Изучение генетического разнообразия диплостом (Trematoda: Diplostomidae) – паразитов рыб и птиц

Рисунок 6. Метацеркария Diplostomum sp. (ув. x150).

Первый этап паразитирования диплостом в дополнительном хозяине начинается с момента внедрения церкарии в хозяина и завершается ее миграцией. В этот момент трематода носит название диплостомула. Диплостомула - уже не церкария, поскольку не имеет хвоста, а средой её обитания является живой организм хозяина, но еще и не метацеркария, поскольку в морфологическом отношении она не отличается от церкарии, а средой ее обитания являются любые органы и ткани, кроме органа стационарного обитания метацеркарии (глаза, головной мозг). Достигнув окончательного места паразитирования в хозяине, она прекращает миграцию. Только с этого момента ее можно называть метацеркарией. Инвазионные метацеркарии впадают в состояние стадийного гипобиоза и характеризуются большой продолжительностью жизни. В отдельных случаях срок их жизни может превышать срок жизни своих хозяев, в связи с чем на протяжении всего периода жизни хозяина наблюдается непрерывный процесс увеличения его зараженности. Стимулом к дальнейшему развитию метацеркарий служит их попадание в организм дефинитивного хозяина, где они заканчивают развитие и превращаются в половозрелую мариту.

1.1.2 Экология трематод рода Diplostomum

Широкое географическое распространение, а также богатство и видовое разнообразие трематод, в том числе и рода Diplostomum, обусловлено сложным гетероксенным жизненным циклом, включающим в себя несколько хозяев. Прежде всего, это связано с обилием первых промежуточных хозяев - моллюсков. Чаще всего они встречаются в мелководных хорошо прогреваемых участках водоемов с обильными зарастаниями мелколиственными водными растениями (роголистник, элодея, хара, рдесты и др.). Так как церкария эндотрофна и ее "свободная жизнь" в воде, в зависимости от температуры водоема сильно ограничена, она зачастую проникает в рыбу со сходными условиями обитания первых хозяев [14].

На стадии метацеркарии большинство из известных диплостом паразитируют в глазах, реже в мозге рыб и круглоротых. Головной мозг используется метацеркариями представленного рода крайне редко. В нем на сегодня зарегистрировано всего шесть видов, причем почти все они обладают узкой гостальной специфичностью [2, 3, 5]. В некоторых источниках помимо указанных мест, они могут локализоваться и на поверхности внутренних органов, в мускулатуре и под кожей рыб [2]. Питаются хрусталиковыми волокнами или продуктами их лизиса, другие - пигментным слоем ретины. А.А. Шигин (1996) обозначает глаз как местообитание паразитов термином «гостальный биотоп», выделяя в нем шесть эндостаций (микрониши); диплостомиды занимают четыре из них - хрусталик, жидкие среды, внутренние оболочки, стекловидное тело глаза.

Локализация именно в этих местах не случайна. В ряде экспериментов было показано, что манипулирование поведением рыбы ведет к повышению доступности её хищникам, которые служат паразиту дефинитивным хозяином. Воздействие возбудителей диплостомозов направлено главным образом на изменение реакций хозяина на искаженное восприятие внешних раздражителей, то есть на изменение стереотипа его поведения. На примере трематоды D. spathaceum, метацеркарии которой развиваются в хрусталике глаза рыбы, показано, что вызванные паразитом модификации защитного поведения не только точно синхронизированы с развитием паразита, но и происходят по-разному в разных биотопах. У молоди лососевых рыб, обитающей в толще воды, нарушается комплекс стайного оборонительного поведения; у тех же рыб, ведущих территориальный образ жизни на мелководных участках, нарушается индивидуальное оборонительное поведение, связанное с использованием убежищ [15].

Особенности топической приуроченности, трофических связей, экологии и миграции птиц, играют важную роль в реализации жизненных циклов диплостом, а также расширению границ их естественного ареала. В зависимости от типа питания птиц варьирует и разнообразие паразитов в одной особи.

Наибольшим разнообразием трематодофауны характеризуются семейства Утиных и Чайковых, так как, многие из них являются полифагами (кряква, серебристая чайка). В то время как ихтиофаги имеют более специфичную фауну паразитов (крохаль, клуша). Число видов диплостом, приуроченных к остальным семействам водоплавающих птиц, гораздо меньше. Наиболее узкоспецифичную фауну трематод имеют Пастушковые, что связано с особенностями их рациона питания.

Широкий межпопуляционный обмен и обширные территориальные связи птиц могут иметь решающее значение для формирования современного облика фауны рода Diplostomum [16].

1.1.3 Проблемы идентификации и таксономии диплостом

На протяжении всего времени изучения трематод рода Diplostomum одна из главных проблем являлась видовая идентификация паразита. К началу 60-х годов возбудителем всех диплостомозов пресноводных рыб России и сопредельных государств считался один вид - D. spathaceum, тогда как у рыбоядных птиц этой же фауны к тому времени было зарегистрировано 13 видов этого рода [17]. Систематика диплостом и сегодня находится в спорном положении по нескольким причинам: представители данного рода обладают высокой морфологической пластичностью, что затрудняет идентификацию на всех стадиях жизненного цикла, а также вследствие того факта, что стадии жизненного цикла изучались и классифицировались изолированно и обособленно друг от друга [18]. Зачастую, большинство исследователей при паразитологическом обследовании рыб и птиц указывают локализацию паразита предельно упрощенно: «хрусталик», «стекловидное тело глаза», «тонкий кишечник». В таблице 1 (приложение) собраны морфологические данные из шести источников, охватывающие период с 1986 года по 2013 год. Трудности в классификации и идентификации диплостом не раз приводила к биологическому парадоксу: количество зарегистрированных и описанных паразитов рода Diplostomum у водно-болотных птиц значительно превышает число видов в промежуточных хозяевах: рыбах и моллюсках. Так, по последним данным из Чехии и Словакии соотношение видов диплостом в рыбоядных птицах, рыбах и моллюсках составляет 9:3:2 [19, 20, 21, 22]. Эти показатели свидетельствуют о том, что и хозяин, и пространственное распространение D. spathaceum были завышены (50 видов хозяев), и что большую часть видов, вероятно, пропустили из-за невозможности идентифицировать или ошибки [19]. В научно-исследовательской литературе по изучению зараженности организмов паразитами представители рода Diplostomum до сих пор указываются как Diplostomum sp. и до вида не определяются. Сложности идентификации и видовой классификации церкарий и метацеркарий являются серьезными препятствием для оценки разнообразия видов диплостом, фактической роли в популяциях рыб, а также для экологического мониторинга, для углубления знаний биологии паразита и эволюционных аспектов отношений паразит-хозяин изучаемого рода [8].

1.2 Геномная вариабельность рДНК трематод

В геноме трематод, как и у всех эукариот, имеется кластер рибосомной ДНК (рДНК), представляющий собой многократно тандемно повторенные транскрипционные единицы (опероны), которые разделяются межгенными спейсерами (NTS). Каждый оперон состоит из генов рибосомных РНК (18S, 5.8S, и 28S), внутренних (ITS1, ITS2) и внешних (ETS) транскрибируемых спейсеров, которые транскрибируются вместе и затем расщепляются на отдельные молекулы [23]. Молекулы рРНК, кодируемые 18S, 5.8S и 28S генами, становятся структурными частями рибосом. Эти гены высоко консервативны и универсальны, то есть имеются у всех таксономических групп. Последовательности 18S, 5.8S и 28S рДНК позволяют проводить филогенетические сравнения на разных таксономических уровнях, включая представителей разных царств. Считается, что различия между этими генами прямо пропорциональны филогенетическим расстояниям, степени эволюционного родства [23].

По сравнению с этими генами, транскрибируемые спейсеры ITS1 и ITS2 значительно более вариабельны, так как их транскрипты вырезаются из рРНК и не участвуют в образовании рибосомы. Нуклеотидные последовательности ITS полезны для таксономических сравнений близко родственных видов и родов.

Анализ многочисленных данных по секвенированию рДНК трематод выявил различия в длине и структуре ITS1 и ITS2, что редко позволяет выровнять эти последовательности на уровне семейств и более высоких таксонов [23]. В особенности это касается ITS1, для которого нередко наблюдается внутривидовая и даже индивидуальная изменчивость. Последовательности ITS1 содержат различные повторы, вероятные промоторные сайты, горячие точки рекомбинации. Использование более консервативного 3`-конца ITS1 вполне возможно для оценки филогенетических связей даже крупных таксонов [23]. В то же время, два вида D. spathaceum и D. parviventosum, между которыми существуют четкие морфологические отличия на всех основных стадиях жизненного цикла, имели идентичные последовательности ITS1 рДНК [24]. И наоборот, два криптических вида из группы Trichobilharzia franki имели одинаковые последовательности ITS2 и отличались по другим локусам (ITS1 рДНК, cox1).

Внутривидовая изменчивость ITS2 мала или вообще отсутствует у большинства изученных трематод. Так, для представителей рода Ichthyocotylurus внутривидовая изменчивость ITS2 составляет всего лишь 1.0%, в то же время межвидовая достигает 5.4% [25].

Таким образом, последовательности кластера ITS позволяют достаточно надежно идентифицировать и дифференцировать близкородственные и некоторые криптические виды организмов, в частности, трематод, а также выявлять между ними филогенетические связи.

1.3 Геномная вариабельность митохондриальной ДНК трематод

На сегодняшний день без молекулярно-генетических методов практически невозможно представить дальнейшее развитие таких областей знания, как систематика, популяционная экология, филогенетика. При этом особенно популярным становится анализ изменчивости митохондриальной ДНК (мтДНК). В отличие от ядерной ДНК, у мтДНК передача информации осуществляется от предка к потомку только по материнской линии, нет интронов, большое количество копий и минимальный уровень рекомбинации. Она обладает высокой скоростью эволюции и значительным внутривидовым полиморфизмом, а также селективно нейтральной или почти нейтральной природой мутаций [26].

Митохондриальная ДНК эукариотических организмов сильно варьирует по размеру и генному составу. У животных она почти всегда представлена кольцевой молекулой и составляет в среднем 15-20 тыс. пар нуклеотидов [23]. Размер митохондриального генома трематод составляет 13,5-16,9 тыс п.н. [27].

Молекулярно-генетические маркёры используются для установления филогенетических взаимоотношений между разными таксонами трематод и плоских червей вообще. Помимо молекулярной филогении, ядерные и митохондриальные маркёры используются и для видовой идентификации. Что касается митохондриальных маркёров, то из-за высокой скорости эволюции генома митохондрий по сравнению с ядерным (примерно в 5-10 раз), филогенетический анализ их последовательностей подходит в большей степени для относительно недавно дивергировавших таксонов [28]. И по ряду причин лучшим кандидатом является участок баркода cox1. Cox1 плоских червей имеет более высокую изменчивость по сравнению с ITS- регионом и может быть использован как более удобный маркер для детекции видов [29]. Область баркода (первые 650 пар нуклеотидов гена cox1) как было доказано, подходит для идентификации большого набора таксонов животных и для выявления разнообразия криптических видов [30]. Специфичные для диплостомид праймеры, фланкирующие область баркода cox1 были разработаны недавно и используются для создания большой библиотеки баркода для североамериканских диплостом [31]. Результаты этих первых молекулярных исследований метацеркарий из рыб в реке Св. Лаврентия (Канада) выявили гораздо более высокое видовое разнообразие, чем предполагалось ранее только при морфологическом определении [32, 33]. Такие же результаты были получены в Исландии: собранные образцы из трех озер, после проведенной молекулярно-генетической идентификации увеличили видовое богатство на 200% [7]. Но контраст нехватки данных при сравнении исследований в Северной Америке и Европе сохраняется, что затрудняет крупномасштабный скрининг естественных диплостомных инфекций в промежуточных хозяевах [8].

Использование маркеров мтДНК коренным образом меняет ранг операционной таксономической единицы, в отличие от традиционной систематики, где таковой является вид, и от популяционной биологии, оперирующей с популяциями, в филогеографии сравнимое значение приобретает уже особь.

Глава II. Материалы и методы исследования