Плазмідні вектори pBudCE4.1 та pREP4

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

Плазмідні вектори pBudCE4.1 та pREP4

Виконала:

Студ. 4 курсу

денної форми навчання

Ігнатьєва Крістіна

Київ - 2011 р.

Вектор pREP4

Цей вектор розроблений для конститутивної експресії високого рівня, завдяки промотору CMV або RSV. Вектора містить ген EBNA-1 для епісомної експресії у клітинних лініях приматів і собак.

pREP4 це епісомной експресуючий вектор ссавців, який використовує Рауса Саркома.

Вірус довгий кінцевий повтор вірусу саркоми Рауса (RSV LTR) енхансер / промотор для транскрипції рекомбінантних генів вбудований в сайт множинного клонування.

Оріджин вірусу Епштейна-Барра (oriP) і ядерний антиген (кодується EBNA-1 геном) преносяться плазмідою, для позахромосомної реплікації в організмі людини, приматів і собак. pREP4 також переносить ген стійкості до гігроміціну B для детекції трансформованих клітин.

pREP4/CAT використовується в якості контролю для відносного рівня експресії рекомбінантних білків у клітинній лінії. pREP4/CAT експресує хлорамфенікол ацетил-трансферазу білка з RSV LTR енхансера / промотора. pREP4/CAT містить ген стійкості до гігроміціну B для селекції.

Карта вектора

Структура полілінкера

Для клонування і експресії використовують наступну схему:

1. проаналізувати структуру полілінкерадля розробки стратегії клонування гена в pREP4.

2. Лігувати нашу вставку в pREP4 вектор і трансформувати в E. coli. Селекція трансформантів на LB середовищі, що містить 50 до 100 мкг / мл ампіциліну.

3. Аналіз трансформантів на присутність нашої вставки обмеженною рестрикцією.

4. Вибрати трансформанти з правильними патернами рестрикції і використати секвенування щоб підтвердити, що ген клонований у правильній орієнтації.

5. Трансфектувати конструкт в лінії клітин ссавців, використовуючи коректний для них метод. Створити стабільну клітинну лінію, якщо це необхідно.

6. Тест на експресію рекомбінантного гена проводити за допомогою вестерн - блотингу.

Клонування за допомогою pREP4

Для отримання довідки по лігування ДНК, трансформацію, рестрикційного аналізу, очищення олноланцюгової ДНК, секвенування ДНК зверніться до Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1994).

Штам кишкової палички

Багато штамів E. coli підходять для напрацювання цього вектора, в тому числі TOP10 і DH5?. Ми рекомендуємо вам напрацьовувати вектор, що містить вставки в штамах з низькою рекомбінаційною (recA) та ендонуклеазною (endA) активністю.

TOP10 доступний у вигляді хімічно компетентних і електрокомпетентних клітин у каталозі Invitrogen.

Трансформація

Ви можете використовувати будь-який метод для трансформації. Хімічне перетворення є найбільш зручним для більшості дослідників. Електропорація є найбільш ефективним методом для великих плазмід.

Сіквенс послідовності Козак для ссавців

Якщо ви будете рекомбінувати з цільвим вектором для експресії у ссавців, ваша вставка повинна містити консенсусну послідовність Козак з ініціюючим кодоном ATG для правильної ініціації трансляції (Козак, 1987; Козак, 1991; Козак, 1990). Приклад послідовності Козак наводиться нижче. Інші послідовності також можливі, але G або А в позиції -3' і G в положенні +4 (виділено жирним шрифтом) найбільш часто зустрічаються. Заміна одної з двох основ на цих позиціях забезпечує модифікацію консенсусу.

(G/A)NNATGG. Трансфекція

Коли ви визначили, що ген клоновано у правильній орієнтації і він містить ініціюючий та стоп-кодони, ним можна трансформувати обрану клітинну лінію.

ДНК плазміди перед трансфекцією в еукаріотичні клатини потрібно очистити від контамінантів, які вбивають клітини за допомогою PureLink™ HQ Mini Plasmid Purification Kit or the PureLink™ HiPure Plasmid Midiprep Kit, із каталогу Invitrogen.

Метод трансфекції підбирається до конкретної лінії за допомогою аналізу літератури:Methods for transfection include calcium phosphate (Chen and Okayama, 1987; Wigler et al., 1977), lipid-mediated (Felgner et al., 1989; Felgner and Ringold, 1989) and electroporation (Chu et al., 1987; Shigekawa and Dower, 1988).

Позитивний контроль

Як позитивний контроль використовується pREP4/CAT (постачається у наборі).

Селекція клітин здійснюється за допомогою гігроміцину.

Особливості pREP4

pREP4 (10349 пар основ) містить наступні елементи.

Вектор pBudCE4.1

pBudCE4.1 вектор розміром 4,6 kb, призначений для одночасної експресії двох генів у клітинних ліній ссавців. Вектор містить ранній промотор людського цитомегаловірусу (ЦМВ) і промотор людського фактору подовження 1?-субодиниці (EF-1?),

Особливості вектора дозволяють виявлення та очищення екс пресованих білків. Окрім двох промоторів, вектор містить такі елементи:

* С-кінцевий пептид, кодуваний Myc (с-Myc) епітопом або V5 епітоп і polyhistidine (6xHis) метал-зв'язуючий тег для виявлення та очищення рекомбінантних білків

* ген стійкості до зеацину для селкції Zeocin E. coli і створення стабільних ліній клітин ссавців (Mulsant і співавт., 1988).

* SV40 origin для епісомної реплікації в клітинних лініях, які латентно інфіковані SV40 або які еспресують SV40 Т антиген (наприклад, COS7) pBudCE4.1 / Lac Z / CAT включений для використання в якості позитивного контролю для трансфекції, експресії і виявлення в цільовій клітинній лінії.

pBudCE4.1 є покращеною версією pBudCE4. Під час синтезу вихідного вектора, ATG був випадково створений у multiple cloning site (672-674 bp) 3? до CMV промотора. Оскільки це може заважати належній трансляції клонованого гена, це ATG було змінено на ATT для створення pBudCE4.1

Клонування за допомогою pBudCE4.1

Для отримання довідки по лігування ДНК, трансформацію, рестрикційного аналізу, очищення олноланцюгової ДНК, секвенування ДНК зверніться до Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989) or Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 1994).

Штам кишкової палички

Багато штамів E. coli підходять для напрацювання цього вектора, в тому числі TOP10 і DH5?™ T1R. Ми рекомендуємо вам напрацьовувати вектор, що містить вставки в штамах з низькою рекомбінаційною (recA) та ендонуклеазною (endA) активністю.

TOP10 доступний у вигляді хімічно компетентних і електрокомпетентних клітин у каталозі Invitrogen.

Будь який штам, що містить Tn5 transposable element (в т.ч. DH5 F.IQ, SURE, SURE2) кодують e ble (ген стійкості до блеоміцину). Ці послідовності спричиняють стійкість до зеацину, тому рекомендовано використовувати штами, що не містять ген Tn5 gene.

вектор клонування ген ссавець

Трансформація

Ви можете використовувати будь-який метод для трансформації. Хімічне перетворення є найбільш зручним для більшості дослідників. Електропорація є найбільш ефективним методом для великих плазмід.

Умови клонування

Якщо ви будете рекомбінувати з цільовим вектором для експресії у ссавців, ваша вставка повинна містити консенсусну послідовність Козак з ініціюючим кодоном ATG для правильної ініціації трансляції (Козак, 1987; Козак, 1991; Козак, 1990). Приклад послідовності Козак наводиться нижче. Інші послідовності також можливі, але G або А в позиції -3' і G в положенні +4 (виділено жирним шрифтом) найбільш часто зустрічаються. Заміна одної з двох основ на цих позиціях забезпечує модифікацію консенсусу

Трансформація E. coli

Трансформувати плазміну у компетентні recA, endA штами E. coli (TOP10) провести селекцію на середовищі Low Salt LB яке містить 25-50 ?g/mL зеацину. Обрати 10-20 клонів і проаналізувати наявність та орієнтацію вставки. Найкраще це зробити за допомогою секвенування конструкту, щоб переконатися, що кожен із вставлених генів вбудований поблизу C-кінцевого пептиду.

CMV Multiple Cloning Site

EF-1? Multiple Cloning Site

Трансфекція

Коли ви визначили, що гени клоновано у правильній орієнтації і вони містять С-кінцевий пептид, таким вектором можна трансформувати обрану клітинну лінію.

ДНК плазміди перед трансфекцією в еукаріотичні клатини потрібно очистити від контамінантів, які вбивають клітини за допомогою PureLink™ HiPure Miniprep Kit або the PureLink™ HiPure Midiprep Kit, із каталогу Invitrogen.

Метод трансфекції підбирається до конкретної лінії за допомогою аналізу літератури:Methods for transfection include calcium phosphate (Chen and Okayama, 1987; Wigler et al., 1977), lipid-mediated (Felgner et al., 1989; Felgner and Ringold, 1989) and electroporation (Chu et al., 1987; Shigekawa and Dower, 1988).

Позитивний контроль

pBudCE4.1/lacZ/CAT використовується як позитивний контроль для трансфекції в клітин ссавців, а також експресії. Ген, що кодує ?-галактозидазу екс пресується з промотора CMV як додаток до myc епітопа ссавців. Ген, що кодує хлорамфенікол ацетилтрансферазу (CAT) екс пресується злитино з V5 епітопом від EF-1? промоутера.

Для розділення білків доцільно використовувати гель-електрофорез.

Для детекції химерних рекомбінантних білків вестерн-блот аналізом можна скористатися антитілами Anti-myc, Anti-V5, or the Anti-His(C-term)

Можливі сайти лінеаризації

Для створення стабільних трансфектантів, можна лінеаризувати вектор перед трансфекцією.

Хоча лінеаризація не може поліпшити ефективність трансфекції, це збільшує шанси того, що вектор не інтегрується по дорозі, що порушить структуру гена або елементів, необхідних для його експресію.

У таблиці нижче представлені унікальні сайти, які можуть використовуватися для лінеаризації.

Для селекції стабільних інтегрантів використовується зеацин

Карта вектора

Особливості вектора pBudCE4.1 Vector

Висновки

Обидва вектори належать до так званих човникових векторів, оскільки здатні експрасуватись як в еукаріотичних, так і в прокаріотичних системах. Вони містять як бактеріальні промотори, так і промотори ссавців. Це дозволяє напрацьовувати плазміну у бактеріальній культурі і синтезувати білковий продукт у еукаріотичних клітинах, де відбуваються пост трансляційні зміни і білок набуває нативної конформації.

Размещено на Allbest.ru