Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Міністерство освіти, науки, молоді та спорту України

Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича

факультет біології, екології та біотехнології

кафедра молекулярної генетики та біотехнології

Курсова робота

Вплив іонів міді, кадмію та заліза на активність та ізоферментний спектр гваякол пероксидази тютюну

Пентелюк Олена Сергіївна

Науковий керівник к.б.н., доцент І.І. Панчук

Завідувач кафедри

молекулярної генетики та біотехнології

доктор біологічних наук, професорР.А. Волков

Чернівці

2011

Зміст

Вступ

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Вплив важких металів на рослинний організм

1.2 Роль антиоксидантної системи в захисті рослин

1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази

Розділ 2. Матеріали та методи дослідження

2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами

2.2 Визначення активності гваякол пероксидази

2.3 Визначення вмісту білку

2.4 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази

2.5 Техніка безпеки праці в лабораторії

Розділ 3. Результати та їх обговорення

3.1 Зміна активності гваякол пероксидази рослин N. tabacum за дії стресу, викликаного іонами важких металів

3.2 Ізоферментний спектр водорозчинної фракції гваякол пероксидази за дії стресу, викликаного іонами важких металів

Висновки

Список використаної літератури

Вступ

В природних умовах на рослинні організми постійно діють біотичні та абіотичні стресові фактори довкілля. Це кліматичні та едафічні умови - надмірна кількість води, високі і низькі температури, дисбаланс поживних речовин та мінеральних елементів тощо. Крім природних чинників існують такі, що спричинені діяльністю людини - антропогенні фактори. Серед них - накопичення іонів важких металів, вплив яких на рослинний організм є важливим для вивчення [22, 25, 30].

Важкі метали (ВМ) - одні з основних хімічних забруднювачів довкілля через їх швидке накопичення у ґрунті та легкодоступність для рослин. Надлишкове надходження металів в екосистеми в результаті антропогенного впливу часто призводить до незворотних змін та порушення життєвоважливих функцій у більшості організмів [3]. Тому за останні роки підвищилась зацікавленість у вивченні їх впливу на рослинний організм. Іони металів необхідні для росту і розвитку рослинного організму, але в надмірних кількостях токсично впливають на нього. Цим вони зумовлюють зміни на всіх рівнях метаболізму, зокрема сприяють утворенню активних форм кисню (АФК). Такі процеси провокують відповідь антиоксидантної системи, яка складається з ферментативної та неферментативної ланок. Пероксидази та глутатіон редуктаза належать до ферментативної ланки захисту - відповідно знешкоджують пероксид водню та відновлюють окиснений глутатіон [24]. До неферментативної ланки належать аскорбат та глутатіон, що виконують функцію антиоксидантів [43]. Аскорбат знешкоджує супероксид аніон шляхом перетворення його у пероксид [27, 35], а глутатіон відновлює дисульфідні зв`язки у білках та здійснює детоксикацію гідропероксидів [15].

Для вивчення механізмів відповіді рослинної клітини на дію ВМ важливо оцінити різноманітні показники оксидативного стресу, такі як вміст відновленого і окисленого аскорбату, глутатіону, а також активність гваякол пероксидази і глутатіон редуктази.

Тому метою даної роботи було дослідити зміни активності гваякол пероксидази та ізоферментного спектру гваякол пероксидази рослин тютюну в умовах стресу, викликаного ВМ.

Відповідно до поставленої мети було сформовано ряд наступних завдань:

1. Визначення відносної активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 контрольних та стресованих рослин тютюну.

2. Визначення відносної активності солерозчинної фракції гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 контрольних та стресованих рослин тютюну.

3. Порівняння ізоферментного спектру гваякол пероксидази Nicotiana tabacum W38 за дії іонів міді, кадмію, заліза та за нормальних умов.

Розділ 1. Огляд літератури

1.1 Вплив важких металів на рослинний організм

В природі рослини знаходяться під впливом різноманітних стресових чинників [23], джерелом яких є зміни умов довкілля [19], такі як посуха, високі та низькі температури, затоплення, нестача чи надлишок мінеральних речовин, зокрема іонів металів [31], засолення, низькі температури, інтенсивне освітлення [22] тощо. Останнім часом у зв`язку з бурхливим промислово-технологічним прогресом у біосфері відбувається накопичення важких металів [6]. Стрес, викликаний іонами ВМ, впливає на габітус, анатомо-морфологічні, молекулярно-фізіологічні характеристики та розвиток рослин [23].

Важкими металами умовно називають хімічні елементи з атомною масою більше 50 а.о.м., які володіють властивостями металів та металоїдів. З хімічної точки зору термін «важкі метали» використовується для елементів густиною більше 5 г/см³ [29]. До ВМ належать: свинець, мідь, цинк, нікель, кадмій, кобальт, стибій, олово, бісмут, ртуть, платина, срібло, вольфрам, залізо, золото, марганець. До екологічно значущих важких металів відносять: свинець, кадмій, ртуть, стибій, марганець, нікель, кобальт, цинк, мідь, залізо, молібден [4].

Більшість ВМ життєво необхідні (есенціальні) для живих організмів. До них належать такі важкі метали як марганець, нікель, мідь, кобальт і цинк, які разом із залізом і молібденом входять до складу ферментів або їх активаторів [4]. У невеликих концентраціях вони необхідні для нормальної життєдіяльності рослин як мікроелементи. Мікроелементи беруть участь в ключових метаболічних процесах, активують багато ферментів, здійснюють перенесення електронів в енергоспряжених мембранах хлоропластів та мітохондрій у складі металоензимів [3].

Але підвищені концентрації ВМ у навколишньому середовищі можуть призводити до малоспецифічних фізіологічних і біохімічних змін [3]. Дослідження показують, що вплив іонів ВМ викликає підвищення активності ферментативної антиоксидантної системи [43]. Загальними проявами стресу, викликаного надлишком ВМ, визначають:

· зміни активності ферментів;

· пошкодження мембран;

· гормональний дисбаланс;

· дефіцит необхідних елементів;

· інгібування фотосинтезу;

· утворення активних форм кисню [3];

· перекисне окиснення ліпідів [5].

Рослини можуть і пристосовуватись до змінених умов зростання. Так, відомо, що, не маючи механізмів специфічного захисту до металів, протягом еволюції рослини розвинули стійкість до токсичної дії металів. На сьогодні відомі конститутивні механізми, які забезпечують стійкість до важких металів (білки теплового шоку - БТШ, ліганди, фітохелатини, металотіонеїни та ін.), які надають рослинам змогу акумулювати токсичні елементи в метаболічно інертних органах і органелах, або хелатувати, тобто переводити їх у фізіологічно безпечні форми. Проте універсального механізму, який би забезпечував стійкість рослини до кількох ВМ, не існує [5].

Кадмій. Кадмій - один з найбільших токсичних полютантів, знайдених у повітрі, воді та грунті, що не є есенціальним для рослин. Цей метал впливає на фотосинтезуючий, дихальний та азотний обмін, і як наслідок - зниження біомаси, пригнічення росту кореня, пагона, та навіть смерть рослини [33]. Кадмій зумовлює виникнення жовтих та коричневих плям на листках рису [15]. Це мобільний метал, який здатний до накопичення не лише в коренях та листках, а й у зерні [3]. Так, з літератури відомо, що протягом стресу кадмій інтенсивніше накопичується в молодих листках кукурудзи. В коренях накопичення відбувається повільніше, але концентрація металу набагато більша [4].

Кадмій пригнічує ростові процеси значно більше, ніж Zn²⁺ і Pb²⁺, оскільки за хімічним властивостями подібний до цинку і завдяки цьому заміщує його в металобілкових комплексах ферментів, інгібуючи їхні функції [4]. Відомо, що за впливу концентрацій кадмію 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5 мМ на проростки рапсу (Brassica napus) спостерігалось значне пригнічення їх росту порівняно з контрольними (не піддавались впливу металу), а на 4 тиждень досліду - загибель усіх піддослідних рослин [5].

Кадмій знижує поглинання кисню клітинами кореня та ізольованими клітинами тютюну. Він пригнічує транспорт електронів та протонів у мітохондріях, що може призводити до порушення роботи електрон-транспортного ланцюга. Фотосинтез також чутливий до дії кадмію, оскільки хлорофіл є мішенню для впливу іонів цього металу - кадмій здатний заміщувати магній в молекулі порфірину [20]. Також цей метал інгібує активність ключових ферментів гліколізу та пентозофосфатного окиснювального шляху, порушує водний баланс рослини. Викликає оксидативний стрес у рослинах шляхом генерування вільних радикалів та активних форм кисню [33].

Встановлено, що одноденний стрес кадмієм лише дещо зменшує активність гваякол пероксидази та глутатіон редуктази в коренях кукурудзи [33, 40]. Також цей метал може індукувати пошкодження хромосом, але ця його здатність менша порівняно зі свинцем, який вважається менш отруйним для клітин. Показано, що обробка насінин Crepis capillaries 0.01 М розчином CdCl₂ протягом години підвищувала частоту перебудов хромосом на 1.69% порівняно з контролем, а 27-годинна експозиція за тієї ж концентрації - лише на 0.21 %. Відома також здатність цього металу підвищувати частоту утворення мікроядер за поділу клітин коренів Vicia faba та Allium cepa за дії концентрацій 5 та 50 мкМ розчину CdCl₂ протягом 24 годин [4].

Мідь. Мідь посідає особливе місце серед інших металів - є обов'язковим елементом для росту і розвитку рослин, водночас її солі є відомими токсикантами. Як і інші есенціальні метали, мідь необхідна в невеликих кількостях, відіграючи вирішальну роль в процесах росту та розвитку рослин, оскільки є кофактором багатьох ферментів і бере участь в утворенні їх конформації [11, 18, 26, 39, 43].

Попри її фізіологічно зумовлену необхідність підвищення вмісту міді становить небезпеку для рослинного організму та його нормального функціонування тим, що може викликати руйнування ліпідів та білкових складових мембран. Останнім часом вона стає все більш небезпечною через інтенсивне використання її у фунгіцидах, пестицидах, добривах тощо [11, 18, 26, 39, 43].

Як і будь-який інший важкий метал, купрум токсичний навіть за низьких концентрацій. Відомо, що вплив міді викликає зменшення площі листової пластинки, сухої маси кореня та пригнічення росту рослин томату. Зміни у морфології кореня, такі як уповільнене видовження та збільшене формування бічних коренів також пов'язане з різким зменшенням активності оксидази індолілоцтової кислоти під дією високих концентрацій міді [11, 18, 26, 39, 42, 43].

Токсична дія міді проявляється в ультраруйнуванні структури та впливі на біохімічні процеси (зміни в перенесенні електронів в електрон-транспортному ланцюгу, пошкодження мембран тилакоїдів тощо). Це - перехідний метал, який бере участь в окисно-відновних реакціях. У надлишку вона може спричинити оксидативний стрес завдяки тому, що пошкоджує біомакромолекули шляхом зміни їх окисно-відновного потенціалу, виснажує пул глутатіону. Також порушує сульфгідрильний гомеостаз - вільні іони металу можуть незворотньо зв'язувати SH-групи каталітичних центрів ферментів. Зумовлює зміни проникності мембран, структури хроматину, синтезу білків, активності ферментів (зокрема, підвищує активність супероксиддисмутази, каталази, гваякол пероксидази). Також викликає пероксидне окиснення ліпідів та активує старіння клітин. Проявляє порівняно низьку мутагенну активність [11, 18, 26, 39, 43].

Показано, що в персика (P. сerasifera) під дією 100 µМ міді відбувалось суттєве підвищення активності каталази та супероксиддисмутази - активація їх генів. Це свідчить про те, що P. сerasifera є толерантним відносно купруму - здатний мобілізувати такі компоненти антиоксидантного захисту як каталаза та супероксиддисмутаза для пом'якшення негативного впливу надлишку міді [26].

Вплив іонів купруму протягом 8 днів за концентрації 50 µМ значно пригнічує активність гваякол пероксидази та аскорбат пероксидази у листках і коренях томату. Це компенсується підсиленням активності супероксиддисмутази та каталази [18].

Залізо. Залізо - есенціальний елемент для всіх рослин, оскільки виконує багато важливих біологічних функцій у клітинних процесах. Так, цей метал бере участь у процесі фотосинтезу, розвитку хлоропластів, входить до складу каталітичної групи багатьох клітинних редокс-систем, таких як гемопротеїни (цитохроми, каталаза, пероксидаза) і залізосірковмісні протеїни (фередоксин, аконітаза, супероксиддисмутаза), каталізує початкові етапи синтезу хлорофілу [3,28, 32].

Водночас ферум належить до ВМ і за низьких концентрацій може бути токсичним для рослин. Токсичність його пов'язана з високим рівнем поглинання коренями Fe²⁺ та транспортом у листки з висхідним током. У соняшника може виникати хлороз, викликаний заміною феруму іншими ВМ в активних центрах ферментів, зокрема міддю та кадмієм [26].

Надлишок іонів цього металу викликає утворення вільних радикалів. Відомо, що надлишок заліза викликає пригнічення процесів фотосинтезу в тютюну та сої внаслідок оксидативного стресу. В свою чергу, відбувається підвищення активності аскорбат пероксидази. Також за дії цього металу збільшується концентрація пероксиду водню, фенольних сполук та зменшується кількість хлорофілу і розчинних білків. У рису надлишок заліза викликає накопичення його в коренях, зменшення вмісту хлорофілів, розчинних білків, підвищену активність каталази, пероксидази [28].

Відомо, що іони заліза, вивільняючись з активного центру ліпоксигенази при виході поліненасичених жирних кислот зі складу мембрани, можуть знижувати активність антиоксидантних ферментів. Також іони цього металу можуть спричинювати акумуляцію пероксиліпідів у рослин [38]. Нестача заліза викликає інгібування синтезу хлорофілу, зменшення активності каталази та аскорбат пероксидази в рослин огіркової трави (Borago officinalis) [32].

Тобто ВМ індукують оксидативний стрес в клітинах та тканинах наступними шляхами:

1) переносять електрони в одноелектронних реакціях, які стимулюють утворення вільних радикалів. Т.з. перехідні метали (Fe, Cu, Mn та ін.), які мають неспарені електрони на їхніх орбіталях, приймають та віддають такі електрони на кисень, що провокує утворення АФК, їх взаємоперетворення та оксидоредукцію;

2) порушують метаболічні шляхи, особливо в тилакоїдних мембранах, як наслідок - утворюються вільні радикали та АФК;

3) змінюють активність антиоксидантних ферментів (пероксидази, каталази, супероксиддисмутази), які знешкоджують АФК;

4) накопичення ВМ зменшує пул низькомолекулярних антиоксидантних сполук, таких як глутатіон, який використовується для утворення фітохелатинів [29].

Відомо, що гомеостаз клітини підтримується рівновагою між численними метаболічними шляхами, які проходять у різних органелах. Різні стресові фактори можуть порушити цю рівновагу, що призводить до оксидативного стресу та як наслідок - надпродукції активних форм кисню [6, 23]. Вони виникають внаслідок переходу атомів кисню у збуджений стан або в окисно-відновних реакціях (ОВР). АФК утворюються в реакціях одно-, дво- та триелектронного відновлення кисню в результаті спонтанного та ферментативного окиснення, а також у фотоіндукованих реакціях. АФК поділяються на: вільнорадикальні частинки (супероксидний аніон-радикал (О₂^•-), гідроксильний радикал (ОН^•), пероксидні радикали (RO₂^•) та ін.) та нейтральні молекули (пероксид водню (Н₂О₂), синглетний кисень (¹О₂), озон (О₃) та ін.) [6].

За нормальних умов АФК постійно генеруються у хлоропластах, мітохондріях, мікросомах та плазматичній мембрані рослинної клітини [25]. Це - токсичні вторинні продукти аеробного метаболізму. Водночас вони виступають регуляторами росту, розвитку і захисту: здійснюють контроль та регулюють всі біологічні процеси в клітині - ріст, клітинний цикл, апоптоз, гормональну передачу сигналів, дихання, утворення АТФ, фотосинтез тощо [6].

Посилення утворення АФК - одна з неспецифічних реакцій живих організмів на дію біотичних та абіотичних стресових факторів. За дії абіотичних чинників вони пошкоджують важливі клітинні компоненти, такі як ДНК, білки та ліпіди: АФК викликають окислювальні пошкодження білків, що проявляється в окисненні -SH груп і FeS-центрів ферментів, появі фрагментації пептидних ланцюгів і підвищенні чутливості білків до протеаз. Вільні радикали здатні прямо взаємодіяти з ДНК, викликаючи пошкодження азотистих основ, дезоксирибози та появу нових ковалентних зв`язків (зшивок). Непряма дія активних форм кисню полягає у їх утворенні під час виходу з різних компартментів іонів кальцію та активації ними нуклеаз. Загальновідомим є те, що надлишок вільних радикалів кисню ініціює програму апоптозу клітини. Також вони відіграють роль сигнальних молекул, які активують гени ферментів, що беруть участь в захисних реакціях клітини [6].

Рослина здатна утилізувати АФК, включаючи їх в різноманітні метаболічні процеси, наприклад, під час утворення лігніну, опадання листя та квіток, старіння клітин, дозрівання плодів та цвітіння [19]. Також рослинні організми захищаються тим, що переводять вільні радикали в менш активні форми [22].

Згідно відомостей з літератури, причиною оксидативного стресу є не стільки продукція АФК, скільки порушення часово-просторового балансу між їх генерацією та видаленням [6].

1.2 Системи антиоксидантного захисту рослин

Життя в аеробних умовах вимагало створення системи захисту від змін, викликаних абіотичним стресом. Протягом еволюції рослини розвинули складну стрес-специфічну антиоксидантну систему для підтримання балансу та ефективного функціонування клітини [17, 34].

Компоненти антиоксидантної системи, пов`язані з контролем рівня АФК, чутливі до змін клітинного окисно-відновного балансу та здатні активувати необхідні метаболічні процеси [25]. Відомо, що існує дві ланки антиоксидантної системи: ферментативна та неферментативна. Супероксиддисмутаза, пероксидази (аскорбат-, глутатіон-, гваякол-), каталаза, глутатіон редуктаза, ферменти, що окиснюють та відновлюють аскорбат - до ферментативної. Токофероли, флавоноїди, каротиноїди, глутатіон та аскорбінова кислота належать до неферментативної ланки антиоксидантної системи. Обидві складові системи антиоксидантного захисту ефективно регулюють концентрацію АФК у клітині та організмі в цілому [10, 13, 19, 21, 23, 26].

Глутатіон редуктаза (GR, NADPH-залежна глутатіон оксидоредуктаза; ЕС 1.6.4.2.) - фермент, який відновлює глутатіон за рахунок окиснення НАДФН⁺.

GSSG + 2 H⁺ + 2 NADPH -> 2 GSH + 2 NADH⁺



NADPH регенерує з допомогою глюкозо-6-фосфат дегідрогенази та ізоцитрат дегідрогенази, які каталізують окиснення. В цьому випадку NADPH виступає ко-субстратом. Коли глутатіон редуктаза не здатна впоратися з надлишком глутатіону дисульфіду в клітині, клітина може активно утилізувати його за рахунок енергії АТФ. Також цей фермент включений до циклу знешкодження АФК у хлоропластах, які є дуже чутливими до оксидативного стресу [E. Kulikowska-Karpiсska, 2004; Suk-Yoon Kwon, 2001]. Глутатіон редуктаза та аскорбат формують аскорбат-глутатіоновий цикл - один з шляхів знешкодження пероксиду водню [23].

В A. thaliana було ідентифіковано два гени - gr 1 і gr 2, які кодують цитозольну та пластидну ізоформи глутатіон редуктази відповідно [21].

За дії теплового стресу (45С та вологості 30% протягом п'яти днів) активність GR зростала на 52.36% у термотолерантних проростків Brassica juncea, в той час як у чутливих до дії високих температур рослин цей показник становив всього 33.73% [36].

У листках дині (Cucumis melo L.) за дії сольового стресу також зростає активність GR [41].

Глутатіон (д-глутамілцистеїнілгліцин) - трипептид, у якого при розчиненні у воді підсилюються відновні властивості, що зумовлено наявністю тіольної групи. Синтезується з глутаміну, цистеїну та гліцину. В клітині глутатіон присутній у високих концентраціях в цитоплазмі, мітохондріях та ядрі (5-10 мМ), а в ендоплазматичному ретикулумі менше - всього 2 мМ. У мітохондріях глутатіон - основна складова з інших компонентів неферментативної антиоксидантної системи. Більше 99% глутатіону в клітині знаходиться у відновленій формі (GSH), і лише незначна частина - в окисненій (дисульфід, GSSG) [24].

Відновлений глутатіон (г-Glu-Cys-Gly, GSH) - завдяки унікальному окисно-відновному потенціалу та нуклеофільним властивостям здатний захищати клітину від токсичного впливу ксенобіотиків, вільних радикалів, засолення, закислення та ВМ (мідь, срібло, цинк, хром), з якими утворює стійкі комплекси - фітохелатини, таким чином нівелюючи прояв токсичності ВМ [15, 24].

Відомо, що генетично модифіковані рослини A. thaliana зі зниженим вмістом глутатіону, були більш чутливими до дії Cd через їх обмежену здатність до утворення фітохелатинів. Основна властивість глутатіону - знешкодження активних електрофільних сполук та роль своєрідного внутрішньоклітинного «відновного буферу» [15, 24].

Глутатіон - важливе джерело небілкових тіолів для рослинної клітини, тому відіграє вирішальну роль у її життєдіяльності. Цей трипептид - частина антиоксидантного аскорбат-глутатіонового циклу, який допомагає попередити або мінімізувати шкоду, спричинену АФК. Функція знешкодження АФК включає окиснення тіольних груп, переважно утворюючи глутатіон дисульфід (GSSG). Глутатіон бере безпосередню участь у реакції знешкодження та видалення ліпідних пероксидних радикалів у реакції нуклеофільного атакування гідропероксидів глутатіон-S-трансферазою [38]. Також бере участь у підтримці тіольних груп білків у відновленій формі, що важливо для збереження активності білків. Глутатіон може впливати на окисно-відновні умови певних білків через не ензиматичний обмін SH/SS груп. Тобто він поєднує ензиматичний та неензиматичний захист клітинних структур від окиснення [24].

L-аскорбінова кислота (вітамін С, аскорбат - AsA) - ендіольна форма д-лактону 3-кето-гулонової кислоти. Молекула кислоти складається з ендіольної групи [-(OH)=C(OH)-], відповідальної за окисно-відновні властивості. Вона володіє сильними кислотними властивостями, тому є важливим антиоксидантним фактором у водному середовищі [24].

Аскорбінова кислота - нестабільна сполука, чутлива до нагрівання, особливо в присутності кисню, та ВМ (заліза, міді). Вона окиснюється до L-дегідроаскорбату з допомогою вільнорадикального L-монодегідроаскорбату:

L-аскорбінова кислота - вільний аскорбільний радикал - L-дегідроаскорбат

У водному розчині молекула кислоти дуже нестабільна - лактонне кільце може спонтанно розгортатися, утворюючи дикетогулонову кислоту, гідроліз якої спричинює втрату активності. Дегідроаскорбат ефективно захищає мембранні ліпіди від переокиснення міддю [24].

Основна функція аскорбінової кислоти - участь в реакціях гідроксилювання, наприклад, гідроксилази, яка є кофактором у синтезі колагену і вимагає наявності аскорбату. В організмі рослин аскорбат відіграє роль антиоксиданту, що реагує з АФК та попереджує пошкодження ДНК. Разом з цитохромами а і с, піримідинами та флавіновими нуклеотидами, глутатіоном аскорбат формує відновну систему, яка регулює окисно-відновний потенціал клітини. Необхідний для регенерації б-токоферолу [24, 35].

Показано, що за низької концентрації (50 мМ) та присутності іонів транзитних металів аскорбат проявляє пероксидні властивості через встановлення оптимального співвідношення Fe³⁺/Fe²⁺ та Cu²⁺/Cu⁺, відновлення яких підтримує перекисне окиснення НАДФН⁺-залежних ліпідів. За вищої концентрації аскорбат інтенсивно відновлює Fe³⁺ до Fe²⁺, чим інгібує перекисне окиснення НАДФН⁺-залежних ліпідів [24]. Серед антиоксидантів аскорбат - ключова сполука у механізмі знешкодження АФК, особливо пероксиду водню. Реакція аскорбінової кислоти з Н₂О₂ може відбуватись прямо або каталізуватись APX. Відновлення її каталізується прямо відновленим фередоксином фотосистеми I та монодегідроаскорбат редуктазою (MDHAR), дегідроаскорбат редуктазою (DHAR) та GSH [23].

Тому аскорбат - важливий антиоксидант, що функціонує як термінальний антиоксидант аскорбат-монодегідроаскорбатної пари через його окисно-відновний потенціал, який є набагато меншим за потенціали більшості вільних радикалів. В оброблених тріазолом рослинах у листках та коренях збільшувався вміст аскорбату [37].

1.2.1 Загальна характеристика гваякол пероксидази

Гваякол пероксидаза належить до класу III - класичних пероксидаз рослин. Це гемвмісний глікопротеїн, що кодується величезною мультигенною родиною у рослин. Ці пероксидази глікозильовані, містять 4 дисульфідних зв'язки та 2 катіони кальцію на молекулу ферменту [2]. Залежно від характеру локалізації у рослинних клітинах розрізняють: розчинні (містяться у вакуолях та цитоплазмі), іонозв'язані (локалізовані в мембранах та клітинній стінці) та ковалентно зв'язані (знаходяться в основному в клітинній стінці) форми пероксидази. Кожна форма представлена численними ізоферментами. Пероксидази класу III кодуються великою кількістю генів - 73 генами в Arabidopsis thaliana L. та 138 генами в Oriza sativa L. [8].

Гваякол пероксидаза відіграє вирішальну роль у життєдіяльності клітини - бере участь у процесах, пов'язаних з лігніфікацією, розгалуженням полісахаридів клітинної стінки, окисненням фенольних сполук, видовженням клітин. Зміни (підвищення або зниження) активності цього ферменту можуть свідчити про зміни у процесах фотосинтезу, транспірації, дихання, газообміну [16].

За впливу холодового стресу +5С на 5-й день активність апопластичної POD набагато зростає у листках зимової пшениці [16].

Зростання активності розчинної пероксидази спостерігалося за короткочасного 42С теплового стресу у проростках сортів пшениці степового екотипу. Також відмічали підвищення термостабільності ферменту, пов'язане з індукованим синтезом нових ізоформ ферменту [8].

Підвищення активності гваякол пероксидази також може свідчити про наявність вільних іонів ВМ (Cu, Pb, Zn тощо), які не можуть зв'язатись з клітинними стінками чи накопичитись у вакуолях. Тобто активність POD може бути індикатором стресу, викликаного іонами ВМ та використовуватись для передбачення змін стану рослинного організму [16].

Дослідження показують, що 10-денний вплив 100 µМ концентрації міді викликає значне підвищення активності гваякол пероксидази у коренях Phaseolus vulgaris [43] та в стеблах проростків кукрудзи [13].

Рослини розвинули складні адаптивні механізми для захисту від негативного впливу іонів ВМ. Активну участь в механізмі захисту бере гваякол пероксидаза, механізми відповіді якої на стрес ВМ ми поставили за мету з'ясувати у цій роботі.

Розділ 2. Матеріали і методи

2.1 Рослинний матеріал та умови стресу, викликаного важкими металами

Рослинний матеріал та умови культивування

Дослідження проводились на рослинах Nicotiana tabacum лінії W38.

Для дослідження ролі гваякол пероксидази в умовах стресу, викликаного іонами міді, кадмію та заліза, використовували рослини Nicotiana tabacum лінії W38, вирощені у ґрунті за сталої температури + 26⁰С та 16-годинного світлового дня. Полив рослин здійснювали по мірі висихання ґрунту.

Умови стресу

Для забезпечення швидкого проникнення іонів ВМ рослинам 5-6 тижневого віку, що росли на ґрунті, у воді гострим лезом відокремлювали надземну частину від кореневої і місцем зрізу занурювали у 0,5х MS, в яке додавали іони Cu²⁺ або Cd²⁺ або Fe²⁺ до кінцевої концентрації 0.1, 0.5 та 5 мМ. Контролем слугували рослини, які поміщали у 0,5х MS без додавання металів. Стресову обробку рослин проводили у темряві протягом 2-х та 12-ти годин.

Після стресу рослини заморожували у рідкому азоті та зберігали в морозильній камері за температури -70⁰С для подальших досліджень.

2.2 Визначення активності гваякол пероксидази

Визначення активності гваякол пероксидази проводили за методом, описаним в літературі [12].

Для екстракції білку використовували екстракційний буфер, що містив: 50 мМ натрій-фосфатний буфер (рН 7.0), 0.25 мМ ЕДТА, 10% гліцерин, 2.5 мМ аскорбат. До екстракційного буферу додавали рослинний матеріал, розтертий у рідкому азоті, та центрифугували на центрифузі Biofuge pico при 14 000 g протягом 15 хв. Після центрифугування відбирали супернатант та до вимірювання активності зберігали на льоду. Осад ресуспендували у буфері, що містив: 1 М NaCl, 0.2 М натрій-фосфатний буфер (рН 7.0), дистильовану воду та інкубували за температури 30⁰С з постійним перемішуванням протягом 2-х годин. Після цього центрифугували на центрифузі Biofuge pico при 14 000 g протягом 15 хв і використовували супернатант для подальших досліджень.

Загальну активність гваякол пероксидази вимірювали спектрофотометрично за довжини хвилі л=470 нм. В реакційну пробу до 975 мкл реакційного буферу додавали 25 мкл білкового екстракту та спостерігали появу коричневого забарвлення. Активність ферменту виражали як зміну оптичної густини тетрагваяколу на 1 мг білка в пробі за 1 хв. Отримані результати перераховували у відсотки, приймаючи активність ферменту в інтактних рослинах за 100%. Кожний експеримент виконувався у 4 біологічних та 3 аналітичних повторностях. Одержані результати опрацьовували статистично з використанням критерію Стьюдента [7].

2.3 Визначення вмісту білку

Кiлькiсть бiлку визначали спектрофотометрично за методом Бредфорда [14]. Для цього до 995 мкл реактиву Бредфорда додавали 5 мкл білкового екстракту та перемішували. Суміш інкубували протягом 10 хв та проводили вимiрювання за довжини хвилi 595 нм. Кількість білку в екстракті визначали за допомогою калібрувального графіка, побудованого зі стандартним розчином білку. Як стандарт, використовували бичачий сироватковий альбумiн.

2.4 Визначення ізоферментного спектру гваякол пероксидази

Виявлення ізоферментних спектрів гваякол пероксидази в ПААГ в нативних умовах проводили за загальноприйнятою методикою, описаною в літературі [1].

Гель для електрофорезу готували як вказано в таблиці 1.

Таблиця 1

Приготування ПААГ для проведення електрофорезу білків у нативних умовах

Компонент	Розділяючий гель	Концентруючий гель
бідистильована вода, мл	5	3
1,5 М трис-HCI (pH=8,8), мл	2,5	-
0,5 М трис-HCI (pH=6,8), мл	-	1,25
30% АКА-БІС, мл	2,5	0,65
гліцерин, мг	1	0,7
10% АПС, мкл	50	45
ТЕМЕД, мкл	10	5
Загальний об'єм, мл	~12	~6

В кожну лунку гелю наносили в середньому по 10 мкг білку. Електрофорез проводили за напруженості протягом 3 годин. Після закінчення електрофорезу гелі протягом 15 хв інкубували в буфері, що містив 50 мМ натрій-ацетатний буфер (рН 5.0) та 0.08 М гваякол. Після цього гелі поміщали у 0.01% Н₂О₂.

В місцях локалізації гваякол пероксидази на гелі спостерігали появу коричневих смуг на прозорому фоні, що пов'язано з утворенням тетрагваяколу під дією ферменту.

2.5 Техніка безпеки праці в лабораторії

Вимоги безпеки під час виконання роботи

Під час роботи у лабораторії слід дотримуватись таких правил:

1) необхідно використовувати захисний одяг (лабораторний бавовняний халат, при необхідності гумові рукавички та окуляри або захисну маску; при роботі з дрібнодисперсними речовинами потрібно носити респіраторні маски);

2) двері під час роботи мають бути зачинені;

3) при роботі з вибуховими та легкозаймистими речовинами потрібно дотримуватись запобіжних заходів. Зберігати вибухові та горючі речовини необхідно в окремих приміщеннях у невеликих кількостях і в місцях, захищених від світла, вологи і пилу;

4) при роботі з леткими речовинами слід користуватись витяжною шафою.

У приміщеннях кафедри забороняється:

- працювати без нагляду співробітника або лаборанта;

- працювати у верхньому одязі;

- користуватися косметикою, палити, їсти, пити та зберігати продукти харчування;

- набирати реактиви у піпетки ротом;

- викидати в раковини скло, сміття, виливати концентровані кислоти, луги, органічні розчинники, легкозаймисті та горючі рідини;

- користуватись електронагрівачами, джерелами відкритого вогню (сірниками, запальничками тощо);

- переносити обладнання без дозволу зав. кафедрою або зав. лабораторією;

- користуватись зіпсованими електроприладами;

- самостійно проводити ремонт розеток, вимикачів, запобіжників;

- користуватись витяжними шафами з розбитим склом або непрацюючою вентиляцією;

- зберігати реактиви у посуді без етикеток.

Вимоги безпеки після закінчення роботи

По закінченні роботи кожний працівник зобов'язаний:

- привести до порядку робоче місце, прилади та апаратуру;

- виходячи останнім, зачинити вікна (кватирки), вимкнути світло, газ, перевірити чи вимкненні всі електроприлади та закриті крани, зачинити приміщення на ключ. Ключі передаються черговому охоронцю, про що робиться запис у журналі.

Надання першої медичної допомоги

У випадку ураження людини струмом перш за все потрібно вимкнути рубильники та викликати «Швидку допомогу» за номером 103.

При легких термічних опіках шкіру слід промити етанолом, а потім змастити гліцерином або вазеліном. При більш сильних опіках обпечене місце після промивання концентрованим розчином перманганату калію та етанолом необхідно змастити засобом від опіків (наприклад, пантенолом).

При опіках кислотами потрібно промити обпечене місце великою кількістю води протягом 10 хв., потім - 3% розчином соди.

При опіках лугами шкіру потрібно промити великою кількістю води, а потім нейтралізувати 1% розчином борної кислоти. Аміак майже не діє на шкіру, але при попаданні в очі може викликати сильне пошкодження і навіть сліпоту.

При отруєнні хімікатами слід терміново викликати лікаря або відправити потерпілого в найближчий лікарський заклад. Дуже важливо визначити, отруєння якою речовиною мало місце.

Перша допомога при будь-якому отруєнні полягає у швидкому видаленні отрути з організму, а якщо це неможливо, то у знешкодженні її в організмі. При потраплянні отрути в організм через рот необхідно викликати блювання. Проте це не можна робити, якщо постраждалий знаходиться у несвідомому або напівсвідомому стані, а також при різкому порушенні кровообігу. Щоб видалити отруту зі шлунку, слід дати випити велику кількість (5-8 склянок) теплої (30-35°С) води, після чого знову викликати блювання. Таке промивання шлунку слід повторити декілька разів. Якщо отрута відома, шлунок промивають чистою водою або розчинами речовин, що нейтралізують отруту. При отруєнні кислотами для промивання шлунку застосовують воду (використання розчину соди не допускається). При отруєнні лугами промивку проводять 2% оцтовою або лимонною кислотою. При отруєнні ртуттю або свинцем для промивання використовують молоко.

При отруєнні парами постраждалого слід вивести на свіже повітря. При послабленні дихання та нестачі кисню слід застосовувати штучне дихання і викликати лікаря.

При потраплянні хімікатів у очі їх необхідно негайно промити великою кількістю води.

При порізах у разі необхідності видалити з рани уламки скла або інших матеріалів, промити рану, краї рани продезинфікувати 3% спиртовим розчином йоду, а потім накласти стерильну пов'язку. При сильних кровотечах слід накласти вище рани джгут і викликати лікаря або направити постраждалого у лікарню [9].

Розділ 3. Результати та їх обговорення

гваякол пероксидаза тютюн стрес

З літератури відомо, що іони ВМ впливають на активність антиоксидантних ферментів, що пов'язано зі змінами в експресії відповідних генів на рівні транскрипції та сплайсингу. У більшості досліджень вивчався довготривалий вплив іонів ВМ - від 1 до 40 діб. Проте такий підхід дозволяє дослідити лише механізми пізньої відповіді рослин на стрес.

Для з'ясування механізмів ранньої відповіді рослинної клітини на гострий стрес, ми використали дизайн експерименту, який забезпечував швидке проникнення іонів міді, кадмію та феруму у клітини листків. Для цього у рослин видаляли кореневу систему, яка, як відомо, виконує роль бар'єру та затримує надходження ВМ у пагін.

Для дослідження використовували рослини N. tabacum, що вирощувалися на ґрунті до стадії 4-5 листків.

3.1 Зміна активності гваякол пероксидази рослин N. tabacum за дії стресу, викликаного важкими металами

Проведені дослідження показали, що активність водорозчинної та солерозчинної фракцій гваякол пероксидази залежить не лише від концентрації та іону ВМ, а також від тривалості стресу.

Експериментальні дані, отримані стосовно зміни активності водорозчинної та солерозчинної фракцій гваякол пероксидази у рослин N. tabacum за дії стресу, викликаного іонами кадмію, міді та заліза, представлені на рис. 3.1-3.4.

В результаті проведених досліджень було встановлено, що інкубування пагона рослин протягом 2-х годин в присутності 0.1 та 0.5 мМ хлориду кадмію призводило до падіння активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази на 50% та 27% відповідно відносно контролю. Проте в умовах більш тривалого 12-годинного стресу за дії 0.5 мМ іонів кадмію у тютюну спостерігалось зростання активності ферменту - на 21% відносно контролю (рис. 3.1).

Активність солерозчинної фракції POD у листках тютюну зростала на 43% відносно контролю за дії концентрації іонів кадмію 0.5 мМ протягом 2-годинного стресу, в той час як за інших концентрацій за дії 2-годинного стресу залишалась незмінною. Подібний ефект спостерігався за 12-годинного стресу за дії концентрації хлориду кадмію 0.5 та 5 мМ - активність солерозчинної фракції POD зростала відповідно на 57% і 36% відносно контролю (рис. 3.1).

Рис. 3.1 Активність гваякол пероксидази у листках N. tabacum за дії 0.1, 0.5 і 5 мМ хлориду кадмію протягом 2 та 12 годин

У дослідженнях, проведених з проростками рапсу (Brassica napus) - у 8-денних рослин за дії низьких концентрацій хлориду кадмію (1 і 2.5 мМ) також відбувалось падіння пероксидазної активності, в той час як за дії вищих концентрацій кадмію (5 і 7.5 мМ) - зростання активності ферменту порівняно з контролем [5].

Слід зазначити, що у дослідженнях, проведених з проростками редиски (Raphanus sativus L.) 40-денного віку, активність гваякол пероксидази зростала пропорційно до збільшення концентрації хлориду кадмію і досягала максимуму за найвищої концентрації 50 ppm [20].

Тобто втрата активності гваякол пероксидази за дії стресу, викликаного ВМ, може призводити до зростання концентрації пероксиду водню та посилення оксидативного стресу в клітині. Падіння активності водорозчинної фракції POD за 2-годинного стресу може бути викликане оксидативною інактивацією ферменту [43]. А підвищена активність водорозчинної фракції POD за 12-годинного впливу та солерозчинної фракції POD за 2- та 12-годинного стресу порівняно з контролем, свідчить про адаптацію рослини до стресових умов.

Інкубування рослин протягом 2-х годин в присутності іонів міді у концентрації 0.1 мМ призводило до зниження активності водорозчинної фракції POD на 23% відносно контролю. Натомість 2-годинний вплив концентрації іонів міді 0.5 мМ викликав підвищення активності ферменту на 28% відносно контролю. 12-годинний стрес концентраціями хлориду міді 0.1 мМ та 5 мМ також викликав підвищення активності ферменту відповідно на 44% та 97% відносно контролю (рис. 3.2).

В умовах 2-годинного стресу спостерігалось зростання активності солерозчинної фракції POD відносно контролю. Максимальне підвищення активності ферменту на 24% відмічали за дії 0.1 мМ купруму. За впливу довготривалого стресу іонами міді також відбувалось підвищення активності солерозчинної фракції POD відносно контролю. Дія концентрації 0.5 мМ викликала найбільше зростання активності - на 31% відносно контролю (рис. 3.2).



Рис. 3.2 Активність гваякол пероксидази у листках N. tabacum за дії 0.1, 0.5 і 5 мМ хлориду міді протягом 2 та 12 годин

Проводились дослідження, присвячені вивченню 7-денного впливу іонів міді на проростки кукурудзи (Zea mays L.). Було помічено, що значні зміни активності гваякол пероксидази відбувались за дії 100 µМ концентрації CuSO₄. За цієї концентрації активність ферменту збільшувалась на 46% порівняно з контролем [13].

Подібне дослідження полягало у з'ясуванні впливу CuSO₄ на активність гваякол пероксидази суспензійної культури N. tabаcum cv. Bright Yellow 2. На відміну від вищенаведених результатів відносно впливу купруму іони міді концентрацією 10 µМ викликали 30% зниження активності ферменту протягом першої години експерименту та низькі значення активності протягом наступних годин експерименту [44].

Отримані дані свідчать про те, що мідь, порівняно з кадмієм, менш токсична, а тому не викликає інактивації ферменту. З іншого боку, гваякол пероксидаза може бути менш чутлива до токсичної дії міді через те, що активний центр ферменту залишається неушкодженим, чого не спостерігається у випадку з кадмієм, який може заміняти залізо в металобілковому комплексі.

Інкубування надземної частини рослин протягом 2-х годин в присутності 0.1 мМ FeNaЕДТА призводило до підвищення активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази - на 57%, а в присутності 5мМ FeNaЕДТА - до зниження на 29% відносно контролю. В умовах тривалішого 12-годинного стресу за дії 0.5 мМ іонів заліза спостерігалось підвищення активності ферменту на 104% відносно контролю (рис. 3.3).

Рис. 3.3 Активність водорозчинної фракції гваякол пероксидази у листках N. tabacum за дії 0.1, 0.5 і 5 мМ NaЕДТА та FeNaЕДТА протягом 2 та 12 годин

У випадку солерозчинної фракції гваякол пероксидази спостерігалась загальна тенденція до підвищення активності ферменту за дії як 2-, так і 12-годинного стресу. Зокрема, максимальні зростання активності відмічались за впливу 0.1 та 0.5 мМ FeNaЕДТА в умовах 2-годинного стресу - відповідно на 25% та 41%, а за умов 12-годинного стресу - відповідно на 97% та 31% відносно контролю (рис. 3.4).

Рис. 3.4 Активність солерозчинної фракції гваякол пероксидази у листках N. tabacum за дії 0.1, 0.5 і 5 мМ NaЕДТА та FeNaЕДТА протягом 2 та 12 годин

Було проведено дослідження, в якому перевіряли ефект впливу іонів заліза на суспензійну культуру клітин тютюну (N. tabаcum cv. Bright Yellow 2). За дії 5 µМ концентрації FeSO₄ протягом перших двох годин експерименту активність гваякол пероксидази не змінювалась - була близька до контролю. Зате на третю годину відмічали падіння активності на 20%, а на четверту - підвищення на 35% відносно контролю [44].

Зниження активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази за дії 5мМ протягом 2 годин та подальше підвищення активності ферменту може бути пояснене тим, що спершу пероксидаза була інактивована за рахунок токсичної дії заліза, а далі відбулась адаптація рослини до умов стресу. Постійна підвищена активність солерозчинної POD, імовірно, зумовлена тим, що дана фракція чутлива до концентрації іонів заліза в клітині, оскільки відомо, що за нестачі заліза в клітині активність мембранозв'язаної гваякол пероксидази значно знижується [32].

З огляду на вищенаведені дані можна припустити, що вплив іонами ВМ підсилює відповідь антиоксидантної системи в рослин. Мінливість активності гваякол пероксидази пояснюється захисною реакцією на вміст АФК у клітині. З іншого боку, можливо, ця мінливість з'являється внаслідок того, що інші ферменти антиоксидантної системи беруть на себе функцію знешкодження пероксиду водню в клітині, наприклад, каталаза. Це свідчить про те, що оксидативний стрес може ініціювати шлях передачі сигналу активації ферментів антиоксидантної системи [44].

3.2 Ізоферментний спектр водорозчинної фракції гваякол пероксидази за дії стресу, викликаного іонами важких металів

Відомо, що у рослин гваякол пероксидаза кодується великою мультигенною родиною. Для з'ясування того, як іони ВМ впливають на активність різних ізоформ гваякол пероксидази, ми дослідили зміни в ізоферментних спектрах гваякол пероксидази за дії різних концентрацій іонів кадмію, міді та феруму.

На електрофореграмах гваякол пероксидази чітко виділяються 2 ізоформи, інтенсивність яких залежала від концентрації токсиканта та тривалості стресової обробки (рис. 3.5-3.8). Електрофореграми підтверджують результати вимірювань активності гваякол пероксидази за дії стресу, викликаного іонами ВМ.

Рис. 3.5 Електрофореграма ізоферментних спектрів POD у листках N. tabacum за дії 0.1; 0.5 та 5 мМ хлориду кадмію протягом 2 та 12 годин

За дії іонів міді та кадмію концентрацією 5мМ та 2-годинного стресу спостерігалось збільшення інтенсивності ізоформ.

Рис. 3.6 Електрофореграма ізоферментних спектрів POD у листках N. tabacum за дії 0.1; 0.5 та 5 мМ хлориду міді протягом 2 та 12 годин

Це підтверджується літературними даними, де було показано, що інтенсивність ізоформ гваякол пероксидази збільшується відповідно до збільшення концентрації металу (кадмію) у середовищі [20].

Рис. 3.7 Електрофореграма ізоферментних спектрів POD у листках N. tabacum за дії 0.1; 0.5 та 5 мМ NaЕДТА протягом 2 та 12 годин

За дії концентрації 0.5 мМ FeNaЕДТА протягом 12-годинного стресу спостерігається значне збільшення інтенсивності ізоформ. Значне зменшення відбувалось за 5 мМ концентрації та 2-годинного впливу іонів заліза.

Рис. 3.8 Електрофореграма ізоферментних спектрів POD у листках N. tabacum за дії 0.1; 0.5 та 5 мМ FeNaЕДТА протягом 2 та 12 годин

Отже, в листках тютюну нами ідентифіковані дві ізоформи POD, які реагують на зміну концентрації досліджуваних іонів кадмію, міді та феруму.

Висновки

1. Інкубування рослин в присутності іонів кадмію, міді та феруму призводило в основному до зниження активності водорозчинної фракції гваякол пероксидази в умовах 2-годинного стресу, а за 12-годинного стресу - до підвищення активності ферменту порівняно з контролем. Це свідчить про те, що за дії тривалішого стресу рослина переходила в стадію адаптації.

2. Активність солерозчинної фракції гваякол пероксидази залишалась на підвищеному рівні за будь-яких концентрацій та тривалості стресових умов відносно контролю. Незначне падіння активності ферменту спостерігалось лише за дії 2-годинного стресу іонами кадмію концентраціями 0.1 та 5 мМ. Ці дані підтверджують те, що реакція мембранозв'язаної фракції гваякол пероксидази є неспецифічною.

3. За проведеної стресової обробки у рослин тютюну виявлено 2 ізоформи гваякол пероксидази, які реагують на зміну концентрації токсиканта та тривалість його дії.

Список використаної літератури

1. Гавриленко В.Ф. Большой практикум по физиологии растений / В.Ф. Гавриленко, М.Е. Ладыгина, Л.М. Хандобина. - М.: Высшая школа, 1975. - 392 с.

2. Газарян И.Г. Особенности структуры и механизма действия пероксидаз растений / И.Г. Газарян, Д.М. Хушпульян, В.И. Тишков // Успехи биологической химии. - 2006. - Т. 46. - C. 303-322.

3. Головко Т. Тяжелые металлы в окружающей среде и растительных организмах / Т. Головко, Е. Гармаш, С. Скугорева // Вестник ИБ. - 2008, № 7. - С. 2-7.

4. Евсеева Т.И. Закономерности индукции цитогенетических эффектов у растений при действии тяжелых металлов / Т. Евсеева, Е. Белых, Т. Майстренко // Вестник института биологии Коми НЦ УрО РАН. - 2005. - Т. 87, №1. - С. 4-13.

5. Колесниченко В.В. Изучение влияния разных концентраций кадмия на этиолированные проростки пшеницы (Triticum aestivum L.) и рапса (Brassica napus) / В.В. Колесниченко // J. of stress physiology & biochemistry. - 2009. - Vol. 5, № 1-2. - P. 16-31.

6. Колупаев Ю.Е. Активные формы кислорода в растениях при действии стрессоров: образование и возможные функции / Ю. Е. Колупаев // Вісник харківського національного аграрного університету: Серія біологія. - 2007. - Т. 12, № 3. - C. 6-26.

7. Лакин Г.Ф. Биометрия: изд. 4-е перераб. и доп. / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

8. Обозный А.И. Влияние кратковременного нагрева на активность и термостабильность растворимой пероксидазы корней пшеницы разных экотипов / А. И. Обозный, Т. О. Ястреб, Ю. Е. Колупаев, В. Н. Попов, Р. В. Криворученко // Вісник харківського національного аграрного університету: Серія біологія. - 2010. - Т. 20, № 2. - C. 61-68.

9. Панчук І.І. Практикум з молекулярної генетики. Навчальний посібник / І.І. Панчук, Р.А. Волков. - Чернівці: Рута. - 2007. - 120 с.

10. Abedi T. Antioxidant enzyme changes in response to drought stress in ten cultivars of oilseed rape (Brassica napus L.) / T. Abedi, H. Pakniyat // Czech j. genet. plant breed. - 2010. - Vol. 46, № 1. - P. 27-34.

11. Ahmed A. Antioxidant enzymes as bio-markers for copper tolerance in sunflower (Carthamus tinctorius L.) / A. Ahmed, A. Hasnain, S. Akhtar, A. Hussain, Abaid-ullah, G. Yasin, A. Wahid, S. Mahmood // African j. of biotech. - 2010. - Vol. 9, № 33. - P. 5441-5444.

12. Amako K. Separate assays for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate peroxidase in plants / K. Amako, G. Chen, K. Asada // Plant cell physiol. - 1994. - Vol. 35. - P. 497 - 504.

13. Bouazizi H. Effects of copper excess on growth, H₂O₂ production and peroxidase activities in maize seedlings (Zea mays L.) / H. Bouazizi, H. Jouili, E. El Ferjani // Pakistan j. of biol. sciences. - 2007. - Vol. 10, № 5. - P. 751-756.

14. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Analyt. biochem. - 1976. - Vol. 72. - P. 248-254.

15. Cai Y. Genotypic dependent effect of exogenous glutathione on Cd-induced changes in cadmium and mineral uptake and accumulation in rice seedlings (Oryza sativa) / Y. Cai, L. Lin, W. Cheng, G. Zhang, F. Wu // Plant soil environ. - 2010. - Vol. 56, № 11. - P. 516-525.

16. Зakmak T. Effects of putrescine and low temperature on the apoplastic antioxidant enzymes in the leaves of two wheat cultivars / T. Зakmak, Ц. Atэcэ // Plant soil environ. - 2009. - Vol. 55, № 8. - P. 320-326.

17. Chinnusamy V. Molecular genetic perspectives on cross-talk and specificity in abiotic stress signalling in plants / V. Chinnusamy, K. Schumaker, J.-K. Zhu // Journal of experimental botany. - 2003. - Vol. 55, № 395. - P. 225-236.

18. Cui X.M. The investigation of the alleviated effect of copper toxicity by exogenous nitric oxide in tomato plants / X.M. Cui, Y.K. Zhang, X.B. Wu, C.S. Liu // Plant soil environ. - 2010. - Vol. 56, № 6. - P. 274-281.

19. D№browska G. Characteristics of the plant ascorbate peroxidase family / G. D№browska, A. Kata, A. Goc, M. Szechyсska-Hebda, E. Skrzypek // Acta biologica cracoviensia: Series Botanica. - 2007. - Vol. 49, № 1. - P. 7-17.

20. El-Beltagi H. S. Response of antioxidative enzymes to cadmium stress in leaves and roots of radish (Raphanus sativus L.) / H. S. El-Beltagi, A. A. Mohamed, M. M. Rashed // Not. sci. biol. - 2010. - Vol. 2, № 4. - P. 76-82.