Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

министерство здравоохранения Республики Беларусь

Учреждение образования «Гомельский государственный медицинский университет»

Медико-диагностический факультет

Кафедра общей и клинической фармакологии с курсом анестезиологии и реаниматологии

Дипломная работа

ДИАГНОСТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ НЕИНВАЗИВНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕНОТИПА N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗЫ 2

Исполнитель: О.Н. Басенкова

Первый руководитель: Е.И. Михайлова

Второй руководитель: А.А. Кудря

Гомель, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

РЕФЕРАТ

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

УСЛОВНЫЕ СТАТИСТИЧЕСКИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение фармакогенетики и индивидуализации фармакотерапии

1.2 Реакция N-ацетилирования - одна из наиболее важных систем биотрансформации ксенобиотиков

1.3 Методы определения фенотипа ацетилятора

1.3.1 Колориметрия и спектрофотометрия

1.3.2 Газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуориметрия

1.3.3 Капиллярный электрофорез

1.3.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

1.3.4.1 Приготовление реактивов и образцов

1.3.4.2 Подготовка хроматографа и проведение анализа

1.3.4.3 Определение фенотипа N-ацетилирования

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методология и общая характеристика структуры исследования

2.2 Общеклинические, лабораторные и инструментальные методы обследования пациентов

2.3 Методика определения вариабельности фенотипа N-ацетилтрансферазы 2

2.4 Методы статистической обработки

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Принципы формирования и клиническая характеристика обследованных пациентов

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1 Фенотипический полиморфизм фермента N-ацетилтрансферазы 2 у здоровых добровольцев

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

РЕФЕРАТ

Структура и объем дипломной работы:

Дипломная работа состоит из реферата, введения, основной части, состоящей из 4 глав, заключения, списка использованных литературных источников. Полный объем дипломной работы включает 50 страниц компьютерного текста, содержит 7 таблиц и 10 иллюстраций, 94 источника (32 - на русском языке и 62 - на иностранных языках).

Цель и задачи

Целью дипломной работы является изучение эффективности метода определения фенотипа N-ацетилирования на основе определения клиренса мочевой кислоты до и после приема кофеина в качестве тестового препарата.

Задачи:

1. Изучить активность фермента NAT2 и распределение фенотипов N-ацетилирования у здоровых добровольцев, проживающих в Юго-Восточном регионе Республики Беларусь, полученных на основе определения клиренса мочевой кислоты до и после приема кофеина в качестве тестового препарата.

2. Сравнить распределение фенотипов N-ацетилирования у здоровых добровольцев, проживающих в Юго-Восточном регионе Республики Беларусь, полученных на основе изучаемого метода и известного способа выявления фенотипа N-ацетилирования по метаболизму тестового лекарственного препарата «изониазид» с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с ультрафиолетовым обнаружением на аппарате «Agilent 1100».

В соответствие с поставленными целью и задачами объектом исследования явились клинически здоровые лица.

Предметом исследования стала активность фермента N-ацетилтрансферазы 2 у здоровых добровольцев, проживающих в Юго-Восточном регионе Республики Беларусь.

СПИСОК УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АсINH-Ацетизониазид

БА-Быстрые ацетиляторы

ВЭЖХ-Высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК-Дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗД-Здоровые добровольцы

INH-Изониазид

ЛС-Лекарственное средство

МА-Медленные ацетиляторы

НЛР-Нежелательные лекарственные реакции

НПР-Неблагоприятные побочные реакции

NAT1-N-ацетилтрансфераза 1

NAT2-N-ацетилтрансфераза 2

ПЦР-Полимеразная цепная реакция

СД-Сульфадимезин

CYP-Система цитохрома Р-450

Cl-Клиренс вещества

УСЛОВНЫЕ СТАТИСТИЧЕСКИЕ ОБОЗНАЧЕНИЯ

95%ДИ (95% CI) - 95% доверительный интервал

Р - вероятность справедливости нулевой гипотезы

Ф - коэффициент ранговой корреляции Кендалла

Ме - медиана

М - среднее арифметическое значение

S - среднее квадратическое отклонение

ВВЕДЕНИЕ

Достижения медицинской науки и внедрение огромного количества новых лекарственных средств (ЛС) не снижают актуальность проблем эффективной и безопасной фармакотерапии. Когда говорят о безопасности фармакотерапии, приводят впечатляющие цифры: только в США ежегодно регистрируют более 2 млн нежелательных лекарственных реакций (НЛР); более 100 000 человек умирают по причине НЛР; экономический ущерб от НЛР возрос с 76,6 (1997) до 177,4 млрд долларов (2001) [4]. В то же время эффективность фармакотерапии по-прежнему остается недостаточной. Так, по данным B.M. Silber, не отвечают на лекарственную терапию до 40% больных с различными заболеваниями [9].

Одним из путей повышения эффективности и безопасности фармакотерапии является ее индивидуализация, то есть внедрение в клиническую практику технологий так называемой персонализированной (персонифицированной) медицины. В основе этих технологий -- индивидуальный подход к выбору ЛС и его режима дозирования с учетом факторов, влияющих на фармакологический ответ конкретного пациента. Известно, что индивидуальный фармакологический ответ зависит от множества факторов, таких как пол, возраст, сопутствующие заболевания, совместно применяемые ЛС, характер питания, биологические ритмы, вредные привычки и т.д. Однако 50% неблагоприятных фармакологических ответов (развитие осложнений или недостаточная эффективность) зависят от генетических особенностей пациента. Именно поэтому клиническая фармакогенетика предоставляет возможность индивидуализации выбора ЛС и режимов его дозирования на основании изучения генотипа конкретного пациента.

Как правило, особенности распределения и выведения препаратов связаны с мутациями генов, кодирующих ферменты, которые метаболизируют эти вещества и в зависимости от повышения или снижения его содержания и/или активности приводят к изменениям биотрансформации лекарственных средств. В последние годы внимание многих исследователей сосредоточено на изучении роли ферментативных систем метаболизма в биотрансформации различных лекарственных препаратов [1, 2]. Известно, что основным путем метаболизма широкого ряда гидразиновых и ариламиновых лекарственных средств и ксенобиотиков, включая канцерогены, является N-ацетилирование, которое происходит при участии фермента N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2). Научные исследования показали, что по активности NAT2 человеческую популяцию можно разделить на 2 группы: с фенотипом быстрого и медленного N-ацетилирования [3].

N-ацетилтрансфераза 2 проявляет типичный генетический полиморфизм, поскольку быстрый и медленный фенотип ассоциирован с определенным генотипом NAT2 гена. В настоящее время изучается значительное число мутаций в гене NAT2, которые могут приводить к проявлению медленного фенотипа N-ацетилирования [3, 5, 6]. Определение фенотипа ацетилирования важно для оптимизации терапии и чаще всего используется в качестве фенотипического маркера, так как у медленных ацетиляторов могут развиться осложнения, а у быстрых ацетиляторов фармакотерапия может быть неэффективной. Получение и анализ фенотипических данных, касающихся особенностей метаболического статуса процессов ацетилирования, позволяет адекватно оценить реакцию организма на проводимое лечение и найти баланс между эффективностью и безопасностью фармакотерапии. Анализирующими методами, позволяющими выявлять фенотип N-ацетилятора, являются высокоэффективная жидкостная хроматография и спектрофотомерия. Однако, не смотря на их высокую чувствительность и способность измерять даже низкие концентрации, как лекарственных средств, так и их метаболитов, эти методы не всегда доступны для практического здравоохранения в силу их дороговизны, сложности процесса.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Значение фармакогенетики и индивидуализации фармакотерапии

Клиническая фармакогенетика -- раздел клинической фармакологии и клинической генетики, изучающий роль генетических особенностей пациента, влияющие на фармакологический ответ. Термин «фармакогенетика», F. Vogel (1959), A.G. Motulsky (1957).

Предмет фармакогенетики -- наследственные различия, выражающиеся в определенном фармакологическом ответе на ЛС. Роль наследственности в формировании индивидуального ответа на ЛС была известна давно, понимание механизмов влияния генетических факторов на эффективность и безопасность фармакотерапии стало возможным лишь в связи с развитием методов молекулярной биологии и реализацией международной программы «Геном человека» [7]. Генетические особенности пациента, влияющие на фармакологический ответ представлены на рис.1 .

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1 ? Генетические особенности пациента, влияющие на фармакологический ответ

Генетические особенности, как правило, представляют собой полиморфные участки генов белков, участвующих в фармакокинетике или фармакодинамике ЛС [3]. К первой группе относятся гены, кодирующие ферменты биотрансформации, и гены транспортеров, участвующих во всасывании, распределении и выведении ЛС из организма. В настоящее время активно изучается роль генов, контролирующих синтез и работу ферментов метаболизма ЛС, в частности изоферментов цитохрома Р 450(CYP2D6,CYP2C9, CYP2C19) и ферментов II фазы биотрансформации (N-ацетилтрансферазы). В последние годы начали изучать влияние на фармакокинетику ЛС полиморфизма генов так называемых транспортеров ЛС: транспортеров органических анионов, транспортеров органических катионов и гликопротеина Р [1, 8]. Ко второй группе относятся гены, кодирующие молекулы-мишени ЛС (рецепторы, ферменты, ионные каналы), и гены, продукты которых вовлечены в патогенетические процессы (факторы свертывания крови, аполипопротеины и т. д.) [9, 10].

Именно обнаружение конкретных аллельных вариантов этих генов и является сутью фармакогенетических тестов. Одним из путей повышения эффективности и безопасности фармакотерапии является индивидуализация фармакотерапии, или, иными словами - внедрение персонифицированной медицины, в том числе на основе изучения индивидуальных особенностей биотрансформации лекарственных средств [11].

Фармакогенетическое тестирование, наиболее перспективный инструмент для клинической практики персонализированной медицины, при котором могут быть выявлены генетические особенности пациента, обусловливающие «ответ» на то или иное лекарственное средство (эффективность/неэффективность /развитие неблагоприятных побочных реакций). Фармакогенетическое тестирование целесообразно применять в клинической практике только при определенных условиях. Проведение тестирования особенно необходимо при применении высокоэффективных препаратов, когда часто могут развиваться неблагоприятные побочные реакции, в том числе и серьезные [11]. Персонализированная медицина подразумевает использование врачом тактики выбора лекарственных средств и их доз исходя из индивидуальных особенностей конкретного пациента. Показано, что подобный подход в ряде случаев позволяет значительно повысить эффективность и безопасность фармакотерапии пациентов с различными заболеваниями.

Таким образом, фармакогенетическое тестирование -- это выявление изменений (полиморфизмов) в генах, кодирующих белки, ответственных за фармакокинетику или фармакодинамику ЛС. Для проведения фармакогенетического тестирования в качестве биоматериала у пациента берут кровь или соскоб буккального эпителия (для выделения ДНК) [12].

Сбор этого биологического материала у больного не требует предварительной подготовки. Фармакогенетический тест выполняется однократно, так как его результаты в течение жизни остаются неизменными. При этом не имеет никакого значения, когда берется материал для фармакогенетического тестирования (до еды или после, при обострении заболевания или в период ремиссии, и т. д.).

Результаты фармакогенетического теста представляют собой полученные генотипы больного по тому или иному полиморфизму гена. Как правило, врач-клинический фармаколог интерпретирует результаты фармакогенетического теста -- формулирует рекомендации по выбору ЛС и его режима дозирования для конкретного пациента. Применение таких тестов позволяет заранее прогнозировать фармакологический ответ на ЛС. Это позволяет персонализированно выбрать ЛС и режим его дозирования, а в редких случаях -- и тактику ведения пациентов. При этом станет возможным составление так называемого генетического паспорта пациента. С этих позиций фармакогенетика, а в будущем и фармакогеномика, в литературе рассматриваются как перспективные направления персонализированной медицины [7].

В настоящее время фармакогенетика является активно развивающейся наукой; около 50 % всех применяемых в клинической практике ЛС уже имеют генетическую информацию: проведены исследования ассоциаций между полиморфизмами тех или иных генов и фармакологическим ответом на ЛС (развитие НПР, неэффективность или, наоборот, высокая эффективность).

Однако не каждая «генетическая» информация о ЛС может стать фармакогенетическим тестом, который может применяться в клинической практике. Для того, чтобы это произошло, фармакогенетический тест должен отвечать следующим требованиям [7] :

* Наличие выраженной ассоциации между выявляемым полиморфизмом того или иного гена и фармакологическим ответом (развитие НПР, недостаточная эффективность или высокая эффективность).

* Наличие хорошо разработанного алгоритма применения ЛС в зависимости от результатов фармакогенетического теста -- выбор ЛС, режим его дозирования.

* Встречаемость выявляемого полиморфизма в популяции с частотой не менее 1%.

* Доказанность преимуществ применения ЛС с использованием результатов фармакогенетического теста по сравнению с традиционным подходом: повышение эффективности, безопасности фармакотерапии и экономическая рентабельность подобного подхода.

* Доступность фармакогенетического теста больным и врачам, то есть наличие в лаборатории ЛПУ или коммерческих лабораториях специальных диагностических наборов [Felix W. Frueh,2006].

* Фармакогенетический тест должен обладать высокой чувствительностью, специфичностью, предсказательной ценностью положительного (PPV) и отрицательного (NPV) результатов.

В настоящее время этим требованиям удовлетворяет ограниченное количество фармакогенетических тестов, применение которых в клинической практике разрешено в большинстве стран мира и регламентировано в инструкциях по медицинскому применению.

Важными характеристиками фармакогенетического теста являются значения чувствительности, специфичности, предсказательной ценности положительного (PPV) и отрицательного результата (NPV) :

При низких значениях этих показателей внедрение фармакогенетического теста окажется, скорее всего, экономически не оправданным.

Применение подобного фармакогенетического теста может привести к тому, что у пациента не будет использовано высокоэффективное ЛС, которое может оказаться у него и высоко эффективным и безопасным, несмотря на результаты теста.

Эта ситуация наиболее значима в случаях фармакотерапии злокачественных новообразований, ВИЧ-инфекции и других прогностически неблагоприятных заболеваниях [13]. Предсказательные ценности положительного и отрицательного результатов некоторых фармакогенетических тестов представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Предсказательные ценности положительного и отрицательного результатов некоторых фармакогенетических тестов

Лекарственное средство	Прогнозируемое изменение фармакологического эффекта	Фармакогенетический тест	PPV %	NPV %
Трициклические антидепрессанты	Гипотония, ажитация, сонливость	Выявление «медленных» аллельных вариантов гена CYP2D6	63	80
Варфарин	Кровотечения	Выявление «медленных» аллельных вариантов гена CYP2С9	16	97
D-пенецилламин	Высокая эффективность при ревматоидном артрите	Выявление нулевых аллелей гена GSTM1	30	87
Изониазид	Полневриты	Выявление «медленных» аллельных вариантов гена NAT2	24	94

Фармакогенетическое тестирование особенно необходимо в следующих клинических ситуациях:

* при применении ЛС с большим спектром и выраженностью НЛР

* при длительном применении ЛС (сердечно-сосудистые, психотропные ЛС, гормональные препараты и др.)

* при применении ЛС с узкой терапевтической широтой

* у пациентов из групп риска развития НЛР

* при применении дорогостоящих ЛС [4]

Список лекарственных средств, при назначении которых обосновано использование фармакогенетического тестирования растет с каждым днем. В США он насчитывает уже около 150 позиций [14].

Фармакогенетические тесты, рекомендованные к примененению в клинической практике в различных странах для снижения риска развития НПР

* оральных антикоагулянтов: варфарина, аценокумарола (определение полиморфизмов генов CYP2C9 и VKORC1)

* антидепрессанты и нейролептики (определение полиморфизмов гена CYP2D6)

* изониазид, пиразинамид, рифампицин (определение полиморфизмов гена NAT2)

* оральные контрацептивы (определение т.н. «мутации Лейдена» в гене V фактора свертывания )

* атомоксетин (определение полиморфизмов гена CYP2D6)

* вориконазол (определение полиморфизмов гена CYP2С19)

* карбамазепин (определение полиморфного маркера HLA-B*1502)

* абакавир (определение полиморфного маркера HLA-B*5701)

* азатиаприн, 6-меркаптопурин (определение полиморфизмов гена ТРМТ)

* иринотекан (определение полиморфизмов гена UGT1A1)

Клиническая фармакогенетика представляет реальную возможность индивидуализации выбора ЛС и режимов их дозирования на основании изучения генотипа конкретного пациента. Однако существование ряда пока неразрешенных проблем, связанных с фармакогенетикой является причиной того, что фармакогенетические тесты в клинической практике применяются крайне редко.

Серьезным препятствием к внедрению фармакогененетических тестов в клиническую практику является их высокая стоимость и низкая доступность, а также недостаточный уровень знаний в области клинической фармакогенетики у врачей и организаторов здравоохранения. В настоящее время уже нет никаких сомнений в том, что внедрение фармакогенетических тестов в клиническую практику является реальным путем к персонализированной медицине, и, как следствие повышением эффективности и безопасности фармакотерапии. Уже разработан ряд фармакогенетических тестов. Однако темпы внедрения фармакогенетики в реальную клиническую практику неоправданно низки.

1.2 Реакция N-ацетилирования - одна из наиболее важных систем биотрансформации ксенобиотиков

Лекарственные вещества, поступающие в системный кровоток, подвергаются метаболизму (биотрансформации), или же изменению химических свойств действующих веществ под влиянием ферментов организма [15].

Обычно в результате биотрансформации ЛС снижается его растворимость в жирах (липофильность) и повышается растворимость в воде (гидрофильность), а также изменяется его фармакологическая активность [4]. Соответственно, эффективность и безопасность терапии во многих случаях определяется процессами биотрансформации. Метаболические процессы с участием ферментов обычно классифицируются как реакции Фазы I или Фазы II [15]. В 1-й фазе - преимущественно семействами цитохромов CYP450, во 2-й фазе - ферментами конъюгации, такими как изоформы глутатион-S-трансфераз, глюкуронилтрансфераз, N-ацетилтрансфераз, метилтрансфераз и сульфотрансфераз [1].

Фармакокинетический путь при участии определенных ферментов, находящихся под генетическим контролем, проходят в организме человека и все лекарственные препараты. Учитывая разнородность человеческой популяции, можно предположить, что судьба каждого лекарственного средства на каком-то фармакокинетическом этапе связана с полиморфной системой того или иного фермента или белка. По этой причине различные индивиды неодинаково реагируют на одно и то же лекарственное вещество [16].

Известно, что одной из наиболее важной системой биотрансформации ксенобиотиков является реакция N-ацетилирования. Ацетилирование эволюционно является одним из ранних механизмов адаптации, так как эта реакция необходима для синтеза жирных кислот, стероидов, функционирования цикла Кребса. Система ацетилирования находится под контролем фермента N-ацетилтрансферазы (NAT),требует присутствия в качестве кофактора ацетил-кофермента А (Ац-КоА) и протекает в два последовательных этапа. Сначала ацетильная группа Ац-КоА переносится к цистеиновому остатку внутри активного центра фермента с высвобождением кофермента А (E-SH + КoA-COCH3 > E-S-COCH3 + КoA-SH), а затем перемещается с ацетилированного фермента на аминогруппу субстрата. Данный процесс относится ко II фазе биотрансформации ксенобиотиков. Для сильноосновных аминов скорость N-ацетилирования определяется первым шагом, для слабоосновных - вторым. В определенных случаях N-ацетилтрансферазы могут катализировать и реакцию О-ацетилирования [17, 18].

Сама история изучения ариламин-N-ацетилтрансферазы началась практически сразу после введения в медицинскую практику изониазида в 1952 году для лечения туберкулёза. Было обнаружено, что у 40% лиц, принимавших изониазид в дозе 20 мг/кг в сутки, в течение 3 - 8 недель развивался периферический неврит. Выяснилось, что это осложнение тесно связано с метаболизмом препарата и зависит от степени его ацетилирования. Высокая стабильность типа элиминации свободного изониазида, независимого от характера питания и состояния здоровья, и большой размах межиндивидуальной изменчивости по этому признаку дали основание для предположения, что обмен изониазида в сильной степени определяется наследственными задатками [19]. Авторы номенклатуры предложили корневой символ для генов ариламин N-ацетилтрансфераз писать тремя латинскими заглавными буквами (NAT) [7].

К препаратам, ацетилирование которых генетически детерминировано относятся лекарства, содержащие ароматические аминные или гидразиновые группы (сульфаниламиды(сульфасалазин, сульфаметоксозол, сульфадиазин, сульфацетамид), изониазид, прокаинамид, гидралазин (апрессин), нитразепам, призидилол (прекапиллярный вазодилататор, адреноблокатор), амринон (инотроп), эндралазин, аминоглутетимид (ингибитор синтеза стероидов в надпочечниках и периферической ароматизации надпочечниковых андрогенов), клоназепам и кофеин, широко распространенные загрязнители окружающей среды (бензидин, аминофлюорен, 4-аминобифенил, в-нафтиламин, ароматические амины и др.), канцерогенные вещества, содержащиеся в пище и табачном дыме, а также некоторые эндогенные соединения (серотонин, гистамин, дофамин) метаболизируются в печени с участием изоферментов ариламин-N-ацетилтрансфераз: NAT1 и NAT2 [20, 31].

Однако подвержены этому влиянию не все препараты, которые ацетилируются, поскольку некоторые из них ацетилируются с участием различных ферментов в других органах. Исключениями являются сульфаниламиды, Р-аминобензойная и Р-аминосалициловая кислоты [20].

К настоящему времени известно существование одного гена NAT у прокариот (доядерные - бактерии), у эукариот (формы, имеющие ядро) определено три локуса NAT (NAT1, NAT2, NAT3), нумерация их зависит от исторической последовательности изучения. N-ацетилтрансферазы являются цитозольными ферментами, которые были найдены в печени и во многих других тканях у большинства видов млекопитающих, за исключением лис и собак, которые неспособны к N-ацетилированию ксенобиотиков. У кроликов и мышей экспрессируется две формы N-ацетилтрансферазы, обозначаемых NAT1 и NAT2. У человека две формы фермента NAT1 и NAT2. По последним данным, у человека идентифицировано, кроме этих 2 классов, еще 3 класса ферментов: арилалкин-N-ацетилтрансфераза (AANAT), L1-протеин-регулятор адгезии клеток (L1 CAM) и гомолог Saccharomyces cerevisiae N-ацетилтрансферазы (ARD1) [16, 21].

У человека имеется два функциональных локуса, кодирующих N-ацетилтрансферазы NAT1 и NAT2. Гены, кодирующие N-ацетилирование, локализованы в хромосоме 8p21.3-23.1 [21]. N-ацетилтрансферазы для про- и эукариотов классифицируются в соответствии с международными правилами генетической номенклатуры, где локус обозначается арабскими цифрами, аллели - латинскими буквами, отделенными от локуса гена звездочкой [26]. На сегодняшний день известно 36 аллелей, кодирующих белки с разной степенью ацетилирующей способности [27]. Все исследованные гены NAT состоят из открытых для считывания 870 пар оснований, кодирующих каталитически активные белки со средней молекулярной массой 33,5 кДа [16, 28]. Гены NAT хотя и расположены на одной хромосоме, но регулируются независимо друг от друга. NAT1 экспрессируется в большинстве тканей организма, NAT2 - только в печени и кишечнике. Эти ферменты отличаются по субстратной специфичности. Субстратами, преимущественно метаболизируемыми NAT1, являются парааминосалициловая кислота, парааминобензойная кислота и сульфаметоксазол. К веществам, преимущественно N-ацетилируемым при участии NAT2, относят изониазид, гидралазин, сульфаметазин и дапсон. Некоторые ксенобиотики, например, 2-аминофлуорен одинаково хорошо метаболизируются обоими ферментами [22-24].

Считается, что NAT2 обладает меньшей специфичностью и метаболизирует более широкий круг веществ, поэтому именно NAT2 привлекает большее внимание исследователей. Blum М. с соавт. (1990) доказали, что ген NAT2 полиморфен, его продукты по - разному инактивируют изониазид, а также данный ген отвечает за фенотип ацетилирования [28]. Генетический полиморфизм NAT2 был открыт Vatsis К.Р. с соавт. (1995) [25].

Активность NAT2 в силу своего генетического полиморфизма значительно варьирует у различных индивидов. Были установлены несколько диких и мутантных генотипов фермента NAT2 [29, 30]. Распределение генотипов и фенотипов N-ацетилтрансфераз в различных популяциях на сегодняшний день подвергается активному изучению. Результаты этих исследований позволяют определить не только предрасположенность каждого человека к тому или другому заболеванию, но и его индивидуальную реакцию на то или иное лекарственное средство [28, 31].

Установлено, что по активности N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) человечество делится на группы - «быстрые», «промежуточные» и «медленные» ацетиляторы. Распределение скоростей ацетилирования в популяции бимодальное [20]. Разница между быстрым и медленным N-ацетилированием зависит от количества печеночной NAT2 в большей степени, чем от изменений ее свойств [20]. Известно, что быстрое ацетилирование наследуется по аутосомно-доминантному типу, в то время как медленной ацетилирование - по рецессивному. Интенсивность ацетилирования в организме человека контролируется в2-адренорецепторами, метаболическими резервами (пантотеновая кислота, пиридоксин, тиамин, липоевая кислота), генотипом.

Соотношение между лицами со способностью к быстрому ацетилированию («быстрые» ацетиляторы) и лицами со способностью к медленному ацетилированию («медленные» ацетиляторы) у представителей разных рас различное [7]. «Быстрый» аллель является исходной формой и одинаков у всех рас, тогда как «медленные» аллели европеоидов и монголоидов различны. У «медленных» ацетиляторов - гомозигот по «медленным» аллелям - скорость работы ферментов снижена на 20%. Например, у эскимосов и японцев отмечен самый низкий процент медленных ацетиляторов (около 10%) [32, 33]. У китайцев он несколько выше и составляет около 20% [34]. Медленные ацетиляторы меньше распространены среди коренного населения Гонконга, Малайзии и Сингапура. В популяциях европеоидов типично приблизительно равное распределение быстрых и медленных ацетиляторов. Например, одно из исследований среди европеоидов Берлина выявило 62% медленных ацетиляторов [35]. Фенотипирование европеоидов в одном из северных регионов Германии (Гросхансдорф) определило 71% медленных метаболизаторов [36]. В то же время у европеоидов Франции данный показатель колеблется от 53% до 61,3% [37, 38]. По данным D.A.P. Evans, удельный вес медленных ацетиляторов в Великобритании составляет около 62% [39]. В Швеции этот показатель приближается к 68% [40, 41], а в Дании - к 58% [41]. В Испании частота медленных ацетиляторов среди здорового населения колеблется от 53-55% до 65,4% [42, 43]. Среди негроидных популяций частота медленных ацетилятров варьирует от 18 до 80%. Белое население США - 60%, коренное население Северной Америки - 20% медленные ацетиляторы [44]. Частота медленных ацетилятров у индусов - 59% [45, 46]. В Кении выявлено 69,9% медленных ацетиляторов [47]. Фенотип медленного ацетилирования преобладает на Ближнем Востоке (Египет, Марокко) и составляет 70%. Например, в иранской популяции их уровень находится в пределах 78,4%, что соответствует вариациям в арабских странах и превышает таковые у европейцев [48]. В России подобные исследования единичны. По их результатам в среднем соотношение медленных и быстрых ацетиляторов составляет 60% и 40% соответственно [49, 50]. Подобные данные полученные Сатыровой Т.В. с соавторами, в популяции европеоидов Юго-Восточного региона Республики Беларусь составляли медленный тип ацетилирования имел место у 66% населения, а быстрый - у 34% [51].

Индивидуальная активность метаболических процессов имеет важное биологическое (патогенетическое) значение. Установлено, что некоторые заболевания связаны с типом ацетилирования. Показано, что медленный тип N-ацетилирования предрасположен к раку мочевого пузыря (частота рака мочевого пузыря у «медленных» ацетиляторов в 2-3 раза больше, чем у «быстрых» ацетиляторов), особенно если носители к тому же являются курильщиками или подвергаются профессиональному воздействию бициклическими ароматическими аминами (Indulsky, 2000) [93, 94]. Считается, что фенотип медленного ацетилирования предрасполагает к повышению уровня метаболитов токсичных веществ в моче. Взаимодействие между полиморфизмом NAT2, курением табака (активным или пассивным) является важным фактором риска возникновения рака легкого и рака молочной железы [92]. При изучении рабочих асбестового производства было выявлено повышение риска развития рака легкого у индивидуумов, имеющих фенотип медленного ацетилирования в сочетании с нулевым генотипом гена GSTM1 (Hirvoven et al., 1995). Курящие женщины в постменопаузе имеют выраженную предрасположенность к раку молочной железы, если они «медленные» ацетиляторы, тогда как «быстрые» ацетиляторы такой ассоциации не имеют [39]. Медленный тип N-ацетилирования характерен также для ревматоидного артрита (Pawlik A. и др., 2002) [52], вирусного гепатита (Тихонова Н.Н.,1991), системной красной волчанки (Gunnarsson et al., 1997; Kato, Yamazoe, 2000) [53], бронхиальной астмы (Вавилин В.А. и др.,2003), обструктивного бронхита [54, 55], экземы (Аковбян В.А.,1991) [56]. Тогда как, у «быстрых» ацетиляторов повышен риск рака толстой кишки, который снижен у «медленных» ацетиляторов (среди «быстрых» ацетиляторов в 1,8 раз чаще встречается колоноректальный рак). Быстрый тип ацетилирования характерен также для больных сахарным диабетом (Mrozikiewicz P. И др.,1994) [57, 59], витилиго (Дворянкова Е.В., 2006) [62], для пациентов со спаечной болезнью (Чекмазов И.А., 2002) [58], ангиной [60], аллергическим дерматитом (Nacak M., 2006) [61].

Определение типа ацетилирования важно для оптимизации терапии, так как у медленных ацетиляторов могут развиваться осложнения, а у быстрых ацетиляторов фармакотерапия может оказаться неэффективной.

Литературные данные показывают, что процессы метаболизма ксенобиотиков включают огромное число ферментов и химических реакций, контролирующих как детоксикацию, так и активацию ксенобитиков [15]. Изучение гена или фермента в отдельности не является достаточным условием для решения проблемы индивидуальной чувствительности человека (предрасположенности или устойчивости) к воздействию ЛС. Наиболее перспективным для разработки методического подхода к изучению влияния ксенобиотиков на организм человека и формирования как побочных эффектов, так и заболеваний у человека представляется, изучение сочетанного эффекта различных генов биотрансформации, задействованных в процессах детоксикации и активации ксенобиотиков.

Определение ацетиляторного фенотипа основано на изучении метаболизма некоторых лекарственных средств, например, сульфадимидина, изониазида, дапсона или кофеина. Большинство эпидемиологических исследований по выявлению зависимости действия различных лекарственных веществ, биотрансформация которых протекает с участием N-ацетилтрансферазы или опосредованно зависит от этих реакций, было проведено до открытия 2 независимых локусов NAT. Поскольку типирование выполнялось по скорости метаболизма изониазида или сульфаметазина - типичных субстратов NAT2, выявленные различия относят к полиморфизму NAT2 [35, 63, 64].

Как правило, отношение концентрации метаболита к концентрации исходного препарата измеряют в сыворотке, моче или слюне спустя определенное время после его перорального приема. Распределение частоты отношения в группе здоровых людей является, в большинстве случаев, бимодальным. В то же время некоторые исследователи представляют свои данные в виде тримодального распределения [35, 64].

На генетически предопределенную степень активности фермента может влиять ряд физиологических параметров: раса, пол (например, зависимая от пола секреция гормона роста, модифицирующая активность ферментов), возраст, патологические состояния (например, болезни печени, почек, кишечника, нарушения печеночного и почечного кровотока), средовые влияния (например, состояние окружающей среды), профессия; поведенческие особенности (например, характер пищи, пристрастие к табакокурению и алкоголю). По этой причине ацетиляторный фенотип не всегда согласуется с соответствующим генотипом [65, 66]. Однако четкую зависимость активности NAT2 от пола, возраста, массы тела, роста, курения, употребления кофе, алкоголя, способа кулинарной обработки мяса по результатам пока еще не многочисленных исследований установить до сих пор не удалось [35, 40, 67-69].

У здоровых людей достаточно часто отмечается высокое соответствие между ацетиляторным генотипом и фенотипом. Например, при исследовании ацетиляторного статуса среди китайских женщин установлено почти полное совпадение частоты встречаемости фенотипа и генотипа быстрых ацетиляторов (78% и 76% соответственно) [34]. Среди 222 белых американцев распределение медленных ацетиляторов составило 58,1% и 59,5% по фенотипу и генотипу соответственно. Конкордантность генотипа и фенотипа NAT2 составила 97,8% в бимодальной модели [44]. Среди 38 европеоидов Германии изучение фенотипа и генотипа ацетилирования показало их 100%-е соответствие. Распределение медленных и быстрых ацетиляторов составило 27:11. Генотипирование показало 11 различных комбинаций NAT2, среди которых самыми частыми оказались *5B/*5B, *5B/*6А, *5А/*6С [36]. В России подобные исследования единичны. Например, исследование московской популяционной выборки волонтеров показало, что соотношение быстрых и медленных ацетиляторов, определяемое с использованием 2 подходов, не имело достоверных различий и составляло 47% при фенотипировании и 44% при генотипировании. Абсолютные значения скорости ацетилирования в этом исследовании варьировали в широких пределах, как для «быстрых», так и для «медленных» ацетиляторов. Наиболее распространенными аллелями оказались NAT2*4, NAT2*5 и NAT2*6, генотипами - NAT2*5/*5, NAT2*4/*6 и NAT2*4/*5. Полная конкордантность между фенотипом и генотипом обнаружена только у 62 из 75 индивидуумов (87%) [92].

На результаты исследований по изучению полиморфизма N-ацетилрования могут в ряде случаев влиять методологические особенности фенотипирования. Так, O'Neil с соавторами доказали, что распределение медленных и быстрых ацетиляторов по фенотипу различалось в зависимости от тестового препарата и составляло 70:30 при использовании кофеина и 53:47 при применении дапсона. Генотип NAT2 показал соотношение медленных и быстрых ацетиляторов как 45:55. В группе контроля фенотипирование по кофеину выявило распределение медленных и быстрых ацетиляторов как 67:33 против 60:40 при генотипировании [89]. У здоровых добровольцев в Индии исследование фенотипа в зависимости от измерений сульфадимидина в моче и сыворотке показало 58% и 66% медленных ацетиляторов соответственно [45]. Следовательно, генотип фермента NAT2 является более существенной и стационарной характеристикой популяции по изучаемому признаку и имеет большое значение для метаболизма и детоксикации лекарственных средств или иных ксенобиотиков.

Таким образом, изучение частоты встречаемости фенотипа и генотипа N-ацетилирования, а также их соотношения среди здоровых лиц и больных с различной патологией сохраняют свою актуальность, так как многие аспекты этой проблемы еще не до конца изучены, а большинство полученных результатов противоречивы. Решение этой задачи поможет раскрытию механизмов развития и факторов предрасположенности ко многим мультифакторным заболеваниям. Фенотип ацетилятора способствует подбору оптимальной дозы лекарственного препарата пациентам с быстрым типом ацетилирования и выявлению безопасной дозы лекарственного препарата больным с медленным типом ацетилирования.

1.3 Методы определения фенотипа N-ацетилятора

Как было уже сказано, изониазид - лекарственный препарат, давший толчок исследованию полиморфизма NAT. Методы для определения ацетиляторного фенотипа, которые осуществляется с помощью противотуберкулезных препаратов и их метаболитов в сыворотке, плазме крови и моче. Оценка активности фермента N-ацетилтрансферазы-2 позволяет установить скорость ацетилирования, которая определяет генетически детерминированные особенности индивидуума в метаболизме ряда лекарственных веществ [19]. Лекарственные средства, биотрансформация которых осуществляется путем реакции ацетилирования, содержащие ароматические аминные или гидразиновые группы (изониазид, прокаинамид, гидралазин (апрессин), нитразепам, призидилол, амринон (инотроп), эндралазин, аминоглутетимид, клоназепам и кофеин).

1.3.1 Колориметрия и спектрофотометрия

Количественные колориметрические и спектрофотометрические методы определения изониазида в биологических жидкостях широко используются в клинической практике. Некоторые из этих методов позволяют также определять ацетилизониазид. Здесь мы приведем лишь часть из методов.

Описан метод колориметрического определения изониазида в плазме крови после дериватизации нитропруссидом натрия. Чувствительность метода 5 мг/л. Интерференция с пиразинамидом и ипрониазидом [70].Спектрофотометрический метод, пригодный для измерения терапевтических концентраций изониазида в плазме, после дериватизации коричным альдегидом. INH экстрагируется из 3 мл сыворотки. Наблюдается интерференция с пиразинамидом и ипрониазидом [71].

Основные недостатки вышеперечисленных методов следующие:

* большие объемы образца для анализа, что неприемлемо при рутинных клинических анализах, требующих отбора проб через малые промежутки времени для изучения фармакокинетических параметров;

* низкая специфичность.

1.3.2 Газовая хроматография, масс-спектрометрия, флуориметрия

Газовая хроматография обычно не используется для рутинного определения изониазида в клинических образцах. Плазменно-ионизационный детектор дает низкую чувствительность даже после дериватизации, азот-чувствительный детектор не дает лучшие результаты (в моче предел обнаружения 2 мг/л для INH и AcINH и 400 мг/л для гидразина, моноацетилгидразина и диацетилгидразина) [72]. Компоненты должны быть сначала экстрагированы полярным органическим растворителем, например, метилен-хлоридом или этилацетатом.

Позднейшие методы используют масс-спектрометрию, но часто требуют дейтерированных внутренних стандартов или использования утомительной дифференцирующей экстракции и двойной дериватизационной процедуры получения триметилсилильных производных, занимающего относительно много времени при анализе большого числа проб [73]. Этот метод имеет высокую специфичность и позволяет анализировать производные гидразина вместе с INH и AcINH, что используется для фармакокинетических исследований. Также есть статьи в которых используется ГХ-МС для определения пиразинамида и его производных, предел обнаружения 10 µг/л для PZA.

Флуориметрический метод, разработанный Мисели и Олсоном [74], позволяет определять как сам INH, так и его ацетильное производное после гидролиза, на уровне 0,02 мг/л, но необходима крайне сложная и длительная пробоподготовка.

Суммируя все вышесказанное, можно сделать вывод, что основными недостатками вышеперечисленных методов являются:

* сложность и длительность пробоподготовки;

* высокая стоимость анализа.

фармагенетика ацетилирование ксенобиотик фенотип

1.3.3 Капиллярный электрофорез

Обычно считается, что дата возникновения капиллярного электрофореза (КЭ) -1981 год, когда Джоргенсон и Лукас описали эффективное разделение пептидов, используя зонный электрофорез в стеклянном капилляре диаметром 75 мкм. Сейчас примерно 150 лекарств разных классов измеряются этим методом в биожидкостях для токсикологических, фармакокинетических и фармакогенетических целей [75]. Метод имеет ряд несомненных достоинств: малый объем анализируемой пробы и используемых дорогих растворителей, высокая разделяющая способность, быстрота, относительно низкая стоимость анализа. Поэтому в будущем этот метод имеет хорошие перспективы для использования в широкой клинической практике, но на данный момент вследствие таких недостатков, как относительно низкая чувствительность и воспроизводимость и недостаточная степень автоматизации, метод КЭ пока не находит широкого применения для рутинного анализа [76]. Оганесяном с сотрудниками был разработан и охарактеризован метод определения рифампицина в плазме крови с помощью системы капиллярного электрофореза фирмы Хьюлетт-Паккард [77].

1.3.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

ВЭЖХ как высокочувствительный и универсальный метод анализа, которому во многих случаях нет альтернативы, позволяет одновременно следить за изменением концентрации несколько лекарственных веществ, отличается достаточной селективностью, точностью и воспроизводимостью. Поэтому, начиная с середины 70-х годов, он становится основным аналитическим методом для определения противотуберкулезных лекарств в сыворотке и плазме крови [19].

1.3.4.1 Приготовление реактивов и образцов при использовании метода ВЭЖХ

А. Подготовка пациента, забор крови, получение и хранение сыворотки крови

После 12-часового периода голодания пациент должен принять изониазид в дозе 10 мг на каждый кг массы тела. Через 3 ч. после приема изониазида из локтевой вены необходимо забрать инъекционным шприцем в центрифужную пробирку 10 мл венозной крови. Образец выдержать при комнатной температуре в течение 30 мин. Пробирку не позже через 1 ч после взятия крови в течение 10 мин центрифугировать при скорости 1500g. Сыворотку перенести автоматическим дозатором с наконечником 1 000 мкл в две полипропиленовые пробирки объемом 1,5 мл типа «Eppеndorf». Образцы поместить в морозильную камеру, заморозить до -20°С и хранить при данной температуре до 1 мес. вплоть до проведения количественного анализа содержания ацетизониазида и изониазида. Температуру в морозильной камере контролировать с помощью термометра [78].

Б. Подготовка образцов сыворотки крови

Подготовку проб сыворотки крови производить методом осаждения белка. К 1 мл образца сыворотки крови добавить 0,5 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Смесь тщательно перемешать в течение 1 мин, поместить в центрифугу и центрифугировать в течение 10 мин при 3000 оборотов/мин. После этого для нейтрализации избытка трихлоруксусной кислоты к 0,5 мл надосадочной жидкости добавить 0,5 мл 0,5 М (рН 8,20) раствора ацетата аммония. Объем вводимой пробы должен составить 10 мм3. Для каждого образца выполнить три инжекции.

Исходный раствор изониазида готовят путем растворения точной навески стандартного образца изониазида, составляющей 100,0 мг, в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя следует использовать воду для хроматографии. Концентрация исходного раствора должна составить 1000 мкг/мл.

Рабочий раствор приготовить из исходного раствора изониазида. Концентрация рабочего раствора должна составить 50 мкг/мл.

Градуировочные растворы различных концентраций изониазида сделать из рабочего раствора путем разведения сывороткой крови, свободной от лекарственных веществ. Примерная концентрация градуировочных растворов изониазида должна составлять 0,5-1,0-2,0-5,0-12,0 мкг/мл [78].

1.3.4.2 Подготовка хроматографа и проведение анализа

А. Условия хроматографического разделения

Разделение проводият в градиентном режиме.

Установить следующие параметры хроматографического разделения:

- скорость потока 1,2 мл/мин;

- давление 100-120 бар;

- температура термостата колонки 20±1°С;

- температура устройства для ввода образцов +4°С;

- время хроматографирования: 3-кратное время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора.

Б. Проведение хроматографического анализа

Убедиться в стабильности скорости потока подвижной фазы и температуры колонки. Впрыснуть по 10 мм3 испытуемого раствора. Получить хроматографические кривые. Время выхода изониазида должно составить 2,8±0,1 мин., ацетизониазида -- 2,3±0,1 мин. Соотношение времени выхода ацетизониазида к времени выхода изониазида должно колебаться от 0,83±0,03.

1.3.4.3 Определение фенотипа N-ацетилирования

Фенотип ацетилирования определяют как скорость ацетилирования изониазида и рассчитывают как отношение концентраций ацетизониазида к изониазиду (отношение R).

В зависимости от интервала отношения R: [0-0.28]; [0.28-0.37]; [0.37-1] выделяют медленный, промежуточный и быстрый фенотип ацетилятора. Левый интервал относят к достоверно медленным, правый -- к достоверно быстрым, а средний -- к промежуточным или предбыстрым ацетиляторам [78].

Из вышеизложенного можно сделать вывод, что метод высокоэффективной жидкостной хроматографии является достаточно удобным для рутинного определения противотуберкулезных препаратов в биологических средах, т.к. он отличается быстротой, селективностью, достаточной чувствительностью, доступностью приборной базы, возможностью одновременного определения нескольких препаратов при комплексной терапии туберкулеза легких.

Также используют определение фенотипа N-ацетилирования в основной и контрольной группе с помощью модифицированного метода Bratton & Marshall (1938) с помощью тестового препарата сульфадимезина (СД) или кофеина. Пациенты и индивидуумы контрольной группы натощак принимали 0,5 г. СД. Клинический материал (моча) собирали через 6 часов после приема СД. Определяли уровень свободного и общего СД методом спектрофотометрии при длине волны 400 нм. Уровень ацетилированного СД определяли по формуле: АЦС = ОБС - СВС, где АЦС - ацетилированный СД, ОБС - общий СД, СВС - свободный СД. Фенотип N-ацетилирования определялся как скорость N-ацетилирования СД и рассчитывался как отношение АЦС к ОБС в %. Быстрыми N-ацетиляторами считали лиц, у которых за 6 часов было ацетилировано от 70% до 100% 0,5 г количества введенного СД. Остальные обследованные определялись как медленные N-ацетиляторы [79].

Однако, не смотря на высокую чувствительность и способность измерять даже низкие концентрации, как лекарственных средств, так и их метаболитов, вышеизложенные методы определения фенотипа ацетилятора не всегда доступны для практического здравоохранения в силу их дороговизны, сложности и трудоемкости процесса. По этой причине поиск простых, недорогих и доступных методов определения фенотипа N-ацетилирования является по-прежнему своевременной и актуальной задачей современной медицины.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Методология и общая характеристика структуры исследования

Исследование серии случаев, в котором приняло участие 28 пациентов, выполнено на базе Учреждения «Гомельская областная клиническая больница» в период с марта по июнь 2013 года.

Основные критерии включения:

1. Мужчины или небеременные и не кормящие грудью женщины в возрасте 18 лет и старше (у женщин в детородном возрасте до включения в исследование должен быть получен отрицательный тест на беременность).

2. Пациенты, являющиеся европеоидами и не состоящие между собой в родстве.

Основные критерия исключения:

1. Терапия любыми лекарственными средствами в течение не менее четырех недель, предшествующих исследованию.

2. Клинические и/или лабораторные признаки тяжелых соматических заболеваний.

3. Анамнестические данные о перенесенных ранее хирургических вмешательств.

2.2 Общеклинические, лабораторные и инструментальные методы обследования больных

С целью верификации и выявления сопутствующей патологии всем пациентам проведено стандартное обследование с использованием клинических, лабораторных и инструментальных методов.

Клиническое обследование пациентов состояло из сбора жалоб, анамнеза заболевания и жизни, а также объективного осмотра с определением антропометрических показателей.

Лабораторные тесты включали в себя клинический, биохимический анализы крови, анализы мочи и кала. Все лабораторные исследования проводились по стандартной методике [80, 81].

2.3 Методика определения вариабельности фенотипа N-ацетилтрансферазы 2

Фенотип ацетилятора устанавливали на основе определения клиренса мочевой кислоты до и после приема кофеина в качестве тестового препарата.

Кофеин выбран в качестве тестового препарата в силу схожести путей его метаболизма с сульфадимезином, которое состоит в участии полиморфной N-ацетилтрансферазы 2 как в ацетилировании изониазида, так и в ацетилировании метаболитов кофеина [82]. Следовательно, у пациентов с медленным и быстрым типом ацетилирования имеют место вполне определенные различия в соотношении некоторых промежуточных метаболитов кофеина (5-ацетиламино-6-формиламина-3-метилурацила и 1-метилксантила), которые используются в качестве показателей, указывающих на скорость процессов ацетилирования. Количественное определение всех метаболитов кофеина в большинстве случаев производится с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии, что ограничивает вследствие недоступности и трудоемкости метода его применение в практической медицине. Однако эти различия вполне применимы к конечному продукту метаболизма кофеина - мочевой кислоте, определение которой вполне доступно и не сопровождается существенными методическими трудностями [83].