Диагностика мутаций гена BRCA1 методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в лечении рака молочной железы

Размещено на http://www.allbest.ru/

15

Министерство образования и науки российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Кубанский государственный университет» (ФГБОУ ВПО «КубГУ»)

Кафедра биохимии и физиологии

Заведующий кафедрой

Канд. биол. наук, доцент

В.В. Хаблюк

Выпускная квалификационная работа бакалавра

ДИАГНОСТИКА МУТАЦИЙ ГЕНА BRCA1 МЕТОДОМ ПЦР В ЛЕЧЕНИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Работу выполнил А.И. Скорикова

Факультет Биологический

Направление Биология 020200.62

Научный руководитель

доцент, канд. биол. наук М.Л. Золотавина

Нормоконтролёр канд. биол. наук, доцент Н.Н. Улитина

Краснодар 2013

РЕФЕРАТ

Квалификационная работа представлена на 30 листах печатного текста и содержит три главы, пять таблиц, шесть рисунков. В работе использовались 24 литературных источника.

Ключевые слова: РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ, СЕМЕЙНЫЙ РАК МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И РАК ЯИЧНИКОВ, ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ, МУТАЦИЯ В ГЕНЕ BRCA1.

Работа выполнялась на базе генетической лаборатории Краснодарского онкологического диспансера №1 в период с 26.06.12 по 26.05.13 гг.

Целью исследования было определение закономерностей мутации гена BRCA1 в лечении рака молочной железы.

В данной работе описывается метод ПЦР в реальном времени, его использование в диагностике различных заболеваний, в том числе и определение мутаций в генах, приводящих к возникновению рака молочной железы и рака яичника. В нашей работе была использована ДНК, выделенная из крови 79 больных с диагнозами рак молочной железы и рак яичника. Из них 70 человек имели спорадическую форму заболеваний, что составило 87% и девять человек - наследственную форму - 13%.

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1. Аналитический обзор

1.1 Метод ПЦР в реальном времени

1.2 Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса

1.3 Наследственные формы рака молочной железы и рака яичника

1.4 Профилактика развития рака молочной железы в Краснодарском крае

2. Материал и метод исследования

2.1 Материал исследования

2.2 Исследование мутации методом ПЦР

2.3 Статистические методы и программы

3. Диагностика мутаций гена BRCA1 методом ПЦР в лечении рака молочной железы

Заключение

Библиографический список

ОПРЕДЕЛЕНИЯ, ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время клиническая лабораторная диагностика занимает важное место в диагностике заболеваний. Наиболее часто в клинической практике врачи обращаются к биохимическим методам, которые позволяют оценить состояние организма и/или отдельных органов, но, к сожалению, эти методы не дают точной и ранней информации о развитии заболевания.

ПЦР в реальном времени ? это метод диагностики, который позволяет проверить генетический материал, экстрагированный из исследуемого клинического образца, на наличие в его составе участка чужеродной или изменённой генетической информации. Большим преимуществом ПЦР метода является то, что для анализа требуется ДНК, содержащаяся в клетках организма и поэтому для ПЦР анализа можно брать любую ткань. Одним из анализов является выявление мутации в гене BRCA1, которая приводит к развитию рака молочной железы и раку яичника.

В мире ежегодно выявляется более одного миллиона случаев рака молочной железы, а в РФ свыше 5·103 случаев [Гарин, 2006]. Существенным фактором риска развития рака молочной железы и рака яичника является наследственная предрасположенность. Семейные формы РМЖ и РЯ составляют до 10% всех случаев заболевания. Чаще всего развитие наследственных форм РМЖ и РЯ связано с мутациями в гене BRCA1 [Карпухин, Поспехова, Любченко, 2002].

Актуальность исследования состоит в том, что раннее выявление и постановка диагноза рака молочной железы и рак яичников окажет своевременную в диагностике и лечении заболеваний.

Цель: определение закономерностей мутации гена BRCA1 в лечении рака молочной железы.

В соответствии с целью решались следующие задачи:

1. Определение вероятности возникновения мутации в гене BRCA1.

2. Определение зависимости между формами заболевания и возрастом больных.

3. Определение зависимости между формами заболевания и возникновением мутации.

1. Аналитический обзор

1.1 Метод ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция - метод молекулярной биологии, позволяющий добиться значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК в биологическом материале (пробе).

Помимо амплификации ДНК, ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с нуклеиновыми кислотами (введение мутаций, сращивание фрагментов ДНК) и широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, выделения новых генов.

Метод ПЦР основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях (in vitro). При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. В отличие от амплификации ДНК в живых организмах, (репликации), с помощью ПЦР амплифицируются относительно короткие участки ДНК. В обычном ПЦР-процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов.

ПЦР в реальном времени (или количественная ПЦР, англ. real-time PCR) ? лабораторный метод, основанный на методе полимеразной цепной реакции, используется для одновременной амплификации и измерения количества данной молекулы ДНК. Метод включает в себя одновременно детекцию и количественное определение (измерение непосредственно количества копий, либо измерение копий относительно внесенной ДНК или дополнительных калибровочных генов) специфической последовательности ДНК в образце.

Метод использует общие принципы ПЦР. Основное отличие состоит в том, что измеряется количество амплифицированной ДНК в реальном времени после каждого цикла амплификации. Для количественного определения используют два метода ? флюоресцентные красители, интеркалирующие в двуцепочечные молекулы ДНК, и модифицированные олигонуклеотиды (ДНК-зонды), которые флюоресцируют после гибридизации с комплементарными участками ДНК.

Флуоресцентные методы позволяют избирательно регистрировать амплификацию лишь определённых фрагментов ДНК, повышая тем самым достоверность исследования. Можно сказать, что замещение обычной ПЦР методиками с флуоресцентной регистрацией накопления ДНК в области выявления и количественного определения нуклеиновых кислот.

Специфические детекции позволяют достоверно регистрировать накопление фрагмента ДНК строго определённой последовательности. Все специфические системы детекции продуктов ПЦР отличаются наличием в реакционной смеси олигонуклеотида, неспособного выступать в качестве затравки и комплементарного уникальной части амплифицируемой последовательности. Меченный нуклеотид может быть прикреплён к праймеру или находиться в растворе в свободном форме.

Одной из специфических детекций является свободные меченные пробы, а именно пробы с «молекулярные маячки» [ПЦР в реальном времени, 2001].

В данной методике использовали два олигонуклеотида, гибридизирующихся с матричной ДНК в непосредственной близости друг от друга. Один из олигонуклеотидов несёт флуорофор-донер, другой - флуорофор-акцептор. Гибридизация двух олигонуклеотидов с матрицей ведёт к сбилижению флуорофоров и переносу энергии с донором на акцептор. Детекицю продуктов амплификации ведут путем регистрации спектра флуорисценции флуорофора-акцептора при возбуждении флуорофора-донора. Наиболее распространение данный подход нашёл при определении однонуклеотиных полиморфизмов, позволяя определить сразу несколько вариабельных позиций ДНК в одной пробе [ПЦР в реальном времени, 2011].

Специфичность ПЦР основана на образовании комплементарных комплексов между матрицей и праймерами, короткими синтетическими олигонуклеотидами длиной 18-30 оснований. Каждый из праймеров комплементарен одной из цепей двуцепочечной матрицы и ограничивает начало и конец амплифицируемого участка.

В случае неверного выбора длины и нуклеотидного состава праймера или температуры отжига возможно образование частично комплементарных комплексов с другими участками матричной ДНК, что может привести к появлению неспецифических продуктов. Верхний предел температуры плавления ограничен оптимумом температуры действия полимеразы, активность которой падает при температурах выше 80°C [ПЦР в реальном времени, 2011].

1.2 Действие генов-супрессоров на формирование опухолевого процесса

Ген BRCA1 ? ген-супрессор, ответственный за развитие рака молочной железы, кодирует белок из 1863 аминокислотных остатков. Сходство этого белка с другими известными белками минимально, однако, изучение структуры белка помогло выделить несколько областей конкретного функционального значения (домены):

- RING домен (или цинк-связывающий домен);

- NLS (сайт ядерной локализации) ? область, ответственная за взаимодействие с RAD51;

- BRCT домены (состоят из двух BRCT-N и BRCT-C доменов) гомология между геном BRCA1 человека и его мышиным аналогом составляет только 58%; низкое сходство указывает на быструю эволюцию этого гена. Несмотря на низкую консервативность гена в эволюции, BRCA1 имеет две высоко консервативные последовательности - RING домен на N-конце и BRCT домен на С-конце. Оба домена насчитывают около 300 аминокислотных остатка, что составляет 16% от общего размера белка BRCAl.

Ген рака молочной железы (BRCA1) функционально препятствует развитию рака молочной железы. Обнаружение мутаций обычно связывается с увеличенным риском развития рака молочной железы и рака яичников. Вариант BRCA1 5382insC соответствует более неблагоприятным [Гарин, 2006].

В данном гене происходит делеция (выпадение) нуклеотида С, что приводящая к сдвигу рамки считывания и появления стоп-кодона:

wt 5'-AAGCGAGCAAGAGAATTCCAG-3'

mut 5'-AGCGAGCAAGAGAATTCCCA-3'

Гены - контроля клеточного цикла напрямую вовлечены в его регуляцию. Их белковые продукты способны сдерживать опухолевую прогрессию, ингибируя процессы, связанные с делением клетки. Дефекты генов контроля целостности генома приводят к повышению нестабильности генома, увеличению частоты возникновения мутаций, и, следовательно, к повышению вероятности повреждения генов, в том числе и контроля клеточного цикла [Kurian, 2010].

Если унаследована повреждённая копия гена контроля клеточного цикла, образование опухоли может быть инициировано соматической мутацией в неповреждённом аллеле. Поэтому в случае наследственных форм опухолей, когда имеется наследуемая мутация, для начала заболевания необходимо всего одно соматическое мутационное событие - повреждение единственного функционального аллеля. Спорадические случаи возникновения опухоли того же типа требуют двух независимых мутационных событий в обоих аллелях. В итоге, для носителей мутантного аллеля вероятность развития данного типа опухоли значительно выше, чем в среднем по популяции.

Мутации на стыке экзонов и интронов - мутации сайтов сплайсинга - часто нарушают процессинг первичного РНК-транскрипта, в результате чего происходит либо неправильное вырезание соответствующей интронной области и трансляция бессмысленного удлиненного белка, не защищенного от протеолитического действия внутриклеточных ферментов, либо вырезания экзонов и образование делетированного белка. В результате чего происходит потеря экзона. Критическое значение имеют также последовательности, прилежащие к указанным динуклеотидам [Логинова, 2004].

Прямым доказательством мутационной природы рака можно считать открытие протоонкогенов и генов-супрессоров, изменение структуры и экспрессии которых за счёт различных мутационных событий, в том числе и точечных мутаций, приводит к злокачественной трансформации.

Молекулярно-биологическими методами было установлено, что ДНК нормальных клеток различных видов эукариот содержит последовательности, гомологичные вирусным онкогенам, которые получили название протоонкогенов. Превращение клеточных протоонкогенов в онкогены может происходить в результате мутаций кодирующей последовательности протоонкогена, что приведет к образованию изменённого белкового продукта, или в результате повышения уровня экспрессии протоонкогена, вследствие чего в клетке увеличивается количество белка. Протоонкогены, являясь нормальными клеточными генами, обладают высокой эволюционной консервативностью, что указывает на их участие в жизненно важных клеточных функциях [Knudson, 2002].

Антионкогены, или гены-супрессоры опухолей, ? это гены, наличие продукта которых подавляют образование опухоли. Утрата функции этих антионкогенов вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию. Благодаря своему противоположному по отношению к онкогенам функциональному назначению они были названы антионкогенами или генами-супрессорами злокачественности. В отличие от онкогенов, мутантные аллели генов-супрессоров рецессивны. Отсутствие одного из них, при условии, что второй нормален, не приводит к снятию ингибирования образования опухоли.

Таким образом, протоонкогены и гены-супрессоры образуют сложную систему позитивно-негативного контроля клеточной пролиферации и дифференцировки, а злокачественная трансформация реализуется через нарушение этой системы.

1.3 Наследственные формы рака молочной железы и рака яичника

Опухоли могут носить как наследственный характер, так и приобретённый (спорадический).

Рак молочной железы ? болезнь женщин среднего и пожилого возраста. Симптомами рака этого органа являются различной степени выраженности асимметрия молочных желез, втянутый сосок с серозными и кровянистыми выделениями, а также гиперемия и отек кожи над опухолью.

Большое значение в диагностике рака молочной железы получил рентгенологический метод исследования - бесконтрастная маммография [Farooq, Walker, Bowling, 2010]. Она проводится с целью уточнения размеров, характера роста опухоли, выявления инфильтративного компонента рака. Большой диагностической информативностью обладает пункционная биопсия. Последнее время точность цитологической диагностики значительно возросла, до 98% случаев правильных ответов с характеристикой степени дифференцировки злокачественной опухоли, но эти методы не позволяют провести раннюю диагностику.

В структуре рака молочной железы выделяют спорадический, семейный и наследственный, встречающиеся с разной частотой. Наиболее часто (около 68%) встречается спорадический рак молочной железы, характеризующийся отсутствием злокачественных новообразований в семье. На втором месте (около 23%) располагается семейный рак - накопление случаев рака молочной железы в семье. Наследственный, или генетически детерминированный рак молочной железы является следствием терминальных мутаций в генах предрасположенности, передающихся из поколения в поколение (5-15%) [Карпухин, Поспехова, Любченко, 2002]. Благодаря проведению многочисленных исследований появилась возможность изучения генетических маркеров предрасположенности к развитию рака молочной железы в определённых семьях [Геворкян, Дашков, Солдаткина, 2008].

На молекулярном уровне измена структуры гена BRCA1 объясняет восприимчивость к мутациям, что приводят к возникновению рака молочной железы или рака яичников. Ген содержит очень большое количество повторяющихся участков ДНК, что редко встречается в человеческих генах. Повторяющиеся участки ДНК могут вести к геномной нестабильности и реаранжировкам генов. Индивидуумы, которые унаследовали мутации в BRCA1, более подвержены риску развития рака молочной железы и рака яичников. Люди, имеющие мутацию в гене BRCA1, находятся в группе риска, (если они доживают до возраста 85 лет) с 80% вероятности развития рака молочной железы. Общий риск для любого человека зависит от индивидуальных генетических факторов и факторов риска окружающей среды, действию которых они подвергаются. Считается, что мутации BRCA1 ответственны за 5-10% всех случаев заболевания раком молочной железы [Ильницкий, 2003].

Выявление и установление клинической значимости полиморфных вариантов и структурных перестроек в генах, ответственных за наследственную предрасположенность к раку молочной железы, позволит создать новые возможности и перспективы медико-генетического консультирования. Полученные результаты ДНК-диагностики обеспечат подтверждение генетического диагноза, позволят оценить клинические особенности заболевания и, как следствие, оптимизировать тактику лечения, а также разработать профилактические мероприятия в отношении РМЖ с учетом индивидуального генотипа, а в ближайшем будущем и решить проблему планирования семьи и деторождения в семьях с наследственным раком молочной железы [Галуев, Шелякина, Мхитарьян, 2005].

Возраст и наличие заболеваний раком молочной железы у ближайших родственников являются главными факторами риска развития этого заболевания. Известно, что наличие мутаций генов BRCA1 связанно с высоким риска развития наследственного РМЖ и рака яичников. Истинное значение мутаций вышеуказанных генов для развития РМЖ затруднено различными критериями отбора пациентов для обнаружения мутаций [Chapman, Hauschild, Robert, 2011].

У женщин с наличием мутации гена BRCA1 риск развития рака молочной железы на протяжении жизни составляет 50-80%, рака яичников - 15-45%. Риск развития рака предстательной железы, кишки, гортани, кожи и эндометрия, также как и лейкемии вследствие химиотерапии, повышается при наличии мутаций гена BRCA [Михайлов, Сагайдак, Голубева, 1990].

Считается, что наличие мутации BRCA1 является неблагоприятным прогностическим признаком при развитии рака молочной железы. Диагноз рак яичников ассоциированный с мутацией BRCA развивается позже, чем рак молочной железы (старше 40 лет).

Выявление носителей до момента развития опухоли с последующей организацией в систему - диспансерное наблюдение. К сожалению, специальная профилактика в данное время не возможна [Летучих, Сасина, 2007].

В Краснодарском крае в период с 2005 по 2009 годы была отмечена следующая динамика по диагнозу рак молочной железы, что составило 13,6 % прироста к 2005 г. Диагноз рак яичников составило 443 человека - - 1.1% прироста к 2005 году. Рак молочной железы является одной из ведущей локализации опухоли у женщин, что составляет 10,3%. Структура заболеваемости злокачественными новообразованиями среди женщин характеризуется ростом к 2005 году доли рака молочной железы на 3,3% [Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность), 2010].

1.4 Профилактика развития рака молочной железы в Краснодарском крае

рак яичник ген полимеразный

В Краснодарском крае приказом департамента здравоохранения на базе ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер № 1» был организован Краевой маммологический центр на функциональной основе для обеспечения эффективной своевременной диагностики заболеваний молочных желез у женщин [Галуев, Шелякина, Мхитарьян, 2005].

С марта 2011 г. по июль 2012 г. состоялось 15 выездов «Онкопатруля» в муниципальные образования края. Всего было обследовано 52 399 жителей Кубани, из них у 2690 человек выявлены предраковые и онкологические заболевания (что составило 5,1% от всех обследованных). Врачами-маммологами в течение всех выездов осмотрено 22 784 женщины. С целью уточнения диагноза и дифференциальной диагностики с другим и заболеваниями в ходе проведения «Онкопатруля» большинству осмотренных были выполнены дополнительные методы исследования - маммография и ультразвуковое исследование. У 634 человек (2,8% осмотренных) выявлены различные предопухолевые заболевания, в основном - узловые мастопатии и фиброаденомы. Подозрения на злокачественные новообразования молочных желез обнаружены в 0,6% случаев (129 человек) от всех обследованных женщин. У большинства из больных женщин онкологическое заболевание установлено своевременно - на ранней стадии, когда специальные методы позволяют полностью излечить пациенток [Ковалев, Попова, Старинский, 2001].

Заболеваемость злокачественными новообразованиями молочной железы среди женщин Кубани снизилась с 82,1 до 77,2 % (на 100 тысяч женщин) в 2011 г. Одновременно произошло уменьшение запущенности (III и IV стадии заболевания) онкопатологии молочной железы - с 37,4% в 2010 г. до 35,6% в 2011 г. [Галуев, Шелякина, Мхитарьян, 2005].

Таким образом, новый профилактический проект «Онкопатруль» показал, что сочетание культурного, образовательного наряду с профилактическим и медицинским компонентами является наиболее эффективным комплексом 8 профилактических мероприятий и скрининговые программы приводят к повышению диагностики онкологических заболеваний молочной железы в ранних стадиях [Гарин, 2006].

2. Материал и метод исследования

2.1 Материал исследования

Исследование проводилось на базе генетической лаборатории Краснодарского Клинического онкологического диспансера №1. В период с 26.06.2012 по 26.05.2013гг.

Материалом исследования нашей работы являлась кровь, взятая у пациенток страдающих раком молочной железы и раком яичников. Забор крови больных проводился без учёта приёма пищи и времени взятия. Образцы крови брались в вакутейнеры, содержащие ЭДТА-К2.

Выборку вошли женщины больные раком молочной железы и раком яичников, разделили на две группы с учётом возрастных категорий: первая группа от 25 до 40 лет (14 человек), вторая группа от 41 до 90 лет (58 человек).

Выборка составляла в количестве 72 больных раком молочной железы и раком яичника в возрасте от 25 до 90 лет, так как мутация в гене BRCA15382insC приводит к возникновению данных заболеваний (из выборки исключили людей, не принадлежащих к славянской расе).

Наглядно данные представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Процентное соотношение диагноза семейной и спорадической форм заболеваний у больных

Диагноз	Количество (n)	Процент (%)
Рак молочной железы (семейная форма)	2	6,7
Рак молочной железы (спорадическая форма)	28	93,3
Рак яичников (семейная форма)	2	5,3
Рак яичников (спорадическая форма)	29	94,7
Другая отягощённость (семейная форма)	5	45,5
Другая отягощённость (спорадическая форма)	6	54,5
Итого	72

По данным таблицы 1, 29 (9,7%) человек имели рак яичников спорадической и две (5,3%) семейной формы. Диагноз рак молочной железы составляет 28 (93,3%) человек спорадической формы и две (6,7%) семейных формы. 11 человек имели другие отягощённые формы (рак молочной железы и рак яичников, рак молочной железы и рак тела матки, рак молочной железы и рак толстого кишечника, рак молочной железы и рак желудка, рак яичника и рак молочной железы и рак молочной железы), пять (45,5%) человек имели семейную форму заболевания в данной отягощённости и шесть (54,5%) спорадическую форму. Следует учесть, что подсчёт производился из расчёта 100% на каждую группу. Из 72 человек 14 (17,7%) имеют мутацию в гене BRCA15382insC.

2.2 Метод исследования

Выделение ДНК

ДНК выделяли из 100 мкл цельной крови при помощи набора компании «Биолинк» (Новосибирск, РФ) методом сорбции нуклеиновых кислот на стекле в растворе с высокой концентрацией солей с последующей промывкой спиртосодержащим буфером и элюцией ДНК буферным раствором с низкой концентрацией солей.

Проведение ПЦР

Для выполнения исследования в гене BRCA 1 использовалась аллель-специфическая ПЦР в режиме реального времени с детекцией амплификации ДНК при помощи флуоресцентно-меченных олигонуклеотидных праймеров.

Для выполнения анализа использовался набор компании «Биолинк». Проводили одновременно две реакции с исследуемым образцом ДНК:

1) С использованием смеси праймеров «5382-W*» (для детекции ДНК генаBRCA1 дикого типа)

2) С использованием смеси праймеров «5382-М», (для детекции ДНК генаBRCA1 с мутацией 5382insC).

Параллельно в качестве положительного контроля - ДНК с мутацией, в качестве отрицательного контроля - ДНК без мутации, контролем контаминации служила - ddH 2

На рисунке 1 представлен пример «положительной» детекции мутации в гене BRCA1 5382insC.

Рисунок 1 ? ДНК, содержащей мутацию BRCA1 5382insC

Образец считали положительным (содержащим мутацию), если при использовании смесей праймеров 5382-М и 5382-W появлялись кривые амплификации, пересекающие порог флуоресценции с разницей не более чем в 1 цикл (в идеальном случае одна кривая должна накладываться на другую) [Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению].

На рисунке 2 представлен пример «отрицательной» детекции мутации в гене BRCA1 5382insC.

Рисунок 2 ? ДНК, не содержащей мутацию BRCA1 5382insC

Образец считали отрицательным (дикого типа), если при использовании смеси праймеров 5382-W появлялась кривая амплификации, которая пересекает порог флуоресценции не позднее 35 цикла и отсутствовала кривая амппификации при использовании смеси праймеров 5382-М. [Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению].

2.3 Статистическая обработка данных

Статистическая обработка данных осуществлялась на ПК с помощью программы Microsoft Office Excel 2010 и онлайн калькулятора на сайте биометрики. Для подсчёта статистических данных нами были использованы следующие методы: критерии хи-квадрат [http://biometrica.tomsk.ru/freq1.htm], точный критерий Фишера [http://www.vassarstats.net/tab2x2.html], а также использовался доверительный интервал, для оценки данных [Microsoft Office Excel 2010].

Для сравнения частот и определение границы частот (min-max) использовали критерий Фишера и критерий хи-квадрат. Различия считались статистически значимыми при значении p ? 0,05.

3. Диагностика мутаций гена BRCA1 методом ПЦР в лечении рака молочной железы

Следуя цели нашего исследования, были получены данные по раку молочной железы больных с учётом возраста и обнаружения мутации.

Проанализировав полученные данные, нами было вычислено процентное соотношение больных в двух группах. Данные представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Процентное соотношение больных по возрасту

Возрастная группа	1 группа (от 25 до 40 лет)	2 группа (от 41 до 90 лет)
Количество больных (n)	14	58
Процент (%)	17,7	82,3

Из таблицы 2, очевидно, что в первой возрастной группе больных с диагнозом рак молочной железы и рак яичника было выделено 14 человек, что составило 17,7%. Во второй возрастной группе отмечали 58 больных - 82,3 %. Высокий процент больных наблюдался во второй возрастной группе, это связано с возрастными изменениями в репродуктивной системе женщин. Наши предположения совпадают с данными Ю.А. Геворкян, А.В. Дашков, Н.В. Солдаткина [2005].

Следуя нашим задачам, мы определили процент больных женщин, имеющих мутацию 5382insC в гене BRCA1 (рисунок 3).

На рисунке 3 показано, что процент обнаруженных мутаций в гене больных BRCA1 5382insC составляет 18%, не обнаруженных - 82%, что может свидетельствовать о том, что к возникновению рака молочной железы и рака яичников могут приводить другие факторы.



Рисунок 3 - Процентное соотношение больных по мутации в гене BRCA1

Проанализировав полученные данные, мы провели статистический анализ по отягощённости заболевания.

На диаграмме представлено три вида отягощённости, представленные на рисунке 4.

Рисунок 4 - Доля носителей мутации гена BRCA1insC у больных в зависимости от суммы факторов отягощённости

Из данных диаграммы нами было отмечено, что столбец 3 соответствует больным с диагнозом рак яичников, имеет самый высокий процент появления мутации, что составляет 66%; второй столбец - рак молочной железы - 25%, первый столбец - рак молочной железы и рак яичников - 9,5 %. Данные являются достоверно значимые, так как p=0,0025 (р<0,05).

Все средние значения долей мутаций входят в доверительный интервал. Это означает, что риск возникновения мутаций является очень высоким. Для дальнейшего прогнозирования появления мутации в Краснодарском крае проводили скрининговые программы по профилактической программе «Онкоптруль», что позволяет уменьшить риск возникновения мутации и предотвращения развития данного заболевания (подробно указано в 1.4).

В ходе работы был определен процент мутации в двух возрастных группах. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Процентное соотношение мутации в гене BRCA1 и возрастных группах больных

Возрастная группа	Количество (n)	Процент (%)
1 группа без мутации	11	15,3
1 группа с мутацией	3	4,2
2 группа без мутации	48	66,7
2 руппа с мутацией	10	13,8

Таким образом, высокий процент заболевания выявлен во второй возрастной группе больных не несущей мутацию, что составло 66,7%; у больных первой возрастной группе не несущей мутацию составила 15,3% случаев. У больных второй возрастной группе несущей мутацию в 13,8% случаев. У больных первой возрастной группе несущей мутацию проявление заболевание выделено в 4,2%.Это показывает, что высокий процент мутации находится во второй группе.

Из данных таблицы 3 нами была рассчитана доля носителей мутации в возрастных группах (рис. 5).

Рисунок 5 ? Доля носителей мутации гена BRCA1 в возрастных группах больных

Таким образом, в первой возрастной группе больных с мутацией (столбец 1) среднее значение входило в доверительный интервал и составила 22%. Во второй возрастной группе больных с мутацией (столбец 2) - 17,5%. Данные являются достоверно значимыми, так как p=0,002.

По происхождению заболевания мы всех больных разделили на диагнозы спорадический и семейный рак молочной железы и рак яичников. Данные представлены в таблице 4.

Таблица 4 - Процентное соотношение спорадического и наследственного рака молочной железы и рака яичников в возрастных группах больных

Форма заболевания и возрастная группа	Количество (n)	Процент (%)
Спорадическая форма у больных 1 группы	13	92,9
Семейная форма у больных 1 группы	1	7,1
Спорадическая форма у больных 2 группы	53	91,4
Семейная форма у больных 2 группы	5	8,6

Проанализировав данные таблицы 4, мы сделали следующие выводы, что семейная форма рака молочной железы и рака яичников встречаются реже, чем спорадическая форма. В первой возрастной группе больных (25-40 лет) спорадическая форма рака молочной железы и рака яичника составила 92,9%; 7,1% ? семейная форма. Во второй возрастной группе больных (41-90 лет) 91,4% ? спорадическая форма; 8,6% ? семейная. Следует учесть, что подсчёт производился из расчёта 100% на каждую группу больных раком молочной железы и раком яичника, что позволило получить более точное представление о распространении мутации. Это связано с тем, что рак молочной железы и рак яичников может возникать по другим причинам, не связанные с возникновением мутации в гене BRCA1.

Далее, мы определили процентное обнаружение мутаций в разных формах заболевания. Данные представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Процентное соотношение форм заболеваний в семейной и спорадической формах рака молочной железы и рака яичников у больных

Форма и статус мутации	Количество (n)	Процент (%)
Спорадическая форма с мутацией	8	11,1
Спорадическая форма без мутации	58	80,5
Семейная форма с мутацией	6	8,4

Таким образом, из данных таблицы 5 отметили, что преобладала спорадическая форма без мутации рака молочной железы и рака яичников и составила 80,5%. Втором место занимает спорадическая форма с мутацией 11,1%, на третьем месте - семейная форма заболеваний - 8,4%. Данные являются достоверно значимыми, так как p = 0,003.

Проанализировав значения таблицы 5, мы выявили долю носителей мутации в спорадической и семейной форме заболевания. Данные представлены на рисунке 6.



Рисунок 6 ? Доля носителей мутации в гене BRCA1 в спорадической и семейной форме заболевания у больных

Таким образом, средние значения доли носителей мутации в спорадической и семейной формах входили в доверительный интервал, что составло в спорадической форме заболевания (столбец 1) 12%, в семейной (столбец 2) 8%. Данные являются достоверно значимыми, так как p=0,002.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Благодаря последним исследованиям в области молекулярно-генетических механизмов наследственной предрасположенности к РМЖ обнаружено, ген BRCA1 несёт мутации, которые связаны с высоким риском возникновения рака молочной железы и рака яичников. Изучена их структура и получена значительная информация о функциональных особенностях. Ген BRCA1 имеет ряд схожих структурных параметров и функциональных проявлений, действует в качестве генов-супрессоров злокачественной трансформации клетки. Наследуемые мутации в гене BRCA1 приводит к риску возникновения рака молочной железы и рака яичников, составляющему 80-90% при выраженных семейных формах этого заболевания. ДНК-диагностика мутаций в гене BRCA1 создаёт новые существенные возможности для медико-генетического консультирования, профилактики и лечения.

Следуя поставленной цели, мы выделили следующие закономерности:

1. В нашем исследовании у больных раком молочной железы и раком яичников мутация в гене BRCA1 5382insC возникала в 18% случаев.

2. Высокий процент заболевания выявлен во второй возрастной группе больных не несущей мутацию, что составло 66,7%; у больных первой возрастной группы не несущей мутацию составила 15,3% случаев. У больных второй возрастной группы несущей мутацию в 13,8% случаев. У больных первой возрастной группы несущей мутацию проявление заболевание выделено в 4,2%.

3. Среди форм заболеваний высокий процент имеет спорадическая, что составляла 80,5%; а спорадическая форма заболевания с мутацией - 11,1%, в случае семейной формы заболевания - 8,4%.

Для дальнейшего прогнозирования появления мутации необходимо проводить скрининговые программы по территории Краснодарского края, что позволит уменьшить риск возникновения мутации и предотвращения развития данного заболевания.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Вычисление критерия Хи-квадрат для таблиц сопряжённости 2х2 (без поправки Иэйтса). Режим доступа: http://biometrica.tomsk.ru/freq1.htm (3.03.2013).

2. Галуев Р.Э., Шелякина Т.В., Мхитарьян О.В. Скрининговая диагностика рака и предраковых заболеваний ободочной кишки. Современные технологии в онкологии: материалы VI Всероссийского съезда онкологов. М., 2005. С. 187-188.

3. Гарин А.М. Повышение выживаемости и качества жизни больных раком молочной железы - достижимая задача // Онкология. 2006. № 11. С. 28-30.

4. Геворкян Ю.А., Дашков А.В., Солдаткина Н.В., Петров Д.С. Улучшение качества жизни больных раком молочной железы после органосохраняющего лечения с интраоперационной химиотерапией на аутосредах организма // Сибирский онкологический журнал. 2008. № 2. С. 37.

5. Злокачественные новообразования в России в 2011 году (заболеваемость и смертность) / под ред. В.И. Чиссова, В.В. Старинского, Г.В. Петровой. М., 2012. 260 С. 5.

6. Ильницкий А.П. Санитарно-просветительная работа в профилактике рака в России // Российский онкологический журнал. 2003. № 6. С. 49-51.

7. Инструкции по применению набора для выделения ДНК из цельной крови.

8. Казанцева М.В., Тесленко Л.Г., Цокур И.В. Злокачественные новообразования в Краснодарском крае (2005-2009 гг.). Краснодар, 2010. 182 с.

9. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников. 2002. № 5. Тверь, С. 1-4.

10. Ковалев Б.Н., Попова А.А., Старинский В.В. Нормативная база становления онкологического скрининга в России. Организационные вопросы ранней диагностики, профилактики злокачественных новообразований и паллиативной помощи онкологическим больным: материалы Всерос. научн. конференции. Казань, 2001. С. 123-129.

11. Летучих Е.В., Сасина М.С. Организационные аспекты проведения профилактических мероприятий среди целевых групп // Здравоохранение Российской Федерации 2007. № 5. С. 41-43.

12. Логинова А. Н.. Молекулярно-генетический анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников: диссертация; [Место защиты: Государственное учреждение "Медико-генетический научный центр РАМН"]. Москва, 2004. 103 с.

13. Михайлов Э.А., Сагайдак В.Н., Голубева Е.А. Программа обучения женщин самообследованию молочных желез // Вопросы онкологии. 1990. С. 1095-1099.

14. ПЦР в реальном времени / Д.В. Ребников, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов и др. - 3е изд. - М.: Бионом. Лаборатория знаний. 2011. 223 с.

15. Точный критерий Фишера вероятностей. Режим доступа: http://www.vassarstats.net/tab2x2.html (29.03.2013).

16. Chapman P. B., Hauschild A., Robert C. Improved survival with vemurafenib in melanoma with BRAF V600E mutation. New Engl. J. Med., 2011. Vol. 364. P. 2507-2516.

17. Farooq A., Walker L J., Audisio R. A. Cowden syndrome . Cancer Treat Rev, 2010. - Vol. 36. P. 577-583

18. Gerber P. A., Antai A. S, Neumann N. J. et al. Neurofibromatosis II Europ. J. Med. Res., 2009. Vol. 14. P. 102-105.

19. German J., Sanz M. M., Ciocci S. et al. Syndrome-causing mutations of the BLM gene in persons in the Blooms Syndrome Registry II Hum. Mutat, 2007. Vol. 28. P. 743-753.

20. Grudinina N. A., Golubkov V. I., Tikhomirova 0. S. et al. Prevalence of widespread BRCA1 gene mutations in patients with familial breast cancer from St. Petersburg II Russ J. Genet, 2005. Vol. 41. P. 318-322.

21. Hansson J. Familial cutaneous melanoma. Med. Biol., 2010. Vol. 685. P. 134-145

22. Knudson A. G. Cancer genetics / Amer. J. Med. Genet, 2002. Vol. 111. P. 96-102.

23. Kurian A. W. BRCA1 and BRCA2 mutations across ran and ethnicity: distribution and clinical implications info Opin. Obstet. Gynecol., 2010. Vol. 22. P. 72-78.

24. Real-time PCR-BRCA1-5382insC инструкция по применению.

Размещено на Allbest.ru