Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования и науки РФ

ФГБОУ ВПО "Волгоградский государственный технический университет"

Кафедра "Органическая химия"

СЕМЕСТРОВАЯ РАБОТА

по биохимии на тему:

"Физико-химические свойства белков и их определение"

Выполнила:

ст. группы ПП-352

Ешева Аида

Проверила: доцент

Кутыга Ольга Николаевна

Волгоград 2013

Содержание

• Введение
• Физические свойства
• Биологические свойства
• Химические свойства белков
• Химический синтез и анализ белков
• Определение первичной структуры белков
• Определение вторичной структуры белков
• Определение третичной и четвертичной структур белков
• Денатурация белков
• Выделение и очистка белков
• Белки в промышленности и медицине
• Заключение
• Список использованной литературы

Введение

Белки представляют собой высокомолекулярные органические соединения, построенные из остатков б-аминокислот, соединенных между собой пептидными связями.

Белки играют наиважнейшую роль в процессах жизнедеятельности. Ни один из известных живых организмов не обходится без них. Белки служат питательными веществами, они регулируют обмен веществ, исполняя роль ферментов - катализаторов обмена веществ, способствуют переносу кислорода по всему организму и его поглощению, играют важную роль в функционировании нервной системы, являются механической основой мышечного сокращения, участвуют в передаче генетической информации и т.д. Известно, что аминокислоты, соединяясь друг с другом посредством пептидных связей, образуют полипептиды. Белками являются полипептиды, способные образовывать и самостоятельно стабилизировать свою пространственную структуру. Как правило, белками называют полипептиды, которые содержат более 50 аминокислотных остатков.

Различают химические, физические и биологические свойства белков.

Химические свойства отличаются исключительным разнообразием. Некоторые из радикалов аминокислот содержат свободные минные (лизин, аргинин) и карбоксильные (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) группы. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (воды), ионогенные группы ионизируются, образуя катионные и анионные центры молекулы белка.

Целью данной семестровой работы является изучение химических и физических свойств белков. Поставленная цель решается посредством следующих задач:

рассмотрение основных физических свойств белков;

изучение характеристики их химических свойств.

Физические свойства

Особо следует отметить подвижность белковых молекул в электрическом поле, их оптическую активность, способность рассеивать свет (ввиду значительных размеров белковых частиц) и поглощать ультрафиолетовое излучение. Перечисленные оптические свойства белков используют при их фракционировании, количественном определении, измерении молекулярной массы и т.п.

Одним из характерных физических свойств белков является их способность адсорбировать на своей поверхности (а иногда и захватывать внутрь молекулы) низкомолекулярные органические соединения и ионы. С этим свойством белков связана их транспортная функция в организме: некоторые белки являются хорошими переносчиками продуктов обмена и токсических веществ [1].

Биологические свойства

В первую очередь следует отметить биокаталитическую (ферментативную) активность белков. Благодаря особому строению молекулы или наличию активных групп многие белки обладают способностью каталитически ускорять ход химических реакций. Это свойство белков играет важную роль в осуществлении процессов жизнедеятельности.

Другое важное биологическое свойство белков - их гормональная активность, т.е. способность воздействовать на целые группы химических реакций в организме. Некоторым белкам присущи также токсические свойства, патогенная активность, защитные функции в организме и т.п.

Важной является пластическая роль белков: в сочетании с другими макромолекулами они дают начало смешанным сополимерам - нуклеопротеинам, липопротеинам и гликопротеинам, которые в свою очередь обеспечивают возникновение субклеточных структур и надклеточных образований в организме.

Особым свойством белков является их способность к денатурации. Белки, обладающие всеми характерными природными свойствами, называют нативными. Часто под влиянием мягкой обработки (например, легкого встряхивания) или при резких физических или химических воздействиях (тепловой шок, стресс, отравление тяжелыми металлами) белки теряют нативность и переходят в денатурированное состояние.

Изменение уникальной структуры нативного белка, сопровождающееся обратимой или необратимой потерей характерных для него свойств (растворимости, биологической активности, электрофоретической подвижности и т.п.) называют денатурацией. При обратимой денатурации, как правило, нарушаются четвертичная, третичная и частично вторичная структура белковой молекулы, но не происходит каких - либо изменений первичной структуры. В случае обратимой денатурации (в отличие от необратимой) при определенных условиях денатурированный белок можно частично или полностью вернуть к нативному состоянию, такой белок называют ренатурированным, а процесс - ренатурацией.

При необратимой денатурации белка (при кипячении, под действием ионов тяжелых металлов и других агентов) происходит глубокое нарушение структуры белка, в результате чего ренатурация его невозможна [2].

Химические свойства белков

Они отличаются исключительным разнообразием. Обладая аминокислотными радикалами различной химической природы, белковые тела способны вступать в разнообразные реакции. Некоторые из радикалов аминокислот содержат свободные аминные (лизин, аргинин) и карбоксильные (аспарагиновая и глутаминовая кислоты) группы. Взаимодействуя с окружающими молекулами растворителя (воды), ионогенные группы ионизируются, образуя катионные и анионные центры молекулы белка.

В зависимости от соотношения противоположно заряженных ионов белковая молекула получает суммарный положительный или отрицательный заряд. Для характеристики кислотно-основных свойств молекул белков и аминокислот используется такой показатель, как изоэлектрическая точка.

Изоэлектрическая точка белка (рI) - это значение рН среды, при котором молекула белка электронейтральна и не перемещается в электрическом поле.

Белки, как и аминокислоты, являясь амфотерными электролитами, могут диссоциировать как кислоты и как основания. Условно молекулу белка в растворе с равным числом ионизированных аминных и карбоксильных групп (вблизи изоэлектрической точки) можно представить следующим образом:

В кислой среде (рН < 7) происходит подавление диссоциации белка по карбоксильным группам, в этом случае молекула белка заряжается положительно:

В щелочной среде (рН > 7) подавляется диссоциация белка по аминогруппам, и молекула заряжается отрицательно:

Изоэлектрическая точка кислых белков (с повышенным содержанием дикарбоновых кислот) лежит в слабокислой области, изоэлектрическая точка основных белков (с повышенным содержанием диаминокислот) - в слабощелочной области.

В водном растворе белков их молекулы заряжены и гидратированы, что обусловливает устойчивость белковых растворов. Однако при высокой концентрации солей, ионы которых тоже гидратированы, происходит разрушение водных оболочек белковых молекул и нейтрализация их заряда адсорбирующимися противоионами соли. Белковые частицы слипаются и выпадают в осадок. Таков механизм высаливания белков, который используют для выделения отдельных белков из смеси [3].

Химический синтез и анализ белков

Синтез. Осуществление белкового синтеза химическим путем привлекало внимание многих исследователей. Метод твердофазного синтеза, разработанный Б. Меррифилдом, дал возможность получать достаточно большие полипептиды. Таким же способом был получен гормон инсулин, а его уже можно отнести к классу белков. В случае инсулина более трудной задачей было соединение двух полипептидных цепей в активную макромолекулу. К. Диксон и А. Уардлоу справились с этой задачей и положили основу химического синтеза белков. Однако несмотря на разработку автоматических синтезаторов, метод химического синтеза белков не получил широкого распространения из-за наличия большого числа технических ограничений. В природе небольшие полипептиды синтезируются с помощью соответствующих ферментов, основная же масса белков образуется посредством матричного синтеза.

Анализ. Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава. Для этого необходимо провести полный гидролиз пептидных связей и получить смесь, состоящую из отдельных аминокислот. Гидролиз проводят при помощи 6М соляной кислоты при кипячении в течение 24 ч. Так как для гидролиза пептидных связей изолейцина и валина этого может быть недостаточно, проводят контрольный 48 - и 72 - часовой гидролиз. Некоторые аминокислоты, например триптофан, при кислотном гидролизе разрушаются, поэтому для их идентификации используют гидролиз при помощи метансульфоновой кислоты в присутствии триптамина.

Для определения цистеина белок окисляют надмуравьиной кислотой, при этом цистеин превращается в цистеиновую кислоту, которую затем анализируют. Выделение и идентификацию аминокислот проводят при помощи аминокислотных анализаторов, принцип действия которых основан на хроматографическом разделении белкового гидролизата на сульфополистирольных катионитах.

В основе количественного определения той или иной аминокислоты лежит цветная реакция с нингидрином, однако более перспективным следует считать метод, при котором аминокислоты модифицируют в производные, поглощающие свет в видимом диапазоне. Разделение смеси аминокислот проводят при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии, а само определение - спектрофотометрически.

Следующим этапом является определение концевых аминных и карбоксильных группировок в белковой макромолекуле. Это необходимо для того, чтобы знать, какой белок подвергается анализу - протомер или олигомер. Олигомерные белки предварительно обрабатывают надмуравьиной кислотой для разделения на отдельные полипептидные цепи. N-Концевую аминокислоту определяют при помощи динитрофторбензола, который реагирует с б-аминогруппой белка, образуя окрашенное в желтый цвет производное. Что касается С-концевых аминокислот, то их определение связано с применением ферментативного метода. В качестве фермента чаще всего используют карбоксипептидазу А, которая последовательно отщепляет от карбоксильного конца отдельные аминокислоты. Суть метода заключается в количественном определении накопления свободных аминокислот во времени [4].

Определение первичной структуры белков

Определению первичной структуры предшествует денатурация и разрыв поперечных дисульфидных связей в белке. Это достигается посредством избытка меркаптоэтанола.

Цистин превращается в два остатка цистеина, которые затем блокируют избытком иодуксусной кислоты, чтобы предотвратить обратное образование связей - S-S-.

Расщепление полипептидной цепи на фрагменты проводят обычно при помощи протеолитических ферментов, таких, как трипсин, химотрипсин или пепсин. Эти ферменты действуют на различные участки полипептидной цепи, так как имеют повышенное сродство к различным аминокислотным остаткам. Необходимо учитывать также соседние аминокислотные остатки, т.е. пространственное окружение атакуемой пептидной связи. Оказалось, что трипсин гидролизует только те пептидные связи, в образовании которых участвует карбоксильная группа лизина или аргинина, а химотрипсин гидролизует связи по фенилаланину, триптофану и тирозину. Обычно протеолитические ферменты, гидролизующие полипептидные цепи, предварительно иммобилизуют на нерастворимых матрицах для более легкого отделения их от продуктов гидролиза. Далее определяют аминокислотные последовательности каждого полипептидного фрагмента. Для этого чаще всего используют метод Эдмана, заключающийся в анализе полипептида только с N-конца. Концевая аминокислота при взаимодействии с фенилизотиоцианатом в щелочной среде образует стойкое соединение, которое можно отщепить от полипептида без его деградации. Фенилтиогидантоиновое (ФТГ) производное аминокислоты идентифицируется хроматографическим методом.

После идентификации концевого N-аминокислотного остатка метка вводится в следующий аминокислотный остаток, который становится концевым. Метод Эдмана можно автоматизировать, пользуя секвенатор (от англ. sequetice - последовательность) с помощью которого ФТГ-производные отщепляются от полипептида и идентифицируются посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Ф. Сэнгер впервые полностью расшифровал первичную структуру белкового гормона инсулина, используя метод Эдмана.

Другим высокочувствительным методом является так называемый дансильный метод, связанный с присоединением к концевой аминокислоте дансилхлорида (1-диметиламино-нафталин-5-сульфохлорида) по следующей схеме:

Первичная структура белка может быть установлена косвенно следующим образом: сначала получают соответствующую кДНК., затем идентифицируют клон, относящийся к анализируемому белку, и по чередованию в нем нуклеотидов с использованием библиотеки аминокислотных последовательностей определяют первичную структуру белка.

Определение вторичной структуры белков

Для определения вторичной структуры белков используются в основном оптические методы. Конечно, более надежным является рентгеноструктурный метод, однако его применение сопряжено с определенными трудностями и требует значительного времени. Такие оптические методы, как дисперсия оптического вращения и круговой дихроизм, являются более простыми и, что весьма важно, позволяют определять изменения вторичной структуры белка в растворах. При помощи дисперсии оптического вращения можно получить информацию о степени спирализации белковой макромолекулы. Несмотря на то, что метод является приближенным, достаточно отчетливо просматриваются переходы типа спираль-клубок. Что касается метода кругового дихроизма, то его спектр определяется набором углов ш и ц, свойственных тому или иному типу вторичной структуры. Оба метода можно расценивать как скриннинговые, и для полной идентификации вторичной структуры их надо комбинировать с рентгеноструктурным анализом белков.

Определение третичной и четвертичной структур белков

Третичная и четвертичная структуры белков определяются при помощи рентгеноструктурного анализа, который впервые был проведен применительно к миоглобину и гемоглобину Дж. Кендрью и М. Перутцем в Кембридже. Значение рентгеноструктурного анализа белков трудно переоценить, так как именно этот метод дал возможность впервые получить своеобразную фотографию белковой молекулы. Для получения информативной рентгенограммы необходимо было иметь полноценный кристалл белка с включенными в него атомами тяжелых металлов, так как последние рассеивают рентгеновские лучи сильнее атомов белка и изменяют интенсивность дифрагированных лучей. Таким образом можно определить фазу дифрагированных на белковом кристалле лучей и затем электронную плотность белковой молекулы.

Это впервые удалось сделать М. Перутцу в 1954 г., что явилось предпосылкой для построения приближенной модели молекулы белка, которая затем была уточнена при помощи ЭВМ. Однако первым белком, пространственная структура которого была полностью идентифицирована Дж. Кендрью, оказался миоглобин, состоящий из 153 аминокислотных остатков, образующих одну полипептидную цепь. В результате было экспериментально подтверждено предположение Л. Полинга и Р. Кори о наличии в молекуле миоглобина б-спиральных участков, а также М. Перутца и Л. Брэгга о том, что они имеют цилиндрическую форму. Несколько позднее М. Перутцем была расшифрована структура гемоглобина, состоящая из 574 аминокислотных остатков и содержащая около 10 000 атомов. В отличие от миоглобина гемоглобин имеет четвертичную структуру, включающую в себя четыре глобулы: две б-субъединицы и две в-субъединицы [1].

Денатурация белков

Под денатурацией понимают изменение пространственной структуры белков и, как следствие, уменьшение или полное подавление функциональной активности, растворимости и других биологических и физико-химических свойств. Следует различать денатурацию и деградацию белков. При деградации происходит фрагментация первичной структуры и образование фрагментов белковой макромолекулы. Денатурация не сопровождается фрагментацией, однако может происходить разрыв дисульфидных мостиков, а также слабых водородных, гидрофобных и электростатических связей. В результате изменениям подвергается четвертичная (при ее наличии), третичная и в меньшей степени вторичная структуры.

Денатурирующие агенты делятся на химические и физические. К последним относится прежде всего температурное воздействие, в частности замораживание или нагревание, а также давление, ультразвуковое воздействие, облучение и др. Химические агенты - это органические растворители (ацетон, хлороформ, спирт), концентрированные кислоты, щелочи, ионы тяжелых металлов. В лабораторной практике в качестве денатурирующих агентов чаще всего используют мочевину или гуанидинхлорид, легко разрывающие водородные и гидрофобные связи, при помощи которых формируется третичная структура белка. Максимальное денатурирующее действие оба реагента проявляют при высоких концентрациях (8-10 моль/л). Тепловая денатурация белков в растворах при 50-60°С также связана с разрывом связей, при помощи которых образуется третичная структура. Денатурация, осуществляемая в мягких условиях, часто оказывается обратимой, т.е. при удалении денатурирующего агента происходит восстановление нативной конформации белковой молекулы. Для ряда белков восстановление связей может быть 100% -м, причем это касается не только водородных или гидрофобных связей, но и дисульфидных мостиков. Денатурация изменяет как стабильность, так и функции белков, поэтому весьма важно определять ее характер в научных экспериментах, а также при применении белков в промышленности и медицине. Как правило, при денатурации изменяется форма белковой молекулы, поэтому для контроля ее нативности применяют такие методы, как коэффициент вращательной диффузии, рассеяние света, электронная микроскопия. Кроме того, при переходе молекулы белка в денатурированную форму меняется ее растворимость, спектры поглощения, иммунохимические свойства [5].

Выделение и очистка белков

Для изучения структур и функций белков требуется выделение и очистка их с минимальным количеством примесей, а в идеале - до гомогенного состояния. Связи, поддерживающие высшие структуры белковых макромолекул, легко разрываются, число гидрофобных и гидрофильных группировок на поверхности белковых глобул изменяется, что сказывается в первую очередь на их растворимости. Для выделения белков из клеток последние разрушаются, причем если для деградации цитоплазматических мембран животных клеток достаточно применения гомогенизаторов, то разрушение клеточных стенок растительных и особенно микробных клеток требует больших усилий (ультразвук, шаровые мельницы и т.д.). После удаления остатков клеточных структур при помощи диализа освобождаются от различных малых молекул. Затем последовательно используются различные методы фракционирования.

Высаливание. Высокие концентрации сульфата аммония, а также солей щелочных металлов осаждают белки. Механизм осаждения связан со способностью солей разрушать гидратную оболочку растворенных белковых макромолекул, что приводит к их агрегации и последующему осаждению. Далее используют ряд методов концентрирования и тонкой очистки белков, причем наиболее эффективными являются различные хроматографические процедуры. К преимуществам хроматографических методов следует отнести:

1. технологическую гибкость - разделение веществ можно осуществлять при реализации различных типов межмолекулярных взаимодействий сорбент-сорбат;

2. динамичность, т.е. большое преимущество перед такими одноактными методами, как экстракция и осаждение. Концентрирование продукта в этом случае состоит в селективности взаимодействия хроматографического носителя с целевым веществом, содержащимся в многокомпонентной смеси;

3. вещества в процессе хроматографического разделения, как правило, не подвергаются химическим изменениям [2].

Белки в промышленности и медицине

В последние годы белки растительного происхождения все в большей степени используют для питания не только животных, но и человека. Прямое потребление человеком растительных белков касается в первую очередь зерновых культур, бобовых, а также различных других овощей. Выделение высокоочищенных белков (изолятов) происходит в несколько стадий. На первой стадии белки избирательно переводятся в растворимое состояние. Эффективность разделения твердой (примеси) и жидкой (белки) фаз является залогом получения в дальнейшем высокоочищенного продукта. В большинстве случаев белки из растительных источников являются альбуминами или глобулинами, причем глобулины растворимы в слабых солевых растворах, а альбумины - еще и в чистой воде. Белковый экстракт содержит много сопутствующих растворимых продуктов, поэтому на второй стадии белки отделяют осаждением или, используя различия в размерах или в электрическом заряде, применяют мембранную технологию, а также другие приемы (электродиализ, ионообменные смолы, молекулярные сита и др.). Когда оптимальные условия растворимости белков определены, выбор конкретного технологического процесса зависит от вида сырья и целевого продукта.

Производство белковых продуктов методом микробиологического синтеза имеет многовековую историю. Следует отметить, что питательные свойства микробной биомассы во многом определяются белками, составляющими большую часть сухой массы клеток. Микробные белки привлекают внимание биотехнологов в качестве пищевых продуктов в связи с дешевизной и быстротой их получения по сравнению с животными и растительными белками. Промышленное получение белка из микробных клеток осуществляется методом глубинного, непрерывного культивирования. Существенным недостатком этой технологии является наличие в конечном продукте примесей микробных клеток, количество и токсичность которых должно строго учитываться. Наличие нежелательных примесей при производстве микробного белка привело к тому, что в основном он используется в качестве корма для сельскохозяйственных животных. Белки и продукты их деградации применяются в медицине в качестве лекарственных веществ и лечебных пищевых добавок [3].

белок химическое свойство денатурация

Заключение

В результате изучения данной темы можно сделать вывод, что физические и химические свойства белков разнообразны, что обусловлено их сложной структурой.

Методы анализа белковых макромолекул селективны и осуществляются в зависимости от того, какая структура является объектом исследования, и начинаются с определения аминокислотного состава.

Под денатурацией понимают изменение пространственной структуры белков и, как следствие, уменьшение или полное подавление функциональной активности, растворимости и других биологических и физико-химических свойств.

В белках основной вклад в формирование кислотно-основных свойств вносят заряженные радикалы аминокислотных остатков, расположенные на поверхности белковой глобулы. Основные свойства белков связаны с такими аминокислотами, как аргинин, лизин или гистидин, а кислые - с аспарагиновой и глутаминовой аминокислотами. Белки, будучи амфотерными электролитами, проявляют буферные свойства, хотя их буферная емкость в большинстве случаев незначительна. Исключение составляют белки, содержащие большое число остатков гистидина. В растворах белки проявляют коллоидные свойства, такие, как явление светорассеяния (эффект Тиндаля), неспособность проходить через полупроницаемые мембраны, высокая вязкость, образование гелей и др. Вместе с тем белки не являются истинными коллоидами, так как они способны образовывать молекулярные растворы. Основное сходство между коллоидными частицами и белками заключается в том, что они имеют более или менее близкие размеры. Белки так же, как и истинные коллоиды, могут образовывать гели, представляющие собой сетчатые структуры, заполненные водой.

Список использованной литературы

1. Комов, В.П. Биохимия: учеб. для вузов / В.П. Комов, В.Н. Шведова. - 2-е изд., испр. - М.: Дрофа, 2006. - 638 с.

2. Овчинников, Ю.А. Биоорганическая химия / Ю.А. Овчинников. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.

3. Петров А. А, Бальян Х.В., Трощенко А.Т. Органическая химия: Учебник для вузов. - СПб.: "Иван Федоров", 2002. - 624 с.

4. Тюкавкина, Н.А. Биоорганическая химия / Н.А. Тюкавкина, Ю.И. Бауков. - М.: Медицина, 1991. - 528 с.

5. Филиппович Ю.Б., Ковалевская Н.И., Севастьянова Г.А. и др. Биологическая химия: Учеб. пособие для ступ. высш. учеб., др.: Под ред.Н.И. Ковалевской. - М.: "Академия", 2005. - 256 с

Размещено на Allbest.ru