Размещено на http://www.allbest.ru/

ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«РЕСПУБЛИКАНСКИЙ НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР ЭПИДЕМИОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ»

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕКОМБИНАНТНЫХ ФОРМ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1 ТИПА, ВЫЯВЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

ВВЕДЕНИЕ

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является одной из наиболее значимых угроз для глобального здоровья человечества. Согласно современной классификации выделяют 2 типа ВИЧ: ВИЧ-1 и ВИЧ-2, основной вклад в эпидемию вносит ВИЧ-1, распространение которого в мире носит характер пандемии[1, 2], и на конец2014 года в мире насчитывалось около 36,9 миллиона человек, живущих с ВИЧ-инфекцией [3]. По данным ООН, 30-40 миллионов человек умерло от синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД) с момента первого упоминания о ВИЧ-инфекции в начале 80-х годов XX века [4].

Одним из основных препятствий в борьбе с эпидемией ВИЧ/СПИД в мире является высокая скорость геномных мутаций и, как следствие, высокое генетическое разнообразие вируса. Результат такой высокой изменчивости - ускользание вируса от воздействий иммунной системы, возникновение мутаций резистентности и последующая невосприимчивость к терапии. Фундаментом генетического разнообразия ВИЧ-1 являются, по крайней мере, 3 фактора: многократное внедрение вируса в человеческую популяцию, низкая точность и высокая рекомбиногенность обратной транскриптазы ВИЧ-1, а также высокий уровень генетической гетерогенности вируса в инфицированном организме, называемый «квазивид».

При коинфекции человека двумя и более различными субтипами ВИЧ в процессе репликации вируса могут возникать рекомбинантные формы. Такие вирусы содержат генетический материал от разных родительских вариантов ВИЧ. Это создает дополнительную проблему при разработке вакцин, поскольку, согласно рекомендациям ООН, кандидатные вакцины должны создаваться на основе штаммов вирусов, доминирующих в конкретном регионе. Кроме этого, рекомбинантные формы могут наследовать мутации резистентности от родительских вариантов, тем самым снижая эффективность высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ).

В Республике Беларусь за последние 5 лет ежегодно регистрируется более 1000 новых случаев ВИЧ-инфицирования, а за 2015 год количество выявляемых случаев превысило 2000. Хотя доминирующим субтипом ВИЧ-1 в Беларуси является субтип A1, зарегистрировано появление циркулирующих рекомбинантных форм (ЦРФ) ВИЧ-1, а также впервые выявлена новая уникальная рекомбинантная форма (УРФ) ВИЧ-1 AB, ранее никем не описанная.

Все это создает предпосылку для выявления и молекулярно-генетического анализа рекомбинантных форм ВИЧ-1 на территории Республики Беларусь.

Связь работы с крупными научными программами и темами

Тема диссертационного исследования и научный руководитель были утверждены приказом директора РНПЦ эпидемиологии и микробиологии от 29.12.2012№ 56.

Исследования были выполнены в государственном учреждении «Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии» по заданию 02.16 «Разработать диагностическую тест-систему для определения мутаций резистентности ВИЧ-1» (2013-2015гг., № госрегистрации 20115329 от 16.12.2011); по заданию 01.08 «Разработать и внедрить в практику здравоохранения систему молекулярно-эпидемиологического мониторинга за ВИЧ/СПИД, подготовить и внедрить контрольную панель сывороток крови на основе преобладающих в Беларуси субтипов ВИЧ-1» (2011-2013 гг., № госрегистрации 20115334 от 16.12.2011) в рамках выполнения ГНТП «Новые технологии диагностики, лечения и профилактики», подпрограмма «Инфекции и микробиологические нанотехнологии»; по заданию 4.14 «Разработать тест-систему ПЦР на основе консенсусных последовательностей гена pol для диагностики и генотипирования ВИЧ-1» в рамках выполнения Подпрограммы 1 «Инновационные биотехнологии в Республике Беларусь», МЦП ЕврАзЭС «Инновационные биотехнологии» на 2014-2015 гг.

Цель и задачи исследования

1. Провести молекулярно-генетический скрининг ВИЧ-1, выявленного на территории Беларуси за период 2008-2015 годов.

2. Определить спектр и распространенность рекомбинантных форм ВИЧ-1 в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов, проживающих на территории Республики Беларусь.

3. Установить филогенетические связи выявленных рекомбинантных форм ВИЧ-1, определить направления заноса вирусов на территорию страны, выявить мутации резистентности к антиретровирусным препаратам.

4. Изучить структуру полноразмерного генома новой уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 и установить ее происхождение.

Научная новизна

1. Установлено, что на территории Республики Беларусь за период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7%. Кроме субтипа А1 выявлено 15 случаев ВИЧ-инфекции (4,9%), вызванных рекомбинантными формами ВИЧ-1, 9 случаев (3,0%) - субтипом В, и по 2 случая (0,7% каждый) - субтипами C и G.

2. Впервые на территории Республики Беларусь в популяции ВИЧ-инфицированных пациентов определен спектр рекомбинантных форм ВИЧ-1, выявлено три типа циркулирующих рекомбинантных форм ВИЧ-1: CRF03_AB - 8 (2,6%), CRF02_AG - 4 (1,3%), CRF06_cpx - 2 (0,7%), и одна уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 (0,3%).

3. Установлены многократные случаи заноса циркулирующих рекомбинантных форм ВИЧ-1 на территорию Беларуси: CRF03_AB - занесена в результате шести независимых событий, два из которых привели к дальнейшему распространению CRF03_AB уже на территории страны, CRF02_AG - занесена в результате трех событий, в двух случаях происхождением вируса является территория Западной Африки и в одном случае две CRF02_AG (ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) происходят из Узбекистана, две CRF06_cpx были занесены в результате одного события - родственны ВИЧ-1, описанному на территории Эстонии.

4. Впервые секвенирован и описан полноразмерный геном уникальной рекомбинантной формы ВИЧ-1 Mos. Установлено, что ее геном имеет мозаичную структуру и состоит из ВИЧ-1 субтипов А1 (~80%) и В (~20%), встраивание субтипа В произошло в структурных генах gag и pol. Метод кластерного филогенетического анализа показал, что фрагменты субтипов А1 и В относятся к вариантам ВИЧ-1 AFSU и BFSU, получившим распространение на территории стран бывшего СССР.

Положения, выносимые на защиту

1. На территории Республики Беларусь за период 2008-2015 гг. доминировал ВИЧ-1 субтипа А1, на который приходилось 90,7% (207 из 303) проанализированных сиквенсов ДНК по участку гена pol. Рекомбинантные формы ВИЧ-1 по частоте встречаемости находись на втором месте - 4,9% (15) от всех проанализированных последовательностей ДНК: CRF03_AB - 8 (2,6%), CRF02_AG - 4 (1,3%), CRF06_cpx - 2 (0,7%), и в одном случае (0,3%) выявлена уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 между субтипами A1 и B. Выявлено 9 случаев (3,0%) ВИЧ-инфекции, вызванной субтипом В, и по 2 случая (0,7% каждый), вызванных субтипами С и G ВИЧ-1 соответственно.

2. Рекомбинантные формы ВИЧ-1 занесены на территорию Республики Беларусь в результате множественных событий. Наиболее часто встречаемая рекомбинантная форма CRF03_AB занесена в результате шести независимых событий, вероятнее всего, с территорий России и Литвы. Два события привели к дальнейшему распространению CRF03_AB уже на территории страны. Рекомбинантная форма CRF02_AG занесена на территорию страны из трех независимых источников: в двух случаях вирус происходит с территории Западной Африки, в одном случае две CRF02_AG (ВИЧ-инфицированные мать и ее ребенок) - с территории Узбекистана. Две CRF06_cpx занесены на территорию Беларуси в результате одного события, вероятнее всего, из Эстонии.

3. Новая уникальная рекомбинантная форма ВИЧ-1 Mos является результатом рекомбинации ВИЧ-1 субтипов А1 и В, встраивание фрагментов генома субтипа В произошло в структурных генах ВИЧ-1 gag и pol. На долю ВИЧ-1 субтипа А1 приходится порядка 80% генома УРФ ВИЧ-1 Mos, на субтип B - 20%. Геном ВИЧ-1 Mos состоит из фрагментов геномов ВИЧ-1 AFSU/BFSU, получивших распространение на территории стран бывшего СССР, и не является рекомбинантной формой CRF03_AB.

Личный вклад соискателя ученой степени

Научным руководителем предложены тема диссертационной работы и ее методическое решение. Соискатель самостоятельно определил цель и задачи исследования, выбор методов и объем исследований. Автор лично выполнил первичную обработку исследуемого материала (сыворотки и плазмы крови), полученного от ВИЧ-инфицированных пациентов, получил сиквенсы участка генов gag-pol исследуемых образцов, создал электронную базу данных для внутрилабораторного хранения и учета информации о пациентах. Диссертант полностью провел филогенетический анализ и молекулярно-генетические исследования рекомбинантных форм ВИЧ-1, выявленных на территории Республики Беларусь, установил их структуры геномов, профили резистентности, а также происхождение и распространение на территории страны. Автором пополнена международная база данных Genbank 241 нуклеотидной последовательностью ВИЧ-1 областей генов gag-pol и 1 полноразмерным геномом ВИЧ-1 субтипа А1. На основании проведенных исследований получен патент на новую уникальную рекомбинантную форму ВИЧ-1 Mos № 18124 [31-A] (вклад соискателя - 30%).

Основные научные результаты представлены в статьях с долей личного участия соискателя соответственно: [1-A, 2-A] - 50%, [3-A] - 30%, [4-A] - 70%, [5-A] - 50%, [6-A, 7-A] - 10%, [8-A] - 70%, [9-A, 10-A] - 10%, [11-A] - 30%, [12-A] - 80% (в среднем 39%); в материалах научных форумов и тезисах докладов [13-A, 14-A] - 30%, [15-A] - 30%, [16-A, 17-A] - 20%, [18-A] - 70%, [19-A] - 30%, [20-A-22-A] - 10%, [23-A] - 70% (в среднем 30%); в сборниках рецензируемых научных трудов [24-A-28-A] - 20% (в среднем 20%). На основании проведенных исследований утверждены 2 инструкции по применению: по генотипированию и определению мутаций резистентности в геноме ВИЧ-1 [29-A, 30-A] (вклад соискателя 30%).

Апробация диссертации и информация об использовании ее результатов

Основные положения работы были доложены и обсуждены на конференции «Основы инфекционной патологии человека» (30-31 октября 2014 г., г. Минск, Беларусь); на 12 ежегодной конференции Балтийской Антивирусной Сети «Вирусные инфекции регионального значения» (3-5 октября 2015 г., г. Москва, Россия); мини-симпозиуме «Молекулярная эпидемиология ВИЧ-1 и вирусных гепатитов в Балтийском регионе» (19-21 марта 2015 г., Каролинский Институт, г. Стокгольм, Швеция). Результаты проведенных исследованийбыли использованы при созданииотечественной диагностической тест-системы для определения мутаций резистентности и генотипирования ВИЧ-1 «Бел ВИЧ-1 резистентность-генотип» - регистрационное удостоверение № ИМ-7.103886, для создания контрольной панели «Панель контрольная сывороток крови, содержащих и не содержащих антитела к специфическим белкам ВИЧ-1 и ВИЧ-2 и антигены ВИЧ-1» - регистрационное удостоверение № ИМ-7.102188.

Опубликование результатов диссертации

Результаты диссертационной работы опубликованы в 31 научной работе, из них 12 - статьи в журналах, включенных в перечень научных изданий ВАК (объем 5,9 авторских листа), 11 - в материалах научно-практических конференций (объем 3,3 авторских листа), 5 - в сборниках рецензируемых научных трудов (1,1 авторских листа), 2 - в инструктивно-методических рекомендациях, 1 - патент. Общий объем публикаций составляет 10,3 авторских листа.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, обзора литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов исследований, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, библиографического списка (190англоязычных и 7 русскоязычных источников), списка работ соискателя, 5 приложений. Работа изложена на 137 страницах, содержит 18 таблиц и 38 рисунков.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История открытия ВИЧ

В конце 80-х - начале 81-х гг. прошлого века в США среди мужчин, практикующих секс с мужчинами (МСМ), и потребителей инъекционных наркотиков (ПИН) без известных на то время причин были выявлены случаи пневмоцистной пневмонии [5, 6]. Практически в это же время появились сообщения об обнаружении у еще одних МСМ редкой формы онкологического заболевания кожи - саркомы Капоши [7, 8]. Оба эти заболевания представляют собой редкие оппортунистические инфекции, проявляющиеся у лиц с серьезными нарушениями иммунной системы. Вскоре после первых сообщений о вспышке данных заболеваний в США стали появляться сообщения о схожих симптомах и в других частях света. Состояние, при котором возникали эти инфекции, назвали синдромом приобретенного иммунодефицита (СПИД), однако причина СПИДа стала известна лишь в 1983г., когда независимо друг от друга в Институте Пастера во Франции под руководством Люка Монтанье и в Национальном институте рака в США под руководством Роберта Галло был изолирован новый ретровирус, названный вначале вирусом, ассоциированным с лимфаденопатией (lymphadenopathy-associated virus, or LAV) [9] и Т-лимфотропным вирусом человека [10]. В 1986 году обнаружили, что эти два вируса генетически идентичны, и им было присвоено наименование «вирус иммунодефицита человека» (ВИЧ) [11]. В 2008-м Люк Монтанье и Франсуаза Барр-Синусси были удостоены Нобелевской премии в области физиологии и медицины «за открытие вируса иммунодефицита человека» [12].

1.2 Организация генома и кодируемые белки ВИЧ

Генетический материал ВИЧпредставлен двумя копиями положительно-смысловой (+)РНК. Длина молекулы РНК составляет в среднем около 9700 нуклеотидов и содержит 3 рамки считывания(рисунок 1.1)[13].

Как и у всех вирусов Семейства Retroviridae, геном ВИЧсодержит 3 основных структурных гена gag, pol и env, кодирующих структурные белки вируса и ферменты, необходимые для вирусной репликации. Помимо структурных, геном ВИЧ-1 включает гены tat, rev, nef, vif, vpr и vpu (vpx у ВИЧ-2)[14],кодирующие белки, которые участвуют в регуляции экспрессии других вирусных генов и поддержании латентной стадии вируса(таблица 1.1)[15].

Таблица 1.1. - Продукты генов ВИЧ-1и их основные функции

На 5'- и 3'-концах вирусной РНК находятся длинные концевые повторы (long terminal repeat, LTR), обеспечивающие инициацию, регуляцию и терминацию транскрипции, регуляцию упаковки генома в капсид и некоторые другие функции.

1.3 Структура вириона ВИЧ

Вирусные частицы ВИЧимеют сферическую форму размером 100-120 нм, окруженную липидной мембраной(рисунок 1.2).

Липидная мембрана образована из клеточной мембраны клетки-хозяина, в которой происходила репликация вириона. Каждая вирусная частица содержит 72 гликопротеиновых комплекса gp160, интегрированных в липидную мембрану [16]. Данные комплексы являются рецепторами вируса и состоят из двух вирусных белков: поверхностного gp120 и трансмембранного gp41. К внутренней поверхности мембраны прикреплен матриксный белок p17.

Капсид ВИЧсостоит из белка p24 и имеет коническую форму, суженная часть которого взаимодействует с оболочкой вириона. Внутри капсида находятся две молекулы однонитевой РНК (ssRNA), которые стабилизированы нуклеокапсидным белком p7. В капсиде также инкапсулированы вирусные ферменты: обратная транскриптаза, интеграза и протеаза, некоторые вспомогательные белки ВИЧ.

1.4 Жизненный цикл ВИЧ

Жизненный цикл ВИЧможно разделить на несколько этапов(рисунок 1.3):

Связывание с рецепторами и корецепторами клетки-мишени

В начале исследований ВИЧ-инфекции был выявлен главный рецептор, с которым связывается вирус, - это гликопротеин CD4 (cluster of differentiation 4), найденный на поверхности иммунных клеток (Т-хелперов, макрофагов, моноцитов и дендритных клеток). Внедрение в клетку-мишень обеспечивается связыванием трехмерного гликопротеина ВИЧgp120 одновременно с рецептором CD4 и корецептором CCR5 или CXCR4 [17, 18].

Гликопротеин gp120 ВИЧсостоит из ~500 аминокислот и включает в себя 5 константных (C1-C5) и 5 вариабельных (V1-V5) областей различной длины. Домен связывания с CD4 находится в нескольких эпитопах областей V1-V2 и С2, C3, C4 и C5 [19].

Вначале происходит связывание CD4-связывающего домена gp120 с рецептором CD4. Это приводит к структурным изменениям молекулы gp120, открывая хемокин-связывающий домен. Данный домен, в свою очередь, связывается с одним из корецепторов клетки-мишени, что является сигналом для начала конформационных изменений трансмембранного белка gp41.

Проникновение ВИЧв клетку-мишень

После связывания gp120 ВИЧс рецептором CD4 и одним из корецепторов конформационные изменения в gp41 приводят к внедрению N-терминального гидрофобного региона этого протеина в мембрану клетки-мишени [20]. Результатом данного внедрения является слияние мембран вируса и клетки-мишени и, как следствие, попадание компонентов ВИЧв цитоплазму клетки [21].

После проникновения компонентов вируса в цитоплазму клетки вирусная РНК и ферменты находятся внутри матрикса, который разрушается под действием p38 MAP-киназы (MAPK) [22] и нуклеокапсида, разрушаемого циклофилином А (CypA) [23]. В результате этого генетический материал и ферменты вируса попадают в цитоплазму клетки-мишени, что приводит к инициации обратной транскрипции.

Обратная транскрипция

В цитоплазме клетки вирусная обратная транскриптаза (ОТ) при помощи фермента РНКазы H преобразует вирусную РНК в двухцепочечную ДНК методом обратной транскрипции. Было высказано предположение, что обратная транскрипция может происходить и в вирионе до внедрения в клетку, однако данный процесс сильно ограничен низкой концентрацией дНТФ внутри вириона [24].

Переход вирусного генома из РНК в ДНК происходит с помощью механизма, устраняющего два препятствия, с которыми сталкивается вирус в процессе репликации. Во-первых, требование системы РНК-праймера исключает точное транскрибирование генома в ДНК от начала до конца, так как не было бы никакого способа, чтобы скопировать область связывания праймера. Во-вторых, поскольку новые вирусные геномы должны быть получены с помощью клеточной РНК-полимеразы II, сигналы, соответствующие прямому синтезу РНК, должны находиться до начала сайта инициации транскрипции за пределами области, подлежащей копированию. С этой целью ВИЧ, как и остальные ретровирусы, синтезируют в обоих 5'- и 3'-концах ДНК дополнительную копию последовательностей, присутствующих только один раз в РНК-геноме, U5 и U3. Таким образом,длинные концевые повторы (LTR) (U3-R-U5) содержат практически все cis-активные элементы, необходимые для событий, которые происходят на уровне ДНК, то есть интеграции и экспрессии провирусной ДНК[25].

Инициация обратной транскрипцииВИЧпроисходит путем связывания клеточной транспортной РНК tRNALys3, выступающей в качестве праймера [26], с сайтом связывания праймера (primer binding site, PBS), расположенным на расстоянии приблизительно 180 нуклеотидов от 5'-конца вирусной РНК(рисунок 1.4, A). После связывания происходит синтез участков R и U5 кДНК, образуя таким образом гетеродуплекс РНК/ДНК, который является субстратом для РНКазы H(рисунок 1.4, B). РНКаза H расщепляет 5'-конец вирусной РНК, высвобождая вновь синтезированную (-)цепь ДНК. Концы вирусной РНК являются повторяющимися последовательностями, называемыми R. Эти повторы действуют как мост, который позволяет вновь синтезированной (-)цепи ДНК переходить от 5'- к 3'-концу вирусной РНК(рисунок 1.4, С). Было показано, что вновь синтезированная (-)цепь ДНК может связываться с 3'-концом любой из двух молекул РНК, упакованных в геном ретровируса [27, 28].

После связывания (-)цепи ДНК с R-областью 3'-конца РНК происходит синтез полной (-)цепи ДНК(рисунок 1.4, D). РНКаза H расщепляет РНК ВИЧ, за исключением участка, богатого пуринами (полипуриновый тракт, polypurine tract, ppt)(рисунок 1.4, E). Данный участок является резистентным к РНКаза H и служит праймером для инициации синтеза (+)цепи ДНК на матрице (-)цепи ДНК. ОТ ВИЧсинтезирует не только копию (-)цепи ДНК, но также первые 18 нуклеотидов праймера tRNALys3. Как только tRNA была скопирована в ДНК (+)цепи, она становится субстратом для РНКазы Н. Большинство ретровирусов удаляют всю tRNA, но ОТ ВИЧявляется исключением. Она оставляет один рибонуклеотид аденин на 5'-конце (-)цепи ДНК [29]. Расщепление tRNALys3 высвобождает участок PBS (primerbindingsite, сайт посадки праймера) на (+)цепи ДНК, который комплементаренPBS (-)цепи ДНК. Эти два комплементарных участка связываются между собой (рисунок 1.4, F), и происходит достраивание (+)цепи ДНК(рисунок 1.4, G).

В процессе обратной транскрипции синтезируется ДНК, которая длиннее РНК-матрицы: оба конца ДНК содержат последовательности с каждого конца РНК (U3 от 3'-конца и U5 от 5'-конца). Таким образом, каждый конец вирусной ДНК имеет ту же последовательность, U3-R-U5, которая после интеграции в геном клетки-хозяина будет являться концами провируса ВИЧ.

Интеграция вирусного генома в геном клетки-хозяина

Синтезированная двухцепочечная провирусная ДНК формирует пре-интеграционный комплекс с белками клетки-хозяина, вирусными белками интегразой, vpr и матриксным белком p17. Сигнал ядерной локализации внутри p17 направляет комплекс в ядро клетки [30, 31]. В ядре клетки геном ВИЧв виде двойной спирали ДНК интегрируется в геном клетки-хозяина путем сплайсинга с помощью фермента интегразы ВИЧ[32]. Результаты исследований показали, что провирусная ДНК предпочтительно интегрируется в области кодирования активных генов клетки [33]. Интегрированная форма генома ВИЧизвестна как «провирус» и реплицируется как часть нормального клеточного генома. Регуляция экспрессии генов ВИЧвключает в себя комплексное взаимодействие между хроматин-ассоциированной провирусной ДНК, клеточным фактором транскрипции и вирусным трансактиватором транскрипции Tat [34]. Несплайсированная полноразмерная РНК обладает характеристиками эукариотической клеточной мРНК, поскольку содержит кэп на 5'-конце и полиаденилирована на 3'-конце [35]. Данная РНК используется как для продукции вирусных структурных и регуляторных белков, так и для формирования новых вирусных частиц.

Транскрипция провирусной ДНК и синтез вирусных белков

LTR ВИЧ служат сайтами инициации транскрипции и содержат cis-актиновые элементы, необходимые для синтеза РНК. Транскрипция инициируется в области перехода U3/R LTR ВИЧ. Сайт U3 содержит множество элементов (LBP-1, NFкB, LEF, Ets, USF-1, NFAT-1), которые направляют РНК-полимеразу II (pol II) к провирусной ДНК ВИЧ. Транскрипция с LTR ВИЧприводит к синтезу большого количества (более 30) копий вирусной РНК [36].

Эти РНК разделяются на 3 больших класса:

1. несплайсированные РНК, которые функционируют как мРНК для Gag и прекурсора полипротеина Gag-Pol, и данные РНК пакуются в дочерние вирионы как генетический материал нового вируса;

2. частично сплайсированные мРНК размером ~5 т.п.н., кодирующие вирусные белки Env, Vpu, Vif и Vpr;

3. небольшие, размером около 1,7-2,0 т.п.н., полностью сплайсированные мРНК, которые транслируются в белки Rev, Tat и Nef.

На первой стадии ВИЧ-инфекции образуются полностью сплайсированные небольшие мРНК, инициирующие транскрипцию ранних регуляторных белков ВИЧTat, Rev и Nef [37-39]. Белок Tat связывается с TAR-петлей, формирующейся на 5'-конце продукта транскрипции и значительно ускоряет транскрипцию [34, 40]. Белок Rev взаимодействует с участком РНК RRE (Rev Response Element), образующимся на поздней фазе репликации ВИЧ. Данный комплекс из RRE и нескольких молекул Rev экспортируется в цитоплазму с помощью Rev-зависимого пути экспорта. Для этого комплекс Rev-RRE использует комплекс человеческих белков, содержащих белок экспортин-1 (XPO1/CRM1) и Ran-GTP. Образовавшийся комплекс Rev-RRE-Xpo1/RanGTP уже экспортируется в цитоплазму клетки и транслируется для синтеза остальных белков ВИЧили пакуется в качестве генома новых копий вируса [41].

Обычно трансляция мРНК в эукариотических клетках включает в себя поиск стартового кодона AUG, однако поскольку LTR ВИЧсодержат множество структурных регионов, таких как TAR, PBS, поли(А)-хвост, то обычный рибосомальный механизм поиска последовательности AUG на мРНК ВИЧне эффективен[42]. Кроме того, некоторые мРНК ВИЧсодержат последовательность AUG в области UTR (untranslated region), что может помешать инициации трансляции с истинного стартового кодона. Было предложено два основныхмеханизма, позволяющих инициировать трансляцию мРНК ВИЧальтернативными способами. Поскольку мРНК полиаденилирована, то она может быть транслирована через обычную кэп-зависимую инициацию трансляции или через связывание IRES (англ. Internal Ribosome Entry Site - участок внутренней посадки рибосомы[43-45]. После связывания с рибосомой РНК становится матрицей для синтеза вирусных белков.

Сборка вириона и продукция вируса

После синтеза полного набора вирусных белков начинается процесс сборки нового вириона ВИЧ. Для сборки инфективного вириона необходимо наличие двух копий вирусной РНК, вирусного праймера обратной транскрипции tRNALys3[26], полипротеинов Env, Gag и трех вирусных ферментов: протеазы, обратной транскриптазы и интегразы. Сборка ВИЧпроисходит на плазматической мембране инфицированной клетки. Все компоненты, необходимые для сборки вируса, доставляются к плазматической мембране с помощью транспортных систем инфицированной клетки [46].

Главную роль в сборке вируса играет прекурсор полипротеин Gag, Pr55Gag[47, 48]. Он состоит из матрикса (МА), капсида (CA), нуклеокапсида (NC), домена p6, а также включает два белка SP1 и SP2.МА-домен, ответственный за связывание Pr55Gag с клеточной мембраной, способствует включению вирусных гликопротеинов Env в образующиеся вирионы ВИЧ. СА обеспечивает мультимеризацию Gag в процессе сборки вириона, NC присоединяет вирусные РНК и способствует сборке вириона, домен p6 присоединяет ESCRT (the endosomal sorting complexes required for transport), который катализирует процесс отделения от мембраны клетки, способствуя, таким образом, отпочкованию вируса [49, 50].

1.5 Механизмы рекомбинации ВИЧ

Скорость рекомбинации ретровирусов выше, чем для большинства других вирусов, а скорость рекомбинации ВИЧ выше, чем у других ретровирусов, таких как вирус лейкемии мышей и вирус некроза селезенки[51-54]. Анализ геномов ВИЧ путем прямого секвенирования показал, что рекомбинации в процессе синтеза ДНК - явление довольно частое [55-59]. Во время синтеза (-)цепи ДНК ОТ ВИЧможет «переключаться» между двумя РНК, упакованными в вирион, с использованием каждой из них в качестве матрицы для синтеза ДНК. Таким образом, рекомбинантную ДНК могут генерировать только те вирионы, в которых были упакованы две генетически различные молекулы РНК [60].

Необходимо соблюдение нескольких условий для генерации новой рекомбинантной формы ВИЧ: во-первых, клетка, в которой происходит репликация вируса, должна быть инфицирована более чем одним вирусом. Во-вторых, молекулы РНК от двух разных провирусов должны быть упакованы в один вирион. В третьих, во время обратной транскрипции ОТ должна переключаться между матрицами РНК для генерирования рекомбинантной ДНК-копии ВИЧ, которая должна быть интегрирована в геном клетки-мишени. И, наконец, такой рекомбинантный провирус должен обладать свойством генерировать вирусы, способные к инфицированию и репликации. По этим причинам факторы, влияющие на любой из таких этапов, могут оказывать влияние на рекомбинацию. В настоящее время мало известно о том, как часто клетки-мишени у пациентов инфицируются более чем одним ВИЧ-1 (двойная инфекция). В культуре клеток двойная инфекция встречается чаще, чем предполагалось, в сравнении со случайными событиями [61]. Такой результат, по крайней мере, связан с тем, что некоторые клетки имеют больше рецепторов/корецепторов и, следовательно, более восприимчивы к инфекции ВИЧ-1 [62]. Двойная инфекция возрастает, когда ВИЧ-1 передается через клеточно-опосредованные события, поскольку множество вирусов передаются от клетки-донора в клетки-мишени [61].

Во время сборки ВИЧ-1белок p24 упаковывает полноразмерную РНК в виде диметра, следовательно, выбор молекулы РНК происходит до капсидирования РНК-геномов. Основным фактором, определяющим выбор той или иной РНК, является сигнал инициации димеризации (dimerization initiation signal, DIS), расположенный в 5'-области нетранслируемой РНК ВИЧ-1 [63]. Большинство ВИЧ-1 субтипов B и D имеют последовательность GCGCGC в DIS, тогда как большинство ВИЧ-1 субтипов А, С, F и G имеют последовательность GTGCAC, хотя возможны и другие последовательности [64,65]. Считается, что палиндромная последовательность в DIS способствует связыванию оснований двух РНК, что инициирует димеризацию РНК. Другие последовательности нуклеотидов в геноме вируса также могут оказывать влияние на частоту РНК гетеродимеризации, хотя и с менее выраженным эффектом, чем DIS [66].

Скорость рекомбинации ВИЧ-1 была измерена с использованием маркерных генов. Эти результаты показали, что скорость рекомбинации пропорциональна увеличению расстояния между двумя аллелями, когда расстояние между маркерами составляет менее 600 нуклеотидов, а максимально возможная скорость рекомбинации достигается, когда две аллели разделены между собой 1300 нуклеотидами [54, 67].

Несмотря на то, что рекомбинация происходит на протяжении всего генома ВИЧ-1, структура РНК может влиять на частоту рекомбинации определенных областей[68]. Гомология нуклеотидных последовательностей может влиять как на скорость рекомбинации ВИЧ, так и на распределение точек разрыва генома [69, 70]. Например, рекомбинация возникает гораздо чаще между двумя РНК ВИЧ-1 одного субтипа, чем между РНК различных субтипов, упакованных вместе в один вирион [59].

Существует несколько предположений о причинах рекомбинации генетического материала ретровирусов. Одна из теорий гласит, что адаптивное значение рекомбинации происходит от ее способности восстанавливать генетические повреждения, в том числеу РНК-содержащих вирусов[71]. Действительно, в первых работах по изучению рекомбинации ретровирусов было высказано предположение о существовании модели «принудительного выбора» (forced copy-choice model), когда ОТ переключается с одной матрицы РНК на другую, если в матрице имеются повреждения (разрывы) [72]. Однако дальнейшие исследования показали, что репликация вируса происходит с одинаковой частотой как на целых, так и на поврежденных матрицах РНК [73], и экспериментально индуцированные генетические нарушения в РНК не привели к более высокой частоте возникновения рекомбинаций [74]. В дальнейшем эта модель была пересмотрена, дополнена и переименована в модель «динамического выбора» (dynamic copy-choice model) [75]. Эта модель предполагает, что баланс между полимеразной активностью и активностью РНКазы Н вирусной ОТ определяет стабильность связи между синтезируемой ДНК и матрицей РНК, и что смещение этого баланса влияет на скорость рекомбинации. Если баланс смещается в сторону большей активности РНКазы Н по отношению к полимеразной активности ОТ, то возникает снижение взаимодействия между синтезируемой ДНК и матрицей РНК из-за диссоциации гетеродуплекса РНК/ДНК и происходит переключение ОТ на другую РНК-матрицу [75]. Обратный эффект, при котором активность РНКазы H снижается, а полимеразная активность ОТ возрастает, показал снижение частоты переключения между матрицами РНК [76, 77].

Наконец, для закрепления рекомбинации такие вирусы должны эффективно реплицироваться в новых клетках-мишенях. Большинство случаев переключения между РНК-матрицами являются комплементарными, то есть точки разрыва у матричной и синтезируемой молекулами совпадают [57, 78]. Однако, поскольку рекомбинанты содержат участки геномов каждого из «родителей», эти последовательности могут или не могут работать вместе эффективно [69, 79]. Особенно это выражено в случае, когда два родительских вирусных генома разделены большим генетическим расстоянием (например, когда родительские вирусы относятся к различным субтипам или группам). По этой причине многие вновь созданные межсубтипные рекомбинантные формы вирусов устраняются путем естественной селекции во время репликации вируса [59]. Создание жизнеспособной межсубтипной рекомбинантной формы сталкивается с множеством проблем: возможное снижение эффективности соупаковывания РНК, относительно неэффективное переключение между РНК-матрицами, а также снижение репликации. Тем не менее, согласно консервативной оценке, около 20% всех циркулирующих в настоящее время вариантов ВИЧ являются межсубтипными рекомбинантными формами ВИЧ[80]. Это доказывает, что рекомбинация является основной движущей силой эволюции в популяцииВИЧ.

1.6 Рецепторы и тропизм ВИЧ

Первый рецептор ВИЧ, CD4 (clusterofdifferentiation 4), был идентифицирован уже в 1984 г.[81-83]. Вскоре после этого выяснилось, что одного CD4 недостаточно для проникновения ВИЧв клетку-мишень. Первым результатом поиска других рецепторов, важных для проникновения ВИЧ, стало открытие в 1995 г. трех хемокинов подсемейства СС: RANTES (CCL5), MIP-1 (CCL3) и MIP-1 (CCL4), которые продемонстрировали сильное ингибирование ВИЧ-инфекции in vitro[84]. В марте следующего года хемокиновый рецептор CXCR4 был идентифицирован, как необходимый для связывания ВИЧкорецептор [85]. Эти открытия стимулировали целую серию исследований, и в этом же году был открыт второй корецептор ВИЧ- CCR5[86-89]. Также был открыт и специфический лиганд для CXCR4 - SDF-1 (CXCL12) [90, 91]. Третьим важным открытием в этот короткий период стало обнаружение, что делеция размером в 32 нуклеотида в участке, кодирующем ген CCR5 (CCR5-32), приводит к резистентности к ВИЧ[92, 93].

ВИЧможет инфицировать различные клетки, такие как Т-лимфоциты и макрофаги, которые экспрессируют молекулу CD4 на поверхности мембраны. Тропизм ВИЧраньше обозначал тип клетки, которую ВИЧинфицировал и в которой размножался. Так, в исследованиях биологических свойств ВИЧбыло обнаружено, что изоляты ВИЧ, выделенные от пациентов на ранней стадии ВИЧ-инфекции, обычно способны инфицировать макрофаги и первичные культуры CD4+ Т-лимфоцитов, но не способны размножаться в трансформированных Т-клеточных линиях[94, 95]. Для обозначения таких вирусов применялись термины М-тропный (макрофаготропный), NSI-изолят (от англ. non-sincytium inducting), то есть не способный образовывать синцитий, а также SL-изолят (от англ. slow/low - медленно/низко) - из-за низкой скорости репликации в Т-клеточных линиях [96, 97]. Спустя несколько лет после инфицирования, у пациентов образуются штаммы ВИЧ, которые способны размножаться в Т-клеточных линиях, при этом либо сохраняя, либо теряя способность инфицировать макрофаги. Такие штаммы ВИЧназывались Т-тропными, SL-изолятами (от англ. sincytium inducting), RH-изолятами (от англ. rapid/high - быстро/высоко) [98], или вирусами с двойным тропизмом [99]. После открытия корецепторов ВИЧстали понятны причины различия биологических свойств вируса: М-тропный вирус использует в качестве корецептора CCR5, T-тропные штаммы ВИЧиспользуют в качестве корецептора CXCR4 или оба корецептора. [100]. Современная фенотипическая классификация ВИЧоснована на использовании этих корецепторов: корецептор CCR5 - R5 вирус, CXCR4 - Х4 или R5X4 вирус, если ВИЧ использует 2 корецептора [101]. Использование того или иного корецептора вирусом определяется областью V3 белка gp120[102-104].

1.7 Патогенез ВИЧ-инфекции

Течение ВИЧ-инфекции при отсутствии антиретровирусной терапииможно разделить на 3 стадии: острую, хроническую и СПИД (рисунок 1.5)[105].

Острая (симптомная) фаза обычно начинается спустя две недели с момента инфицирования и длитсяоколо месяца. Наблюдаются симптомы, характерные для гриппа: повышение температуры тела, ломота, а также увеличение лимфатических узлов. В этой фазе ВИЧстремительно распространяется к лимфоузлам желудочно-кишечного тракта, в котором происходит быстрое истощение пула CD4+ЖКТ Т-лимфоцитов. Это возникает как из-за естественного истощения пула, так и в результате опознавания натуральными киллерами (НК) инфицированных клеток с помощью киллер-подобных иммуноглобулиновых рецепторов (KIRs) [106].

Острая фаза также характеризуется значительным ростом количества вируса в крови (вирусной нагрузки), доходящей до 105-106копий РНК ВИЧ/мл плазмы крови. В конце острой фазы наступает стабилизация ВИЧ-инфекции вследствие антивирусного иммунного ответа и переход ее в хроническую (латентную) фазу.

Иммунный ответ снижает вирусную нагрузку до ~3x104 копий РНК ВИЧ/мл плазмы (так называемый сет-поинт) [107]. Тем не менее уровень CD4+ Т-лимфоцитов периферической крови продолжает снижаться из-за постоянного восполнения пула погибших клеток, что приводит к истощению иммунной системы. Кроме этого, в хронической фазе ВИЧ-инфекции создается вирусный резервуар из пула инфицированных клеток. Это долгоживущие, невосприимчивые к ВААРТ Т-клетки памяти, макрофаги и дендритные клетки [108]. Хроническая фаза может длиться до 10 лет, на продолжительность времени влияют как генетические особенности организма, так и вирусные факторы. Сам пациент не испытывает каких-либо симптомов, однако наблюдается хроническая активация иммунной системы, в частности повышение уровня активированных клеток иммунной системы и воспалительных цитокинов.

Когда уровень CD4+ Т-лимфоцитов снижается до 200 клеток в 1 мкл крови и менее, наступает стадия СПИД. Развитие данной стадии характеризуется прогрессивной генерализированной лимфаденопатией, оппортунистическими инфекциями (напр. пневмоцистная пневмония) и нетипичными онкологическими заболеваниями (напр. саркома Капоши). Без ВААРТ пациенты со СПИД обычно живут не более трех лет, а при диагностировании опасной оппортунистической инфекции ожидаемый период жизни пациента снижается до одного года [105].

1.8 Терапия ВИЧ-инфекции

В 1987 г. появился первый антиретровирусный препарат зидовудин, нуклеозидный ингибитор обратной транскриптазы (НИОТ). Изначально он был синтезирован как средство против рака, но в дальнейшем было обнаружено, что он блокирует обратную транскрипцию ВИЧ[109,110]. Однако к данному препарату очень быстро развивалась резистентность, и в первые годы, когда зидовудин назначали в очень высоких дозах (1500 мг/сутки), наблюдалось выраженное угнетение кроветворения [111]. В начале 1990-х годов были синтезированы и начали применяться первые ингибиторы протеазы (ИП) и ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ), однако только в 1997 г. были опубликованы статьи [112, 113], в которых говорилось о существенном преимуществе комбинированной терапии, включающей 2 НИОТ и ИП(индинавир). Такая комбинированная терапия минимум трех различных антиретровирусных препаратов стала называться высокоактивной антиретровирусной терапией (ВААРТ), поскольку она значительно снижала заболеваемость оппортунистическими инфекциями и, как следствие, смертность от ВИЧ-инфекции [114].

По состоянию на март 2011 г. для лечения ВИЧ-инфекции разрешены к применению 30 отдельных и комбинированных препаратов, направленных на подавление репликации вируса. Эти препараты принадлежат к пяти фармакологическим группам:

1. нуклеозидные и нуклеотидные ингибиторы обратной транскриптазы (НИОТ);

2. ненуклеозидные ингибиторы обратной транскриптазы (ННИОТ);

3. ингибиторы протеазы (ИП);

4. ингибиторы проникновения (блокаторы корецепторов и ингибиторы слияния);

5. ингибиторы интегразы (ИИ).

В Республике Беларусь до недавнего времени применялись только 3 из 5 групп препаратов: НИОТ, ННИОТ и ИП. В 2015 году началось применение одного препарата из группы ИИ.

Несмотря на свою высокую эффективность, ВААРТ не приводит к полномуизлечению пациента от ВИЧ, поэтомуприем препаратов необходим на протяжении всей жизни ВИЧ-инфицированного. В настоящее время исследования в области терапии ВИЧ-инфекции направлены как раз на то, чтобы элиминировать латентные клетки, содержащие провирус ВИЧв своем геноме [115].

1.9 Генетическое разнообразие ВИЧ

Одними из основных особенностей ВИЧявляются высокие генетическое разнообразие и скорость эволюции вируса. Это обусловлено, по крайней мере, тремя факторами: множественным проникновением ВИЧв человеческую популяцию, низкой точностью и высокой рекомбиногенностью вирусной обратной транскриптазы, а также высокой скоростью размножения вируса [116]. Время жизни ВИЧв плазме крови и ВИЧ-продуцирующих клетках составляет 1-2 дня, и за это время образуется порядка 1010 новых копий вируса [117, 118]. Особенностью обратной транскриптазы ВИЧявляется отсутствие репарационной активности и, как следствие, генерация большого числа «ошибок» при репликации: 1-4 нуклеотидных замены/геном/раунд репликации [119]. Другая особенность обратной транскриптазы ВИЧ- способность «перескакивать» с одной цепи РНК на другую, вызывая рекомбинацию генома вируса [55]. Рекомбинация - один из наиболее значимых факторов, ускоряющих эволюцию ВИЧ, и она происходит, по разным расчетам, от 2 до 9 раз/геном/раунд репликации [27, 57, 120, 121].

Высокий уровень генетического разнообразия ВИЧпривел к тому, что стало необходимо классифицировать различные генетические варианты вируса. Для классификации ВИЧиспользуется метод филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей их геномов. Данная методика позволяет определить степень родства нуклеотидов и, как следствие, самих вирусов.

Согласно современной филогенетической классификации, ВИЧделится на типы, группы, субтипы и рекомбинантные формы (рисунок 1.6). Различают 2 типа ВИЧ: первый и второй (ВИЧ-1 и ВИЧ-2 соответственно). ВИЧ-1 родственен с вирусами, найденными у горилл и шимпанзе, обитающих в Западной Африке, а источником ВИЧ-2 являются черные мангобеи [2]. Филогенетический анализ показал, что внутри первого типа изоляты ВИЧ-1 образуют 4 кластера, названных группами M, N, O и P [1, 122, 123].

Группа М (major) - в нее входит подавляющее большинство штаммовВИЧ-1. В свою очередь, группа М разделяется на субтипы (подгруппы) и рекомбинантные формы. В настоящее время выделяют 9 субтипов ВИЧ, обозначающихся A (A1-A4), B, C, D, F (F1 и F2), G, H, J и K. Сиквенсы внутри субтипа или суб-субтипа более близки между собой, чем с сиквенсами других субтипов на протяжении всего их генома. Рекомбинантные формы ВИЧ-1 являются результатом рекомбинации геномов различных субтипов. Рекомбинантная форма ВИЧ-1 называется циркулирующей, если описано не менее трех, эпидемиологически не связанных случаев инфицирования вирусом с идентичной рекомбинантной структурой и охарактеризовано не менее двух полноразмерных геномов данного вируса. Циркулирующим рекомбинантным формам присваивается название по очередности их открытия с последующим указанием субтипов, из которых состоит данный геном. Сегменты, для которых невозможно определить родительский субтип, обозначаютсябуквой U (от англ. unclassified). Если рекомбинантная форма состоит из трех и более различных субтипов ВИЧ, то такой форме присваивается аббревиатура «cpx»(от англ. complex). В настоящее время выявлено 72 ЦРФ ВИЧ-1 и 1 ЦРФ ВИЧ-2 [124]. Уникальные рекомбинантные формы выявлены только у единичных, эпидемиологически связанных пациентов (например: мать-ребенок).

Вирусы группы О (outlier), вероятнее всего, передались в человеческую популяцию от диких горилл [125] и наиболее распространены в Камеруне, где в 1997 году более 2% пациентов были заражены вирусами данной группы,и в соседних центральноафриканских странах [126].

Группа N (non-M, non-O) представлена вирусами, циркулирующими только в Камеруне [127]. В 2011 г. единичный случай выявлен также во Франции.

Вирус группы P был впервые обнаружен в 2009 г. в Камеруне у ВИЧ-инфицированной женщины. Генетически этот вариант ВИЧ-1 близок к вирусу иммунодефицита горилл (SIVgor) и не проявлял никаких признаков рекомбинации с другими известными группами[122].Исследователи предположили, что данный вирус образует новую группу ВИЧ, не относящуюся к уже известным группам M, N или O. Позже данное предположение было подтверждено другой группой исследователей, которые обнаружили второй ВИЧ, принадлежащий к группе P. Этот вирус был выявлен у ВИЧ-серопозитивного пациента мужского пола в больнице Камеруна, подтверждая таким образом, что ВИЧ-1 группы P реплицируется в организме человека [123].

Различные генетические формы ВИЧ-1 зачастую локализованы в отдельных географических регионах. Наиболее часто встречаемые формы вируса - ВИЧ-1 субтипа А1 (12,3% всех случаев ВИЧ-инфекции в мире), субтипы B (10,2%), C (49,9%) и G (6,3%), а также CRF01_AE (4,7%) и CRF02_AG (4,8%) (рисунок 1.7)[128].В Северной Америке, Западной Европе и Австралии превалирующим является ВИЧ-1 субтипа B, в странах бывшего СССР - субтипа А1 и CRF03_AB. Доминирующий в пандемии ВИЧ-1 субтипа С локализованв основном в Южной и Восточной Африке, а также в Индии, где наблюдается наиболее сложная ситуация с эпидемией ВИЧ-1 в мире. Среди ЦРФ ВИЧ-1 превалирующей считается CRF02_AG, которая является наиболее часто встречаемой формой ВИЧ-1 в Западной Африке. Для сравнения, в других регионах нигде не наблюдается такой высокой превалентности рекомбинантных форм над «чистыми» субтипами ВИЧ-1. Очевидным исключением из регионального превалирования субтипов ВИЧ-1 является регион Западной и Центральной Африки, в котором наблюдается широкая вариабельность генетических форм ВИЧ-1 [124]. Это также может свидетельствовать о попаданииВИЧ-1 в человеческую популяцию именно в этом районе [129, 130].

Распространение ВИЧ-1 на территории стран бывшего СССР

Первые случаи ВИЧ-инфекции на территории СССР были зарегистрированы в 1987 г. в Ленинграде (совр. Санкт-Петербург) [131] и до 1994 г., уже после распада СССР, эпидемия ВИЧна этой территории носила случайный характер. У пациентов, выявленных в данный период на территории Российской Федерации, было обнаружено 8 субтипов ВИЧ-1: А1, В, С, D, E, F, G и H, доминирующим из которых являлся ВИЧ-1 субтипа B[132]. Вторым по значимости был субтип G, вызвавший вспышку ВИЧ-инфекции в Элисте, Республика Калмыкия[133]. Остальные субтипы выявлялись значительно реже и были связаны в основном с половым путем передачи [134].Все выявляемые вирусы не были генетически близкими друг другу, что свидетельствовало о множественном проникновении вируса на территорию России [135].

Эпидемия ВИЧ на территории бывшего СССР началась в 1994-1996 гг. и была вызвана стремительной передачей вируса среди потребителей инъекционных наркотиков. Эпидемия началась в южных городах Украины: г. Одесса (3500 случаев ВИЧ-инфекции среди ПИН) и г. Николаев (2000 случаев передачи среди ПИН,зарегистрированных с 1994 по 2000 гг.) [136, 137]. В дальнейшем эти варианты вируса вызвали вспышки эпидемии ВИЧв других городах Украины (Киев, Донецк), России (Санкт-Петербург, Саратов, Пермь и др.) [138, 139] и Беларуси (Светлогорск) [140]. Позже вспышки ВИЧ-инфекции среди ПИН выявились на территориях других стран бывшего СССР, включая Балтийский регион: Латвия, Литва и Эстония[141-143], Кавказ: Азербайджан и Грузия [144,145], Центральная Азия: Казахстан, Узбекистан, Дагестан и Таджикистан [146-148], a также на территории Молдовы [149]. Подавляющее большинство вирусов было выявлено среди потребителей инъекционных наркотиков, и эти варианты вируса относились к крайне генетически гомогенному варианту ВИЧ-1 субтипа А1, названному AFSU (или AIDU) [136]. Данный вариант вируса быстро стал преобладающим на территориях всех этих государств, за исключением Эстонии, в которой доминирующим является рекомбинантная форма CRF06_cpx [150]. Хотя первые вспышки ВИЧ-инфекции были зарегистрированы в конце 1994 г. на юге Украины, ретроспективный анализ образцов, собранных в Одессе в 1993 г., выявил несколько случаев инфицирования вариантом ВИЧ, филогенетически близким к AFSU, однако данный вариант имел более низкий уровень распространения и передавался в основном половым путем [151].

Вариант вируса AFSU впоследствии стал одним из родительских форм вируса для рекомбинантной формы, вызвавшей вспышку ВИЧ-инфекции в Калининграде - CRF03_AB. Позже был идентифицирован второй родительский вариант: ВИЧ-1 субтипа B - популяция вирусов, названная BFSU (или BIDU) [152]. Данная популяция вирусов была выявлена в другом южном украинском городе - Николаеве. Штаммы данного вируса также отличались чрезвычайно низким уровнем генетического разнообразия, характерным для общего источника заражения. При этом не удалось показать близкое генетическое родство данного варианта ни с одним штаммом субтипа В, обнаруженным ранее в странах бывшего СССР, Западной Европе или США. Предположительно, источником этой вспышки мог быть штамм ВИЧ-1 из Польши [153].

На сегодняшний день ВИЧ-1 субтипа А1 по-прежнему остается доминирующим на территории стран бывшего СССР:в Латвии[154], Литве, Украине [155], Российской Федерации[156], стран Кавказского региона[146, 148, 157, 158]. Исключениеиз этого списка - Эстония, где превалирующим вариантом ВИЧ-1 является циркулирующая рекомбинантная формаCRF06_cpx. Ожидаемо, генетические дистанции между вирусами субтипа А1 увеличились, с 1-3 до 6-8%, как из-за естественного вирусного разнообразия, так и из-за изменения основного пути передачи вируса с внутривенного введения наркотических средств на гетеросексуальный путь [160, 161].