Отъёмно–доливное культивирование микроорганизмов – продуцентов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Тема работы: "Отъёмно-доливное культивирование микроорганизмов - продуцентов"

1. Введение (Цель и задачи биотехнологии как науки).

2. Общая характеристика различных методов культивирования продуцентов.

3. Принципы составления питательных сред. Основные источники питания, используемые для культивирования микроорганизмов-продуцентов. Методы оптимизации питательных сред.

4. Образование продуктов при культивировании микроорганизмов. Первичные и вторичные метаболиты. Двухфазность процесса обмена веществ у микроорганизмов.

5. Основные понятия об отъёмно-доливном способе культивирования. Кинетические характеристики, на основании которых подбирается программа проведения процесса.

6. Привести пример промышленного применения отъёмно-доливного способа ферментации и описать данный процесс.

7. Преимущества и недостатки отъёмно-доливного процесса ферментации по сравнению с традиционным периодическим культивированием.

Содержание

• Введение
• 1. Определение процесса брожения. Основные виды процессов брожения. Характеристика продуктов,получаемых путем ацетоно-бутилового брожения - ацетона, бутанола, масляной кислоты. Химизм образования перечисленных веществ. Области применен
• 1.1 Основные виды процессов брожения
• 1.1.1 Молочнокислое брожение
• 1.1.2 Маслянокислое брожение
• 1.1.3 Пропионовокислое брожение и пропионовокислые бактерии
• 1.1.4 Ацетоно-бутиловое брожение
• 1.2 Характеристика продуктов, получаемых путем ацетонобутилового брожения - ацетона бутанола, масляной кислоты
• 1.3 Химизм образования ацетона, бутанола масляной кислоты при ацетонбутиловом брожении
• 1.4 Области применения
• 2. Методы культивирования продуцентов биологически активных веществ. Указать, какие из существующих методов используются при получении ацетона, бутанола, масляной кислоты
• 3. Технологии получения ацетона и бутанола, включая: характеристику микроорганизмов - продуцентов, источников питания, входящих в состав питательных сред, условия проведения процесса, аппаратурное оформление
• 3.1 Особенности ацетоно-бутилового брожения
• 3.2 Производственные среды
• 3.3 Поддержание культуры бактерий и подготовка инокулята
• 3.4 Брожение
• 3.5 Инфицирование в условиях ацетоно-бутилового брожения
• 3.6 Перегонка ацетоно-бутиловой бражки
• 4. Основные пути интенсификации процессов биосинтеза в том числе продуктов ацетоно-бутилового брожения
• Заключение
• Список литературы
• брожение бутиловый продуцент биосинтез
• Введение
• Биотехнология -- междисциплинарная область научно-технического прогресса. Она весьма гетерогенна по своему теоретическому базису, потому что призвана исследовать не какой-либо класс объектов, а решать определенный круг комплексных проблем. Одной из них является, например, поиск дешевого заменителя тростникового (свекловичного) сахара, и армия биотехнологов берется за дело, сочетая в своей деятельности элементы различных наук: методы микробиологии, необходимые для выращивания микроорганизма, биохимии -- для выделения глюкоизомеразы (дающей глюкозо-фруктозный сироп при использовании глюкозы как субстрата), органического синтеза-- для получения полимерного носителя, а при регулировке параметров системы с иммобилизованным ферментом необходимы физико-химические расчеты. Добавим еще, что для повышения эффективности биосинтеза глюкоизомеразы могут быть использованы методы генетической и клеточной инженерии.
• Круг вопросов, к решению которых привлекают биотехнологические разработки, весьма широк. Однако большинство из них прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией: загрязнение окружающей среды, угроза экологического кризиса; истощение запасов полезных ископаемых, в первую очередь источников энергии, угроза мирового энергетического кризиса; нехватка продовольствия, особенно ощутимая в развивающихся странах.
• Слова "биология" и "биотехнология" различаются лишь тем, что в слове "биотехнология" есть вставка "техно". И биология, и биотехнология имеют дело с живыми объектами, но как различны их подходы к живому! Биотехнолог изучает живое не из чисто познавательного интереса, он пытается "заставить" работать живые объекты, производить нужные человеку продукты. "Зачем брать на себя труд изготовления химических соединений, если микроб может сделать это за нас?", -- говорил Дж. Б. С. Холдейн еще в 1929 г., предвосхищая грядущий расцвет биотехнологии.
• В современной биотехнологии живое рассматривается как средство производства в ряду всех прочих средств; например, при биологической трансформации органических соединений микроорганизмам отводят роль химических реагентов. Не случайна и стандартная для инженерной энзимологии метафора, уподобляющая иммобилизованные биообъекты "закованным в цепи рабам". Биообъект, таким образом, понижают в ранге, переводя из категории самостоятельной целостной живой системы в категорию реагентов, датчиков, реле, компьютерных деталей, прочих орудий модернизированного производства.
• Эта тенденция современной биотехнологии имеет не только философское, но и практическое значение. Она порождает чересчур грубый, примитивный, чисто эмпирический подход к такому сложному объекту, как живое, что ведет к его низкоэффективному функционированию в условиях биотехнологического процесса. Не оправдал себя, в частности, лобовой метод оптимизации подобного процесса, оптимизация "грубой силой", проводимый без детальных знаний физиологии используемого организма. Недостаточно надежен в биотехнологии и метод кибернетического моделирования, упрощающий биологический объект до "черного ящика".
• 1. Определение процесса брожения. Основные виды процессов брожения. Характеристика продуктов,получаемых путем ацетоно-бутилового брожения - ацетона, бутанола, масляной кислоты. Химизм образования перечисленных веществ. Области применения
• Брожение - процесс анаэробного расщепления органических веществ, преимущественно углеводов, происходящий под влиянием микроорганизмов или выделенных из них ферментов. В ходе брожения в результате сопряженных окислительно-восстановительных реакций освобождается энергия, необходимая для жизнедеятельности микроорганизмов, и образуются химические соединения, которые микроорганизмы используют для биосинтеза аминокислот, белков, органических кислот, жиров и др. компонентов тела. Одновременно накапливаются конечные продукты брожения. В зависимости от их характера различают брожение спиртовое, молочнокислое, маслянокислое, пропионовокислое, ацетоно-бутиловое, ацетоно-этиловое и др. виды.

1.1 Основные виды процессов брожения

Спиртовое брожение -- это процесс окисления углеводов, в результате которого образуются этиловый спирт, углекислота и выделяется энергия.

Сбраживание cахаров известно с глубокой древности. В течение столетий пивовары и виноделы использовали способность некоторых дрожжей вызывать спиртовое брожение, в результате которого сахара превращаются в спирт.

Брожение производят главным образом дрожжи, а также некоторые бактерии и грибы. В различных странах для получения спирта используют различные микроорганизмы. Например, в Европе используют в основном дрожжи из рода Saccharomyces, в Южной Америке -- бактерии Pseudomonas lindneri, в Азии -- мукоровые грибы.

Сбраживаться могут лишь углеводы, и притом весьма избирательно. Дрожжи сбраживают только некоторые 6-углеродные сахара.

Схематично спиртовое брожение может быть изображено уравнением

С6Н12О6 -> 2С2Н5ОН + 2С02 + 23,5 * 104 дж.

Процесс спиртового брожения -- многоступенчатый, состоящий из цепи химических реакций. Превращения глюкозы до образования пировиноградной кислоты происходят так же, как и при дыхании. Эти реакции происходят без участия кислорода (анаэробно). Далее пути дыхания и брожения расходятся.

При спиртовом брожении пировиноградная кислота превращается в конечном итоге в спирт и углекислоту. Эти реакции протекают в две стадии. Сначала от пирувата отщепляется С02 и образуется уксусный альдегид; затем уксусный альдегид присоединяет водород, восстанавливаясь в этиловый спирт. Все реакции катализируются ферментами. В восстановлении альдегида участвует НАД-H2. Обычно при спиртовом брожении, кроме главных продуктов, образуются побочные. Они довольно разнообразны, но присутствуют в небольшом количестве: амиловый, бутиловый и другие спирты, смесь которых называется сивушным маслом -- соединение, от которого зависит специфический аромат вина. Образование побочных веществ связано с тем, что превращение глюкозы частично идет другими путями. Биологический смысл спиртового брожения заключается в том, что образуется определенное количество энергии, которая запасается в форме АТФ, а затем расходуется на все жизненно необходимые процессы клетки.

1.1.1 Молочнокислое брожение

При молочнокислом брожении конечным продуктом является молочная кислота. Молочнокислые бактерии подразделяют на 2 группы -- гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные бактерии (например, Lactobacillus delbruckii) расщепляют моносахариды с образованием двух молекул молочной кислоты в соответствии с суммарным уравнением:

C6H12O6 = 2CH3CHOH·COOH.

Гетероферментативные бактерии (например, Bacterium lactis aerogenes) ведут сбраживание с образованием молочной кислоты, уксусной кислоты, этилового спирта и CO2, а также образуют небольшое количество ароматических веществ -- диацетила, эфиров и т.д.

При молочнокислом брожении. превращение углеводов, особенно на первых этапах, близко к реакциям спиртового брожения, за исключением декарбоксилирования пировиноградной кислоты, которая восстанавливается до молочной кислоты за счёт водорода, получаемого от НАД-Н. Гомоферментативное молочнокислое брожение- используется для получения молочной кислоты, при изготовлении различных кислых молочных продуктов, хлеба и в силосовании кормов в сельском хозяйстве. Гетероферментативное молочнокислое брожение происходит при консервировании различных плодов и овощей путём квашения.

1.1.2 Маслянокислое брожение

Сбраживание углеводов с преимущественным образованием масляной кислоты производят многие анаэробные бактерии, относящиеся к роду Clostridium. Первые этапы расщепления углеводов при маслянокислом брожении аналогичны соответстветственным этапам спиртового брожения, вплоть до образования пировиноградной кислоты, из которой при маслянокислом брожении образуется ацетил-кофермент A (CH3CO-KoA).

Маслянокислое брожение применялось для получения масляной кислоты из крахмала.

1.1.3 Пропионовокислое брожение и пропионовокислые бактерии

Пропионовокислые бактерии обитают в рубце и кишечнике жвачных животных (коров, овец); они участвуют там в образовании жирных кислот, главным образом пропионовой и уксусной. Благодаря им образующаяся в рубце в результате различных видов брожения молочная кислота превращается главным образом в пропионовую. Пропионовокислые бактерии не встречаются в молоке, и их не удается выделить из почвы или природных вод. Различают несколько видов таких бактерий, из которых наиболее известны вид Propionibacterium freudenreichii и его подвид shermanii, а также P. acidi-propionici (прежнее название -Р. pentosaceum). Возбудитель угрей - воспаления волосяных фолликулов у человека - тоже относится к пропионовокислым бактериям (P. acnes). Помимо рода Propionibacterium к бактериям, образующим пропионовую кислоту, причисляют Veillonella alcalescens (Micrococcus lactilyticus), Clostridium propionicum, Selenomonas и Micromonospora. Пропионат как продукт брожения выделяют и многие другие бактерии.

Пропио-новая кислота образуется из молочной согласно следующему уравнению:

ЗСН3--СНОН--СООН -> 2СН3--СН2--СООН + СН3-- СООН + С02 + Н20

Восстановление лактата или пирувата до пропионата идет по пути, который по характерному промежуточному продукту был назван ме-тилмалонил-СоА-путем. Сначала пируват при участии комплекса биотин-С02 карбоксилируется метилмалонил-СоА-карбокси трансферазой с образованием оксалоацетата, а затем восстанавливается через малат и фумарат до сукцината. Транспорт электронов на этом этапе сопряжен с фосфорилированием. Затем сукцинат с помощью СоА-трансферазы (сукцинил-СоА: пропионат-СоА-трансферазы) присоединяется к СоА и таким образом активируется. Сукцинил-СоА под действием метилмалонил-СоА-мутазы и при участии кофермента В12 (цианкобаламина) превращается в метил-малонил-СоА, и только от этого промежуточного продукта, наконец, отщепляется С02; в результате образуется пропионил-СоА, а С02 связывается с упомянутой выше метилмалонил-СоА-карбокситрансфе-разой. Из пропионил-СоА образуется пропионат, в результате того что СоА-трансфераза переносит СоА на сукцинат. Следует особо отметить, что в процессе образования пропионата две группы (С02 и СоА) переносятся с последующего продукта на предшествующий, не освобождаясь. Заслуживает внимания и участие трех кофакторов (биотина, СоА и кофермента В12) в этом процессе. По метилмалонил-СоА-пути пропионат образуется у большинства пропионовокислых бактерий, а также у Veillonella alcalescens и Selenomonas ruminantium.

1.1.4 Ацетоно-бутиловое брожение

Бактерии Clostridium acetobutylicum сбраживают углеводы с преим. образованием бутилового спирта (CH3CH2CH2CH2OH) и ацетона (CH3COCH3). При этом образуются также в сравнительно небольших количествах водород, CO2, уксусная, масляная кислоты, этиловый спирт. Ацетоно-бутиловое брожение использовалось для промышленного получения бутилового спирта и ацетона, применяемых в химической и лакокрасочной промышленности.

1.2 Характеристика продуктов, получаемых путем ацетонобутилового брожения - ацетона бутанола, масляной кислоты

Масляная кислота (бутират)-продукт конденсации двух молекул ацетил-СоА при участии тиолазы с образованием ацетоацетил-СоА и его последующим восстановлением . Ацетоацетил-СоА восстанавливается за счет NADH2 при участии fi-гидроксибутирил-СоА-дегидрогеназы до (3-гидроксибутирил-СоА. От последнего с помощью крото-назы отщепляется вода. Кротонил-СоА под действием флавинового фермента бутирил-СоА-дегидрогеназы восстанавливается до бутирил-СоА. От бутирил-СоА с помощью СоА-трансферазы СоА может переноситься на ацетат; при этом освобождается масляная кислота, которая выходит в среду. Из ацетил-СоА при участии фосфотрансацетилазы и ацетаткиназы может быть получен свободный ацетат, что сопровождается синтезом АТР из ADP.

Бутанол, ацетон образуются при сбраживании глюкозы клетками Clostridium acetobutylicum. При этом вначале выделяется также масляная кислота; однако по мере подкисления среды начинают синтезироваться ферменты (в том числе ацетоацетатдекарбоксилаза), действие которых приводит к накоплению ацетона и бутанола. Процессы образования этих веществ тесно связаны между собой. В результате декарбоксилирования части ацетоацетата утрачивается потенциальный акцептор водорода, который при восстановлении в бутират мог бы дважды присоединить 2[Н]. Этот водород так или иначе должен быть передан другим акцепторам, в том числе и только что образовавшемуся бутирату. Для восстановления до бутанола бутират должен быть сначала активирован путем превращения в бутирил-СоА. При брожении в щелочной среде С. acetobutylicum ведет себя как С, butyricum.

1.3 Химизм образования ацетона, бутанола масляной кислоты при ацетонбутиловом брожении

Химизм ацетонобутилового брожения еще недостаточно выяснен. В последнее время для изучения его используют метод меченых атомов. В бродящую среду вводят промежуточные продукты брожения (уксусную, ацетоуксусную и масляную кислоты), содержащие углерод С13, а затем определяют наличие этого углерода в конечных продуктах. Этим способом установлено, что при добавлении уксусной кислоты с С13 около 50% всего меченого углерода содержится в бутиловом спирте, около 15%- в ацетоне, до 18% - углекислом газе. При добавлении масляной кислоты, содержащей С13, около 85% меченого углерода переходит в бутиловый спирт. Он найден также в этиловом спирте, в уксусной и масляной кислотах. Исходя из этих данных, считают, что образование бутилового спирта идет главным образом через масляную кислоту. Кроме того, полагают, что ацетон образуется через масляную кислоту.

Первые стадии брожения до образования ацетольдоля протекают подобно маслянокислому брожению. Далее между двумя молекулами ацетальдоля протекает окислительно - восстановительная: оксимасляная кислота и оксибутиловый спирт по следующему уравнению: реакция, в результате которой образуются два соединения: в - оксимасляная кислота и в - оксибутиловый спирт по следующему уравнению:

2СН3СНОСН2СНО + Н2О > СН3СНОНСН2СООН + СН3СНОНСН2СН2ОН

в - Оксимасляная кислота далее отщепляет водород и переходит в ацетоуксусную кислоту, которая затем распадается на ацетон и углекислый газ:

СН3СНОНСН2СООН > СН3СОСН2СООН > СН3СОСН3 + СОв -

оксибутиловый спирт подвергается восстановлению до n - бутилового спирта согласно уравнению:

CН3СНОНСН2СН2ОН + Н2 > СН3СН2СН2СН2ОН + Н2О

Часть уксусного альдегида, по-видимому, также вовлекается в окислительно-восстановительную реакцию с образованием уксусной кислоты и этилового спирта:

СН3СНО + СН3СНО + Н2О >СН3СООН + СН3СН2ОН

Рисунок 1 - Схема ацетоно-бутилового брожения: 1 -- фосфотраисферазная система фруктозобнсфосфатного пути; 2 -- пируват: ферредоксин-оксидоредуктаза; 3 -- гндрогеназа; 4 -- ацетоацетилтрансфераза (тнолаза); 5 - L (+)-в-гидрокснбутнрил-КоА-дегндрогеназа; 6-- L-3-гидроксиацетил-КоА-гидролаза (кротоиаза); 7 -- бутнрил-КоА-де-гндрогеиаза; 8 -- КоА-трансфераза; 9 -- фосфотрансацетилаза; 10 -- ацетаткиназа; 11 -- бутирилальдс-гиддегидрогеназа; 12 -- бутанолдегидрогсназа; 13 -- КоА-трапсфераза; 14-- ацетоацетатдекарбоксилаза; Ф_д -- ферредоксин

Бутиловый спирт -- продукт брожения некоторых разновидностей маслянокислых бактерий -- обнаружен Пастером в 1862 г. Несколько позднее Бейеринк выделил палочковидную бактерию, сбраживающую глицерин с образованием в числе продуктов брожения бутилового спирта. Более подробно вопросом образования при брожении бутанола занимались Фитц и Бухнер, а Шардингер (1905) установил, что некоторые бактерии при росте на средах с углеводами накапливают ацетон. Но все эти исследования сначала представляли чисто теоретический интерес. Положение, однако, изменилось в 1909 г., когда бутиловым спиртом заинтересовались как возможным исходным продуктом для синтеза каучука (через бутадиен). Первый ацетоно-бутиловый завод был построен в Англии в 1914 г. Брожение происходит с одновременным образованием трех продуктов: бутилового спирта, этилового спирта и ацетона.

В период первой мировой войны еще большее значение приобрел второй продукт брожения -- ацетон, необходимый для приготовления взрывчатых веществ. Продукты брожения применяются для нужд нитроцеллюлозной и лакокрасочной промышленности, производства фотопленок, ацетилцеллюлозы, органического стекла и других отраслей химической и фармацевтической промышленности.

Несколько позже заводы по производству растворителей были построены в Канаде, США, Индии.

Создание в СССР производства бутилового спирта и ацетона путем брожения явилось результатом работ коллектива ученых, руководимого Шапошниковым. Проведенные ими исследования позволили в 1935 г. осуществить промышленное получение этих продуктов микробиологическим способом на специальном заводе.

1.4 Области применения

Ацетон является популярным растворителем, значительно превосходящим в плане безопасности бензин, скипидар и отчасти керосин. В частности как растворитель используется он: в производстве лаков, в производстве взрывчатых веществ, в производстве лекарственных препаратов

Бутанол используется как растворитель для красок, лаков и олиф, натуральных и синтетических смол, каучуков, растительных масел, красок и алкалоидов. Он играет роль промежуточного звена в производстве фармацевтических препаратов и химикалий, и используется в отраслях промышленности, производящих искусственную кожу, текстиль, небьющееся стекло, резиновый клей, шеллак, плащи, фотографические пленки и духи. Вторичный бутанол также используется как растворитель и химический промежуточный продукт; он входит в состав тормозных жидкостей, промышленных моющих средств, политур, средств для удаления краски, агентов для флотации руды, фруктовых эфирных масел, духов, красителей.

Масляная кислота (бутановая кислота, этилуксусная кислота) - применяют в качестве экстрагента щелочноземельных элементов (кальция, магния, бария), для обеззолевания (удаление солей кальция); в синтезе душистых веществ для парфюмерии пластификаторов, эмульгаторов и др.

2. Методы культивирования продуцентов биологически активных веществ. Указать, какие из существующих методов используются при получении ацетона, бутанола, масляной кислоты

В природе встречается множество микроорганизмов. Но в производстве для микробиологического получения различных веществ используют главным образом чистые культуры, т. е. однородные популяции микроорганизмов одного определенного вида и штамма. Чистую культуру обычно получают из одной изолированной клетки, которую потом постепенно размножают в стерильной среде. Эту работу проводят в стерильном боксе. Чистую культуру удобно изолировать, используя твердые среды Коха -- агар, желатин и др. Если на поверхность твердой среды посеять достаточно разведенную суспензию микроорганизмов, то в благоприятных условиях вокруг каждой клетки культуры образуется островок однородных клеток -- колония. Клетки из одной колонии при помощи петли или иглы в стерильных условиях переносят в стерильную среду, где они продолжают размножаться.

Для изолирования культур используют также метод Линднера. Согласно этому методу на покровное стекло кончиком пера наносят ряды капель культуры различного разведения и рассматривают в микроскоп каждую каплю. Каплю, где находится только одна клетка, с помощью кусочка стерильной фильтровальной бумаги переносят в стерильную среду. Отдельную клетку из препарата под микроскопом можно изолировать манипулятором.

Получая чистые культуры анаэробных микроорганизмов, работу проводят так, чтобы культура развивалась без доступа воздуха, например используют стеклянные трубочки -- капилляры, пастеровские капиллярные пипетки и др. При выращивании микроорганизмов глубинным методом клетки суспендированы в жидкости и находятся во взвешенном состоянии. В небольшую (50 - 250 мл) колбу наливают жидкую питательную среду, в которую засевают чистую культуру либо с поверхности косого агара, либо из ампул. Затем колбу на сутки или более помещают в термостат с определенной температурой, где культура растет и размножается. Чисто аэробные микроорганизмы выращивают в специальных колбах, которые ставят на качалку в термокамере. После этого культуру пересевают в лабораторные ферментаторы со средой такого же или несколько измененного состава. Лабораторные ферментаторы -- стеклянные аппараты емкостью 1 -10 л, в которых можно обеспечить продувание среды воздухом, регуляцию температуры, рН и других условий роста. По описанной выше схеме обычно организуют исследование культур микроорганизмов. Кроме того, таким путем готовят и чистую культуру для производственных нужд. Дальнейшее размножение чистой культуры в производственных условиях идет в несколько стадий при использовании металлических инокуляторов объемом от 0,1 до 100 м³ и более. Инокуляторы снабжены мешалками, аэраторами, устройствами для стерилизации и охлаждения, арматурой, измерительными приборами. Для каждой следующей стадии необходимо 3 - 20% посевного материала (по объему).

Последнюю стадию, в которой получают нужный продукт, называют рабочей ферментацией. В культуральнои жидкости, полученной после нее, суспендированы микробная биомасса, остатки питательной среды и экстрацеллюлярные метаболиты. Методами химической технологии из культуральнои жидкости получают биомассу или нужное вещество -- спирт, кислоту, аминокислоту, антибиотики и пр.

Аналогично выращиваются и анаэробные микроорганизмы только в этом случае через питательную среду не продувают воздух.

Используя метод поверхностных культур, микроорганизмы выращивают на твердых средах (влажные отруби и др.) или на жидких средах, залитых тонким слоем (2 - 20 см) в специальные кюветы. В этом случае биомасса располагается на поверхности среды. Чаще всего этим методом выращивают грибы, например культуры рода Aspergillus, используемые для получения лимонной кислоты и ферментов. Сначала размножают споры, которыми инфицируют стерильную среду. В камерах с кюветами поддерживают нужную температуру и обеспечивают аэрацию -- циркуляцию воздуха между кюветами.

Культивирование микроорганизмов может быть непрерывным и периодическим. При периодическом процессе весь объем питательной среды загружают в аппарат сразу, добавляют посевной материал и при оптимальных условиях продолжают процесс до тех пор, пока не накопится нужное количество биомассы или определенного метаболита. В ходе периодического культивирования изменяется темп роста культуры, ее морфология и физиология. За время культивирования меняется состав среды -- уменьшается концентрация питательных веществ, увеличивается содержание метаболитов. С физиологической точки зрения периодическое культивирование невыгодно. В ходе его возникает также ряд технологических трудностей -- циклический ход операций, сменные режимы, что затрудняет контроль и регуляцию процесса.

Указанные недостатки устраняются при непрерывном культивировании, методы которого разработали С. В. Лебедев, А. А. Андреев, Н. Д. Иерусалимский и другие ученые. Из непрерывных процессов лучше всего разработан метод глубинной ферментации. В этом случае в ферментатор с культурой продуцента непрерывным потоком подается стерильная среда, а из него непрерывно вытекает готовая культуральная жидкость. Процесс может быть гомо- и гетерогенно непрерывным. При гомогенно непрерывном процессе в аппарате, где идет интенсивное перемешивание, все параметры (концентрация питательных веществ, клеточный титр и др.) постоянны во времени. При гетерогенно непрерывном процессе несколько ферментаторов соединены вместе и образуют каскад.

Питательная среда поступает в первый ферментатор и готовая культуральная жидкость вытекает из последнего ферментатора. Культивирование микроорганизмов в протоке через систему трубок также идет по принципу гетерогенно непрерывного процесса ферментации. В этом случае имеет место непрерывный поток питательной среды, но клетки не обеспечены постоянными условиями роста (сколько аппаратов, столько и условий культивирования).

При непрерывном культивировании микроорганизмов необходимо отрегулировать такую скорость притока питательной среды и вытекания культуральной жидкости, чтобы предотвратить вымывание культуры из системы, т. е. концентрация клеток должна быть постоянной. В стерильных условиях непрерывный, или проточный, метод обеспечивает сохранение культуры в физиологически активном состоянии длительное время.

В промышленности ацетонобутиловое брожение ведут по непрерывному методу или полунепрерывному методу.

3. Технологии получения ацетона и бутанола, включая: характеристику микроорганизмов - продуцентов, источников питания, входящих в состав питательных сред, условия проведения процесса, аппаратурное оформление

3.1 Особенности ацетоно-бутилового брожения

Бактерии, образующие в процессе своей жизнедеятельности в значительном количестве ацетон и бутиловый спирт, широко распространены в природе. Они находятся в основном в почве, откуда могут быть довольно легко выделены в виде чистых культур. Относятся к роду Clostridium, который включает большое число видов. Из различных клостридиев, способных к образованию в процессе брожения бутанола и ацетона, наиболее активным их продуцентом признан Clostridium acetobutyllcum, применяемый для производства этих растворителей.

Клетки С. acetobutylicum (рисунок 1) представляют собой палочки (0,6 - 0,9 х 2,4 - 4,7 мкм) с перитрихиальным жгутикованием. Образуют овальные споры, расположенные субтерминально. Споры выдерживают нагревание при 80°С в течение 10 - 30 мин, при 100°С -- около 4 мин. Рост культур происходит только в анаэробных условиях на довольно простых средах, содержащих различные углеводы. Кроме углеводов С. acetobutyllcum может сбраживать глицерин, маннит, глюконат, пируват и некоторые другие вещества. Нуждается в таких витаминах, как биотин и парааминобензойная кислота. Бактерия способна к фиксации молекулярного азота. Оптимальная температура для роста 37 - 38°С, оптимальное значение рН среды 5,1 - 6,9.

Благодаря наличию амилолитических ферментов бактерия использует крахмал. Выделяет в среду протеиназы, в результате чего способна разлагать белки. Поэтому С. acetobutyUcutn относят к группе протеолитических клостридиев.

Сбраживание этой бактерией углеводов, как и другими клостридиями, происходит по фруктозобисфосфатному пути, т. е. по пути Эмбдена-Мейергрфа-Парнаса. Продуктами брожения являются уксусная и масляная кислоты, ацетон, бутанол, этанол, а также СО₂ и Н₂. Но состав продуктов и их количества в процессе брожения, а также в зависимости от условий, в которых оно происходит, может меняться.

В результате детального изучения ацетоно-бутилового брожения Шапошников (1939) обнаружил, что оно имеет двухфазный характер.

В течение первой фазы происходит активный рост культур и накопление в среде преимущественно органических кислот. Во вторую фазу рН среды снижается, рост культур замедляется, Преобладает образование нейтральных продуктов, а именно ацетона, бутанола и этанола. В то же время количество органических кислот в среде может даже уменьшаться (рисунок 2).

Рисунок 2 - Динамика ацетоно-бутилового брожения (по Шапошникову, 1948) 1 - общее количество нейтральных продуктов, 2 - ацетон, 3 - кислотность, 4 - газовыделение

Аналогичная двухфазность, как было установлено в дальнейшем, характерна для большинства процессов брожений, а также некоторых других микробиологических процессов, что важно знать для их практического применения.

Для ацетоно-бутилового брожения четко показано, что его двухфазность связана с рН среды. Если значение рН среды в результате накопления органических кислот падает до 4,5 и ниже, начинается интенсивное образование нейтральных продуктов. В результате этого предупреждается дальнейшее подкисление среды, неблагоприятное для бактерий. Если значение рН среды путем добавления в нее мела или другими способами поддерживать на уровне 5,0 и выше, то образования в большом количестве ацетона, бутанола и этанола не происходит.

Установлено, что при низких значениях рН у С. acetobutyliсит увеличивается активность ферментов, катализирующих превращение ацетоацетил-КоА в ацетон (рисунок 2) и больше НАДН используется на/восстановление бутирил-КоА до бутанола. Кроме того, бутанол может частично синтезироваться из ранее образованной масляной кислоты, вновь поступающей в клетки из среды и превращающейся в бутирил-КоА. Поэтому для получения в большом количестве нейтральных продуктов важно соблюдать определенные условия процесса брожения.

3.2 Производственные среды

Ацетоно-бутиловое брожение в производственных условиях может вестись на разных углеводсодержащих средах. Вначале обычно использовали среды, содержащие кукурузную, пшеничную или ржаную муку. В настоящее время в качестве основного сбраживаемого субстрата нередко применяют мелассу и некоторые другие дешевые вещества. Сбраживаемые углеводы не подвергают предварительному осахариванию. Поэтому содержащие их среды именуются заторами (в отличие от сусла -- осахаренной среды спиртового брожения).

Обычно используют заторы, содержащие около 6 % углеводов. Использовать среды с большем количеством сбраживаемых субстратов нецелесообразно, так как образуемый при брожении бутанол уже в концентрации 1,5 % подавляет жизнедеятельность бактерий и брожение прекращается. Поэтому часть углеводов, если их много, остается неиспользованной.

В случае, когда в качестве субстрата для брожения применяют муку, ее предварительно взвешивают на автоматических весах, а затем через дозатор направляют на смешение с водой при 50 - 60°С. Замес проходит ловушки для улавливания комков, а также случайных примесей и поступает на разваривание в варочно-стерилизационные колонки, где нагревается паром до 145 - 160°С и выдерживается при Такой же температуре в трубчатых вертикальных сосудах от 20 до 40 мин, постепенно продвигаясь по ним. Проходя через сепаратор пара, затор подается центробежным насосом в холодильник типа "труба в трубе", охлаждается до температуры брожения (35 - 36°С) и поступает в бродильное отделение.

Среды, содержащие мелассу или гидролизаты растительных отходов, стерилизуют в более мягких условиях (115 - 120°С, 18 - 20 мин), после чего их смешивают с мучным затором.

Для нормального проведения процесса ацетоно-бутилового брожения важно, чтобы в среде имелись в достаточном количестве белки, как это имеет место в мучных заторах.

3.3 Поддержание культуры бактерий и подготовка инокулята

Для выращивания чистой культуры С. acetobutylicum пользуются запасом спор бактерии, заготовляемым обычно на шестимесячный (и более) период работы завода.

Заготовку спор проводят на 6 %-ном заторе кукурузной или ржаной муки путем массового высева. Для этого около 100 пробирок со свежим стерильным затором засевают культурой бактерии и весь цикл брожения, заканчивающийся образованием спор, проводят при 37°С. Готовить споры можно и способом разлива. Для каждой новой заготовки используют споры, полученные из культур, давших в производстве наилучшие результаты брожения. Первая половина брожения проводится в одном большом стеклянном сосуде, из которого бражка разливается затем в стерильные пробирки, в которых процесс заканчивается образованием спор. Пробирки со спорами запаивают на газовой горелке и ставят в термостат. Через 48 - 60 ч бродильные газы спускают, пробирки вновь запаивают и хранят при комнатной температуре. После двухмесячного хранения партия спор подвергается проверке путем пробного брожения. Удовлетворяющие техническим условиям споры признаются пригодными для производства и на них составляют паспорт.

Приготовление требуемого количества чистой культуры бактерий для производства состоит из ряда последовательных пересевов, которые ведутся во все увеличивающихся объемах затора. Разведение культуры начинается с посева спорами в аппарате чистой культуры (АЧК) объемом 10 л. Через 28 ч брожения содержимое АЧК стерильно передается в большой инокулятор (БИН) на 3,5 м³ затора. Стерильный затор для БИН берут непосредственно с производства в горячем состоянии, охлаждают его в БИНе или в холодильнике. Из инокулятора культура бактерий передается в ферментатор-активатор производственной батареи с соблюдением условий стерильности.

Для процесса непрерывного ацетоно-бутилового брожения предложена дополнительная стадия. Это аппарат чистой производственной культуры (АЧПК), емкостью 200 м³, который засевается из БИНа, а спустя 10 - 12 ч брожения вся культура из него переводится в первый ферментатор производственной батареи и сразу начинается ее загрузка затором.

3.4 Брожение

Для понимания специфики ацетоно-бутилового брожения полезно вначале рассмотреть закономерности периодического процесса, хотя в промышленности оно давно ведется в основном полунепрерывным и непрерывным методами. Уже в первые часы после инокулирования затора активной культурой бактерий наблюдается брожение, заметное по пузырькам газа, поднимающихся к поверхности среды. Газовыделение достигает максимума обычно через 24 - 26 ч, спадая к концу брожения. В период максимального газовыделения происходит характерное расслоение субстрата -- на поверхность поднимается рыхлый слизистый слой, в нижнем слое остается мутноватая опалесцирующая жидкость. Вся среда приобретает желтоватую окраску. Это явление в производстве именуется "подъемом" бражки и характеризуется как один из признаков нормального брожения. К концу брожения поднявшаяся твердая часть субстрата оседает на дно. Наряду с газовыделением, характерным для ацетоно-бутилового брожения, является форма кривой титруемой кислотности. Развитие бактерий характеризуется быстрым нарастанием титруемой кислотности, достигающей максимума (4,0 - 4,6 мл 0,1 н NaOH на 10 мл бражки) к 12 - 16 ч брожения, и затем резко снижающегося к 24 - 25-му часу, после чего снова происходит небольшой подъем кислотности к концу брожения. В процесс повышения кислотности рН среды снижается с 6,0 до 4,1 - 4,2 и остается на этом уровне с небольшими колебаниями.

Образование ацетона и спиртов начинается примерно с 6-го часа брожения, но наиболее интенсивно происходит после перелома кривой кислотности. В ацетон и спирты превращается 33 - 35% углеводов и в конечной бражке содержится около 2% растворителей.

Полунепрерывный метод брожения в ацетоно-бутиловом производстве, известный под названием батарейного, имеет ряд преимуществ по сравнению с периодическим и прочно укоренился в нашей промышленности. Батарея состоит из 6 - 8 ферментаторов, последовательно соединенных переточными трубами. Головной из них -- активатор, засевают культурой из инокулятора и после перелома кривой кислотности (примерно через 12 ч) начинают загружать мучным затором. Через активатор заполняется вся батарея. Разгрузка батареи (передача бражки на ректификацию) производится с последнего -- хвостового ферментатора; после стерилизации он становится активатором следующей батареи, состоящей из тех же ферментаторов, но загружаемых в обратном направлении.

Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.

Для первой фазы брожения целесообразнее применять мучной затор, что обеспечивает быстрый рост бактерий и образование ферментов для синтеза растворителей.

Рисунок 3 - Двухпоточная схема непрерывного ацетоно-бутилового брожения. Мучной затор: 1 - заторный чаи; 2 - подогреватель ангора; 3 - ловушка; 4 - насос; 5 - варочная колонна; 6 - выдерживатель; 7 -ннросспаратор; 8 - насос; 9 - холодильник; Паточно-гидролизатпый затор: 10 - заторный чан; 11 - лопушка; 12 - насос; 13 - подогревательная колонки; 14 - выдерживатели; 15 - паросепаратор; 16 - насос; 17 - холодильник; 18 - АЧПК; 19, 20 - первый и второй ферментаторы батареи; 21-23 - ферментаторы батареи; 24 -- насос для подачи бражки на ректификацию.

Мелассу и гидролизаты вводят при переходе брожения во вторую фазу.

Разработана двухпоточная схема непрерывного брожения (рисунок 3). При этой схеме мучной и паточно-гидролизатный мучной затор направляется в первый (головной) ферментатор батареи, а также на разведение чистой культуры в инокулятор и АЧК; мелассный затор -- во второй ферментатор, где происходит переход во вторую фазу брожения.

В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала. Весь процесс ацетоно-бутилового брожения, будь то периодический, полунепрерывный или непрерывный, ведется в строго стерильных условиях, в герметически закрытых ферментаторах под небольшим избыточным давлением (0,4·10⁶ - 0,8·10⁵ Па), создаваемым газами брожения. Выделяемые при брожении газы удаляются через специальные коммуникации. Газы выбрасываются в атмосферу или направляются на переработку (например, в жидкую углекислоту или сухой лед).

3.5 Инфицирование в условиях ацетоно-бутилового брожения

Ведение ацетоно-бутилового брожения с применением чистой культуры бактерий в условиях стерильности сред и всего оборудования обусловлено опасностью инфекции. Наибольший ущерб наносят производству молочнокислые бактерии и бактериофаг, быстро и полностью подавляющие рост ацетоно-бутиловых бактерий. Главная причина попадания бактериофага в производство определяется тем, что он легко задерживается в трещинах сварных швов ферментаторов, трубопроводах и других плохо прогреваемых и порой незаметных участках оборудования. Кроме возможного устранения таких участков наиболее эффективной мерой борьбы с бактериофагом является стерилизация при 120°С не менее 20 мин. В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.

3.6 Перегонка ацетоно-бутиловой бражки

Ацетоно-бутиловая бражка кроме ацетона, бутилового и этилового спиртов содержит ряд побочных продуктов, для разделения которых применяют довольно сложную перегонку и ректификацию. Изложим только принципиальные особенности этих операций.

На бражной колонне дистиллат всех (трех) растворителей отделяется от ацетоно-бутиловой барды. Дистиллат укрепляется до концентрации около 50% и поступает на ацетоновую колонну для отделения ацетона -- продукта с наиболее низкой температурой кипения (56,2°С). Затем на другой колонне отделяют этанол (температура кипения 78,4°С). Несколько сложнее обстоит дело с выделением и обезвоживанием бутанола. Смесь бутанола и воды образует два слоя: верхний -- раствор воды в бутаноле (80% бутанола и 20% воды), его называют "богатой смесью" и нижний -- раствор бутанола в воде (8% бутанола и 92% воды), его называют "бедной смесью". Разделение смесей производится в сосуде - разделителе. Перегонка и обезвоживание бутанола основаны на его свойстве перегоняться вместе с водой (водяным паром) в виде азеотропной смеси, кипящей при 93,4°С и содержащей 59% бутанола и 41% воды. Таким образом, при перегонке "богатой смеси" с верхней части колонны вся вода удаляется в виде азеотропной смеси, а с нижней части отходит безводный бутанол, который затем окончательно очищается на бутаноловой колонне (температура кипения бутанола 117,7°С). При перегонке "бедной смеси" из нижней части лютерной колонны отходит лютерная вода, а с верхней части -- азеотропная смесь, направляемая потом в соответствующий сосуд -- разделитель. Основной отход ректификации и всего производства - барда, содержит около 3% сухих веществ, состоящих главным образом их азотистых соединений сырья. Ранее барда использовалась обычно для откорма скота, но затем на ряде заводов были построены дрожжевые цехи для выращивания на барде кормовых дрожжей.

4. Основные пути интенсификации процессов биосинтеза в том числе продуктов ацетоно-бутилового брожения

В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.

В результате внедрения способа непрерывного брожения на Нарткалинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70% муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой брожения мучных заторов производительность заметно возрастала.

Непрерывное брожение облегчило замену больших количеств муки (до 70%) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (мелассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.

Наиболее эффективной мерой борьбы с бактериофагом является стерилизация при 120°С не менее 20 мин. В результате внедрения способа непрерывного брожения в ацетоно-бутиловом производстве разработан комплекс мероприятий, позволяющих значительно улучшить условия стерильности и сократить случаи инфицирования в процессе брожения.

Заключение

Круг вопросов, к решению которых привлекают биотехнологические методы и достижения, достаточно широк. Большинство из них прямо или косвенно связано с глобальными проблемами, стоящими перед современной цивилизацией, такими, как загрязнение окружающей среды, угроза экологического кризиса, истощение запасов полезных ископаемых, опасность мирового энергетического кризиса, нехватка продовольствия, борьба с болезнями. Благодаря достижениям фундаментальных исследований в молекулярной биологии, биохимии, генетической инженерии и новейшим технологиям в биоиндустрии получают новые продукты заданного состава и качества, очищенные от экотоксикантов и обладающие не только питательной ценностью, но и профилактическими свойствами таким путем получена серия продуктов на основе сои, созданы бесхолестериновые и малохолестериновые спрэды ("намазки") типа хальварина и "легкого" сливочного масла, а также безжирового мороженого.

Переработка растительной и микробной биомассы позволяет получать высококачественные белки, масла, пектиновые вещества, пищевые волокна, а также белок, сбалансированный по аминокислотному составу, и компоненты нуклеиновых кислот, необходимые для медицинской, пищевой, косметической и других отраслей промышленности.

Возникла новая научная дисциплина -- экологическая биотехнология, осуществляющая новейший подход к охране и сохранению окружающей среды. Разработаны технологии рекультивации почвы, биологической очистки воды и воздуха и биосинтеза препаратов, компенсирующих вредное влияние измененной окружающей среды на людей и животных(Одна из важнейших задач биотехнологии -- ограничение масштабов загрязнения нашей планеты промышленными, сельскохозяйственными и бытовыми отходами, токсичными компонентами автомобильных выхлопов. Современные научные исследования нацелены на создание безотходных технологий, на получение легкоразрушаемых полимеров, в том числе биогенного происхождения, а также на поиск новых активных микроорганизмов -- разрушителей полимеров (полиэтилена, полипропилена, полихлорвинила). Усилия биотехнологии направлены на борьбу с пестицидными загрязнениями -- следствием неумеренного и нерационального применения ядохимикатов. Ведутся разработки технологий по утилизации вредных выбросов (химикалии, нефть), загрязняющих воду почву, и сельскохозяйственных отходов типа молочной сыворотки для получения пищевых и кормовых белковых продуктов, в том числе специальных препаратов, обогащенных, например, селеном дрожжей.

Повышение цен на традиционные источники энергии (природный газ, нефть, уголь) и угроза их исчерпания побудили ученых обратиться к альтернативным путям получения энергии. Роль биотехнологии в создании экономичных возобновляемых энергетических источников (спиртов, биогенных углеводородов, водорода) чрезвычайно велика. Эти экологически чистые виды топлива можно получать путем биоконверсии отходов промышленного и сельскохозяйственного производства. Перспективно продолжение исследований по усовершенствованию и внедрению процессов производства метана, этанола, созданию на основе микроорганизмов (и ферментов) элементов, эффективно производящих электричество, а также по организации искусственного фотосинтеза, в частности биофотолиза воды, при котором можно получать богатые энергией водород и кислород.

Развитие сельскохозяйственной биотехнологии на современном этапе направлено на решение таких глобальных проблем, как повышение плодородия почв, урожайности и качества сельскохозяйственной продукции; рекультивация сельскохозяйственных угодий; улучшение экологической обстановки, способствующей восстановлению биоценоза почв; повышение качества кормов и др. В области медицины весьма перспективной является разработка новых технологий использования молекулярных антител в области диагностики и лечения заболеваний, направленного транспорта лекарственных средств, трансплантологии органов, тканей, клеток, формирования нового класса медицинской техники -- индивидуальных биотехнологических систем для контроля состояния организма.

Особый интерес представляют принципиально новые направления, развитие которых предполагается осуществить в XXI в: электрохемитерапия, молекулярное моделирование, отдельные области клеточной инженерии (клеточная инкапсуляция, энергетические межклеточные взаимодействия).

Список литературы

1. Биология культивируемых клеток и биотехнология растений/Под ред. Р. Г. Бутенко. - М., 1991;

2. Биотехнология / Под ред. А. А. Баева. -- М., 1988;

3. Биотехнология растений: культура клеток / Под ред. Р. Г. Бутенко -- М., 1989;

4. Бейли Дж.Э., ОллисД.Ф, Основы биохимической инженерии. -- М 1989.-Ч. II;

5. Бутенко Р. Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе. -- М., 1999;

6. Бутенко Р. Г. и др. Клеточная инженерия. -- М., 1987;

7. Блинов Н.П. Основы биотехнологии. -- СПб., 1995;

8. Мишустин Е.Н. Биотехнология. -- М., 1989;

9. Муромцев Г. С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии -- М., 1990;

10. Промышленная микробиология и успехи генетической инженерии -- М., 1984;

11. Рыбалъский Н.Г., Скуратовская О. Д. Белковая инженерия. -- М., 1990;

Размещено на Allbest.ru