Главная
База знаний "Allbest"
Биология и естествознание
Особенности накопления флаванов в клетках высших растений (на примере культуры ткани Camellia sinensis L.)
Особенности накопления флаванов в клетках высших растений (на примере культуры ткани Camellia sinensis L.)
Флаваны в высших растениях: структура, основные представители, локализация, функциональная роль. Морфофизиологические и биохимические характеристики клеточных и каллусных культур чайных растений. Определение содержания флаванов и проантоцианидинов.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | дипломная работа |
| Язык | русский |
| Дата добавления | 02.02.2018 |
| Размер файла | 2,4 M |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
54
Размещено на http://www.allbest.ru/
Особенности накопления флаванов в клетках высших растений (на примере культуры ткани Camellia sinensis L.)
Содержание
- Введение
- 1. Литературный обзор
- 1.1 Флаваны в высших растениях: структура, представители, локализация, функциональная роль
- 1.2 Структура, представители и биосинтез флаванов
- 1.3 Локализация фенольных соединений и их функциональная роль в растениях
- 1.4 Клеточные культуры высших растений
- 1.5 Получение клеточных культур растений и условия их культивирования
- 1.6 Морфофизиологические и биохимические характеристики клеточных культур растений
- 1.7 Регуляция накопления биологически активных веществ в культурах in vitro
- 1.8 Растения чая и инициированные из них культуры in vitro
- 1.9 Каллусные и суспензионные культуры чая
- 2. Объекты и методы исследования
- 2.1 Объект исследования
- 2.2 Постановка опытов
- 2.3 Морфофизиологические характеристики каллусных культур
- 2.4 Определение ростовых характеристик каллусных культур
- 2.5 Определение содержания воды и оводненности каллусов
- 2.6 Фиксация растительного материала для биохимических исследований
- 2.7 Получение экстрактов для определения различных классов фенольных соединений
- 2.8 Определение содержания флаванов
- 2.9 Определение содержания проантоцианидинов
- 2.10 Статистическая обработка данных
- 3. Результаты и обсуждения
- 3.1 Морфофизиологические и биохимические характеристики каллусных культур чая, инициированных из стебля, листа и корня
- 3.1.1 Морфологические характеристики каллусных культур чая
- 3.2 Изменения в содержании флаванов и проантоцианидинов в каллусных культурах чая
- 3.3 Рост и образование соединений флавановой природы в гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культурах стебля чайного растения
- 3.3 Морфологические характеристики гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культур стебля чайного растения
- 3.4 Динамика образования соединений флавановой природы в гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культурах стебля чайного растения
- 3.5 Кратковременное действие Н2О2 на гетеротрофные и фотомиксотрофные каллусы чайного растения
- 3.5.1 Морфофизиологические характеристики каллусных культур чайного растения стеблевого происхождения после кратковременного действия на них Н2О2
- 3.5.2 Содержание флаванов и проантоцианидинов в каллусных культурах чайного растения после кратковременного действия на них Н2О2
- Выводы
- Список используемой литературы
Введение
Одними из самых распространенных вторичных метаболитов, вырабатываемых растениями, являются фенольные соединения, к которым относятся и флаваны. Фенольные соединения являются естественными антиоксидантами растений. Эти вещества защищают растения от окислительного стресса. Кроме того, фенольные соединения необходимы и для человека. Они используются в фармакологии, так как могут регулировать окислительно-восстановительные процессы в организме человека и животных, а также они, в отличие от синтетических аналогов, не вызывают серьезных побочных эффектов при лечении.
В настоящее время, из-за перспектив использования этих веществ в медицине, растет интерес к исследованию действия флаванов на организм человека. Выяснено, что они могут оказывать капилляроукрепляющее, спазмолитическое, антистрессовое и другие действия. [9,13,33,34]
Согласно литературным данным, наибольшее количество фенольных соединений вырабатывается растениями чая (Camellia sinensis L.), груши дикой, айвы обыкновенной, барбариса, шефердии серебристой. [5,7]. Однако для получения каких-либо веществ природного происхождения в современном мире обычно используют каллусные культуры, выращиваемые в условиях in vitro, так как они сохраняют многие свойства интактного растения, в том числе, способность к синтезу фенольных соединений. Выращивание каллусной культуры в контролируемых условиях позволяет изменять условия выращивания и создавать, таким образом, культуры - сверхпродуценты, которые могут синтезировать необходимые вещества в количествах, в несколько раз превышающих синтез этих веществ целыми растениями. [3,11] Ранее соотношение флаванов и проантоцианидинов в процессе роста каллусных культур не изучалось. Поэтому очень важно было изучить условия, при которых каллусная культура растения чая вырабатывает наибольшее количество этих веществ.
Целью данной работы являлось изучение накопления фенольных соединений флавановой природы в каллусных культурах чайного растения и влияния на этот процесс перекиси водорода, как одной из важнейших сигнальных молекул в растительных клетках.
Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
• сравнить накопление флаванов, в том числе и их полимерных форм - проантоцианидинов, в разных штаммах каллусных культур чайного растения;
• изучить динамику накопления флаванов и проантоцианидинов в процессе роста гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культур стебля чайного растения;
• изучить влияние кратковременного действия перекиси водорода на рост и морфофизиологические характеристики гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культур стебля чайного растения;
• исследовать действие перекиси водорода на накопление флаванов и проантоцианидинов в гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культурах стебля чайного растения.
1. Литературный обзор
1.1 Флаваны в высших растениях: структура, представители, локализация, функциональная роль
Флаваны это наиболее восстановленные соединения фенольной природы.
Фенольные соединения - это вещества, в молекулах которых содержится бензольное ядро с одной или несколькими гидроксильными группами. [9] Фенольные соединения в большом количестве синтезируются в растениях, и являются их характерной чертой и необходимым компонентом жизнедеятельности. Они обнаруживаются во всех высших, и в некоторых низших растениях. [6]
В животных клетках фенольные соединения не синтезируются, их присутствие в тканях, зависит только от потребления в пищу продуктов растительного происхождения. [36]
Для всех фенольных соединений характерна окисляемость, благодаря которой образуются высоко реактивные промежуточные продукты, способные к взаимодействию с белками за счет создания водородных связей и склонные к комплексообразованию с ионами металлов. Поэтому фенолы обладают высокой реакционной способностью. [9]
Классификация фенольных соединений основывается на анализе структуры фенольной части молекул, однако разные группы фенольных соединений различаются также молекулами углеводов, органическими кислотами и другими веществами, прикрепленными к ароматическому кольцу. [17] Из-за большого разнообразия фенольные соединения трудно классифицировать. Обычно их группы подразделяют в соответствии со строением углеродного скелета:
ѕ С6-С1-соединения: протокатеховая, галловая (и их производные), орселлиновая, лишайниковая кислоты, есть так же фенольные соединения со строением С1-С6-С6-С1 (эллаговая, гексаоксидефеновая кислоты и их производные), но по свойствам их относят к первой группе, выделяя в подгруппу.
ѕ С6-С3-соединения: кумарин (и его глюкозиды), феруловая, кофейная, пара-оксикоричная, хлорогеновая кислоты (и их производные), конифериловый спирт;
ѕ С3-С6-С3-соединения: флавоноиды. Их особенности синтеза и накопления изучены недостаточно хорошо. [9]
Простые фенольные соединения могут быть в качестве блоков в структуре более высокоорганизованных полифенольных соединений, в которых есть несколько гидроксильных групп или нескольких ароматических колец. Ароматические кольца соединяются между собой различными способами. [17]
1.2 Структура, представители и биосинтез флаванов
Самым изученным классом полифенольных соединений и самым многочисленным являются флавоноиды (около 8000 структур). Они присутствуют во всех тканях растений в виде разнообразных структурных форм. Фенольный каркас флавоноидов состоит из 15 атомов углерода. [17,35]
Они имеют дифенилпропановый скелет, а именно два ароматических ядра, между которыми находится трехуглеродный компонент, а также в большинстве случаев являются производными 2 веществ:
ѕ хромона;
ѕ флавана.
Рис. 1. Строение хромона и флавана.
Все флавоноиды можно разделить на 11 классов по степени окисления или восстановления трехуглеродного фрагмента: флаваноны, катехины, дигидрохалконы, лейкоантоцианидины, антоцианидины, халконы, флавоны, флаванонолы, флаванолы, ауроны и флаваны (незамещенные в пирановом ядре). Это разнообразие достигается за счет наличия асимметрических атомов углерода в пирановом гетероцикле, разнице в метилировании, ацилировании, гидроксилировании, О - и С - гликозидировании ароматических ядер. [9]
Флаваны же подразделяются на 4 группы: собственно флаваны, флаван-3,4-диолы, флаван-4-олы и наиболее восстановленные флавоноидные соединения - катехины (флаван-3-олы). Они не имеют широкого распространения в растениях по сравнению с другими флавоноидами. [17] Катехины - самые исследованные из них. Они являются предшественниками в синтезе проантоцианидинов.
Рис. 2. Основные классы флавоноидов.
Это большое разнообразие фенольных соединений имеет общие черты строения и биогенетическую природу. Многие из них синтезируются из одного вещества - шикимовой кислоты, поэтому такой путь биосинтеза называется шикиматным. [9] Также есть и другой путь биосинтеза - ацетато-малонатный или поликетидный. Нередко эти пути идут одновременно.
Кольцо А молекул флавоноидов образуется из ацетата, с образованием поликетида, а кольцо В из продуктов, образовавшихся в шикиматном пути. [9]
Рис. 3. Схема молекулы флавоноида.
Шикиматный путь начинается с конденсации двух веществ: фосфоенолпирувата и эритрозо-4-фосфата, образовавшихся в процессе гликолиза и пентозофосфатного цикла. В результате образуется 3-дезокси-D - арабиногептулозонат-7-фосфат, который в результате ряда реакций (3 - дезокси-D-арабиногептулозонат-7-фосфат®3-дегидрохинная кислота®3 - дегидрошикимовая кислота®шикимовая кислота) образует шикимовую кислоту. Затем шикимовая кислота в результате фосфорилирования и присоединения молекулы фосфоенолпирувата образуется хоризмовая кислота, дающая начало либо L-фенилаланину и L-тирозину. Из-за дезаминирования L-фенилаланина, получается самый простой представитель фенилпропаноидов - транс-коричная кислота. Почти также из L-тирозина образуется n-оксикоричная кислота, но масштабы его дезаминирования меньше по сравнению с L-фенилаланином, являющимся основным предшественником фенольных соединений. Далее транс-коричная кислота в результате ряда реакций (транс-коричная кислота®n-кумаровая кислота®кофейная кислота®феруловая кислота®5-оксиферуловая кислота®--синаповая кислота) дает начало оксикоричным кислотам, являющимся основными представителями фенилпропаноидного блока фенольных соединений. [7,32]
Рис. 4. Шикиматный и ацетато-малонатный пути биосинтеза фенольных соединений
Поликетидный путь начинается с конденсации n-кумарил-СоА и трех молекул малонил-СоА. В результате образуется халкон, а именно тетраоксихалкон. Он же под действием фермента преобразуется во флаванон нарингенин. Из-за изменения степени окисления центрального гетероциклического кольца молекулы после окислительно-восстановительных реакций нарингенин является предшественником всех других классов флавоноидов, за исключением халконов и дигидрохалконов. Поликетидный путь используется в основном низшими растениями. [9]
1.3 Локализация фенольных соединений и их функциональная роль в растениях
Многие вторичные соединения, в том числе и фенольные соединения, накапливаются в вакуолях (в центральной или в нескольких более мелких). К вакуолям же их транспортируют микровезикулы. Также фенольные соединения (особенно флавоноиды) находятся в пластидах, которые являются местом первичного синтеза. Третьим местом локализации фенольных соединений служит клеточная стенка, служащая местом образования и отложения фенольного полимера лигнина, а также содержащая оксикоричные кислоты и некоторые флавоноиды, например, проантоцианидины и катехины (формируют лигноуглеводные комплексы клеточной стенки). [9,28,38,40]
Большое разнообразие фенольных соединений связано с многообразием их функций, которые можно условно разделить на две большие группы:
ѕ функции широкого плана, характерные для многих фенольных соединений;
ѕ узкоспециализированные функции, характерные для специфических фенольных соединений. [9]
Функции широкого плана выполняются всеми фенольными соединениями, включая фенилпропаноиды и флаваны. Преобладающая роль флавоноидов отмечается в участии в окислительно-восстановительных процессах, а также они могут быть аттрактантами, сигнальными молекулами и антистрессовыми агентами.
Некоторые флавоноиды формируют яркую окраску плодов и цветков растений, для привлечения животных, участвующих в опылении, размножении и распространении растений.
Как сигнальные молекулы флавоноиды помогают в процессе прорастания, ауксиновом обмене.
Защитная (антистрессовая) функция флавоноидов против механического повреждения, инфекций, насекомых, ультрафиолетового излучения, температурного стресса осуществляется за счет их участия в окислительно-восстановительных процессах и антибиотической активности, а также способности связываться с протеинами и служить материалом для построения клеточной стенки. [12,29]
Благодаря функции протекторов этих соединений против любых абиотических и биотических стрессоров можно считать флавоноиды универсальными физиологическими адаптогенами к неблагоприятным факторам окружающей среды. [13,40]
Остальные фенольные соединения кроме того могут образовывать лигнин из простых стандартных фенольных соединений, придавать улучшенные механические свойства клеточной стенке феруловой кислотой, участвовать в формировании суберина, основного компонента раневой эпидермы, и кутина-структурного полимера кутикулы. [23,27,30,37,39,41]
Специализированные функции флавоноидов это участие в опылении - рост пыльцевой трубки и прорастание пыльцы. Например, при блокировке образования флавоноидов, у кукурузы наступает самостерильность. [14]
Так же флаваноиды являются компонентами электротранспортных цепей у митохондрий и хлоропластов. Они могут быть специфическими защитными агентами в патогенезе растений. То есть растение синтезирует нужное ему фенольное соединение, обладающее фунгицидной, бактерицидной или противовирусной активностью. [9]
Еще одной функцией флаванов является выполнение роли сигналов при создании симбиоза растений с клубеньковыми бактериями или микоризными грибами. [13]
Кроме того, специализированные функции выполняются и другими фенольными соединениями. К ним относятся: участие в обеспечении двигательных функциях растений (в виде гормонов) и разобщение окислительного фосфорилирования. [9,24]
Все перечисленные выше функции фенольных соединений, и в частности флавоноидов можно объединить в таблицу 1. [7]
Таблица 1. Основные функции, выполняемые фенольными соединениями в растениях и участвующие в них компоненты
|
Функция |
Участвующий компонент |
||
|
Переносчики электронов электротранспортных в цепях |
Убихиноны, флавоноиды |
пластохиноны, |
|
|
Структурная: древесина (ксилема), кутикула, клеточная стенка |
Лигнин, димерыоксикоричных кислот |
||
|
Сигнальная: во взаимоотношениях растения - микроорганизмы, опыление, патогенез |
Ацетофенолы, оксикоричные кислоты, оксикоричные спирты, флавоноиды, салициловая кислота |
||
|
Резервная (запасные вещества) |
Флавоноиды, оксикоричные кислоты, оксибензойные кислоты |
||
|
Защитная: от механических повреждений, УФ-Б-радиации, атаки патогенов (фитоалексины), биотических и абиотических стрессов |
Лигнин, оксикоричные кислоты в составе суберина, флавоноиды, кумарины и некоторые другие фенольные соединения |
1.4 Клеточные культуры высших растений
Выращивание тканей и клеток эукариотических организмов на искусственно созданных питательных средах в условиях in vitro (стерильных) называется методом культуры изолированных тканей. Благодаря этому методу стало возможно решать некоторые практические и теоретические вопросы, одним из которых является получение большого количества биологически ценных растительных метаболитов, в частности более дешевых лекарств. [11]
флаван проантоцианидин чайное растение
1.5 Получение клеточных культур растений и условия их культивирования
Существует несколько типов культур клеток и тканей, отличающихся по способу и условиям культивирования, а также по происхождению. К ним относятся культура каллусных клеток с поверхностным культивированием, суспензионных клеток с глубинным культивированием и одиночных клеток. [3]
Основным объектом при культивировании in vitro в течении длительного времени является каллусная ткань. Это неорганизованная пролиферирующая ткань, состоящая из дедифференцированных клеток, специализирующихся затем как каллусные. [3,18,21]
Каллусную ткань в стерильных условиях можно получить почти из любой живой ткани растения. Способностью к каллусогенезу как in vivo, так и in vitro обладают представители всех порядков и классов растений. Но чаще всего используют для получения экспланта покрытосеменные и голосеменные растения, реже - низшие и споровые высшие растения. Наиболее удобными объектами для культивирования являются травянистые двудольные растения, а также травянистые однодольные и зерновые культуры. Труднее культивируются древесные растения, особенно голосеменные, так как древесные растения по мере старения теряют способность к каллусогенезу. [3,18]
Для того чтобы образовалась каллусная ткань in vitro ее клетки должны пройти процесс дедифференциации (утратить специфические свойства исходной ткани). В ходе дедифференциации клетки сначала теряют запасные вещества: белки, липиды, крахмал. Затем клетки способные к фотосинтезу теряют хлорофилл и липиды хлоропластов, увеличивается количество амилопластов, перестраивается цитоскелет и ЭПР, разрушается аппарат Гольджи. Клетки синтезируют РНК и ДНК, и после происходит экспрессирование генов белков, свойственных для каллусных клеток. Но белок быстро перестает вырабатываться. Для инициации каллусогенеза добавляют к питательной среде экзогенные гормоны в определенном порядке: сначала ауксины, затем цитокинины. [3,11] Разработаны определенные требования к выращиванию любой из культур клеток в условиях in vitro.
Первое, и очень важное, соблюдение полной асептики, так как микроорганизмы, попадающие на питательную среду, синтезируют токсины, останавливающие рост клеток культуры и приводящие к ее гибели. Поэтому все манипуляции с клетками и тканями проводят в обработанных ламинар - боксах или асептических комнатах, чистую посуду стерилизуют в сушильном шкафу сухим паром, а рабочие поверхности и инструменты - спиртом. Сам эксплант тоже стерилизуют, как поверхностно (промывание ткани в различных дезинфицирующих растворах), так и внутри при помощи антибиотиков, убивающих микроорганизмы. [3,18]
Второе требование к выращиванию культуры в стерильных условиях - многокомпонентные питательные среды. Хоть они и различаются по составу, есть обязательные компоненты: минеральные соединения (макро - и микроэлементы), источник углеродного питания (обычно сахароза или глюкоза), витамины, регуляторы роста (фитогормоны). Иногда в питательную среду добавляют эндоспермы незрелых зародышей кокоса, пасоку или экстракты растений, что приводит к интересным результатам. Для того чтобы питательная среда была твердой к ней добавляют очищенный агар-агар, полисахарид, который получают из морских водорослей. [11]
Наиболее универсальная и чаще всего подвергающаяся модификациям среда Мурасиге и Скуга. Она используется для поддержания неорганизованного каллусного роста, образования каллусов, морфогенеза многих двудольных растений.
Для выращивания культур в условиях in vitro важны и физические факторы, такие как свет, влажность, температура, аэрация. Для каждой культуры подбираются свои физические факторы. [3]
1.6 Морфофизиологические и биохимические характеристики клеточных культур растений
Каллусная ткань, в зависимости от происхождения и условий культивирования, может быть разной консистенции:
· рыхлой, состоящей из сильно оводненных клеток, легко распадающихся на отдельные мелкие агрегаты;
· средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами;
· плотной, в которой дифференцируются элементы камбия и сосудов. [3]
Каллусная ткань часто является аморфной массой паренхимных клеток, не имеющей строго определенной анатомической структуры. Цвет каллуса бывает белым, желтоватым, зеленым, если каллус начал фотосинтезировать, и красным, если в каллусе есть пигменты антоцианы. В длительно пересадочной культуре на средах, включающих ауксин, каллусные ткани теряют пигментацию и становятся рыхлыми. [18]
Каллусная культура сохраняет некоторые физиологические особенности, которые свойственны интактному растению. Это, например, морозостойкость, устойчивость к воздействию абиотических факторов (засолению, температуре) и конечно же способность к синтезу вторичных метаболитов. Но также у каллусных клеток появляются и свои, характерные лишь для них особенности. Это физиологическая асинхронность, генетическая гетерогенность, тотипотентность и гормоннезависимость. [21]
Генетическая гетерогенность - это появление в процессе культивирования анеуплоидных, полиплоидных клеток, а также клеток с хромосомными аберрациями и генными мутациями. Причинами генетической гетерогенности могут быть: генетическая гетерогенность исходного материала, действие компонентов питательной среды (ауксины являются мутагенами), нарушение коррелятивных связей при взятии экспланта, длительность культивирования (чем дольше, тем больше накапливаются генетически измененные каллусные клетки). Но не следует считать генетическую гетерогенность клеток недостатком, так как это чаще всего наоборот необходимое условие существования, основа адаптации. [18]
Еще одна особенность культуры клеток - физиологическая асинхронность. Это явление, при котором в определенный момент времени клетки находятся в разных фазах роста: делятся, растут, и стареют. Причинами асинхронности являются: особенности вида и генотипа растения, особенности экспланта, генетическая гетерогенность, изменение баланса эндогенных и экзогенных гормонов, физические факторы, аномалии в процессе митоза. [18,21]
Уникальным свойством клеточных культур in vitro является тотипотентность - свойство клетки использовать при определенных условиях имеющуюся у нее генетическую информацию, а затем давать начало целому организму. [3]
Последней же особенностью каллусной культуры является гормоннезависимость. Она может произойти из-за генетических (в результате мутации) и эпигенетических причин (в результате экспрессии генов, определяющих гормоннезависимость клетки). [18]
Как было ранее сказано, в условиях in vitro клетки и ткани сохраняют присущую интактному растению способность к синтезу вторичных соединений, в том числе фенольной природы. По сравнению с интактным растением в каллусной культуре возможно постепенное (в течении нескольких лет) увеличение числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. [3]
1.7 Регуляция накопления биологически активных веществ в культурах in vitro
Первичные культуры клеток чаще всего содержат незначительное количество соединений вторичного метаболизма, или даже не содержат их совсем. Поэтому содержание этих веществ можно повысить в результате определенных манипуляций с клетками и питательной средой. (Носов)
Наиболее часто встречаемым и применяемым подходом для повышения выработки вторичных метаболитов является изменение состава питательных сред: изменение количества фитогормонов, углеводов, макроэлементов, таких как азот и фосфор. [2]
Фитогормоны привлекают наибольшее внимание исследователей. Чаще всего при применении гормональных эффекторов значительно увеличивается синтез вторичных соединений, но для каждой культуры клеток и каждому классу фенольных соединений необходим поиск подходящих именно им условий. Действие фитогормонов специфично, то есть зависит от вида растения, клеточного штамма, природы вторичного соединения. Наиболее изучено действие ауксинов и цитокининов. Например, ауксин 2,4-Д может стимулировать деление и растяжение клеток, а также может резко подавить синтез продуктов вторичного метаболизма. [26]
На синтез вторичных метаболитов также могут оказывать влияние другие компоненты питательной среды. При повышении концентрации углеводов (сахарозы и глюкоза), увеличивается количество синтезируемых соединений. Это связано с ингибированием синтеза внутренних (эндогенных) ауксинов и с ростом активности ферментов пентозофосфатного пути. Большое количество ионов аммония, фосфатов, нитратов вызывает увеличение скорости роста клеток, но недостаток этих же веществ в среде приводит к активизации процессов вторичного метаболизма и вызывает торможение роста. [15] Высокие концентрации фосфора снижают синтез фенолов, антоцианов. Важно также соотношение аммонийного и нитратного азота в культуре: если больше нитратного азота, то увеличивается выработка вторичных метаболитов.
Регуляция синтеза активных веществ у растений осуществляется и с помощью некоторых химических препаратов пестицидов, а также различных ингибиторов. Такие вещества как гербициды группы галоидфеноксикислот (2,4-Д) и кумарин влияют на изменение активности ауксинов, а именно снижают ее, но вызывает накопление фенолов и активацию их биосинтеза. [10]
Так же для увеличения накопления метаболитов используют физические факторы, такие как свет, аэрация, температура, влажность и pH среды. В аэрации важно соотношение О2/СО2 - высокое отношение может ингибировать рост культуры и синтез вторичных продуктов. [16]
Синтез некоторых веществ идет только на свету. Свет активирует ферменты фенольного метаболизма, не оказывая влияние при этом на ферменты углеводного и липидного обмена. Но оптимальную длину светового дня нужно подбирать для каждой культуры клеток, так как температурные оптимумы для ее роста и образования вторичных метаболитов не всегда совпадают. [17]
На синтез биологически активных веществ влияет и действие электромагнитного поля сверхвысоких частот. Оно оказывает положительный стимулирующий эффект на синтез вторичных метаболитов в каллусной культуре. [22]
Могут влиять и элиситоры. [25]
1.8 Растения чая и инициированные из них культуры in vitro
1.8.1 Общая характеристика растения чая
Чайный куст или камелия китайская (Camellia sinensis L.) принадлежит к отделу Покрытосеменные (Angiospermae), классу Двудольные (Dicotyledone), порядку Чаецветные (Theales), семейству Чайные (Theacea), роду Camellia. Ранее вид Camellia sinensis L. входил в род Thea под именем Thea sinensis L.
Родина камелии китайской - тропические и субтропические горные леса Юго-Восточной Азии (Индокитай). История культивирования чайного куста начинается с Древнего Китая, где чай использовали в лечебных целях, а именно от отравлений. Начиная с 2000 года до нашей эры, чайный напиток стал повседневным в провинции Сычуань, где камелию китайскую стали выращивать как культурное растение. Затем чай широко распространился и в Х в. стал всенародным, национальным напитком Китая.
Быстрее всего чай был завезен в Японию, Корею и Таиланд, а затем постепенно ушел в Европу. Хоть в Японии он существовал с 729 г., только в XVI в. чаепитие вошло в обычай. Тогда и были посажены постоянные плантации чайного куста в районе Киото.
В XVII в. обычай пить чай распространился в Корею, Индонезию, Индию, Шри-Ланку. В Европе с ним познакомились только в ХVI столетии. В 1517 г. чай из Китая привезли португальские мореплаватели. В 1610 г. он появился в Голландии, в 1664 г. - в Англии.
Тогда в 1684 г. голландский купец вывез из Китая и попытался посадить камелию китайскую. У него это получилось и в Индонезии появились плантации чая. А в Индию чайный куст завезли и посадили позднее приблизительно в 1780 г.
В России чай впервые появился в 1567 г., и в 1679 г. между Россией и Китаем был заключен договор о постоянных поставках чая.
В Грузию чайное растение было привезено значительно позже (в 1843 г.) из Никитского ботанического сада в Крыму. Там, чайные саженцы, привезенные из Китая, были посажены в 1833 г. Однако почвенно-климатические условия в Крыму были неподходящими для чайного растения, и его направили в Сухумский ботанический сад. В климате Сухуми чайное растение обрело вторую родину. Первые образцы грузинского чая были получены в 1864 г. [20]
А.М. Бутлеров в 1885 г. доказал возможность успешного разведения культуры на Черноморском побережье Кавказа, приготовив чай хорошего качества из листьев чайного растения, посаженного в собственном хозяйстве. [20]
Выделяют три разновидности чая: китайская, японская (мелколистная китайская) и индийская. [20]
Китайская разновидность (Camellia sinensis var. sinensis) является кустарниковым растением с густым ветвлением, высотой 3 - 5 м, со средней длиной листьев (6 - 8 см). Листья плотные, кожистые, темно-зеленого цвета. Продолжительность вегетации - 210 суток. Интенсивно образует побеги. Хорошо переносит низкие температуры (до минус 12°С).
Рис. 5. Строение чайных листьев:
А - японского; Б - китайского; В - индокитайского, Г-индийского.
Растения японской разновидности мельче, чем китайской, и достигают в высоту только 1 - 2 м. Длина листьев 3 - 4 см, ветвление так же густое. Вегетация начинается раньше, чем у других разновидностей, но продолжительность ее самая маленькая - 150 суток. Интенсивность побегообразования, а, следовательно, урожайность ниже, чем у китайской. Растение морозоустойчиво (переносит температуру от минус 14 до минус 16°С).
Индийская, или ассамская, разновидность (Camellia sinensis var. assamica) - это древовидное, довольно высокое (17-18 м) растение с явно выраженным штамбом и очень крупными пузырчатыми листьями (20 - 25 см). По сравнению с другими разновидностями имеет самый продолжительный вегетационный период (270 - 275 суток) и отличается малой морозоустойчивостью (от минус 2 до минус 6°С).
А Б
В
Рис.6. Внешний вид различных разновидностей растении чая: А - китайской; Б - японской; В - индийской.
Сегодня, выделяют еще и грузинскую разновидность. Эта разновидность возникла в результате культивирования китайских и других разновидностей чая в экологических условиях субтропиков Грузии. [19] Чай прижился в новых почвенно - климатических условиях, частично преобразовался и сейчас составляет местную популяцию. [20]
1.9 Каллусные и суспензионные культуры чая
Клетки в условиях in vitro могут существовать в виде каллусной культуры, растущей на поверхности твердой питательной среды, и в виде суспензии, растущей в жидкой питательной среде. В Институте физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (ИФР РАН) в разные годы были получены каллусная и суспензионная клеточные культуры чайного растения.
Введенные в культуру и растущие при пересадках каллусные культуры чайного растения сохраняли способность к синтезу фенольных соединений. [5] Их выращивали как в темноте, так и на свету (гетеротрофный и фитомиксотрофный каллусы). Перенесение гетеротрофных каллусных культур чайного растения в условия непрерывного освещения приводило к увеличению содержания в них как растворимых (в том числе и характерных для чайного растения флаванов), так полимерных (лигнин) форм фенольных соединений. [4]
Но для моделирования физиологических процессов часто используют суспензионные культуры клеток, растущие в жидкой питательной среде. [3]
Суспензионная культура клеток имеет ряд преимуществ перед каллусной, (особенно для биохимических исследований):
· все клетки имеют непосредственный контакт с питательной средой;
· система более гомогенна и дает возможность вводить элементы питания, предшественники и регуляторы роста на любой стадии развития культуры, а также отбирать пробы из гомогенной суспензии;
· деление и рост клеток в суспензионных культурах протекает с большей активностью.
Суспензионную культуру клеток чайного растения получили в ИФР АН в 1979 г., разработав оптимальную методику для ее культивирования. Для этих целей использовали каллусную культуру стебля, которая выращивалась на протяжении 6 лет с пассированием через каждые 5-6 недель. [1] Дальнейшие исследования показали, что полученная суспензионная культура клеток стебля чайного растения сохраняет способность к синтезу фенольных соединений, и не происходит изменения состава фенольного комплекса. Если в исходной каллусной ткани содержание суммы фенольных соединений составляло 3430 мкг/г сухого веса, то в полученной суспензии оно повышалось до 5530 мкг/г сухого веса. Содержание флаванов тоже увеличивалось с 2080 до 2920 мкг/г сухого веса. То есть в целом, уровень содержания фенольных соединений в культуре увеличивался по сравнению с каллусной тканью. [1]
Таким образом, при перенесении каллусных тканей чайного растения в условия суспензионной культуры не происходило изменении в составе фенольного комплекса, но их накопление возрастало.
2. Объекты и методы исследования
2.1 Объект исследования
Клетки для каллусной культуры мы брали от чайного растения (Camellia sinensis L.). Чайное растение синтезирует огромное количество соединений. Химический состав чая очень сложен и до сих пор полностью не установлен. Среди всего многообразия синтезируемых в нем веществ есть такие редкие и ценные, как кофеин, теобромин, теофиллин, танин, катехины, эфирные масла, различные витамины. [6]
Объектом исследования являлась гетеротрофная каллусная культура, инициированная из стебля, корня и листа чайного растения, а также фотомиксотрофная каллусная культура, инициированная из стебля чайного растения. Они представляли собой длительно выращиваемые в условиях in vitro культуры, поддерживаемые в одинаковых условиях.
2.2 Постановка опытов
Для культивирования каллусов использовали модифицированную питательную среду Хеллера.
Таблица 2. Состав среды Хеллера, использованной для выращивания каллусной культуры чая
|
№ |
Вещество |
Концентрация, мл (мг, г) /л среды |
|
|
1 |
Макросоли по Хеллеру |
50 мл |
|
|
2 |
Микросоли по Хеллеру |
1 мл |
|
|
3 |
Витамины по Уайту |
1 мл |
|
|
4 |
Цитрат железа |
1 мл |
|
|
5 |
2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота |
1 мл |
|
|
6 |
Пантотенат кальция |
1 мл |
|
|
7 |
Мезоинозит |
1 мл |
|
|
8 |
Аденин |
5 мг |
|
|
9 |
Глюкоза |
25 г |
|
|
10 |
Дрожжевой экстракт |
1 г |
|
|
11 |
Агар |
7 г |
Питательную среду автоклавировали при давлении 0,7 - 0,8 атм. (15 и 15 мин, соответственно) и температуре 120єС.
Каллусные ткани выращивали в колбах в стандартных условиях: для гетеротрофных - температура 26оС, относительная влажность воздуха 70%, темнота; для фотомиксотрофных - температура 26?С, относительная влажность воздуха 70%, на свету при 16ти часовом светопериоде. Длительность пассажа составляла 42 дня.
Каллусные культуры, инициированные из стебля, листа и корня, вынимали из колб единовременно, фотографировали и оценивали их морфологию, а также брали навески. Гетеротрофную и фотомиксотрофную каллусную культуру стебля через каждые 10 дней (для опыта с перекисью водорода каждые 5 дней на 25 день пассажа) вынимали из колб, фотографировали, оценивали их морфологию. Брали навески материала для последующего определения содержания различных классов фенольных соединений. Материал помещали в пробирки "Эппендорф" (1,5 мл) и хранили в холодильнике при температуре минус 20 или минус 70оС.
2.3 Морфофизиологические характеристики каллусных культур
Морфофизиологическое состояние культур оценивали по их внешним характеристикам - цвет, плотность культуры, оводненность, наличие некротических участков. Определяли свежий вес каллусов.
2.4 Определение ростовых характеристик каллусных культур
Для определения содержания воды в растительном материале каллусную ткань взвешивали (навески 150 мг) и помещали в доведенные до постоянной массы чистые бюксы. Бюксы с приоткрытой крышкой ставили в сухожаровой шкаф "Binder" при +70оС. Через 48 часов материал переносили в эксикатор, охлаждали и взвешивали на аналитических весах.
Содержание воды в каллусах рассчитывали по следующей формуле:
О = (m сыр. - m сух.) / m сух. * 100 (%),
где:
О - оводненность ткани в процентах по сырой массе;
m сыр. - масса навески свежего растительного материала, г;
m сух. - сухая масса растительного материала, г.
2.5 Определение содержания воды и оводненности каллусов
Для определения содержания воды в растительной ткани (или ее оводненности) на торсионных весах взвешивали свежий растительный материал (навески от 150±5 до 500±5 мг, в 3-х повторностях) и помещали его в доведенные до постоянной массы чистые бюксы (см. раздел I).
Заполненные материалом бюксы с приоткрытой крышкой, размещали на стеклянных чашках Петри (которые используют в качестве подставки) и ставили в сухожаровой шкаф "Binder" на 48 часов при Т=70°С.
При работе необходимо соблюдать следующие правила. Свежий материал должен лежать в бюксе рыхло. Бюкс с навеской нужно ставить в шкаф, нагретый до 70°С, и желательно помещать емкости на одном уровне в центре, так как температура в различных частях шкафа непостоянна.
По истечении времени высушивания, для остывания, горячую открытую посуду с высушенной навеской, пинцетом переносили в подготовленный эксикатор, крышку которого закрывали не до конца, оставив маленькую щель (во избежание ее присасывания).
Брали бюксы пинцетом, так как из-за прикосновения к ним пальцами может измениться масса.
Через 30-40 мин., остывшие бюксы закрывали, крышку эксикатора плотно притирали.
Закрытую посуду с высушенной растительной тканью взвешивали на аналитических весах.
После взвешивания бюксы с материалом в закрытом виде хранили в эксикаторе. Процесс высушивания повторяли еще раз при тех же условиях, уменьшая время экспозиции до 24 часов.
После повторного высушивания и охлаждения бюксы с материалом снова взвешивали, соблюдая условия пунктов. Сравнивали результаты двух взвешиваний.
При расхождении значений более чем на 1 мг, процесс высушивания растительной ткани повторяли до тех пор, пока ее масса не станет постоянной.
Расчет содержания воды в ткани и ее оводненности проводили по следующим формулам:
mводы
х = - -------- - х 100%
mсыр
так как, mводы = m сыр - mсух
то, оводненность ткани считается по формуле
О - оводненность ткани в процентах по сырой массе
m сыр - масса навески свежего растительного материала, г m сух - сухая масса растительного материала, г
mсух = m бюкса с сухой навеской - mчистого бюкса
Оводненность растительной ткани рассчитывают, как по сырой, так и по сухой массе.
2.6 Фиксация растительного материала для биохимических исследований
Растительный материал фиксировали жидким азотом (t = - 196??C). Брали навеску свежей каллусной ткани, плотно заворачивали ее в фольгу, после этого помещали в фарфоровый стакан. После того как все навески оказывались в стакане, доливали жидкий азот, до полной заморозки навесок. Затем навески вынимали и переносили в холодильник (t = - 60°--C).
2.7 Получение экстрактов для определения различных классов фенольных соединений
Для извлечения фенольных соединений навеску свежей каллусной ткани (50 мг) помещали в пластиковые пробирки "эппендорф", заливали 0,2 мл 96% -ного этанола и растирали пластиковым пестиком до образования гомогенной массы.
Затем доливали 1,3 мл спирта и выдерживали пробирки в термостате при +45оС в течение 30 мин. Затем экстракт центрифугировали, отделяли надосадочную фракцию, которую использовали для определения различных соединений фенольной природы.
2.8 Определение содержания флаванов
Проводили с ванилиновым реактивом. [8] Для этого 250 мкл этанольного экстракта помещали в пробирки, добавляли 1250 мкл 1% -ного раствора ванилина в 70% Н2SO4. В качестве контроля использовали раствор, где экстракт заменяли на 96% -ный этанол. Спектрофотометрирование проводили при длине волны 500 нм в стеклянных кюветах на спектрофотометре Specord.
Содержание флаванов рассчитывали по следующей формуле:
С = (Е500 * К * R * Vэкстракта) / 1000 * mнавески, (мг/г сыр. массы),
где:
Е500 - экстинкция раствора,
К - коэффициент по (-) - эпикатехину (95),
R - разбавление,
Vэкстракта - объем экстракта (мл),
mнавески - масса навески (г),
1000 - переводной коэффициент. Затем пересчитывали на сухой вес:
С = С (мг/г сыр. массы) / mсух. вещ-ва, (мг/г сух. массы)
mсух. вещ-ва - масса сухого вещества в 1 г каллусной культуры
2.9 Определение содержания проантоцианидинов
Проводили с бутанольным реактивом. [8] Для этого 500 мкл этанольного экстракта помещали в пробирки, добавляли 1000 мкл бутанольного реактива, выдерживали 45 мин. при 950 С в термостате в темноте. В качестве контроля использовали раствор, где экстракт заменяли на 96% -ный этанол. Плотность раствора определяли в стеклянных кюветах при длине волны 550 нм на спектрофотометре Specord.
Содержание проантоцианидинов рассчитывали по формуле:
С = (Е550 * R * V экстракта, мл) / m навески, (Е550/г сыр. массы),
где:
Е550 - экстинкция раствора;
R - разбавление;
Vэкстракта - объем экстракта;
m навески - масса навески (г).
Затем пересчитывали на сухой вес:
С = С (Е550/г сыр. массы) / mсух. вещ-ва, (Е550/г сух. массы)
m сух. вещ-ва - масса сухого вещества в 1 г каллусной культуры
2.10 Статистическая обработка данных
Исследования проводили в трех биологических и двух-трех аналитических повторностях. Все результаты обрабатывали статистически, рассчитывая для каждого показателя стандартное квадратичное отклонение. На графиках представлены средние арифметические значения определений и их стандартные квадратичные отклонения.
3. Результаты и обсуждения
3.1 Морфофизиологические и биохимические характеристики каллусных культур чая, инициированных из стебля, листа и корня
3.1.1 Морфологические характеристики каллусных культур чая
В первом исследовании мы брали каллусы из разных частей растения: стебля, листа и корня, и выращивали их в темноте (гетеротрофная каллусная культура).
Культуры чая, инициированные из стебля, представляли собой средней плотности каллус, со средним приростом, неоднородный с большим количеством апоптозной ткани внизу (примерно 15% от всего объема), сильно оводненный, темно бежевого цвета. (Рис. 7)
Рис. 7. Культура чая, инициированная из стебля
Культуры чая, инициированные из листа, представляли собой плотный каллус, с небольшим приростом, средней оводненности, сверху бежевый внутри белый. Апоптозной ткани в нем было примерно 10%. (Рис. 8).
Рис. 8. Культура чая, инициированная из листа
Культуры чая, инициированные из корня, представляли собой средней плотности неоднородный каллус, с большим приростом ярко белого цвета, средней оводненности, темно-бежевого цвета. Апоптозной ткани в нем было около 13%. (Рис.9)
Рис. 8. Культура чая, инициированная из корня
3.2 Изменения в содержании флаванов и проантоцианидинов в каллусных культурах чая
Для того чтобы изучить накопление флаванов в каллусных культурах чайного растения, мы сравнивали содержание этих веществ в различных штаммах каллусных культур, инициированных из стебля, листа и корня чайного растения.
В результате исследования было выявлено, что наибольшее накопление флаванов характерно для каллусной культуры чая, инициированной из стебля. В штаммах, инициированных из листа и корня содержание флаванов было ниже примерно на 35 - 37%. (рис. 9).
Рис. 9. Накопление флаванов в каллусных культурах чая. ЧС - культура, инициированная из стебля, ЧЛ - из листа, ЧК - из корня.
Для олигомерных форм (проантоцианидинов) прослеживалась иная тенденция: уровни их накопления у данных штаммов были практически одинаковы, лишь у каллусной культуры чая инициированной из листа он чуть ниже - на 6 %. (рис.10).
Рис. 10. Накопление проантоцианидинов в каллусных культурах чая. ЧС - культура, инициированная из стебля, ЧЛ - из листа, ЧК - из корня.
Поскольку проантоцианидины являются частью флаванового комплекса, то можно предположить, что такое высокое накопление флаванов в культуре чайного стебля обусловлено накоплением простых их форм - катехинов, так как уровень накопления проантоцианидинов практически одинаков. Но этот вопрос требует дальнейшего и более подробного изучения.
3.3 Рост и образование соединений флавановой природы в гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культурах стебля чайного растения
3.3 Морфологические характеристики гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культур стебля чайного растения
Поскольку наибольшее накопление фенольных соединений было обнаружено в стеблевой каллусной культуре чая (ЧС), то для дальнейшего исследования мы выращивали именно их в темноте и на 16 часовом фотопериоде с целью получить гетеротрофные и фотомиксотрофные культуры.
Фотомиксотрофные каллусные культуры представляли собой плотный, но распадающийся по частям каллус красно-коричневого цвета, в разрезе зеленовато-бежевый, с небольшим приростом, малой оводненностью и апоптозной тканью в количестве 15 % от всего объема.
Гетеротрофные каллусные культуры представляли собой плотный бежевый каллус, в разрезе светло бежевый, коричневый, с небольшим приростом, средней оводненностью и апоптозной тканью в количестве 10 % от всего объема.
3.4 Динамика образования соединений флавановой природы в гетеротрофной и фотомиксотрофной каллусных культурах стебля чайного растения
В течении всего пассажа наблюдались изменения в накоплении флаванов и проантоцианидинов как в гетеротрофной, так и в фотомиксотрофной каллусных культурах чая, инициированных из стебля. Но эти изменения были различны у двух культур.
В гетеротрофной культуре (рис.11), по мере ее роста, наблюдалось уменьшение содержания флаванов. Наибольшее их количество приходилось на 10 день (начало пассажа), на 20 день снижалось на 10%, а на 30 день на 5%, то есть наблюдалось замедление снижения содержания флаванов.
Аналогичная тенденция характерна и для проантоцианидинов: на 20 день количество проантоцианидинов снижалось на 16%, а на 30 день на 13%. Это свидетельствует о том, что по мере роста гетеротрофной культуры, способность к накоплению флаванов и их олигомерных форм снижалась.
Рис. 11. Изменения в накоплении флаванов и проантоцианидинов в гетеротрофной культуре, инициированной из стебля, по мере ее роста
Что же касается фотомиксотрофной каллусной культуры чая инициированной из стебля, то изначально было видно, что общее содержание флаванов и проантоцианидинов выше, чем в гетеротрофной культуре в 3-4 раза (рис.12). Это происходило из-за того, что свет является одним из факторов, оказывающих влияние на накопление фенольных соединений, поскольку многие ферменты фенольного метаболизма светоактивируемые.
Подобные документы
Структурная и функциональная целостность высших растений, изучение тканей растений и познание особенностей строения, жизнедеятельности и эволюции растений. Генетический контроль гистогенеза, возможности комбинативной и мутационной изменчивости.
курсовая работа [70,8 K], добавлен 08.06.2012Отделы моховидных, плауновидных, хвощевидных, голосеменных и покрытосеменных. Эволюция высших растений, их морфологические и биологические особенности, распространение. Развитие специализированных тканей как важное условие для выхода растений на сушу.
презентация [2,3 M], добавлен 25.10.2010Схема стадий симбиогенеза. Разнообразие клеток высших растений. Направления эволюции в строении тела низших первичноводных растений - водорослей. Схема эволюции высших растений. Жизненный цикл равноспорового папоротника. Преимущества цветковых растений.
презентация [47,5 M], добавлен 05.05.2012Ткани высших растений (покровные, проводящие, механические, основные, выделительные). Строение растения и функции его органов: корня, стебля, листа, побега и цветка. Разновидности корневых систем. Роль цветка как особой морфологической структуры.
презентация [8,1 M], добавлен 28.04.2014Особенности роста и развития растений. Культура и морфогенетические особенности каллусных тканей. Клональное микроразмножение отдаленных гибридов. Применение культур растительной ткани. Вспомогательное использование методов in vitro в селекции растений.
реферат [7,0 M], добавлен 22.09.2009Формы азота, используемые растением. Восстановление нитратов растениями. Стерильные культуры покрытосеменных растений. Представители насекомоядных растений. Симбиоз и паразитизм у растений. Усвоение молекулярного азота микроорганизмами, бактерии в почве.
реферат [887,9 K], добавлен 20.07.2010Классификация растений и определение термина "систематика растений" в ходе развития ботаники. Трехчленное деление царства растений. Типы царства протистов. Исследование Линн Маргулиса предполагаемой эволюции "высших" форм жизни из "низших" форм.
реферат [6,3 M], добавлен 05.06.2010Физиологически активные вещества растительной клетки. Элементы, получаемые растением из почвы через корневую систему, их роль в жизни растений. Морфологическое строение побега, расположение листьев. Элементы древесины и луба голосеменных растений.
контрольная работа [665,7 K], добавлен 13.03.2019Риниофиты как самая древняя и примитивная вымершая группа высших растений. Эволюция спорангия у папоротников. Строения Риниофит и их эволюционное взаимоотношение. Секреторный и периплазмодиальный тапетум. Лептоспорангиатный тип развития спорангия.
реферат [1,1 M], добавлен 27.10.2009Биоиндикация техногенного загрязнения с использованием высших растений. Экологические шкалы Раменского, Цыганова, Элленберга. Реакции хвойных и лиственных растений на присутствие загрязнителей воздуха: газоустойчивость и индикационная значимость растений.
реферат [23,5 K], добавлен 21.12.2013