Идентификация микроводорослей Euglena glacilis и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам

Размещено на http://www.allbest.ru/

Реферат

Пояснительная записка 76 с., 15 рис., 3 табл., 15 источников.

МИКРОВОДОРОСЛЬ, КЛАССИФИКАЦИЯ, ПОДВИЖНОСТЬ, АНТИБИОТИКИ, КСЕНОБИОТИКИ, РАЗОБЩИТЕЛЬ КЛЕТОЧНОГО ДЫХАНИЯ И СИНТЕЗА АТФ, СРЕДА ЛОЗИНО-ЛОЗИНСКОГО, EUGLENA GRACILIS.

Цель работы - выделение и идентификация микроводорослей и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам.

В процессе работы были выделены чистые культуры микроводоросли Euglena glacilis, проведена ее идентификация. Также были рассмотрены методы определения содержания микроводорослей, методы определения подвижности клеток, методы определения жизнеспособности клеток. Проведен эксперимент по определению влияния антибиотиков, разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность микроводоросли Euglena glacilis.

Практическая значимость работы заключается в возможности использования ее результатов для определения антибиотиков в мясомолочной продукции, позволяющий в течение 15-20 мин обнаружить присутствие антибиотиков в концентрации 0,001 ед./мл с относительной погрешностью 10%.

Содержание

• Введение
• 1. Основная часть
• 1.1 Проблема загрязнения водной среды и пищевых продуктов антибиотиками и ингибирующими веществами
• 1.1.1 Характеристика уровня химической загрязненности с/х сырья и пищевых продуктов
• 1.1.2 Влияние ингибиторов на качество с/х сырья и готовой продукции
• 1.2 Биотестирование ингибирующих веществ с помощью микроводорослей
• 1.2.1 Характеристика микроводорослей и их классификация
• 1.2.2 Способы выделения микроводорослей и их идентификация
• 1.2.3 Использование микроводорослей для оценки качества водных сред
• 1.3 Методы наблюдения и описания подвижности микроводорослей
• 1.3.1 Изменение подвижности микроводорослей в присутствии антибиотиков
• 1.3.2 Изменение жизнеспособности микроводорослей в присутствии ксенобиотиков
• 1.3.3 Метод микроскопического подсчета численности и подвижности микроводорослей
• 1.3.4 Метод цифровой фотосъемки
• 1.3.5 Математическое описание влияние ингибиторов на подвижность микроводорослей
• 1.4 Механизмы подавления подвижности клеток
• 1.4.1 Биоэнергетика клеток и ее связь с подвижностью микроорганизмов
• 1.4.2 Разобщители клеточного дыхания и окислительного фосфолирования
• 2. Экспериментальная часть
• 2.1 Материалы и оборудование
• 2.1.1 Микроорганизмы и питательные среды для культивирования микроорганизмов
• 2.1.2 Выделение чистых культур микроводорослейи их идентификация
• 2.2 Методы анализа
• 2.2.1 Методы определения содержания микроводорослей
• 2.2.2 Методы определения подвижности клеток
• 2.2.3 Методы определения жизнеспособности клеток
• 2.3 Результаты и их обсуждение
• 2.3.1 Описание выделения и идентификации микроводорослей
• 2.3.2 Изучение влияния антибиотиков на подвижность микроводорослей
• 2.3.3 Анализ влияния разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток
• Заключение

Список использованных источников

Введение

Микроводоросли - древнейшие про- и эукариотические фотосинтезирующие организмы, ведущие свободный и симбиотический образ жизни. Распространенные по всему земному шару, в самых разнообразных местообитаниях, они играют огромную роль в жизни природы и человека.

Эта группа организмов обладает большим разнообразием морфологии, анатомии, онтогенеза, географии и экологии. В связи с этим микроводоросли являются перспективными объектами для проведения разноплановых научных исследований в области физиологии, биохимии, биофизики, генетики, космической биологии и т.д. Их используют для повышения продуктивности водоемов и плодородия почв, получения биологически активных веществ и различных пищевых и кормовых добавок, в качестве индикаторных организмов при изучении текущего состояния почв и водоемов. В последнее время проводятся исследования, направленные на изучение возможности использования водорослей для получения биотоплива и поглощения углекислого газа из атмосферы. Целью данной курсовой работы является выделение и идентификация микроводорослей и анализ их чувствительности к ингибирующим веществам. Задачи:

1) Рассмотреть методы выделения чистых культур микроводорослей и способы их идентификации;

2) Выделить чистую культуру микроводоросли Euglena glacilis;

3) Рассмотреть методы определения содержания микроводорослей;

4) Рассмотреть методы определения подвижности клеток;

5) Рассмотреть методы определения жизнеспособности клеток.

6) Изучить влияние антибиотиков на подвижность Euglena glacilis;

7) Изучить влияние разобщителей дыхания и синтеза АТФ на подвижность клеток.

1. Основная часть

микроводоросль euglena glacilis клетка

1.1 Проблема загрязнения водной среды и пищевых продуктов антибиотиками и ингибирующими веществами

1.1.1 Характеристика уровня химической загрязненности с/х сырья и пищевых продуктов

Современный Мировой океан, содержащий многочисленные стоки различных высокотоксичных химических веществ и нефтепродуктов, уничтожает фитопланктон, который является основным источником кислорода на Планете, по пищевым цепям загрязняет флору и фауну. Леса, уменьшающие негативное антропогенное влияние и улучшающие экологическую ситуацию, производящие наряду с кислородом эфирные масла, электризующие атмосферу и способствующие образованию озона за счет молниеобразования, активно сводятся в Европе, в Сибири, на Дальнем Востоке, в долине реки Амазонки.

Загрязнение атмосферы промышленными выбросами приводит к выпадению кислотных дождей, снижающих урожайность сельскохозяйственных культур и резко повышающих токсичность продовольственного сырья за счет вынужденного увеличения количества применяемых минеральных удобрений и образования высокотоксичных водорастворимых металлоорганических соединений, в т.ч. тяжелых металлов, что в целом ряде случаев вызывает гибель растений.

Повсеместное в течение длительного времени применение в сельскохозяйственном производстве пестицидов и минеральных удобрений, особенно азотсодержащих, загрязняет литосферу, гидросферу и атмосферу, продовольственное сырье и пищевые продукты ксенобиотиками суперэкотоксикантами. В водопроводной воде, являющейся основным ингредиентом большей части пищевых продуктов, содержатся различные чужеродные химические вещества.

В результате потребления загрязненных продуктов питания существенно снижаются иммунобиологическая защита организма человека и качество его здоровья.

Необходимость нормирования вредных веществ в почвенном покрове особенно актуальна в последнее время в связи с интенсивным процессом накопления в литосфере различных высокотоксичных соединений, продуцируемых, прежде всего, энергетическим комплексом и промышленными предприятиями, а также вследствие применения пестицидов и минеральных удобрений в сельском и лесном хозяйстве. Даже на значительном расстоянии от мест размещения металлургических и химических производств в почвенном покрове и, соответственно в выращенных на этой почве овощах и фруктах, наблюдается повышенное содержание высокотоксичных солей тяжелых металлов, таких как хром, никель, медь, цинк, свинец, кадмий и др.

В основу нормативов качества питьевой воды, воды пресных водоемов и морей, используемых в рекреационных целях, источников водоснабжения и сточных вод положен принцип эпидемиологической безопасности. В качестве нормативного уровня для водоемов, служащих источниками хозяйственно-питьевого водоснабжения, принят такой уровень микробиологического загрязнения по различным индикаторным микроорганизмам, при котором патогенные бактерии и кишечные вирусы, как правило, не выделяются из воды водоемов в условиях их промышленно-бытового загрязнения и при сбросе обеззараженных сточных вод: Е. coli - не более 1000 в 1л, энтерококки - не более 100 в 1л, фаги кишечных палочек - не более 1000 клеток в 1л.

Наибольшую экологическую опасность представляют нарушения в системе централизованного водоснабжения, обусловливающие до 80% вспышек инфекционных заболеваний "водного" происхождения. Важным показателем качества водопроводной воды, используемой для хозяйственно-питьевых целей, служит количество бактерий группы кишечной палочки: в 1л воды должно быть не более 3 бактерий (коли-индекс=3) или, соответственно, количество воды, в котором содержится 1 бактерия (коли-титр) - не менее 300 мл.

Биологическому загрязнению окружающей среды в значительной мере способствуют предприятия микробиологической промышленности. Существенным фактором в распространении аэрогенных инфекций является воздух закрытых помещений, преимущественно больничных.

В существующих, практически повсеместно неблагоприятных экологических условиях, продовольственное сырье и продукты питания загрязняются различными чужеродными для живого организма веществами, представляющими существенную опасность для здоровья людей. Для защиты организма человека от токсичных веществ, которые могут попасть с пищей, создан комплекс нормативов содержания чужеродных химических веществ и загрязнителей биологического происхождения в продовольственном сырье и продуктах питания. Эти нормативы регламентируют такое содержание загрязняющих веществ, которое не должно вызывать заболеваний или нарушений здоровья, в том числе в отдаленные сроки у настоящего и будущих поколений [1].

1.1.2 Влияние ингибирующих веществ на качество с/х сырья и пищевых продуктов

Чужеродные токсические вещества в продуктах питания могут иметь как естественное, так и искусственное происхождение. К последним, так называемым ксенобиотикам (от греч. xenos - чужой и bios - жизнь), относят антропогенные и иные вещества, случайно попадающие в продукты или преднамеренно вносимые как пищевые добавки для улучшения их потребительских свойств или повышения технологичности основного производства: красители, консерванты, антиоксиданты, эмульгаторы и пр. Пищевые продукты могут быть загрязнены также такими высокотоксичными веществами, как пестициды, гормональные стимуляторы, ветеринарные препараты, микотоксины, тяжелые металлы, ингредиенты упаковочных материалов, преимущественно полимерных, и др.

Продовольственной и сельскохозяйственной организацией ООН (ФАО) и Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) совместно с Программой ООН по окружающей среде (ЮНЕП) в целях обеспечения безопасности пищевых продуктов рекомендован обязательный контроль на наличие следующих токсичных загрязняющих веществ:

- загрязнители биологического происхождения - бактерии и бактериальные токсины, гельминты, вирусы, микотоксины: афлатоксины, цитринин, фузариотоксин, охратоксин А, патулин;

- химические загрязнители - металлы: сурьма, мышьяк, кадмий, хром, кобальт, свинец, ртуть, никель, олово и их соли; пестициды: дитиокарбаматы, метилбромиды, хлорорганические, фосфорорганические; прочие вещества: асбесты, фториды, нитраты, нитриты, нитрозосоединения, диоксины и диоксиноподобные соединения, полиароматические углеводороды, винилхлорид, антибиотики, гормональные препараты;

- радиоизотопы - цезий-137, стронций-90, йод-131.

В современном мировом сельскохозяйственном производстве используется широкий ассортимент химических средств, предназначенных для повышения урожайности, защиты и регуляции роста растений. Из них к числу наиболее опасных, с точки зрения загрязнения окружающей природной среды, продовольственного сырья и продуктов питания, а также негативного влияния на здоровье человека, относятся пестициды.

1.) Пестициды (от лат. pestis - зараза и caedo - убиваю, ядохимикаты) - химические препараты для борьбы с сорняками (гербициды), вредителями (инсектициды, акарициды, зооциды и др.), болезнями (фунгициды, бактерициды и др.) культурных растений. В группу пестицидов включают также: дефолианты (от де... и лат. folium - лист) - химические препараты, вызывающие старение листьев и искусственный листопад, что ускоряет созревание и облегчает уборку урожая, в основном хлопчатника; десиканты (от лат. desicco - высушиваю) - химические препараты, вызывающие обезвоживание тканей растений, что ускоряет их созревание и облегчает уборку урожая, в основном хлопчатника, риса, клещевины, картофеля; регуляторы роста растений. Большинство пестицидов - синтетические органические вещества.

В настоящее время в сельскохозяйственном производстве разрешено использование около 600 наименований пестицидов, изготовленных из более 300 веществ, относящихся к различным группам химических соединений. Пестициды подразделяются на хлор-, ртуть-, и фосфорорганические соединения, синтетические пиретроиды, медьсодержащие фунгициды и др.

Принята, основанная на гигиенических характеристиках, следующая классификация пестицидов.

А) По токсичности при однократном поступлении в организм через желудочно-кишечный тракт пестициды делятся на:

- сильнодействующие - ЛД₅₀ - до 50 мг/кг;

- высокотоксичные - ЛД₅₀ - 50-200 мг/кг;

- среднетоксичные - ЛД₅₀ -200-1000 мг/кг;

- малотоксичные - ЛД₅₀ - более 1000 мг/кг,

где ЛД₅₀ - доза, вызывающая гибель подопытных животных.

Б) По кумулятивным (от лат. cumulatio - скопление), свойствам - на вещества, обладающие:

- сверхкумуляцией - коэффициент кумуляции менее 1; - выраженной кумуляцией - коэффициент кумуляции 1-3;

- умеренной кумуляцией - коэффициент кумуляции 3-5;

- слабовыраженной кумуляцией - коэффициент кумуляции более 5,

где коэффициент кумуляции - отношение суммарной дозы препарата при многократном введении к дозе, вызывающей гибель животных при однократном введении.

В) По стойкости:

- очень стойкие - время разложения на нетоксичные компоненты более 2 лет;

- стойкие - время разложения 0,5-1 год;

- умеренно стойкие - время разложения 1-6 мес.;

- малостойкие - время разложения 1 мес. и менее.

Нарушение гигиенических норм хранения, транспортирования и применения пестицидов приводят к их накоплению в кормах, продовольственном сырье и пищевых продуктах. Попадая в организм человека, они оказывают различное токсическое действие, в зависимости от особенностей химической структуры и дозы.

2.) Регуляторы роста растений (РРР) применяют с целью влияния на процессы роста, развития и жизнедеятельности растений, обеспечения урожайности, улучшения качества продукции, облегчения уборки. К этой группе соединений можно отнести также гербициды, вызывающие задержку роста и гибель растений, при этом гербициды в зависимости от дозы, могут проявлять как ингибирующее, так и стимулирующее действие. В отличие от гербицидов, РРР создают подобный эффект в значительно более малых дозах - граммах и миллиграммах действующего вещества на гектар.

Все существующие регуляторы роста растений можно разделить на две группы: природные и синтетические.

Природные РРР - это присущие растениям соединения, выполняющие роль фитогормонов: ауксины, гиббереллины, цитокинины, абсцизовая кислота, этилен и др. Они не представляют какой-либо опасности для человека, так как в процессе эволюции человеческого организма вырабатывались соответствующие механизмы их биотрансформации.

Синтетические РРР получают химическим или микробиологическим путем. С физиологической точки зрения они являются аналогами эндогенных фитогормонов, либо могут оказывать влияние на гормональный статус растений.

К этой группе относятся:

- производные сульфонилмочевины;

- азоксофор;

- биферан (предпосевная обработка клубней картофеля);

- кротонолактон (обработка семян риса);

- квартазин (семян ячменя, пшеницы, ржи);

- фумар (саженцев) и др.

В отличие от природных, синтетические РРР могут оказывать вредное воздействие на организм человека, как ксенобиотики, однако степень опасности многих из них полностью не изучена. Известно, что механизм действия высоких доз РРР заключается в подавлении активности ацетолактатсинтетазы - ключевого фермента на раннем этапе биосинтеза ряда аминокислот. Предполагается при этом, что ростостимулирующее действие низких доз связано с влиянием на эндогенный уровень природных гормонов или непосредственно на клеточные структуры.

Используют регуляторы роста растений и для увеличения сроков хранения растительных продуктов, например, картофеля, моркови, лука, репы и др. При этом сохраняется водный баланс, вкусовые качества, витамины, минеральные вещества, другие показатели пищевой ценности.

Вместе с тем, по причине отсутствия полной ясности о скрытых механизмах воздействия РРР на обменные процессы растений, специалистами не исключается возможность их негативного влияния, связанного с нарушением внутриклеточного обмена и образования токсичных соединений. К тому же, как установлено, остаточные количества РРР в продовольственном сырье и продуктах питания могут сами проявлять токсические свойства.

Потенциальная опасность регуляторов роста растений для человека усугубляется стойкостью этих соединений в окружающей среде и продуктах питания.

3.) Удобрения. Применение удобрений в сельском хозяйстве имеет важное значение для управления плодородием почв, повышения урожайности и пищевой ценности сельскохозяйственных культур. Нарушение агрохимических и гигиенических регламентов применения удобрений приводит к их чрезмерному накоплению в почве, растениях, к загрязнению продовольственного сырья и пищевых продуктов, что оказывает токсическое действие на организм человека.

В зависимости от химического состава различают удобрения азотные, фосфорные, калийные, известковые, микроудобрения, бактериальные, комплексные и др. Условно их можно подразделить на минеральные и органические. Необходимость в удобрениях обусловлена тем, что естественный круговорот азота, фосфора, калия и других питательных для растений соединений не может восполнить потерь этих биоэлементов, уносимых из почвы с урожаем.

Азот играет очень важную роль в жизнедеятельности растений как компонент белков, нуклеиновых кислот, витаминов, других биологически активных веществ. Азотные удобрения, в зависимости от формы соединения азота, существуют в следующих видах:

- аммиачные - азот присутствует в виде свободного аммиака (жидкий, водный, безводный);

- аммонийные - азот представлен ионом аммония (сульфат аммония);

- нитратные - азот находится в составе остатка азотной кислоты (натриевая и кальциевая селитры);

- аммонийнонитратные - содержат азот в аммонийной и нитратной формах (аммиачная селитра);

- амидные - представлены мочевиной - амидом карбаминовой кислоты, превращающимся в почве под воздействием уреазы бактерий в углекислый аммоний;

К медленнодействующим азотным удобрениям относятся мочевиноформальдегидные, мочевиноальдегидные, изобутилдиендимочевина, оксамид и некоторые другие. Нитратная форма удобрений в допустимых дозах способствует образованию в растениях аскорбиновой кислоты и кальция, аммонийная - фосфора.

Фосфорные удобрения различаются количеством оксида фосфора Р₂О₅, один из самых распространенных видов - суперфосфат. Накопление в почве и растениях чрезмерного количества Р₂О₅ тормозит протекающие в них биологические процессы.

Калийные удобрения - калийная соль (калий хлористый), калиймагнезиальное удобрение (КСl+NaCl+MgSO₄), калийно-аммиачная селитра (КNО₃+NH₄Cl) и др. Калий не входит в органический состав веществ растений, он активно участвует в углеводном и белковом обменах.

Микроудобрения необходимы для обогащения почвы микроэлементами, наибольшее распространение из них получили борные, молибденовые, медные, марганцевые, цинковые и кобальтовые.

Комплексные удобрения содержат комплекс питательных для растений элементов - фосфорно-азотные, фосфорно-калийные и др.

С целью повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, профилактики их заболеваний и сохранения доброкачественности кормов в животноводстве широко применяются различные кормовые добавки, а также лекарственные и химические препараты: аминокислоты, минеральные вещества, ферменты, антибиотики и другие антибактериальные вещества, транквилизаторы (от лат. tranquillo - успокаиваю, психотропные средства, уменьшающие чувство напряжения, тревоги, страха), антиоксиданты (природные или синтетические вещества, замедляющие или предотвращающие окисление органических соединений), красители, ароматизаторы и др.

4.) Антибактериальные вещества. Антибиотики, наряду с сульфаниламидами и нитрофуранами, относятся к антибактериальным веществам, которые интенсивно применяются в ветеринарии и животноводстве для ускорения откорма, профилактики и лечения эпизодических заболеваний, улучшения качества кормов, их сохранности и т.д. Добавляются, как правило, в корм в количестве 50-200 г на 1 тонну. Около половины производимых в мире антибиотиков применяется в настоящее время в животноводстве.

Антибиотики способны переходить в мясо, молоко животных, яйца птиц и многие другие продукты и оказывать токсическое действие на организм человека. Эта проблема усугубляется существованием R-плазмидной (внехромосомной) передачи лекарственной устойчивости, как в организме людей, так и животных: R-фактор обладает способностью переносить от бактерии к бактерии устойчивость к множеству антибиотиков сразу и, что особенно опасно, делает возможным передачу резистентности (от лат. resisto - сопротивляюсь) от непатогенных бактерий к патогенным видам, например от S. faecalis к S. aureus, от E. coli к Salmonella или Shigella. Существование внехромосомной передачи лекарственной устойчивости может быть причиной снижения терапевтического эффекта антибиотиков.

Антибиотики могут быть природными компонентами в пищевых продуктах или попадать в них в результате технологических процессов, как, например, при созревании сыров. Такие антибиотики в определенных небольших количествах могут быть полезны для человека, в ряде случаев они определяют вкусовые и диетические свойства продукта.

Антибиотики, содержащиеся в пищевых продуктах в количествах, превышающих допустимые нормы, могут оказывать аллергическое (от греч. allos - другой и ergon - действие, повышенная или извращенная чувствительность организма к какому-либо аллергену - веществу, вызывающему аллергию) действие. При этом наиболее сильными аллергенами являются пенициллин и тилозин. Очевидно, что это обуславливает необходимость эффективного контроля как за применением антибиотиков в ветеринарии и животноводстве, так и за их возможными остаточными количествами в продовольственном сырье и продуктах питания.

Сульфаниламиды, также как и антибиотики, оказывают антимикробное действие. Оно менее эффективно, чем у антибиотиков, однако для борьбы с инфекционными заболеваниями животных сульфаниламиды более доступны. При этом концентрация сульфаниламидов в кормах достигает десятков миллиграммов на 1 кг, они способны накапливаться в организме животных, загрязнять молоко, мясо, яйца, мед, а также изготовленные из них продукты. Как показал опыт, наиболее часто обнаруживаются следующие сульфаниламиды: сульфаметазин, сульфахиноксазолин, сульфадиметоксин и сульфаметозин.

Нитрофураны, также относящиеся к антибактериальным препаратам, обладают бактерицидным (от бактерии и лат. caedo - убиваю; свойство химических веществ - бактерицидов, физических и биологических факторов - температура, ионизирующее излучение и др. - вызывать гибельбактерий) и бактериостатическим (стат - от греч. statos - стоящий, не-подвижный; часть слова, указывающая на неизменность состояния, постоянство чего-либо) действием. Наибольшую антимикробную активность проявляют 5-нитро-2-замещенные фураны, которые различаются по способу применения, длительности циркуляции в организме и пр. Важной особенностью нитрофуранов является их эффективность в борьбе с инфекциями, устойчивыми к сульфаниламидным препаратам и к антибиотикам.

Накопление нитрофуранов в органах и тканях животных зависит от сроков отмены препаратов перед убоем, которые составляют от 5 до 20 суток, увеличение срока особенно важно для кур-несушек. Считается, что остатки этих лекарственных препаратов не должны содержаться в пище человека, поэтому их допустимые концентрации в продуктах питания отсутствуют. Вместе с тем имеются фактические данные, свидетельствующие о возможной контаминации нитрофуранов

5.) Гормональные препараты . Гормональные препараты (ГП) используются в ветеринарии и животноводстве для стимуляции роста животных, улучшения усвояемости кормов, многоплодия, регламентации сроков беременности, ускорения полового созревания и др. Многие гормональные препараты обладают выраженной анаболической (от греч. anabole - подъем (ассимиляция) - совокупность химических процессов в живом организме, направленных на образование и обновление структурных частей клеток и тканей, составляет противоположную катаболизму сторону обмена веществ и заключается в синтезе сложных молекул из более простых с накоплением энергии) активностью и применяются в этой связи для откорма скота и птицы: полипептидные и белковые гормоны (инсулин, соматотропин и др.); производные аминокислот - тиреоидные гормоны; стероидные гормоны, их производные и аналоги.

Следствием применения гормональных препаратов в животноводстве является проблема загрязнения ими продовольственного сырья и продуктов питания.

6.) Азотосодержащие кормовые добавки. В сельскохозяйственном производстве в качестве азотосодержащей кормовой добавки длительное время применяли мочевину. В желудке жвачных она расщепляется до аммиака, который используется микроорганизмами для синтеза белка. Однако передозировка мочевины может приводить к интоксикации, а в ряде случаев - и к гибели крупного рогатого скота. Более перспективной азотосодержащей кормовой добавкой является полиакриламид, кормовая ценность которого обеспечивается наличием группы NH₂.

Применение лекарственных препаратов и кормовых добавок в ветеринарии, животноводстве и птицеводстве требует соблюдения определенных гигиенических правил, направленных на снижение загрязнения продовольственного сырья и продуктов питания. При этом важно обеспечить необходимый контроль остаточных количеств загрязнителей в продуктах питания с использованием быстрых и надежных методов их анализа.

Продукты питания человека, как правило, представляют собой сложные многокомпонентные системы, состоящие из сотен различных химических соединений, которые принято подразделять на следующие три основные группы.

А) Соединения, имеющие алиментарное (от лат. alimentum - пища, содержание) значение; это необходимые организму нутриенты (от позднелат. nutritio - питание): белки, жиры, углеводы, витамины, минеральные вещества.

Б) Вещества, участвующие в формировании вкуса, аромата, цвета, предшественники и продукты распада основных нутриентов, другие биологически активные вещества, которые являются условно неалиментарными; к этой группе относят также природные соединения, обладающие антиалиментарными (например, антивитамины) и токсическими (фазин в фасоли, соланин в картофеле и др.) свойствами.

В) Чужеродные, потенциально опасные соединения антропогенного (от греч. anthropos - часть сложных слов, означающая: относящийся к человеку) или природного происхождения; согласно принятой терминологии, их называют ксенобиотиками (от греч. xenos - чужой и bios - жизнь), а также контаминантами (от лат. contaminatio - соприкосновение, смешение); эти соединения могут быть неорганической и органической природы, в том числе микробиологического происхождения.

Основными путями загрязнения продовольственного сырья и продуктов питания являются:

- использование неразрешенных красителей, консервантов, антиоксидантов и других пищевых добавок или их применение в повышенных дозах (от греч. dosis - порция, прием - точно отмеренное количество чего-либо: вещества, лекарства);

- применение новых, не прошедших соответствующую апробацию (лат. approbatio - одобрение, утверждение, основанное на проверке, обследовании, испытании) нетрадиционных технологий производства продуктов питания или отдельных пищевых веществ, в том числе полученных путем химического и микробиологического синтеза;

- загрязнение сельскохозяйственных культур и продуктов животноводства пестицидами (от лат. pestis - зараза и caedo - убиваю) - ядохимикатами, используемыми для борьбы с вредителями растений и в ветеринарной практике - для профилактики заболеваний животных;

- нарушение гигиенических (от греч. hygieinos - здоровый) правил использования в растениеводстве удобрений, оросительных вод, твердых и жидких отходов промышленности и животноводства, коммунальных и других сточных вод, осадков очистных сооружений и т.д.;

- использование в животноводстве и птицеводстве неразрешенных кормовых добавок, консервантов, стимуляторов роста, профилактических и лечебных медикаментов или их применение в повышенных дозах;

- миграция в продукты питания токсических веществ из пищевого оборудования, посуды, тары, упаковки при использовании неразрешенных неметаллических материалов, в т.ч. полимерных, или металлов;

- образование в пищевых продуктах эндогенных (от греч. endon - внутри), токсических (от греч. toxikon - яд) соединений в процессе теплового воздействия, кипячения, жарения, облучения и других способов технологической обработки;

- несоблюдение санитарных требований к технологии производства и хранения пищевых продуктов, приводящее к образованию бактериальных токсинов: микотоксинов (от греч. mykes - гриб), ботулотоксинов (от лат. botulus - колбаса, - пищевая токсикоинфекция (от лат. infectio - заражение, - внедрение и размножение в организме человека или животного болезнетворных микроорганизмов), в результате отравления продуктами, зараженными палочками ботулизма и их токсинами) и др.;

- поступление в продовольственное сырье и продукты питания токсических веществ, в т.ч. радионуклидов, из окружающей среды: атмосферы, гидросферы, литосферы.

Наибольшую опасность с точки зрения распространенности и токсичности имеют следующие ксенобиотики и контаминанты.

А) Токсины микроорганизмов, которые относятся к числу наиболее опасных природных загрязнителей, широко распространены в растительном сырье. Так, в, арахисе, кукурузе и ячмене, в т.ч. в поступающих по импорту (от лат. importo - ввожу), обнаруживаются афлатоксины, вырабатываемые плесневыми грибами, главным образом аспергиллами, оказывающие токсическое действие на печень млекопитающих, птиц, рыб, потенциальные канцерогены; токсин патулин, как правило, выявляется в продуктах переработки фруктов - соки, фруктовые пюре и джемы, что связано с нарушениями основной технологии основного производства и использованием нестандартного сырья.

Б) Токсические химические элементы, в т.ч. тяжелые металлы, основной источник загрязнения которых - тепловая энергетика, добывающая, металлургическая и химическая промышленность.

В) Антибиотики (греч. anti- - против и греч. bios - жизнь; органические вещества, образуемые микроорганизмами и обладающие способностью убивать микробов или препятствовать их росту; антибиотиками называются также антибактериальные вещества, извлекаемые из растительных и животных клеток) - как результат нарушений их примененияв ветеринарной практике; остаточные количества антибиотиков обнаруживаются в 15-25% продукции животноводства и птицеводства.

Г) Пестициды - накапливаются в продовольственном сырье и пищевых продуктах вследствие неправильного использования химических средств защиты растений, особую опасность при этом вызывает одновременное наличие нескольких пестицидов, уровень которых превышает предельно допустимую концентрацию (ПДК).

Д) Нитраты, нитриты и нитрозоамины, наличие которых в продуктах питания связано с нерациональным использованием азотистых удобрений и пестицидов, приводящее к их накоплению, а также усилению процессов нитрозирования (нитрозирование - введение в молекулу органического соединения нитрозогруппы N-О, при этом образуются нитрозосоединения, нитрозоамины R₂NNO, оксимы R₂CNOH) в объектах окружающей среды и в организме человека, и, как следствие этого, образо-ванию высокотоксичных соединении - N-нитрозоаминов; по данным Института питания РАМН РФ в настоящее время N-нитрозоамины встречаются практически во всех мясных, молочных и рыбных продуктах, при этом до 35% мясных и до 50% некоторых рыбных продуктов содержат их в концентрациях, превышающих гигиенические нормативы.

Е) Диоксины и диоксиноподобные соединения (диоксин - бесцветные кристаллы, tпл. 320-325°С; диоксин и близкие к нему по строению соединения - источники загрязнения окружающей среды, химически инертны, способны накапливаться в организме, наиболее высокотоксичны); являются хлорорганическими, особо опасными ксенобиотиками, образуются как побочные продукты при синтезе некоторых гербицидов (от лат. herba - трава и caedo - убиваю; химические препараты из группы пестицидов для уничтожения нежелательной, главным образом сорной, растительности; включают арборициды и альгициды), а также в целлюлозно-бумажной промышленности, при сжигании мусора и пр.; основными источниками диоксинов являются предприятия, производя-щие хлорную продукцию.

Ж) Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) - образуются преимущественно в результате техногенных процессов, но также и природных процессов.

З) Радионуклиды - искусственные и природные источники.

И) Пищевые добавки - красители, консерванты, антиоксиданты, стабилизаторы, подсластители, ароматизаторы и пр.; их применение регламентируется нормативной документацией и наличием соответствующего разрешения санитарных органов здравоохранения [1].

1.2 Биотестирование ингибирующих веществ с помощью микроводорослей

1.2.1 Характеристика микроводорослей и их классификация

В основу разграничения водорослей по основным таксонам (царствам, отделам, классам и др.) положены следующие признаки: тип фотосинтетических пигментов, а следовательно, и окраска клеток; наличие жгутиков, их строение, количество и способ прикрепления к клетке; химический состав клеточной стенки и дополнительных оболочек; химический состав запасных веществ; число клеток в талломе и способ их взаимодействия.

К началу 20в. Различали следующие классы водорослей по Пашеру:

- сине-зеленые водоросли - Cynophceae;

- красные водоросли - Rhodophyceae;

- зеленый водоросли - Chlorophyceae;

- золотистые водоросли - Chrysophyceae;

- желто-зеленые, или разножгутиковые, водоросли - Xanthophyceae, или Heterocontae;

- диатомовые водоросли -Bacillariophyceae, или Diatomeae;

- динофициевые водоросли - Dinophyceae;

- криптофициевые водоросли - Cryptophyceae;

- эвгленофициевые водоросли - Euglenophyceae.

Каждый класс характеризуется специфическим набором пигментов, запасным продуктом, откладывающимся в клетке в процессе фотосинтеза, и если есть жгутики, то их строением.

Прокариотические микроводоросли объединены в подцарство - цианеи (Cyanobionta). К нему относятся все сине-зеленые водоросли или цианеи. Это простого строения организмы приспособленные жить в воде. Исторические связи этих водорослей с бактериями проявляются в строении клеток. Но они отличаются от бактерий по наличию хролофилла "а" и очень редко - "b". В процессе фотосинтеза они выделяют кислород.

· Отдел Cyаnophyta - сине-зеленые водоросли или цианеи

Большинство цианобактерий -- облигатные фототрофы, которые, однако способны к непродолжительному существованию за счёт расщепления накопленного на свету гликогена в окислительном пентозофосфатном цикле и в процессе гликолиза.

Цианобактерии, по общепринятой версии, явились "творцами" современной кислородсодержащей атмосферы на Земле, что привело к "кислородной катастрофе" -- глобальному изменению состава атмосферы Земли, произошедшему в самом начале протерозоя (около 2,4 млрд лет назад) которое привело к последующей перестройке биосферы и глобальному гуронскому оледенению. В настоящее время, являясь значительной составляющей океанического планктона, цианобактерии стоят в начале большей части пищевых цепей и производят значительную часть кислорода (вклад точно не определен: наиболее вероятные оценки колеблются от 20 % до 40 %). Цианобактерия Synechocystis стала первым фотосинтезирующим организмом, чей геном был полностью расшифрован. Рассматривается возможное применение цианобактерий в создании замкнутых циклов жизнеобеспечения, а также как массовой кормовой или пищевой добавки. Классификация:

- Порядок Chroococcales -- Хроококковые:

Класс Gloeobacteria;

- Порядок Nostocales -- Ностоковые;

- Порядок Oscillatoriales -- Осциллаториевые;

- Порядок Pleurocapsales -- Плеврокапсовые;

- Порядок Prochlorales -- Прохлорофиты;

- Порядок Stigoneomatales -- Стигонемовые.

Эукариотические микроводоросли одно- или многоклеточные, различно окрашенные, первично фотоавтотрофные растения, большей частью живущей в воде. Пластиды этих водорослей содержат хролофилл и чаще всего дополнительный хролофиллы "b", "с" каротиноиды, ксантофиллы и редко фикобилины. Донором электронов для фотосинтеза служит вода. Ранее водоросли классифицировали в составе Царства Растений, где они составляли обособленную группу. Однако с развитием молекулярно-генетических методов систематики стало ясно, что эта группа филогенетически очень неоднородна. В настоящее время водоросли относят к двум Царствам эукариот: Chromista и Protista.

Водоросли, относящиеся к Царству Chromista

Фотосинтезирующие хромисты обычно содержат в хлоропластах не свойственный растениям каротиноид фукоксантин, а иногда и другие специфические пигменты, а также хлорофилл с. Еще одной особенностью клеток хромистое является наличие двух эукариотических жгутиков, один из которых обычно перистый - имеет трубчатые ответвления основной нити. Хлоропласт и ядро чаще окружены общей мембраной, при этом в хлоропласте имеются светочувствительные гранулы (стигма), воспринимающие изменения интенсивности освещения и обусловливающие фототаксис. Запасными веществами хромистое является не крахмал, как у растений, а жироподобное вещество лейкозин, полисахарид ламинарии или другие специфические полисахариды. Типичная по структуре клетка хромистое изображена в соответствии с рисунком 1.

Рисунок 1 - Структура клеток представителей Царства Chromista

- Подцарство Водоросли (Phycobionta):

· Отдел Bacillariophyta- диатомовые водоросли:

Являясь важнейшей составляющей морского планктона, диатомовые создают до четверти всего органического вещества планеты.

Только коккоиды, форма разнообразна. В основном одиночные, реже -- колониальные. Большинство представителей этого отдела одноклеточные, однако встречаются ценоцитные и нитчатые формы. Диатомовые водоросли играют очень важную роль в трофических связях водных организмов, являясь основным компонентом фитопланктона, а также придонных осадков. Будучи фотосинтезирующими организмами, они служат главным источником пищи для пресноводных и морских животных. Считается, что на их долю приходится до четверти всего совершаемого на нашей планете фотосинтеза.

Хлоропласты диатомей содержат хлорофиллы а и с, а также фукоксантин. Размножение в основном бесполое -- путем деления клетки. Запасным веществом служит лейкозин.

У диатомовых водорослей жгутиковая стадия представлена только мужскими гаметами (у некоторых видов). Поэтому подвижные формы передвигаются за счет направленного перетекания цитоплазмы в районе шва панциря, в котором цитоплазма и мембрана граничат с окружающей средой. Эти организмы имеют уникальные двустворчатые панцири, состоящие из кремнезема (SiO₂•nН₂O) и формирующие две половинки, вставляющиеся одна в другую. Створки панциря имеют тонкую орнаментацию и выглядят очень красиво. Известно более 10 тысяч видов диатомей, которые отличаются поразительным разнообразием и тончайшей филигранностью.

При отмирании клеток кремниевые скелеты не разрушаются, они накапливаются в течение десятков миллионов лет на дне водоемов. Эти отложения называют "диатомовым илом" и используют в качестве абразивного материала для полировки, а также для фильтрования.

· Отдел Chrysophyta - золотистые водоросли:

Включают в себя преимущественно микроскопические водоросли различных оттенков жёлтого цвета.

Большинство золотистых водорослей -- одноклеточные, реже колониальные, ещё реже многоклеточные организмы.

В основном золотистые водоросли -- миксотрофы, то есть, имея пластиды, способны поглощать растворённые органические соединения и/или пищевые частички. У некоторых тип питания (автотрофный, миксотрофный или гетеротрофный) зависит от условий окружающей среды или клеточного состояния.

Вегетативное размножение происходит путём продольного деления клетки пополам или фрагментами колонии слоевища. Бесполое размножение осуществляется с помощью одно- или двужгутиковых зооспор, или, реже, апланоспор и амёбоидов. Половое размножение лучше всего описано у представителей с домиками благодаря хорошо наблюдаемому образованию зигот. Клетки прикрепляются друг к другу в зоне отверстия домика, и их протопласты сливаются, образуя зиготу.

Насчитывается более тысячи описанных видов золотистых водорослей, большинство из которых представлено подвижными за счет жгутиков одноклеточными формами, однако встречаются и нитевидные, и колониальные виды. Некоторые представители имеют амебоидное строение клеток и отличаются от амеб только наличием хлоропластов.

Многие хризофиты лишены клеточной стенки, но имеют кремнеземовые чешуйки или скелетные элементы. Запасным веществом служит хризоламинарин. Фотосинтетические пигменты представлены хлорофиллами а и с, а также каротинами и ксантофиллами, которые придают клеткам золотисто-коричневый оттенок.

Золотистые водоросли, как правило, обитают в планктоне, но встречаются и донные, прикреплённые формы. Входят в состав нейстона. Большинство золотистых водорослей встречается в основном в пресноводных бассейнах умеренного климата, достигая наибольшего видового многообразия в кислых водах сфагновых болот, что связано с образованием у них кислых, а не щелочных фосфатаз. Они необычайно требовательны к содержанию железа в воде, которое используют для синтеза цитохромов. Меньшее количество видов обитает в морях и солёных озёрах, единичные обнаружены в почве. Максимума развития золотистые водоросли достигают в холодное время года: в планктоне они доминируют ранней весной, поздней осенью и зимой. В это время они играют значительную роль как продуценты первичной продукции и служат пищей зоопланктону. Некоторые золотистые водоросли (р. Uroglena, Dinobryon, Mallomonas, Synura; Prymnesium parvum), развиваясь в массовом количестве, способны вызывать цветение воды.

Цисты золотистых водорослей, встречаемые в осадках со дна водоёмов, используют в качестве экологических индикаторов для изучения условий окружающей среды в прошлом и настоящем. Золотистые водоросли улучшают газовый режим водоёмов, имеют значение в образовании илов и сапропелей.

· Отдел Cryptophyta - криптофитовые водоросли:

Криптофиты -- небольшая, но экологически и эволюционно очень важная группа организмов, обитающих в морских и континентальных водах. Почти все они -- одноклеточные подвижные жгутиконосцы, некоторые представители способны формировать пальмеллоидную стадию. Только один род Bjornbergiella (выделен из почв Гавайских островов) способен к образованию простых нитчатых талломов (положение этого рода до конца не выяснено, и в ряде систем его не относят к криптофитам), оспаривается и существование колониальных форм.

Среди криптомонад встречаются автотрофы, гетеротрофы (сапротрофы и фаготрофы) и миксотрофы. Большинство из них требуют витамин В12 и тиамин, некоторые нуждаются в биотине. Криптомонады могут использовать аммоний и органические источники азота, но морские представители менее способны к превращениям нитратов в нитриты по сравнению с другими водорослями. Органические вещества стимулируют рост криптомонад.

Основной способ размножения криптомонад -- вегетативный, за счёт деления клетки пополам с помощью борозды деления. При этом впячивание плазмалеммы идёт начиная с заднего конца клетки. Чаще всего делящаяся клетка сохраняет подвижность. Максимальная скорость роста для многих криптомонад -- одно деление в день при температуре около 20 °С. Дефицит азота и избыточное освещение стимулируют образование покоящихся стадий. Покоящиеся цисты окружены толстым экстрацеллюлярным матриксом.

Криптофитовые -- типичные представители планктона, изредка они встречаются в иле солёных озёр и среди детрита в пресных водоёмах. Они занимают видное положение в олиготрофных, умеренных и высокоширотных, пресных и морских водах.

Пресноводные представители предпочитают искусственные и естественные водоёмы со стоячей водой -- отстойники, различные пруды (биологические, технические, рыбоводные), реже встречаются в водохранилищах и озёрах. Они образуют крупные популяции в озёрах на глубине 15--23 м, в месте соединения слоёв воды, богатых и бедных кислородом, где уровень света значительно ниже, чем у поверхности. Бесцветные представители распространены в водах, загрязнённых органическими веществами, их много в сточной воде, поэтому они могут служить показателем загрязнения воды органическими веществами.

Среди криптофит встречаются типичные сфагнофиллы, живущие в болотах с низким значением рН, в то время как ряд видов может развиваться в широком диапазоне рН.

· Отдел Haptophyta - гаптофитовые водоросли:

Гаптофиты -- это группа аутотрофных, осмотрофных или фаготрофных простейших, которые населяют морские экосистемы. Гаптофиты, как правило, одноклеточные, но встречаются и колониальные формы. Несмотря на маленький размер, эти организмы играют очень большую и важную роль в геохимических циклах углерода и серы.

Многие гаптофиты помимо фототрофии способны к осмотрофному и фаготрофному поглощению питательных веществ, таким образом, миксотрофия для них -- обычное явление.

Большинство примнезиофитов обитает в морях, предпочитая открытые зоны, лишь немногие встречаются в пресных и солоноватых водоёмах. Наибольшего биоразнообразия примнезиофиты достигают в водах, содержащих минимальное количество биогенов, субтропических океанических открытых водах, где встречаются даже на глубине более 200 м.

Некоторые примнезиофиты играют отрицательную роль в природе. Так, виды, образующие кокколиты, участвуют в глобальном потеплении климата как ключевые элементы в глобальном балансе улекислого газа. Они могут вызывать "цветение" воды, которое из-за способности кокколитов отражать свет, называют "белым".

· Отдел Xanthophyta - желто-зеленые водоросли:

Водоросли, хлоропласты которых окрашены в жёлто-зелёный или жёлтый цвет.

Среди ксантофитов встречаются одноклеточные жгутиковые формы, а также колониальные, нитчатые и ценоцитные. Последние представлены широко распространенным родом Vaucheria ("водяной войлок"). Эти ценоцитные нитчатые слабоветвящиеся водоросли часто обнаруживаются на периодически затопляемом прибрежном иле.

У большинства жёлто-зелёных известно вегетативное и бесполое размножение.

Жёлто-зелёные водоросли входят в различные экологические группы -- планктон, реже в перифитон и бентос. Подавляющее большинство из них -- свободноживущие формы.

Водоросли, относящиеся к Царству Protista

Фотосинтезирующие Протесты в совокупности с гетеротрофными Протистами входят в состав смешанных типов - Dinoflagellata (динофлагелляты) и Euglenida (эвгленовые), а также представлены крупными группами зеленых и красных водорослей. Динофлагелляты. Относящиеся к типу Dinoflagellata водоросли иначе называют огненными (Pyrrhophyta) за способность к биолюминесценции - явлению свечения, или испускания видимого света.

Большинство огненных водорослей представляют собой одноклеточные формы с двумя жгутиками, часто причудливой и очень разнообразной формы, с плотными целлюлозными пластинками, образующими клеточную стенку в виде шлема или доспехов. Некоторые имеют довольно большие размеры, достигая 2 мм в диаметре. Из-за наличия под плазматической мембраной большого количества слоистых ячеек (альвеол) эти водоросли относят к особой группе Протистов - альвеолятам.

Фотосинтезирующие динофлагелляты обычно содержат хлорофиллы а и с, а также каротиноиды, их клетки бывают окрашены в золотистые и буро-коричневые тона. Запасным веществом является крахмал. Эти водоросли часто вступают в симбиотические отношения с морскими организмами (губками, медузами, актиниями, кораллами, кальмарами и др.). В этом случае они утрачивают целлюлозные пластинки и выглядят как золотистые сферические клетки, называемые зооксантеллами. В таких симбиотических системах животное обеспечивает динофлагелляты углекислотой, необходимой им для фотосинтеза, и предоставляет защиту, а водоросли снабжают животное кислородом и органикой.

Основной способ бесполого размножения динофлагеллят - продольное деление, реже встречается формирование зооспор. Некоторые виды способны к половому размножению в ходе изогамии, иногда - анизогамии.

Известно около 2000 видов ныне живущих динофлагеллят, обитающих чаще в морских, реже - в пресноводных водоемах. Фотосинтезирующие представители типа являются высокопродуктивными компонентами морского планктона, способными, однако, вызывать массовые вспышки заболевания и гибели рыбы, моллюсков, других животных. Оно объясняется необычайно бурным развитием некоторых огненных водорослей, способных образовывать яды, относящиеся к числу мощных нервных токсинов. В результате наносится огромный ущерб морским промыслам, а кроме того, получают отравления люди, употребляющие в пищу рыбу или моллюсков, питавшихся ядовитыми водорослями.

· Отдел Chlorophyta - зеленые водоросли:

Самый обширный на данное время отдел водорослей. По приблизительным подсчётам сюда входит около 500 родов и от 13 000 до 20 000 видов. Все они отличаются в первую очередь чисто-зелёным цветом своих слоевищ, сходным с окраской высших растений и вызванным преобладанием хлорофилла над другими пигментами. Чрезвычайно велик и диапазон их размеров -- от нескольких микрон до нескольких метров.

Преобладающими пигментами хлоропластов (как и у растений) являются хлорофиллы а и Ь, отчего талломы окрашены в зеленый цвет. Каротиноиды в хлоропластах многих одноклеточных Зеленых водорослей формируют скопление в виде "глазка" (стигмы). Многие виды содержат в клетках сократительные вакуоли, участвующие в осморегуляции. Одноклеточные формы обычно подвижны за счет двух одинаковых жгутиков, причем жгутики не покрыты трубчатыми ответвлениями, как у Хромистов.

Основным резервным материалом зеленых водорослей является крахмал, а клеточные стенки большинства видов состоят из целлюлозы. Эти признаки в совокупности с химическим составом фотосинтезирующих пигментов и некоторыми особенностями строения отдельных клеточных элементов делают зеленые водоросли очень похожими на растения. Кроме того, как и у растений, у зеленых водорослей наблюдается смена генераций в жизненном цикле. Подобное сходство позволяет считать зеленые водоросли непосредственными предками наземных растений. Исследование малых рРНК показало, что отдельные представители данной группы, в частности харовые водоросли, даже ближе по степени филогенетического родства к растениям, чем к другим водорослям.

Размножение зелёных водорослей бывает вегетативным, бесполым и половым.