Определение характеристик макета БПК-биосенсора на основе дрожжей Debaryamyces hansenii, иммобилизованных в модифицированный ПВС с использованием различных синтетических сточных вод

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

Последнее десятилетие отмечено интенсивным изучением аналитических возможностей и практическим применением биосенсорных систем. Экспресс-оценка степени загрязнения объектов окружающей среды органическими соединениями является необходимым компонентом экологического контроля. Учитывая постоянно растущий перечень веществ, поступающих как загрязнители в окружающую среду, эффективным инструментом анализа оказываются методы, основанные на интегральной оценке органических компонентов, а не только на определении содержания индивидуальных веществ. Потребности медицинской диагностики, различных областей биотехнологии, промышленности, экологических служб ставят перед аналитической химией комплекс задач, связанных с разработкой простых в применении, недорогих, высокочувствительных и специфичных

методов и приборов на их основе для обнаружения заданных веществ в образце.

Важной характеристикой степени загрязненности воды органическими веществами является индекс биохимического потребления кислорода (БПК). Стандартный метод определения БПК, регламентируемый в ПНДФ, основан на тестах, продолжительность которых составляет 5 или 20 суток. В силу значительной продолжительности процедуры метод не является адекватным, так как представляет результаты анализа со значительной задержкой. Вследствие этого возможно возникновение экологически опасных ситуаций.

Необходимо создание экспресс методов определения БПК. и реализация их требует разработки биоаналитический систем, основанных на применении низкоселективных биосенсоров.

Таким образом, создание универсального биосенсорного анализатора для определения БПК в современных условиях является важной задачей для биотехнологических производств.

Итак, целью данной курсовой работы является изучение характеристик кюветного БПК-биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii с использованием двух стандартов: глюкозо-глутаматная смесь (ГГС) и ОЕСD-синтетические сточные воды.

При этом необходимо решить следующие задачи:

Во-первых, изучить метрологические (диапазон определяемых содержаний, правильность, воспроизводимость, повторяемость, чувствительность, предел обнаружения) и аналитические характеристики (длительность единичного анализа, время функционирования биосенсора без замены рецепторного элемента) кюветного БПК-биосенсора на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii с использованием двух стандартов: глюкозо-глутаматная смесь (ГГС) и ОЕСD-синтетические сточные воды.

Во-вторых, определить БПК реальных образцов стандартным методом разбавления.

В-третьих, применить БПК-биосенсор на основе дрожжевого штамма Debaryamyces hansenii для анализа образцов сточных води полупродуктов брожения, так же с использованием ГГС и ОЕСD.

1. Литературный обзор

1.1 Общая характеристика микробных биосенсоров

1.1.1 Современная концепция биосенсоров

Согласно определению Энтони Тернера биосенсор - это аналитическое устройство, содержащее биологический материал (ткани, клетки микроорганизмов, органеллы, клеточные рецепторы, ферменты, иммуноактивные компоненты, нуклеиновые кислоты и т.д.), находящийся в непосредственном контакте с физико-химическим преобразователем или преобразующей микросистемой, представленными оптическим, электрохимическим, термометрическим, пьезоэлектрическим или магнитометрическим устройствами. Как правило, преобразователь вырабатывает периодическое либо непрерывные аналоговые/цифровые сигналы, которые пропорциональны концентрации одиночного вещества или группы анализируемых соединений.[1]

Биосенсоры можно разделить на различные группы в соответствии с типом преобразователя (физический сенсор, регистрирующий изменение физико-химических свойств биоматериала, составляющего биорецептор) или биорецепторного элемента (основной анализирующий элемент сенсора, содержащий биологический материал (ферменты, клетки, срезы тканей, органеллы антитела/антигены, молекулы ДНК, РНК), реакция которого регистрируется преобразователем). По типу преобразователя биосенсоры можно разделить на следующие группы: электрохимические, оптические, пьезоэлектрические, термометрические. По типу биорецепторного элемента биосенсоры классифицируют на иммунохимические, ферментные, целоклеточные, рецепторные и ДНК-сенсоры.

Микробные сенсоры представляют собой иммобилизованные на преобразователях различных типов (оптических, электрохимических) клетками микроорганизмов, что позволяет достаточно простыми методами производить оценку концентрации многих органических соединений, осуществимую в ряде случаев лишь с помощью длительных химических процедур анализа. Наиболее часто используют преобразователи электрохимического типа [2]. Использование микроорганизмов в качестве основы биосенсоров является известным подходом. В ряде работ показано, что микробные биосенсоры могут быть эффективно использованы для анализа широкого спектра соединений при биотехнологических процессах и экологическом мониторинге. Важными моментами, указывающими на перспективность микробных биосенсоров, является многообразие ферментативного аппарата микробных клеток, что открывает возможность подбора микроорганизмов для анализа практически любого соединения, а также тот факт, что ферменты внутри клеток находятся в "эволюционно оптимизированных условиях" - это в ряде случаев приводит к высокой стабильности аналитических сигналов. Немаловажным с практической точки зрения фактором является более низкая стоимость микробных биосенсоров по сравнению с ферментными ввиду отсутствия необходимости очистки ферментов и использования кофакторов. Перечисленные факты обуславливают актуальность исследований, направленных на совершенствование и получение новых знаний в этой области. Принцип детекции, реализованный в биосенсорах, основан на том, что биоматериал (ферменты, клетки, антитела и др.), иммобилизованный на физическом датчике (преобразователе), при взаимодействии с определяемым соединением генерирует зависимый от его концентрации сигнал, который регистрируется преобразователем электрохимического, оптического или иного типа. Эти изменения могут непосредственно быть зарегистрированы электрохимическими датчиками, например, кислородным электродом или рН - метром.[3]

При использовании амперометрического кислородного электрода измерение основано на регистрации тока, полученного при восстановлении молекулярного кислорода. Сила тока пропорциональна концентрации кислорода в исследуемом образце.

Рис. 1 - Схема кислородного электрода типа Кларка с рецепторным элементом

Рассмотрим схему кислородного электрода типа Кларка с рецепторным элементом (рис.1). Электрод типа Кларка представлен измерительной парой - платиновым катодом и серебряным анодом.

1. Платиновый электрод

2. Стеклянный корпус

3. Электрод сравнения (Ag/AgCl)

4. Источник тока (U = -0,7 В)

5. Амперметр

6. Слой фермента или клеток

7. Полупроницаемая мембрана

Потенциал поляризации - 0,7 В, приложенный к катоду относительно анода, восстанавливает на катоде кислород в соответствии с реакцией:

Катодная реакция: О2 + 2Н2О + 4з ? 4ОНЇ

Анодная реакция: 4Ag + 4Clќ ? 4AgCl + 4з

Указанные химические реакции приводят к протеканию тока, который пропорционален парциальному давлению кислорода. Кислородный электрод поглощает кислород, который поступает к его поверхности из раствора

Помимо электродов типа Кларка существуют также безмембранные (открытые) кислородные электроды, но в сравнении с ними электрохимической ячейке электродов Кларка есть ряд преимуществ:

- возможность измерения кислорода в газах и растворах

- не приводят к взаимному загрязнению среды и электрода

- сигнал в меньшей степени зависит от скорости потока

В связи с этим электроды типа Кларка получили широкое распространение в настоящее время. К наиболее важным параметрам электрода относиться толщина пленки электролита между мембраной и электродом - она должна быть заключена в довольно узком интервале (рис.1) и в значительной мере определяет нулевой ток и линейность измерений. Для каждого электрода можно построить калибровочную зависимость, которые в большинстве случаев имеют сигмоидальный или гипербоидальный вид, характерный для кинетики ферментативных реакций. [4]

1.1.2 Биосенсоры на основе целых клеток.

Микроорганизмы - это живые датчики, которые меняют чувствительность при адаптации или сенсибилизации. Реакция таких датчиков зависит от взаимодействия целой группы факторов, отражая множество тонких и важных изменений в окружающей среде или среде организма.

В результате усвоения микроорганизмами органических веществ изменяется их дыхательная активность (процессы получения химической энергии за счет окисления органических веществ)

В начале 70-х годов XX в. исследователи показали, что не только ферменты, но также и целые клетки, в первую очередь микроорганизмы, могут успешно использоваться в биосенсорах. Первый микробный сенсор использован для определения этанола и представлен бактериями Acetobacter xylinum описан в работе [5].

С точки зрения функционирования клеточного биосенсора во многом аналогично функционированию ферментативного, вместе с тем применение целых клеток имеет некоторые преимущества в сравнении с использованием ферментов. Клетки - доступный биологический материал. Клетки микроорганизмов культивируются, легко воспроизводятся и поддерживаются в чистой культуре. В отличие от ферментов клетки не требуют дорогостоящих стадий очистки. Клетки сохраняют все наиболее важные структуры и проявляют большую стабильность. В некоторых случаях они обеспечивают жизнеспособность и активность ферментных систем в течение нескольких лет. Это позволяет проводить сложные последовательные реакции, осуществляя многостадийные процессы. Для многих типов клеток, особенно микробных, предложены эффективные методы генетических операций, что открывает возможность для работы с высокоэффективными каталитическими системами.

Другим важным преимуществом целых клеток является возможность использования их чувствительности к взаимодействию целой группы факторов, отражая множество тонких и важных изменений в окружающей среде или среде организма.

Таким образом, биосенсоры на основе целых клеток микроорганизмов могут быть использованы не только для определения содержания индивидуальных соединений в анализируемых объектах, но и для определения таких комплексных показателей загрязнения водных сред как биологическое потребление кислорода (БПК), цитотоксичность, мутагенность и т.д. Так, известно большое количество лабораторных моделей и несколько промышленно выпускаемых биосенсорных анализаторов БПК. В Германии, Бельгии, Японии и ряде других стран этот важный показатель качества воды определяют только экспресс-методом с использованием биосенсоров. Такие анализаторы позволяют производить определение БПК в среднем диапазоне 5-300 мг/л за время порядка нескольких минут. [6]

Несмотря на перечисленный положительные качества клеточных сенсоров, они имеют определенные недостатки:

- клетки содержат множество ферментов, часть которых может взаимодействовать с соединениями, присутствующими в пробе и не относящимися к целевым. В этом случае возникает сигнал наличия целевого соединения и соответствующая ошибка анализа;

- реакции протекают более медленно, так как субстраты должны проникнуть в клетку через мембрану, кроме того по такому же пути продукт должен выйти из клетки. Поэтому некоторые субстраты, в особенности макромолекулярные, не могут быть использованы для детекции клеточными биосенсорами;

- различные метаболические пути утилизации субстрата в клетке могут быть источником побочных продуктов, регистрируемых преобразователем; это приводит к снижению селективности клеточного биосенсора;

- высокая приспособляемость и изменчивость микроорганизмов;

- проблема биологической устойчивости, связанная с необходимостью длительного хранения и поддержания жизнедеятельности микроорганизмов. [7]

Областями наиболее интенсивного применения микробных сенсоров являются ферментационный и экологический контроль. Например, Гильбо [8,9] приводит многочисленные примеры использования микроорганизмов для создания биосенсоров: Neigrospora europea - для определения аммиака, Trichosporon brassicae - для определения уксусной кислоты, Sarcina flava - для определения глутамина, Azotobacter vinelaudit - для определения нитратов и другие. Живые организмы (дрожжи, бактерии, клетки растений) используют в методах биоиндикации для выявления вредных веществ. По различию характеристик прироста в опыте и контроле определяют предельную концентрацию вещества, обнаруживаемую организмами. Для оценки токсичности в питательные среды с микроорганизмами вводят не только растворы исследуемых химических веществ, но и экстракты, извлекаемые с помощью растворителей из тканей, почв и т.п [6].

Спектр микроорганизмов, используемых в биорецепторах, довольно широк, однако эффективное применение микробных клеток возможно при наличие представлений об особенностях их физиологии, а также информации о наборе ферментов, присущих выбранному штамму, так как физиологические свойства микроорганизмов определяют чувствительность, специфичность, стабильность биорецептора и другие параметры работы биосенсора.

1.2 Особенности биохимии дрожжевых клеток

Дрожжи представляют собой одноклеточные неподвижные организмы. Они могут быть различной формы: эллиптической, овальной, шаровидной и палочковидной (рис 2). Длина клеток колеблется от 5 до 12 мкм, ширина - от 3 до 8 мкм. 

Рис. 2 - Различные формы дрожжей

Необходимую энергию для жизнедеятельности дрожжи получают в процессе дыхания. Существует два типа дыхания: аэробное, или настоящее дыхание, и анаэробное, или брожение. По соотношению процессов анаэробного и аэробного дыхания дрожжи можно разделить на несколько групп:[10]

1) Дрожжи, существующие только за счет брожения, и не способные расти в аэробных условиях. Например, вид Arxiozyma telluris, обитающий в кишечном тракте грызунов.

2) Активные бродильщики: интенсивно сбраживают различные субстраты, но в аэробных условиях переключаются на дыхательный обмен. Представители: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe.

3) Слабые бродильщики - в основном существуют за счет аэробного дыхания, но в анаэробных условиях могут бродить, однако значительно менее интенсивно, чем виды из предыдущей группы. Например, дрожжи из родов Pichia, Debaryomyces.

4) Дрожжи, существующие только за счет дыхания, и не способные расти в анаэробных условиях. К этой группе относятся дрожжи из рода Lipomyces, Cryptococcus, Rhodotorula, Sporobolomyces.

Таким образом, дрожжи используют кислород для дыхания, однако при его отсутствии многие виды способны получать энергию за счёт брожения с выделением спиртов (спиртовое, молочнокислое, пропионовокислое, муравьинокислое, маслянокислое, уксусное брожение). В отличие от бактерий, среди дрожжей нет штаммов, гибнущих при наличии кислорода в среде. При пропускании воздуха через сбраживаемый субстрат дрожжи прекращают брожение и начинают дышать (поскольку этот процесс эффективнее, так как клетка лучше снабжается энергии, чем при брожении и молекула органического соединения расщепляется более глубоко), потребляя кислород и выделяя углекислый газ. Это ускоряет рост дрожжевых клеток (эффект Пастера). Однако даже при доступе кислорода в случае высокого содержания глюкозы в среде дрожжи начинают её сбраживать (эффект Кребтри) [11]. При брожении для получения энергии расходуется большое количество исходного материала, но зато при брожении создаются условия, в которых не могут развиваться другие микробы, конкурирующие с дрожжами, вызывающими брожение. Так, продукт спиртового брожения этанол оказывает губительное действие на многие бактерии и плесени.

Важно также отметить, что все бродящие дрожжи сбраживают глюкозу и фруктозу, поскольку именно с этих сахаров начинается гликолитическое расщепление. Кроме глюкозы и фруктозы могут сбраживаться другие соединения, такие как гексозы и построенные из них олигосахариды. Например, некоторые виды (Pichia stipitis, Pachysolen tannophilus, Phaffia rhodozyma) усваивают и пентозы, например, ксилозу.[12] Schwanniomyces occidentalis и Saccharomycopsis fibuliger способны сбраживать крахмал [13], Kluyveromyces fragilis -- инулин (полифруктозан) [14]. Из моносахаридов наиболее часто сбраживается галактоза, из дисахаридов - сахароза, мальтоза, трегалоза. Значительно реже встречаются дрожжи, сбраживающие лактозу и мелибиозу.

В аэробных условиях круг усваиваемых субстратов шире: помимо углеводов в него входят также жиры, углеводороды, ароматические и одноуглеродные соединения, спирты, органические кислоты. Так ряд видов дрожжей рода Candida (Candida tropicalis, Candida intermedia, Candida lipolytica, Candida guilliermondii) отличается способностью к аэробному росту на длинноцепочечных жирных кислотах и алканах.

Если в анаэробных условиях лишь единичные виды дрожжей могут сбраживать пятиатомные сахара, то в присутствии кислорода пентозы (арабиноза, ксилоза и др.) и метилпентозы (рамноза) могут служить субстратами для очень многих дрожжей.

Довольно часто встречаются дрожжи, ассимилирующие крахмал. Более 20 видов дрожжей способны аэробно расти на метаноле в качестве единственного источника углерода и энергии. Наиболее активно ассимилируют метанол такие виды, как Pichia polymorpha, Pichia pastoris, Candida boidinii, Candida methylica.

Тем не менее, сложные соединения (лигнин, целлюлоза) для большинства дрожжей (за исключением некоторых видов рода Trichosporon, проявляющих целлюлолитическую активность) недоступны [15].

1.2.1 Общая характеристика рода Debaryomyces

Род Debaryomyces, назван по имени знаменитого ботаника А. де Бари.

Клетки рода Debaryomyces имеют чаще круглую реже яйцевидную или овальную форму. Виды со сферическими клетками размножаются вегетативно множественным почкованием. Вегетативное размножение происходит истинным многосторонним почкованием. Мицелий обычно отсутствует, реже образуется примитивный псевдомицелий.

Рис. 3 - Различные типы организации у дрожжей рода Debaryamyces: 1- почкующиеся клетки Debaryamyces hansenii; 2 - аски с аскоспорами Debaryamyces hansenii; 3 - почкующиеся клетки Debaryamyces vanrijiae; 4 - аски с аскоспорами Debaryamyces vanrijiae

Аски образуются в результате конъюгации между клеткой и ее почкой. Почка превращается в аск с 1-4 круглыми или слегка овальными аскоспорами с гладкой или бородавчатой поверхностью. У некоторых видов споры имеют экваториальный ободок или спиральные бороздки. Виды, имеющие споры с экваториальным ободком, ранее выделяли в самостоятельный род Schwanniomyces. Аскоспоры обычно долго не освобождаются из аска. Споры, чаще всего по одной в сумке, имеют бородавчатую или с правильными выростами поверхность. Разновидность аскоспор дрожжей представлены на рисунке.

Отличительной чертой рода Debaryomyces является то, что клетки не сбраживают сахара, или сбраживают слабо, и только дрожжи двух или трех видов активно сбраживают разные углеводы. Многие из них хорошо развиваются на белковых средах и при повышенных концентрациях солей в среде.

Рассмотрим подробнее свойства вида Debaryomyces hansenii. Этот вид встречается в морской воде, сырах, мясе, винах, фруктах и почве, а так же в продуктах с высоким содержанием сахаров. Клетки Debaryomyces hansenii устойчивы к высоким концентрациям солей. Debaryomyces (Torulaspora) hansenii - это разновидность морских дрожжей, которые могут жить и функционировать при уровне солености воды вплоть до 24%.

Дрожжи Debaryomyces hansenii, в отличие от большинства других, могут расти в присутствии хлорида натрия. Способность выдерживать высокие концентрации соли и расти высокими темпами в их присутствии, делает Debaryomyces hansenii очень ценными для биотехнологии. Debaryomyces hansenii можно выращивать без строгих мер. (За счет способности дрожжей, выдерживать высокие концентрации солей в среде возможно выращивание) и может использовать дешевая соль отходов[16]. В книге [15] представлены данные о том, что дрожжи вида Debaryomyces hansenii лучше растут и развиваются в присутствии солей.

Так же данный вид клеток устойчив к высокому давлению, что позволяет применять их в различных процессах связанных с производством продовольственных товаров. Debaryomyces hansenii - это вид дрожжей обнаруженный во всех типах сыров. Дрожи Debaryomyces hansenii часто встречаются в различных соленьях, на консервированных мясных продуктах, в морской воде.

Дрождевой штамм Debaryomyces hansenii используется при производстве молочных продуктов и рассола, поскольку способен метаболизировать молочную и лимонную кислоты. Эти процессы становятся возможными поскольку Debaryomyces hansenii обладает способностями расти в присутствии солей и при низких температурах. Так же дрожжи Debaryomyces hansenii воздействуют протолитически на процесс созревания сыра.

Благодаря свойствам дрожжей Debaryomyces hansenii накопления, синтезирования липидов они применяются в биотехнологическом производстве естественных и искусственных продуктов.

Дрожи данного вида способны синтезировать токсины. Синтез токсина может быть представлен для биохимических исследований, изучающих возможность выращивания дрожжей Debaryomyces hansenii, так как такие токсины могут предотвращать рост нежелательных организмов. Деятельность этого токсина возможна только в присутствии солей, таких как NaCl или KCl. Debaryomyces токсины могут быть использованы в качестве
терапевтических агентов в медицине против патогенных дрожжей и как biopreservatives в пищу брожения хлоридом натрия для контроля порчи
дрожжей. [16]

1.3 Методы иммобилизации клеток

Для надежной работы биосенсора, биологический материал должен быть надлежащим образом закреплен, или иммобилизован, на физико-химическом преобразователе.

Для обеспечения надежности требуются:

1) высокая специфичность биологического компонента;

2) устойчивость системы к колебаниям температуры, ионной силы, рН, окислительно-восстановительного потенциала и химического состава окружающей среды;

3) встроенное приспособление, ограничивающее загрязнение или биологическую деградацию биокомпонента или способа его присоединения;

4) должна быть исключена возможность инфицирования пациента (часто это достигается при помощи сенсоров со сменными компонентами).

Иммобилизацию можно рассматривать как физическое разделение катализатора (клеток, клеточных фракций или ферментов) и растворителя, при котором молекулы субстрата и продукта могут легко обмениваться между фазами. Метод иммобилизации можно считать пригодным, если после присоединения к носителю биологические компоненты сохраняют активность и стабильность. Методы иммобилизации клеток достаточно подробно описаны в литературе [17-19].

Основные методы иммобилизации:

а) адсорбция на поверхности датчика или на инертной мембране, закрепление на поверхности датчика под полимерную сетку;

б) сшивка биомолекул между собой (рис. 4-б);

в) ковалентное связывание с поверхностью преобразователя. Главные достоинства метода ковалентного связывания состоят в том, что, с одной стороны он обеспечивает надежную связь биоматериала с подложкой и предотвращает его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с длительным временем жизни (рис.4-в); [3]

г) иммобилизация путем включения микроорганизмов в мембраны различного происхождения (рис. 4-д)

д) капсулирование, основано на том, что ферменты размещаются вблизи электрода, отделенные от остального раствора полупроницаемой мембраной, через которую могут проходить молекулы аналита и продукты каталитической реакции. Фактически ферменты находятся в свободном состоянии, однако они локализованы в одной части измерительной ячейки.



Рис. 4 - Схемы иммобилизации биоматериала на преобразователе на примере ферментов: а - адсорбция; б - сшивка; в - ковалентное связывание; г - сшивка и ковалентное связывание; д - включение

1.3.1 Химическая и физическая адсорбция

Одним из самых распространенных методов иммобилизации клеток является адсорбция, которая может быть физической или химической (хемосорбция). Адсорбцией пользуются, главным образом, на стадии исследований, когда достаточно слабого прикрепления биологического материала к преобразователю, а от сенсора не требуется длительной эксплуатации.

Ферменты адсорбируются на поверхности многих материалов. В числе таких материалов - алюминий, уголь, глина, целлюлоза, каолин, силикагелъ, стекло, коллаген и др. Для адсорбции не требуется ни дополнительных реагентов, ни отдельной стадии очистки. Метод практически не нарушает нативной конформации фермента или других белков. Однако белки располагаются неупорядоченно.

При физической адсорбции биоматериал удерживается Ван-дер-ваальсовыми силами, реже водородными и множественными солевыми связями и, в подходящих условиях, за счет образования комплексов с переносом электронов.

Химические методы иммобилизации клеток основаны на образовании ковалентных связей между поверхностью клеток и материалом носителя, то есть клетка химически пришивается к носителю. Это может осуществляться как на поверхности соответствующего нерастворимого материала, так и в объеме носителя (если при формировании матрицы в присутствии иммобилизованных клеток происходят химические реакции присоединения, затрагивающие функциональные группы биополимеров клеток).

1.3.2 Иммобилизация клеток путем включения в массу носителя (включение)

В методе включения биологический материал смешивают с раствором мономера, а затем к раствору добавляют инициатор полимеризации, в результате чего образуется гель, в который включен биоматериал. Полимерные гели предотвращают вымывание клеток микроорганизмов и обеспечивают доступ субстратов и кислорода.

Гель - система полимер-растворитель, пространственная сетка которой стабилизирована по всему своему объему устойчивыми во времени межмолекулярными связями. Различают гели 1-го и 2го рода. Пространственная сетка полимерных гелей 1-го рода образована ковалентными связями (химические сетки). Хорошо известными примерами таких материалов являются полиакриламидные гели, силикагель, гели типа сефадексов (поперечно-сшитые декстраны), полистирольные ионообменные смолы и др. В гелях 2-го рода пространственная сетка поддерживается за счет сил нековалентной природы (водородные связи, гидрофобные взаимодействия, зона образования кристаллитов; это - физические сетки). Примерами таких систем являются гели желатины, агара и агарозы, крахмала и др. Данным гелевым матрицам присуще обратимое плавление - застудневание при изменении температуры, поэтому их обычно называют термообратимыми. Существуют полимеры, растворы которых желируют при охлаждении (наиболее распространены), но есть высокомолекулярные соединения, растворы которых превращаются в гели при нагревании (например, водные растворы метилцеллюлозы) [8].

К недостаткам, связанных с использованием гелевых матриц относится: трудоемкость изготовления рецепторного элемента, необходимость специального подбора для каждого конкретного микроорганизма условий иммобилизации, снижение пластической прочности гелей после иммобилизации. Также через гели часто плохо диффундируют субстраты, что замедляет ферментативную реакцию. Кроме того, со временем фермент может вытекать из геля, что приводит к уменьшению биологической активности распознающего элемента.

Биорецепторные элементы на основе клеток, иммобилизованных в гелевых матрицах, как правило, характеризуются более низкими откликами по сравнению с элементами на основе адсорбированных клеток, причем для отдельных субстратов наблюдается резкое снижение откликов, то есть в зависимости от метода иммобилизации изменяется и субстратная специфичность клеток микроорганизмов. Это связано с тем, что при иммобилизации происходит полная или частичная блокировка активных центров ферментов, отвечающих за окисление этих субстратов. А так же затрудняется диффузия субстрата к клеткам.

Для иммобилизации биоматериала часто используется поливиниловый спирт. ПВС - доступный продукт многотоннажного синтеза, каждая его марка стандартизована, выбор этих марок достаточно широк. Известно так же что полимер-гелеобразователь поливиниловый спирт химически и микробиологически стабилен, нетоксичен и биосовместим [20], поэтому может быть эффективно использован в качестве матрицы для иммобилизации клеток микроорганизмов с целью увеличения пористости, долговременной и операционной стабильности биорецепторных элементов. [17]

В работе [21] описана модификация поливинилового спирта (ПВС) N-Винилпирролидоном (ПВП). Предпополагаемый механизм сшивки поливинилового спирта N-Винилпирролидоном с участием ионов Се+4 в качестве инициатора, приводящего к появлению оксильных радикалов, приведен ниже:

Рис. 5 - Предполагаемый механизм сшивки поливинилового спирта N-винилпирролидоном

Формирование рецепторного элемента может проведено путем включения клеток микроорганизмов в гель поливинилового спирта (ПВС), модифицированного N-винилпирролидоном (N-ВП), в силу того что N-поливинилпирролидон легко образует комплексы со многими соединениями (токсинами, лекарственными веществами, красителями), совмещается с различными веществами, лекарственными средствами, нетоксичен, является основой кровезаменителей. [22]

Схема включения клеток в гель на основе поливинилового спирта, модифицированного N-Винилпирролидоном представлена на (рис.6)



Рис. 6 - Включение клеток в гель на основе поливинилового спирта, модифицированного N-Винилпирролидоном

1.4 Биохимическое потребление кислорода

К основным показателям качества воды относят:

- органолептические показатели: запах, вкус и привкус, мутность и прозрачность, пенистость;

- общие и суммарные показатели: температура, водородный показатель (рН), щелочность и кислотность, растворенный кислород (РК), биохимическое потребление кислорода (БПК), окисляемость, или химическое потребление кислорода (ХПК);

- минеральный состав: карбонаты, сульфаты, хлориды, сухой остаток, кальций, магний, общая жесткость, натрий, калий и т.д.;

- биогенные элементы: аммоний, нитраты, нитриты, фосфаты и общий фосфор;

- металлы: сумма тяжелых металлов, железо, алюминий;

- некоторые важнейшие показатели: фтор (фториды), хлор активный, нефтепродукты, поверхностно-активные вещества, фенолы.[23]

Биохимическое потребление кислорода (БПК) - один из часто используемых показателей загрязнения органическими веществами. Природными источниками органических веществ являются разрушающиеся останки организмов растительного и животного происхождения. Существуют также техногенные источники органических веществ: транспортные предприятия (нефтепродукты), целлюлозно-бумажные и лесоперерабатывающие комбинаты (лигнины), мясокомбинаты (белковые соединения), сельскохозяйственные и фекальные стоки и т.д.

В естественных условиях под действием микроорганизмов происходит биохимическое окисление органических веществ: окисляемое вещество - субстрат разлагается под действием растворенного в воде кислорода, при этом выделяющаяся энергия расходуется на поддержание жизненных процессов и роста клеточных веществ. Биохимическое потребление кислорода (БПК) - это количество растворенного кислорода (мг), необходимое для окисления всех биоразложимых органических отходов, находящихся в 1 дм3 воды. Если условно принять суммарное соотношение жизненно необходимых элементов, входящих в состав всех органических соединений, загрязняющих сточную воду, за соединение с простейшей формулой CxHyOzN. Тогда расход кислорода при дыхании будет отвечать следующей схеме [24]:

Коэффициенты перед кислородом означают:

х - на один атом углерода расходуется одна молекула кислорода;

у - на один атом водорода расходуется 1/4 молекулы кислорода.

Содержащийся в соединении кислород в величину БПК не входит, его вычитают, каждый атом составляет половину молекулы кислорода (z/2); азот восстанавливается до аммиака с затратой трех атомов водорода, что соответствует уменьшению количества кислорода еще на 3/4 молекулы.

При синтезе клеточных веществ протекает примерно следующий процесс:

, где



C5H8O2N - среднее соотношение основных элементов в клеточном веществе бактерий.

Суммарное количество кислорода, израсходованного при этих процессах, и отвечает величине БПКполн.. В лабораторных условиях наряду с БПКполн. определяется БПК5 - биохимическая потребность в кислороде за 5 суток. Ориентировочно понимают, что БПК5 составляет около 70% БПКполн., но может составлять от 10 до 90% в зависимости от окисляющегося вещества.

Биохимическое окисление различных органических веществ происходит с разной скоростью. Загрязнители различной природы могут повышать (понижать) значение БПК. Динамика биохимического потребления кислорода при окислении органических веществ в воде приведена на рис. 7.

Рис. 7 - Динамика биохимического потребления кислорода: а - легкоокисляющиеся вещества, в - нормально окисляющиеся вещества, с - тяжело окисляющиеся вещества

К легкоокисляющимся («биологически мягким») веществам относятся глюкоза, мальтоза, формальдегид, низшие алифатические спирты, фенолы, фурфурол. Нормально окисляющиеся вещества - нафтолы, крезолы, резорцин, анионогенные ПАВ, сульфанол, пирокатехин и т.п. К тяжело окисляющимся («биологически жестким») веществам - неионогенные ПАВ, гидрохинон, тимол, сульфонол и т.п. [25]

Искажать характер потребления кислорода может расходование кислорода на нитрификацию (рис.8)

Рис. 8 - Изменение характера потребления кислорода при нитрификации

Нитрификация протекает под воздействием особых нитрифицирующих бактерий - Nitrozomonas, Nitrobacter и др. Эти бактерии обеспечивают окисление азотсодержащих соединений, которые обычно присутствуют в загрязненных природных и некоторых сточных водах, и тем самым способствуют превращению азота сначала из аммонийной в нитритную, а затем и нитратную формы. Соответствующие процессы описываются уравнениями:

2NH4+ + 3O2 = 2HNO2 + 2H2O + 2H+ + Q

2HNO2 + O2 = 2HNO3 + Q

где: Q - энергия, высвобождающаяся при реакциях.

Процесс нитрификации происходит и при инкубации пробы в кислородных склянках. Количество кислорода, пошедшее на нитрификацию, может в несколько раз превышать количество кислорода, требуемое для биохимического окисления органических углеродсодержащих соединений. Начало нитрификации фиксируется по минимуму на графике суточных приращений БПК за период инкубации. Нитрификация начинается приблизительно на 7-е сутки инкубации (см. рис. 10), поэтому при определении БПК за 10 и более суток необходимо вводить в пробу специальные вещества - ингибиторы, подавляющие жизнедеятельность нитрифицирующих бактерий, но не влияющие на обычную микрофлору (т.е. на бактерии - окислители органических соединений). В качестве ингибитора применяют тиомочевину (тиокарбамид), который вводят в пробу либо в разбавляющую воду в концентрации 0,5 мг/см3.[23]

Итак, полным биохимическим потреблением кислорода (БПКполн.) считается количество кислорода, требуемое для окисления органических примесей до начала процессов нитрификации.

В поверхностных водах величина БПК колеблется в пределах от 0,5 до 5,0 мг/дм3; она подвержена сезонным и суточным изменениям, которые, в основном, зависят от изменения температуры и от физиологической и биохимической активности микроорганизмов. Весьма значительны изменения БПК5 природных водоемов при загрязнении сточными водами.[26]

Норматив на БПКполн. не должен превышать: для водоемов хозяйственно-питьевого водопользования - 3 мг/дм3, для водоемов культурно-бытового водопользования - 6 мг/дм3. Соответственно можно оценить предельно-допустимые значения БПК5 для тех же водоемов, равные примерно 2 мг/дм3 и 4 мгО2/дм3. В таблице 1 приведены значения БПК5 для водоемов разных классов

Таблица 1 - Величины БПК5 в водоемах с различной степенью загрязненности

Степень загрязнения (классы водоемов)	БПК5, мг/дм3
Очень чистые	0,5-1,0
Чистые	1,1-1,9
Умеренно загрязненные	2,0-2,9
Загрязненные	3,0-3,9
Грязные	4,0-10,0
Очень грязные	10,0

Определение БПК5 в поверхностных водах используется с целью оценки содержания биохомически окисляемых органических веществ, условий обитания гидробионтов и в качестве интегрального показателя загрязненности воды. Значение БПК говорит биологу о потенциальной возможности сточных вод истощать запасы кислорода в реке. Этот показатель - весьма важный индикатор загрязнения воды, так как недостаток кислорода приводит к гибели рыбы, а также порождает неприятный запах и развитие популяций нежелательных организмов, устойчивых к разного рода загрязнениям.

Определение концентрации растворенного кислорода при анализе воды на БПК может выполняться различными методами.

1.4.1 Определение БПК5 методом разбавления

Определение БПК5 проводится в первоначальной или соответственно разбавленной пробе по разности между содержанием кислорода до и после инкубации в течение пяти суток без доступа кислорода и света. Инкубацию проводят в режиме постоянной температуры (20±1)°С, причем от точности поддержания значения температуры зависит точность выполнения анализа на БПК. Погрешность в определении БПК может внести также освещение пробы, влияющее на жизнедеятельность микроорганизмов и способное в некоторых случаях вызывать фотохимическое окисление. Поэтому инкубацию пробы проводят без доступа света (в темном месте).[23]

Содержание кислорода в первоначальной или разбавленной пробе должно оставаться в течение всего периода инкубации таким, чтобы были обеспечены нормальные условия протекания аэробных биохимических процессов. Эти условия будут соблюдены, если анализируемая проба перед началом определения будет насыщена кислородом воздуха (приблизительно до 8-9 мг/дм3 при 20°С) и если во время инкубации произойдет снижение концентрации кислорода на 2 мг/дм3 или больше, но так, чтобы спустя пять суток она составляла не менее 2 мг/дм3.

Исследуемую воду (при 20°С) аэририруют путем встряхивания или продувки воздуха. Далее определяют содержание кислорода в первоначальной или разбавленной пробе одним из следующих методов - йодометрическим определением по Винклеру, полярографическим пирофосфатным, или электрометрическим методами.

Определив содержание растворенного кислорода в полученной смеси, ее оставляют в закрытой склянке на 5 суток при 20 °С без доступа воздуха и света. Затем вновь определяют содержание растворенного кислорода. Уменьшение количества кислорода в воде показывает, сколько его за это время израсходовано на окисление органических веществ, находящихся в сточной воде. Это количество, отнесенное к 1 дм3 сточной воды, и является биохимическим потреблением кислорода сточной водой за данный промежуток времени (БПК5).

1.4.2 Определение БПК манометрическим методом

Данным метод основан на том, что в сосуде для определения БПК над жидкостью находится воздух, объем которого четко определяется объемом пробы воды. На биологическое разрушение органических примесей воды расходуется кислород, содержащийся в воздухе над жидкостью. Гранулы гидроксида натрия или калия предназначены для поглощения углекислого газа, образующегося в результате биологического разрушения. Для интенсивного массообмена между жидкой и газовой фазами предусмотрено непрерывное перемешивание. В течение времени количество кислорода в объеме воздуха над пробой воды уменьшается, в результате чего давление внутри сосуда снижается. Снижение давления измеряется датчиком в крышке, которой закрывается сосуд. Диапазон измерений БПК от 0 - 40 до 0 - 4000 мг/дм3, в зависимости от объема пробы и ожидаемого значения.[27]



Рис. 9 - Манометрические датчики OxiTop для определения БПК

Вычисление результатов анализа.

Снижение давления, зафиксированное датчиком, пропорционально количеству поглощенного кислорода, которое пересчитывается в значение БПК по формуле:

, где

M(O2) - молекулярная масса кислорода, 32000мг/моль

R - универсальная газовая постоянная, 83,144 мбар/к•моль

Т0 - исходная температура, к

Т1 - температура измерения, к

V0 - теоритический объем бутыли, см3

V1 - объем пробы, см3

б - коэффициент адсорбции Бунзена

Др(О2) - парциальное давление кислорода

Преимущества манометрического метода по сравнению с методом Винклера в том что воздействия на образец воды сведено к минимуму. Использование OxiTop намного упрощает измерение БПК, так как он автоматически запоминает измеренные значения. Все сохраненные в памяти прибора значения можно считать в любой день. К разбавлениям приходиться прибегать редко, что снижает трудо- и времяемкость анализа. Иными словами количество рутинных операций при использовании OxiTop минимально. Однако метод не избавляет от главного недостатка - 5-ти суточной инкубации.

1.4.3 Методы определения БПК с помощью биосенсоров

Большинство описанных в литературе БПК биосенсоров являются целоклеточными микробными сенсорами биокленочного типа, которые основаны на измерении скорости дыхания бактерий вблизи поверхности преобразователя. Первая работа, посвященная созданию подобного сенсора, была опубликована Karube et al. в 1977 г [28]; в качестве биоматериала были использованы микроорганизмы, взятые из активного ила очистных сооружений. К настоящему времени известно значительное количество лабораторных моделей и несколько промышленно выпускаемых биосенсорных анализаторов БПК. Такие анализаторы позволяют производить определение БПК в среднем диапазоне 5-300 мг/дм3 за время порядка нескольких минут; в качестве модельного соединения для калибровки прибора обычно используется смесь растворов глюкозы и глутаминовой кислоты или другие смеси органических соединений (так называемые синтетические сточные воды).

Разрабатываемые БПК-биосенсоры описанные в литературе разлчаются выбранными штаммами микроорганизмов или аасоциаций [29-38], способами иммобилизации [38], способами фиксации аналитического сигнала [39-42], а также применяемыми стандартами для калибровки датчиков [40], что позволяет повысить точность определения БПК.

Например, использование смешанных культур дает возможность расширения спектра биодеградируемых соединений (и, следовательно, обеспечивает более полное определение БПК), оборотной стороной этого подхода в большинстве случаев является сниженная стабильность и воспроизводимость результатов, что бывает связано с динамикой соотношения различных культур в биорецепторе. Поэтому, наряду с использованием активного ила и других смесей микроорганизмов, при конструировании БПК-сенсоров используют и чистые культуры бактерий и грибов, характеризующихся расширенным спектром метаболизируемых субстратов (т.е. широкой субстратной специфичностью). Примерами подобных приборов могут являться сенсоры, описанные в работах [29-37] и др.

Одним из микроорганизмов, наиболее часто используемых в составе БПК-сенсоров, является Trichosporon cutaneum [36-37]. Разными авторами опубликовано не менее десяти работ, посвященных созданию БПК-сенсоров на его основе; кроме того, он используется в ряде коммерческих анализаторов БПК. Пример подобного сенсора описан в работе [37]. Созданный прибор позволял определять БПК в диапазоне 0,2-18 мг/дм3. Время жизни биорецептора составляло 3 сут. Разброс показаний при измерении идентичных образцов не превышал 8%. Сенсор был использован для анализа промышленных и муниципальных сточных вод.

В некоторых разработанных БПК - биосенсорах для повышения корреляции со стандартным методом проводится предварительная пробоподготовка. Так, например, разработана система для определения низкого биохимическое потребление кислорода в реках с предварительным озонированием [44]. Реки содержат много бионедоступных органических веществ, таких как гуминовые кислоты и лигнин. Свободные радикалы, образованные саморазложением озона, использовались как мощный оксидант, чтобы расколоть органические вещества. При значении БПК 1 мг/дм3, ответ датчика после озонирования был в 1,6 раз выше, чем до озонирования. Время ответа БПК - биосенсора составляло 5 минут и не зависело от значения БПК, нижний предел обнаружения составлял 0,5 мг/дм3 БПК. Разработанная система была применена для определения БПК в реках. Была показана хорошая корреляция между ответом биосенсора и стандартным методом определения БПК5 (R = 0,989).

Описанные выше сенсоры основаны на использовании амперометрических кислородных преобразователей, как правило, электродов Кларка, однако это - не единственный возможный подход к созданию БПК-сенсоров. Следует отметить, что на значение БПК, определяемого с помощью микробного дыхания, влияют количество растворенного кислорода в образце. Известно, что некоторые синтетические соединения (искусственные акцепторы электронов) способны восстанавливаться определенными микроорганизмами, т.е. конкурируют за электроны с кислородом (естественным акцептором электронов). Если эти соединения обладают обратимыми окислительно-восстановительными свойствами, то они могут служить переносчиками электронов от биокаталитических систем микроорганизмов на электрод (медиаторами электронного транспорта). Преимущество использования медиаторов заключается в том что: результаты измерений становятся практически независимыми от парциального давления кислорода в среде и, если в процессе окисления восстановленного медиатора не участвуют протоны, то медиаторный электрод может быть относительно нечувствителен к изменениям рН. Таким образом, одним из наиболее перспективным направлением является разработка БПК-биосенсоров с применением медиаторов электронного транспорта [39-42].

В последнее время большое количество работ посвящено разработке БПК-биосенсоров оптического типа [45-48].

Это связано с тем, что оптические биосенсоры обладают высокой чувствительностью и, соответственно, позволяют определять низкие значения БПК.

Еще один подход к детекции БПК основан на регистрации изменений температуры, вызванных микробиологической деструкцией органических соединений. Этот подход основан на использовании калориметрических преобразователей; биосенсор на основе такого преобразователя описан в работе [49].

В зарубежной статье [50] на базе амперометрического датчика кислорода с ограниченной диффузией (кислородный электрод Кларка) был создан микробный БПК-датчик и исследована зависимость его выходного сигнала от биохимической потребности в кислороде сточных вод. Калибровка датчика БПК была выполнена в стационарном и динамическом режимах измерений с использованием растворах синтетических сточных вод (OECD). Результаты показали широкий диапазон определяемых концентраций (до 230 мг/дм3 БПК7), а также быстрый ответ и время регенерация раз в динамическом режиме анализа. Данные, полученные на стационарном метод показали лучшую воспроизводимость, особенно в оценке БПК7 реальных сточных вод. После калибровки датчика БПК был использован для быстрой оценки БПК городских сточных вод.

В сточных водах с высоким содержанием жира был использован Aeromonas hydrophila P69.1 (А. hydrophila) штамм для создания полуспецифичного биосенсора для оценки биохимического потребления кислорода(БПК). В данной статье сравнивались биосенсоры на основе клеток А. hydrophila и P. fluorescens. Клетки А. hydrophila выращивали в среде, содержащей жир, чтобы вызвать образование необходимые ферменты для транспорта и деградации жирных веществ. Универсальный биосенсор на основе неспецифических specific Pseudomonas fluorescens P75 (P. fluorescens) был использован для проведения экспериментов сравнения. Биосенсоры были откалиброваны с помощью синтетических сточных вод (OECD) и стационарного метода. Линейный диапазон биосенсорова на основе А. hydrophila составил до 45 мг/дм3 БПК7, по сравнению с 40 мг/дм3 БПК7 полученных с помощью биосенсора на основе P. fluorescens. Нижний предел обнаружения обоих биосенсоров составил 5 мг/дм3 БПК7. Срок службы биосенсоров на основе A. hydrophila и P. fluorescens составил 110 и 115 дней соответственно. Время отклика биосенсоров зависело от БПК7 и составляло до 20 мин при анализе различных сточных вод. Оба биосенсора занижали БПК в сточных водах мясоперерабатывающих предприятий с 43% до 71%, но более точные результаты могут быть получены с помощью биосенсора на основе A. hydrophila. Полу-специфичным биосенсором на основе A. hydrophila удалось измерить долю жира в образцах сточных вод, в то время как другие трудноокисляемые соединения не поддавались обнаружению обоих биосенсоров.

Рис. 10 - (А) Схематическое представление биосенсорной измерительной системы: 1 компьютер, 2: измерительный модуль, 3 блок аэрации, 4: биосенсор, 5 магнитная мешалка. (B) устройство биосенсора: 1: датчик растворенного кислорода, 2: вставочное кольцо, 3: мембрана, 4 держатель

В данной работе [52] предложен метод, использующий совместно иммобилизованные клетки Escherichia coli (E.coli), в качестве биокатализатора и нейтральный красный (NR), в качестве искусственного акцептора электронов, для модификации стеклоуглеродного электрода (GCE) для измерения биохимического потребления кислорода (БПК). Два разных подхода модификации GCE были использованы и сравнены. В одном подходе, нейтральный красный был элктрополимеризован на поверхности GCE, и клетки E.coli были смешаны с сополимером PVA-g-PVP (кратко gPVP) и нанесены на пленку NR для получения комплекса (gPVP/E. coli)/PNR/GCE. Во втором подходе, как клетки E.coli так и NR были смешаны с сополимером gPVP и нанесены на GCE, образуя комплекс (gPVP/E. coli/NR)p/GCE. На основе оценки электрохимических свойств, производительность последнего модифицированного электрода была лучше, что может быть обусловлено тем, что NR осаждается на поверхности E.coli вызывая хороший электронный транспорт и проницаемость мембран клеток. Для развития результатов, полученных с использованием (gPVP/E. coli/NR)p/GCE дальше, были использованы нанотрубки TiO2, а также различные эффекты на образцах ГГС, OECD, мочевины и реальных сточных вод. Эти результаты показывают, что данный метод имеет потенциальное применение для быстрого определения БПК с помощью биосенсоров.[52]

В стать [53] для контроля очистки сточных вод от промышленности латекса в качестве рецепторного элемента БПК-биосенсора использовались иммобилизованная смесь микроорганизмов. Принцип измерения был основан на определении потребления кислорода вызванного клеточным дыханием. В качестве смеси для калибровки БПК-биосенсора согласно требованиям Организация экономического сотрудничества и развития использовались синтетические сточные воды (OECD). Время ответа биосенсора составляло 10 - 15 минут. БПК втекающих и вытекающих из анаэробного реактора вод измеряли как методом с использованием биосенсора, так и стандартным методом БПК5 . Был достигнут высокий уровень корреляции между данными, полученными обоими методами, разница между значениями составила менее 10%. Однако при использовании данной смеси культур для анализа сточных вод другого производства уровень корреляции со стандартным методом был низкий. БПК - биосенсор был успешно применен для off-line и on-line мониторинга процессов анаэробной обработки.