с клетками, в качестве положительного контроля ЭТА в объёме 100 мкл, также осуществляли контроль заявленных свойств. Результаты оценивали через 3 сут под микроскопом.



3. Оценка взаимодействия моноклональных антител с рекомбинантными белками Pseudomonas aeruginosa

3.1 Получение рекомбинантных форм OprF-aTox

Рекомбинантные белки получали культивированием штаммов продуцентов по методике, разработанной в лаборатории протективных антигенов ФГБНУ «НИИВС им. И.И. Мечникова». Все полученные рекомбинантные белки проанализированы в ПААГ по Лэммли. В результате экспрессии наблюдался синтез рекомбинантного продукта с массой около

100 кДа, расчетная масса рекомбинантного белка OprF-aTox -- 105 кДа. Рекомбинантные белки содержали на N-конце дополнительную аминокислотную последовательность из шести гистидиновых остатков, что позволило аффинно выделять их колонках с Ni-сефарозой. Этот метод основан на образовании ионных связей шестигистидиновой последовательности с Ni2+ при pH 8,0 и разрушении их при понижении до pH 4,5. В результате экспрессии генов рекомбинантных белков наблюдали образование белковых продуктов, размер которых соответствовал расчётному молекулярному весу для каждого белкового препарата (aTox - 73,8 кДа; OprF - 40 кДа; OprF-aTox - 105 кДа ) (рис. 6).

Рисунок 6 - Анализ белковых продуктов в электрофорезе: дорожки: 1 - F-aTox без индукции; 2 - F-aTox с индукцией; 3 - белковый весовой маркер; 4 - очищенный хроматографически рекомбинантный белок F-aTox; 5 - очищенный хроматографически рекомбинантный белок aTox; 6 - очищенный хроматографически рекомбинантный белок OprF.

3.2 Тестирование первичных гибридных культур в ИФА

Ранее в лаборатории клеточных гибридов ФГБУ «НИИВС им. И.И. Мечникова» наработанными рекомбинантными антигенами иммунизировали мышей линии BALB/c. Схема иммунизации предусматривала трехкратное внутрибрюшинное введение 25 мкг на мышь рекомбинантного белка OprF-aTox с интервалами 2 недели, сорбированного на гидроксиде алюминия. При третьем введении 25 мкг рекомбинантного белка OprF-aTox разводили на физрастворе. Гибридизацию проводили через 3 дня. Спленоциты иммунных мышей сливали с клетками мышиной миеломы P3-X63-Ag8.653 для получения гибридом. Было получено 12 новых гибридных культур - продуцентов Ат.

Для определения параметров ИФА, выполнена серия предварительных экспериментов по подбору оптимальных концентраций белков, сорбируемых на планшете, и разведения конъюгата. Оптимальная концентрация для белков aTox, OprF и OprF-aTox составила 5 мкг/мл КББ, а рабочее разведение конъюгата - 1:2000.

Cупернатанты культур тестировали в ИФА в разведении 1/10. За отрицательный результат принимали оптическую плотность ниже 0,16 при значении отрицательного контроля 0,08. (табл. 1)

Таблица 1 Взаимодействие проб антител с рекомбинантным белками aTox, OprF и OprF- aTox в ИФА

№	aTox	OprF	OprF- aTox
1	2,114	2,083	2,102
2	1,340	1,331	1,468
3	0,979	1,045	0,572
4	1,203	1,518	1,705
5	1,215	1,545	1,705
6	1,089	0,105	1,793
7	1,190	0,100	1,815
8	0,082	2,160	1,964
9	0,178	1,773	1,656
10	2,095	1,362	1,809
11	1,046	0,043	1,750
12	1,027	0,102-	1,892

Полученные гибридные культуры были разделили на 3 группы:

1. Взаимодействующие в ИФА с OprF и слитным белком OprF- aTox, но не взаимодействующие с aTox: № 8, 9 (n=2).

2. Взаимодействующие с aTox и слитным белком OprF-aTox, но не взаимодействующие с OprF: №№ 6, 7, 11, 12 (n=4).

3. Взаимодействующие со всеми рекомбинантными белками aTox, OprF и OprF- aTox: №№ 1, 2, 3, 4, 5, 10 (n=6).

3.3 Тестирование МА в иммунодот варианте иммуноферментного анализа

Данные моноклональные антитела для дополнительной характеристики оценили в иммунодот варианте иммуноферментного анализа, по их взаимодействию с антигенами, где определяющими силами при адсорбции антигена являются полярные и электростатические, а не гидрофобные, как при сорбции на полистироле.

Для этого рекомбинантный экзотоксин А (ToxA) в нативной или денатурированной форме, обработанной денатурирующими агентами наносили на нитроцеллюлозную мембрану (пятна B и Г- рис.7). Так как антитела были получены при иммунизации слитным рекомбинантным белком OprF-aTox, дополнительно представляло интерес сравнить взаимодействие антител отдельно с белком OprF, который также обрабатывали или не обрабатывали денатурирующими агентами (пятна А и Б- рис.7).

Мембрану высушивали, инкубировали с моноклональными антителами, затем проявляли антивидовыми антителами, мечеными пероксидазой хрена. Результат оценивали визуально по интенсивности окраски.

Рисунок 7 - Взаимодействие МА с рекомбинантными белками aTox и OprF в иммунодот варианте ИФА: А - OprF в нативной формой, не обработанный денатурирующими агентами; Б - OprF в денатурированной форме, обработанный 2- меркаптоэтанолом; В - ToxA в нативной формой, не обработанный денатурирующими агентами; Г - ToxA в денатурированной форме, обработанный 2-меркаптоэтанолом; №1-12 - нумерация гибридных культур

Большинство антител №№ 6, 7, 11, 10, 12 (n=5) взаимодействовали только с ToxA, причем как в нативной, так и в денатурированной форме. Результаты соответствовали таковым по иммуноферментному анализу.

Антитела №№ 8 и 9 (n=2) взаимодействовали только с OprF в нативной и денатурированной форме. В ИФА данные антитела взаимодействовали также только с OprF.