Новые возможности применения диметилацеталя диметилформамида при получении производных органических соединений для их хроматографического и хромато-масс-спектрометрического анализа

Размещено на http://www.allbest.ru/

Санкт-Петербургский государственный университет

Химический институт

Кафедра органической химии

Дипломная работа

Новые возможности применения диметилацеталя диметилформамида при получении производных органических соединений для их хроматографического и хромато-масс-спектрометрического анализа

Студентки 5 курса

Пушкаревой Татьяны Ивановны

Научный руководитель

д.х.н., проф. Зенкевич Игорь Георгиевич.

Санкт-Петербург 2015 г.

Содержание

Введение

1. Обзор литературных данных

1.1 Синтез диалкилацеталей диметилформамида

1.2 Реакции диалкилацеталей диметилформамида

1.2.1 Алкилирование соединений, содержащих группы с активными атомами водорода

1.2.2 Диметилацеталь диметилформамида как эквивалент карбонильной группы при образовании оснований Шиффа в реакции с первичными аминами

1.2.3 Реакции вторичных аминов с DMF-DMA

1.2.4 Другие реакции DMF-DMA в органическом синтезе

1.3 Применение диметилацеталя диметилформамида в качестве реагента для дериватизации аналитов в газовой хроматографии

1.3.1 Алкилирование соединений с активными атомами водорода

1.3.2 Получение N-DMAM производных первичных аминов

1.3.3 Взаимодействие вторичных аминов с DMF-DMA

1.3.4 Получение производных аминокислот

2. Экспериментальная часть

2.1 Реагенты

2.2 Условия проведения реакции

2.3 Условия газохроматографического анализа

2.4 Условия масс-спектрометрического анализа

2.5 Обработка результатов

3. Обсуждение результатов

3.1 Особенности выбора неподвижной фазы

3.2 Проверка возможности дериватизации аминокислот DMF-DMA на модельных соединениях

3.3 Методы расчета RI с использованием аддитивных схем

3.4 Закономерности масс-спектрометрического распада N-DMAM производных аминов

3.5 Механизм реакции дериватизации аминокислот DMF-DMA

3.6 Особенности реакции DMF-DMA с аминокислотами содержащими -SH, -NH-, -OH группы

3.7 Закономерности масс-спектрометрического распада N-DMAM-Me производных аминокислот

3.8 Идентификация продуктов взаимодействия DMF-DMA с аминокислотами с использованием аддитивной схемы

3.9 Дериватизация карбонильных соединений DMF-DMA. Идентификация продуктов взаимодействия карбонильных соединений и DMF-DMA с использованием аддитивных схем

3.10 Закономерности масс-спектрометрического распада DMAM производных карбонильных соединений

Выводы

Список литературы

Приложение

Введение

Непосредственный газохроматографический анализ нелетучих и термически нестабильных соединений невозможен. Для его осуществления в стадию пробоподготовки может быть включена обработка аналитов различными реагентами с целью получения их производных (дериватизация). В газовой хроматографии это необходимо для перевода нелетучих соединений в более летучие производные, снижения их полярности, и, как следствие, улучшения хроматографических характеристик.

Однако далеко не все возможные органические реакции находят применение в аналитических целях. Для реакций дериватизации существует несколько критериев [1]:

· Экспериментальные операции должны быть максимально простыми. Предпочтительно проведение реакции при комнатной температуре за минимальное время. Для сокращения времени допустимо нагревание реакционных смесей в запаянных ампулах. Возможно проведение реакции при дозировании реакционной смеси в нагретый испаритель хроматографа или хромато-масс-спектрометра (так называемая флеш-дериватизация).

· Количество стадий должно быть минимальным. Многостадийные процессы должны соответствовать принципу "single pot". Процедура не должна включать извлечение производных, удаление избытка реагентов и побочные, а побочные продукты не должны влиять на проведение анализа, и должны легко отделяться от целевых веществ.

· Выходы продуктов должны быть максимальными и воспроизводимыми.

· Реакция одного субстрата с одним реагентом должна приводить к образованию, желательно, одного производного.

При наличии в соединении нескольких функциональных групп с активными атомами водорода для получения летучих производных требуется их одновременная замена на ковалентно связанные фрагменты. В середине 1970-х годов был предложен новый тип реагентов для одновременной дериватизации -СO₂H и -NH₂ групп - диалкилацетали N,N-диметилформамида. К настоящему времени эти реагенты получили широкое распространение, особенно диметилацеталь N,N-диметилформамида (1, DMF-DMA). Используют также диэтил-, диизопропил- и ди-трет-бутилацетали диметилформамида.

R = CH3, CH2CH3, CH(CH3)2, C(CH3)3.

Свободные аминокислоты (2) разлагаются при плавлении, поэтому для газохроматографического определения их необходимо переводить в летучие, термически стабильные производные. DMF-DMA взаимодействует с первичными аминами X-NH₂ [2] с образованием формамидинов или, иначе, N-(диметиламино)метиленовых производных аминов или N,N-диметил-формимидамидов Х-N=CH-N(CH₃)₂ (3), и, в то же время, обеспечивает превращение карбоксильных групп в метоксикарбонильные. Таким образом, модификация обеих функциональных групп происходит в одну стадию, достаточно быстро, выделение продуктов не требуется, из каждой аминокислоты обычно образуется только одно производное.

DMF-DMA можно использовать и как реагент для дериватизации других соединений. Вторичные амины образуют N-формильные производные [3]. Кроме того, DMF-DMA используют для алкилирования других соединений, содержащих группы с активными атомами водорода, в том числе карбоновых кислот, фенолов и тиолов [4].

Литературный обзор включает сравнительную характеристику химических свойств реагентов класса диалкилацеталей диметилформамида, определяющих возможности их применения в газовой хроматографии. При рассмотрении свойств этих реагентов была обнаружена еще одна интересная для газохроматографического анализа реакция. Это взаимодействие DMF-DMA с соединениями, содержащими активные CH₃- и CH₂-группы, которое приводит к образованию N-DMAM производных в б-положениях к карбонильной группе. Ранее эту реакцию использовали только в синтетических целях. Её возможности в качестве реакции дериватизации в настоящей работе охарактеризованы впервые.

Содержание настоящей дипломной работы составило предмет двух статей (в печати) [5,6] и двух сообщений на Всероссийской и международной конференциях [7,8].

1. Обзор литературных данных

1.1 Синтез диалкилацеталей диметилформамида

При взаимодействии комплекса тетрафторбората триэтилоксония (4) с N,N-диметилформамидом получается тетрафторборатная соль (5). Обработка этой соли этилатом натрия приводит к получению диэтилацеталя N,N-диметилформамида (6). Ацетали других диалкиламидов (7) с выходами 50-60 % образуются при обмене диметиламиногруппы в реакции с диалкиламинами с более высокими температурами кипения.

Возможен синтез ацеталей амидов из имидоилхлорида, который получали из N,N-диалкиламидов (8) и фосгена, тионилхлорида или пентахлорида фосфора. Имидоилхлориды (9) при взаимодействии с двумя эквивалентами алкоголята натрия через промежуточные хлорангидриды амидоэфиров (10) образуют ацетали (11).

Известен метод синтеза ацеталей амидов из дихлорамина (12), который получают реакцией диалкиламинов с дихлоркарбеном. Дихлорамин далее обрабатывают алкоголятом натрия.

Алкилирование DMF диметилсульфатом дает катион (13), алкоголиз которого также приводит к получению ацеталей амидов [9].

Последний метод часто используют на практике. Первую стадию проводят при нагревании реакционной смеси при 75 С в течение трех часов. Вторую - при 30-60 С в течение 30 минут с последующим понижением температуры до -5 С проводят в петролейном эфире [10, 11]. Этот метод был оптимизирован для промышленного использования при мольном соотношении метилата натрия и диметилсульфата 1.2:1. Эти условия позволяют увеличить выход продукта с 40-70 % до 76-80 %, а его чистота достигает 98 % [12].

Метоксигруппы и метиновый протон DMF-DMA способны к дейтерообмену с CD₃OD [13].

1.2 Реакции диалкилацеталей диметилформамида

1.2.1 Алкилирование соединений, содержащих группы с активными атомами водорода

При алкилировании фенолов DMF-DMA по гидроксильной группе отмечено некоторое влияние природы заместителей в бензольном кольце на скорость реакции. При наличии электроноакцепторных групп в пара-положении реакция идет быстрее, чем в случае донорных заместителей. Реакцию можно проводить как при обычном нагревании, так и при микроволновом облучении, что предпочтительно для термически неустойчивых субстратов [14].

Реакция метилирования крезола очень чувствительна к увеличению температуры и мощности микроволнового излучения, однако, по мнению авторов [14], увеличение ее скорости обусловлено только тепловым эффектом. Полагают что, увеличение скорости реакции фенолов с электроноакцепторными заместителями в пара-положениях обусловлено уменьшением их констант кислотности (pK_a), что приводит к увеличению концентрации катионов алкоксиаммония (14), являющихся интермедиатами в этой реакции. Если в соединении присутствуют две группы с активными атомами водорода (16, 17), то в реакцию вступают обе. Реакция алкилирования легко идет в бензоле [15], толуоле [16] и других растворителях. Кроме того, DMF-DMA реагирует с соединениями, содержащими активные CH₃-группы, например, п-гидроксиацетофеноном с образованием енаминокетона (18) [14].



1.2.2 Диметилацеталь диметилформамида как эквивалент карбонильной группы при образовании оснований Шиффа в реакции с первичными аминами

Антраниловую кислоту (19), 2- и 4-аминоникотиновые кислоты и 3-аминоизоникотиновую кислоту (20) вводили в реакцию с DMF-DMA с целью последующего получения различных производных хинозалина [17, 18]. Сначала из этих кислот получают амидиноэфиры (21, 22), которые далее подвергаются катализируемой кислотой циклизации при добавлении алифатического амина с образованием 3-замещенных хинозалин-4-онов (23, 25). Очистка промежуточных соединений трудоемка (перегонка при пониженном давлении) из-за нестабильности промежуточных амидиноэфиров (21), которые могут подвергаться гидролизу на силикагеле с образованием соответствующих N-формильных производных (24). Модификацию обеих групп (карбоксильной и амино) проводят при микроволновом облучении в течение не менее 15 минут. Наличие электроноакцеторных заместителей в бензольном кольце не влияет на реакцию образования амидиноэфира [17].



Реакция 19 и 20 с DMF-DMA. 19: X = CH, Z = CH, Y = CH - антраниловая кислота, 20: X = N, Z = CH, Y = CH - 2-аминоникотиновая кислота, X = CH, Z = CH, Y = N - 4-аминоникотиновая кислота, X = CH, Z = N, Y = CH - 3-аминоизоникотиновая кислота.

По данным кинетических экспериментов установлено, что модификация аминогрупп происходит за пять минут при температуре не выше 100 С и микроволновом облучении, тогда как образование эфира требует большего времени (15 минут) в тех же условиях [18].

Можно сравнить два варианта синтеза соединения (28), чтобы показать эффективность использования DMF-DMA. В первом варианте синтеза получение 6-нитро-3H-хиназолин-4-она (27) проводят при микроволновом нагреве 5-нитроантраниловой кислоты (26) c 5 экв DMF (150° C). Продукт циклизации алкилируют бензилбромидом в положение 3 в присутствии гидрида натрия при атмосферном давлении.



В другом варианте синтеза соединения (28) 5-нитроантраниловую кислоту (26) сначала обрабатывают DMF-DMA при микроволновом нагреве при температуре 105 °С в течение 15 мин. Полученный N,N-диметилформамидин (29) нагревают с бензиламином в присутствии уксусной кислоты в течение 20 минут. Соединение (28) было получено в две стадии с хорошим выходом (92 %), следовательно, этот вариант можно считать более эффективным и более простым [19].

DMF-DMA используют в качестве реагента для обратимой защиты первичных аминогрупп. Получаемые при этом основания Шиффа вступают в различные реакции с сохранением защитной группы (30), после чего защиту снимают концентрированной кислотой или водным раствором аммиака (28 %) в этаноле при 40 єС в течение пяти часов [20].

В статье [21] описано одностадийное преобразование аминогруппы в 1,3,4-триазольный фрагмент. Соединение (31) обрабатывали смесью DMF-DMA и формилгидразина в ацетонитриле с получением соединения (32), которое далее алкилировали с образованием (33) [21].

1.2.3 Реакции вторичных аминов с DMF-DMA

DMF-DMA реагирует со вторичными аминами с образованием новых ацеталей (34). Обменная реакция амина происходит с одной метоксигруппой диалкилацеталя диметилформамида, продуктом является соединение (35). Обмен второй метоксигруппы приводит к ортамиду (36).

Реакционная способность аминов по отношению к DMF-DMA возрастает в ряду: N-метиланилин (не реагирует), пирролидин (не образует аминалей, ацетали получаются только при нагревании), морфолин (аминали при 30 С, ацеталь при нагревании), пиперидин (аминали, ацеталь при 30 С), диметиламин (равновесие достигается в течение двух минут). Какие-либо корреляции между скоростями реакций и основностью аминов не выявлены. Меньшую реакционную способность пиперидина по сравнению с диметиламином объясняют стерическими факторами [13].

1.2.4 Другие реакции DMF-DMA в органическом синтезе

Выше уже было упомянуто взаимодействие DMF-DMA с соединениями, содержащими активные группы -CH₃, что приводит к образованию продуктов с двойными связями С=С. Один из примеров таких свойств DMF-DMA - реакция Леймгрубера-Батчо (Leimgruber-Batcho). Она включает следующие стадии [22]:

1. Конденсация 2-метил-3-нитропиридина с диметилацеталем N,N-диметилформамида. Реакция идёт при кислом катализе [23];

2. Алкилирование или ацилирование промежуточного енамина;

3. Циклизация промежуточно образующихся N-DMAM производных с образованием азаиндолов.

Функционализация С-3 атома индолов основана на электроноизбыточных свойствах этих гетероциклов. Однако если один атом углерода в бензольном кольце заменен атомом азота, прямая функционализация С-3 положения азаиндолов невозможна, поскольку азаиндольные гетероциклы электрононедостаточны. Прямая функционализация С-3 положения азаиндолов ограничена ацилированием под действием кислот Льюиса, галогенированием, и участием в реакции Манниха [22].

Двухстадийный синтез Леймгрубера-Батчо используют для синтеза 4- и 6-азаиндолов из соответствующих 2-метил-3-нитропиридина (38) или 4-метил-3-нитропиридина (37), которые конденсируют с DMF-DMA с получением интермедиатов (39) и (40). Последующее восстановление нитрогруппы сопровождается их циклизацией с образованием 6-аза- (41) или 4-азаиндола (42).

Интермедиаты (39) и (40) (енамины) могут вступать в реакции с электрофильными реагентами с получением замещенных енаминов (43) и (44). Последующее восстановление нитрогруппы сопровождается циклизацией и приводит к 3-замещенным азаиндолам (45) и (46).

Алкилирование (39) (например, бензилбромидом, 4-фенилбензилбромидом, бромистым аллилом, 2-диэтиламиноэтилбромидом) легко происходит в присутствии основания Хюнига (изо-Pr₂NEt) в диоксане при 115 °С [24].

Аналогично, 5-нитропиримидин-4(3Н)-оны (47) в результате обработки DMF-DMA при 100 °С образуют (Е)-енамины (48). Их каталитическое гидрирование приводит к пирроло[3,2-d]пиримидинам (49) [25].

В реакции соединения 50 с DMF-DMA в безводном DMF получается соответствующий пиразоло[3,4-d]пиримидин (51) [24].



R - 9,10-антрахинон-2-ил.

Взаимодействие соединения (52) с DMF-DMA в сухом диоксане дает 2-циано-3-диметиламино-N-(9,10-диоксо-9,10-дигидро-антрацен-2-ил)акриламид (53), который может быть преобразован в производное пиразола (54) при нагревании с гидразин-гидратом [25].

R - 9,10-антрахинон-2-ил.

Соединения (55) легко реагируют с DMF-DMA в толуоле при 80 °С, с образованием енаминов (56) с выходами 80-90 %. Полученные енамины темно-красного цвета, твердые, хорошо растворяются в толуоле, дихлорметане и спирте [26].

При обработке енаминов (56) SnCl₂2H₂O в смеси CH₂Cl₂ / МеОН (1: 1) были получены соответствующие индолы с выходами более 50 %. Хлорид олова (II), был использован по двум причинам: во-первых, этот реагент не восстанавливает нитрогруппы в ароматическом кольце, а, во-вторых, реакция протекает при комнатной температуре. В аналогичной реакции образуется продукт гидролиза енамина (60) [26].

Взаимодействии соединения (61) с DMF-DMA при 100-120 °С также приводит к образованию соответствующего енамина. При его циклизации происходит образование соединения (62), при отщеплении диметиламина от которого получается соответствующий карбазол (63) [27].

1.3 Применение диметилацеталя диметилформамида в качестве реагента для дериватизации аналитов в газовой хроматографии

1.3.1 Алкилирование соединений с активными атомами водорода

Диалкилацетали диметилформамида могут быть использованы в газохроматографическом анализе для дериватизации различных функциональных групп, содержащих активные атомы водорода, например, для превращения кислот в их метиловые эфиры. Выделение производных не требуется, реакционные смеси можно непосредственно дозировать в газовый хроматограф [4]. По литературным данным основным продуктом реакций с участием DMF-DMA является DMF. Механизм метилирования кислот, как полагают, включает образование карбоксилат-иона кислоты (65) и катиона реагента (66) [24].

Карбоновые кислоты, фенолы и тиолы вступают в реакцию с DMF-DMA с образованием соответствующих алкильных производных, спиртовые гидроксильные группы не подвергаются метилированию. Дериватизация молочной, миндальной, яблочной и винной кислот происходит менее чем за одну минуту. Реакция идет только после растворения аналитов. Такой способ дериватизации подходит для флэш-алкилирования в момент ввода образцов в хроматограф, что позволяет анализировать соединения в наномолярых количествах.

Обычная процедура дериватизации включает растворение аналита в 0.5 мл смеси DMF-DMA и выбранного растворителя (1:1) при нагревании до 100 єС. В качестве таких растворителей для жирных кислот рекомендован пиридин, для аминокислот - ацетонитрил [4]. В альтернативном методе смешивают 50 мг кислоты и 1 мл DMF-DMA в запаянных ампулах, которые нагревают при 60 °С в течение 10 - 15 минут или до полного растворения аналита с последующим газохроматографическим анализом [4].

1.3.2 Получение N-DMAM производных первичных аминов

Дериватизация первичных аминов диалкилацеталями N,N-диметилформамида приводит к образованию оснований Шиффа (68) [2, 29].



На примере циклооктиламина было показано, что его взаимодействие с DMF-DMA в различных растворителях (пиридин, бензол, диметилформамид, хлороформ, дихлорметан, ацетонитрил, изооктан, метанол) идет с количественными выходами. Максимальный выход продукта реакции был зафиксирован через 10 мин после начала реакции, оптимальная температура проведения реакции 100 С, при более высокой температуре происходит термическая деградация реагента [2].

1.3.3 Взаимодействие вторичных аминов с DMF-DMA

Взаимодействие вторичных аминов с диметилацеталем диметилформамида приводит к образованию N-формильных производных (71). Формильные производные элюируются позже исходных аналитов.

100 мкг вторичного амина смешивали со 100 мкл ацеталя, нагревали при 80 С в течение 30 мин. Реакционные смеси либо сразу дозировали в хроматограф, либо разбавляли 1 мл воды и дважды экстрагировали 5 мл этилацетата [30]. Продуктом реакции диалкилацеталей N,N-диметилформамида с дезипрамином (72) оказывается N-формилдезипрамин (74). Строение продуктов авторы доказывают на основании закономерностей их масс-спектрометрической фрагментации [31].



1.3.4 Получение производных аминокислот

Для газохроматографического анализа аминокислот необходима дериватизация обеих функциональных групп. Большинство методов дериватизации этих соединений основаны на алкилировании карбоксильной группы с последующим ацилированием аминогруппы (N-трифторацетильные производные метиловых эфиров, N-ацетилпроизводные пропиловых эфиров, N-трифторацетил-н-бутиловые эфиры и др.). Получение TMS-производных возможно в одну стадию, но оно приводит к нескольким продуктам.

Реакция DMF-DMA с аминокислотами идет только после их растворения. Следовательно, основной проблемой их дериватизации представляется выбор подходящих растворителей. Большинство аминокислот реагирует в течение 20 минут с DMF-DMA в смеси с ацетонитрилом (1:1) при 100 єС. Для растворения аспарагиновой кислоты в этой смеси требуется больше времени (почти один час). Для всех аминокислот отмечено образование единственных производных, в которых модифицированы обе функциональные группы [23, 32]. В лизине обе аминогруппы подвергаются дериватизации. DMF-DMA перед использованием рекомендуется высушивать и перегонять (из-за примесей, мешающих определению производных глицина и аланина). Все полученные производные могут быть использованы для газохроматографического анализа [32].

Рассматриваемый метод дериватизации был применен для определения таурина (76) в плазме крови человека. Кристаллическую аминокислоту нагревали в закрытой виале в смеси с 0.01 мл ацетонитрила и 0.01 мл DMF-DMA при 100 єС в течение трех минут. Для детектирования N-DMAM производного таурина (77) использовали масс-cпектрометр [33].

Гидроксизамещенные аминокислоты дают соответствующие производные без метилирования гидроксильных групп, их дополнительная модификация предполагает получение TMS-эфиров [32]. Примером таких соединений является нуклеозид (78). Для хроматографического анализа сначала проводят его реакцию с DMF-DMA с получением N-DMAM производного, затем О-силанизацию BSTFA и/или TMCS. Реакция c DMF-DMA при комнатной температуре приводит к единственному продукту, время реакции три часа. После выпаривания избытка реагента получают TMS-производное (79) и проводят его хромато-масс-спектрометрический анализ [34, 35].

Этот метод можно использовать также для аминокислот, содержащих вторичные аминогруппы. При этом образуются формильные производные эфиров.

Кристаллические аминокислоты (10-50 мкг) растворяли в DMF-DMA (100 мкл) в реакционной виале (1 мл) и нагревали при 100 °С в течение 15 мин. После охлаждения добавляли 200 мкл воды и затем смесь экстрагировали хлороформом (500 мкл). Хлороформный слой использовали для хромато-масс-спектрометрического анализа (82).

Примером аминокислот со вторичной аминогруппой является 4-(метиламино)бутановая кислота (80). При газохроматографическом анализе N-DMAM производного 4-(метиламино)бутановой кислоты на хроматограмме регистрируются два пика. Компонент с меньшим временем удерживания представляет собой продукт трансаминирования (81). После добавления воды к реакционной смеси его пик исчезает, тогда как второй - увеливается. Это позволило предположить, что N-формильное производное (82) образуется в результате гидролиза промежуточного продукта (81) [3].

Еще одним примером эффективного применения DMF-DMA для дериватизации соединений с несколькими активными атомами водорода является домоевая кислота (83), содержащая три карбоксильные группы и одну вторичную аминогруппу [36].

В ходе изучения литературы выяснены новые возможности использования DMF-DMA в органическом анализе. Реакцию DMF-DMA c соединениями, содержащими активные метильные и/или метиленовые группы в б-полжени к карбонильной группе, до настоящего времени использовали только в синтетических целях. Следует изучить возможность её применения в аналитических целях.

2. Экспериментальная часть

2.1 Реагенты

Для работы мы использовали: диметилацеталь диметилформамида (Aldrich), содержание основного компонента ~ 93%; набор аминокислот (Cerna) х.ч.; смесь реперных н-алканов C₇-C₁₉ с нечетным числом атомов углерода в молекуле (раствор в н-гексане); дихлорметан х.ч. в качестве растворителя.

2.2 Условия проведения реакции

диметилацеталь диметилформамид реагент хроматография

Реакцию дериватизации проводили, используя избыток реагента (50 мкл на 1-2 мг аминокислоты), при нагревании в воздушном термостате до 80 °С в течении часа, в некоторых случаях потребовалось более длительное нагревание и повышение температуры до 100 °С (метионин, глутаминовая кислота, аргинин, лизин, триптофан, тирозин, треонин). Из-за низкой температуры кипения DMF-DMA (102-108 °C), для предотвращения его испарения, реакции проводили в запаянных стеклянных ампулах длиной 4-5 см с внутренним диаметром 3 мм. О протекании реакции судили по растворению аминокислоты. Для большинства аминокислот растворитель не потребовался, но для дериватизации гистидина, глицина и треонина, в качестве растворителя брали ацетонитрил и DMF. Соотношение растворитель: DMF-DMA 1:1. В ацетонитриле реакция протекает быстрее, потому что в щелочной среде растворителя не протонируются -COO^- и -NH₂ группы. Для газохроматографического анализа использовали непосредственно полученные реакционные смеси, для хромато-масс-спектрометрического анализа их разбавляли дихлорметаном в соотношении ~ 1 : 100.

В случае карбонильных соединений реакцию дериватизации проводили, так же используя избыток реагента (50 мкл на 20 мкл аналита), при нагревании в воздушном термостате до 100 °С в течении часа, иногда требовалось большее время и повышение температуры до 110 °С, реакции проводили в запаянных стеклянных ампулах. О протекании реакции судили по появлению желтой или оранжевой окраски реакционной смеси. Появление темно-красной окраски свидетельствовало о протекании реакции конденсации карбонильного соединения (аналит). Для хромато-масс-спектрометрического анализа реакционные смеси разбавляли дихлорметаном в соотношении ~ 1 : 100.

2.3 Условия газохроматографического анализа

Газохроматографический анализ проводили на хроматографе Хроматэк-Кристалл 5000.2 с пламенно-ионизационным детектором и колонкой со стандартной полидиметилсилоксановой фазой BPX-1 (длина 10 м, внутренний диаметр 0.53 мм, толщина пленки фазы 2.65 мкм). Анализ проводили в режиме программирования температуры от 70 до 200 °С со скоростью 5 °С/мин. Расход газа носителя (азот) 5.3 мл/мин, линейная скорость 43 см/сек, деление потока 6 : 1. Температура испарителя 220 °C, температура детектора 250 °C. объем дозируемых проб 0.2-0.3 мкл.

2.4 Условия масс-спектрометрического анализа

Хромато-масс-спектрометрический анализ проводили на хромато-масс-спектрометре Shimadzu GC-2010 Plus в режиме ионизации электронным ударом, колонка RTX-5 MS (длина 30 м, внутренний диаметр 0.32 мм, толщина пленки фазы 0.25 мкм). Анализ проводили в режиме программирования температуры от 70 до 200 °С со скоростью 5 °С/мин. Газ носитель (гелий), объемная скорость 1,79 мл/мин, деление потока 10 : 1. Температура ионного источника 200 °C, температура интерфейса 250 °C, объем дозируемых проб 0.2-0.3 мкл.

2.5 Обработка результатов

Расчет линейно-логарифмических индексов удерживания проводили по формуле:

RI_x = RI_k + (RI_{k+m -} RI_k) (3.1)

где (3.2)

где (3.3)

где RI_x, t'_{R,x -} индекс удерживания и время удерживания определяемого соединения;

RI_k, t'_{R,k -} индекс удерживания и время удерживания реперного соединения с k атомов углерода в молекуле;

RI_k+m, t'_R,k+m - индекс удерживания и время удерживания реперного соединения с k+m атомов углерода в молекуле.

Работа выполнена с использованием оборудования Ресурсного образовательного центра по направлению "Химия" при Химическом институте Санкт-Петербургского государственного университета.

3. Обсуждение результатов

3.1 Особенности выбора неподвижной фазы

Численные значения RI определяются полярностью используемой в хроматографической колонке неподвижной фазы. По этой причине отнесение таких аналитических характеристик к числу свойств органических соединений возможно только при выборе стандартной неподвижной фазы для их определения. В настоящее время из всего многообразия таких фаз в качестве стандартных чаще всего используют неполярные полидиметилсилоксановые эластомеры, практически идентичные по своим характеристикам (SE-30, OV-101, SP-2100, DB-1 и т. д.) [37]. Значения газохроматографических индексов удерживания всех N-DMAM производных определены на стандартной неполярной полидиметилсилоксановой неподвижной фазе ВРХ-1 и на аналогичной более полярной фазе RТХ-5, содержащей 5 % фенильных групп. По классификации, принятой в базе данных [38], фазы последнего типа относят к типу "semi-standard".

Для простейших N-DMAM производных аминов среднее значение разностей RI(RTX-5) --RI(ВРХ-1) составляет 14 ± 4 ед. индекса (Табл. 1), что типично для слабо полярных соединений.

3.2 Проверка возможности дериватизации аминокислот DMF-DMA на модельных соединениях

Возможности дериватизации аминокислот DMF-DMA были проверены на примерах нескольких моно-, ди-, трикарбоновых кислот и первичных аминов: декановой (84), янтарной (85), малоновой (86), глутаровой (87), б-кетоглутаровой (88), лимонной (89), анилина (90), бензиламина (91) и моноэтаноламина (92).

Для некоторых монокарбоновых кислот и первичных аминов возможен непосредственный газохроматографический анализ, что дает возможность оценки степени дериватизации по соотношению площадей пиков продуктов реакции и субстратов. В Табл. 1 Приложения приведены газохроматографические индексы удерживания исходных соединений (RI) и данные для продуктов реакции, в том числе значения RI_эксп, справочные величины RI_справ и стандартные масс-спектры. Во всех случаях на хроматограммах не были обнаружены сигналы исходных соединений, что эквивалентно степени их конверсии ~ 100 %.

Образование метиловых эфиров карбоновых кислот во всех рассматриваемых случаях не требует иных подтверждений (в сочетании с информацией о природе исходных соединений и характере реакции), кроме определения их индексов удерживания. Индексы удерживания некоторых N-DMAM производных (в том числе анилина и бензиламина) известны [38], но, тем не менее, все N-DMAM производные впервые охарактеризованы масс-спектрами. Значение индекса удерживания продукта взаимодействия б-кетоглутаровой кислоты с DMF-DMA не характерно для метилового эфира дикарбоновой кислоты. Для идентификации полученного соединения был записан масс-спектр, исходя из которого можно сделать вывод о структуре продукта реакции (93). Получение этого продукта подтверждает целесообразность специального рассмотрения реакции DMF-DMA с активными метиленовыми и метильными группами, находящимися в б-положении к карбонильной группе.

(93) (4.1)

3.3 Методы расчета RI с использованием аддитивных схем

Многочисленные известные методы расчета RI отдельных групп простейших органических соединений по аддитивным схемам основаны на суммировании вкладов соответствующих структурных инкрементов ДRI_i . [37]

RI_x = Уk_iДRI_i (4.2)

Из всех алгоритмов оценок RI_x по соотношениям вида (4.2) наибольшее распространение получили методы, включающие использование экспериментально определенной величины RI₀ некоторого базового соединения (чаще всего простейшего гомолога) в сочетании с наборами инкрементов различных заместителей ДRI_j. [37]

RI_x = Уk_jДRI_j + RI₀ (4.3)

В качестве инкремента индексов удерживания структурного преобразования соединений в различных реакциях может быть выбрано число, которое переводит значение RI_x реагента или сумму УRI_x нескольких реагентов в соответствующие параметры продуктов. Тогда в простейшем случае для описания изомерных превращений A > C или процессов взаимодействия с общим реагентом Z в соответствии со схемой A + Z > C + … расчетное соотношение имеет вид:

RI_A + ДRI_R = RI_C; (4.4)

откуда ДRI_R = RI_C + RI_A (4.5)

Для обобщения полученных значений ДRI_R, характеризующих единичные соотношения между величинами RI_x исходных и конечных веществ в схеме процесса, проверки их воспроизводимости для разных пар конкретных соединений и, фактически, хроматографической характеристики данного преобразования структуры, необходима статистическая обработка серий величин ДRI_R с расчетом средних значений ДRI_R и их стандартных отклонений. Стандартные отклонения величин RI_x вычисляемых на основании соотношения (4.5) оценивают с учетом погрешностей всех составляющих [37].

A > C… RI_C = RI_A + ДRI_R ; S_c = (4.6)

Исходя из выше сказанного, важной газохроматографической характеристикой представляется среднее значение разностей индексов удерживания N-DMAM производных и исходных субстратов ДRI_R соответствующее следующему структурному преобразованию:

(4.7)

ДRI_R можно предварительно оценить по данным даже для трех соединений (Табл. 4.1). Эта величина является основой простейшей аддитивной схемы, которая позволяет оценивать индексы удерживания продуктов органических реакций по данным для исходных веществ. В нашем случае эта величина равна 396 ± 16.

Таблица 4.1. Вычисление значения структурного инкремента ДRIR для структурного преобразования (4.7).

Амин	ДRIR = RIN-DMAM - RIамин	SA	SC
Анилин	408	13	21
Бензиламин	402	10	19
Этаноламин	377	23	28
Среднее ДRIR	396
S0R	16

Вычислены инкременты преобразования гидразинов в амидразоны в реакции с DMF-DMA (R₁R₂N-NH₂ > R₁R₂N-N=CH-N(CH₃)₂). ДRI = 262 ± 13 на основе реакций с двумя гидразинами: дибутилгидразин, монокротилгидразин.

3.4 Закономерности масс-спектрометрического распада N-DMAM производных аминов

Наличие в N-DMAM производных аминов p-р систем сопряжения -N=CH-N< объясняет высокую интенсивность сигналов молекулярных ионов в их масс-спектрах [39]. Однако в их масс-спектрах наиболее интенсивны сигналы ионов с m/z 44 [соответствуют фрагменту N(CH₃)₂], [M - 44] = [M - N(CH₃)₂], а в отдельных случаях (производное бензиламина) с m/z 91 [C₇H₇], m/z 71 = [M - 91] = [(CH₃)₂NCHN] и (производное этаноламина) с m/z 85 = [M - CH₂OH].

3.5 Механизм реакции дериватизации аминокислот DMF-DMA

Механизм реакции DMF-DMA с аминокислотами был рассмотрен в обзоре литературы. Однако здесь стоит отметить, что, по нашим данным, ни в исходном реагенте (содержание основного компонента - 93 %), ни в составе реакционных смесей диметилформамид (индекс удерживания на стандартных неполярных полидиметилсилоксановых неподвижных фазах 749 ± 16) не был обнаружен в заметных количествах. Это позволяет предположить, что промежуточные моноалкилацетали диметилформамида могут далее распадаться не как полуацетали, а как аминали, т.е. с образованием диметиламина и (в случае DMF-DMA) метилформиата:

(4.8)

Оба таких продукта характеризуются весьма малыми индексами удерживания на стандартных неполярных фазах (диметиламин 383 ± 15, метилформиат 386 ± 10) и, следовательно, не только не мешают определению целевых продуктов реакции, но и, фактически, в отличие от диметилформамида, при хромато-масс-спектрометрическом анализе даже не отделяются от сигнала растворителя (СН ₂С 1₂, RI 515 ± 7).

3.6 Особенности реакции DMF-DMA с аминокислотами содержащими -SH, -NH-, -OH группы

Поскольку диалкилацетали диметилформамида вступают в реакции не только с карбоновыми кислотами, но и фенолами и тиолами, не удивительно, что в смеси продуктов взаимодействия тирозина с DMF-DMA обнаружены два компонента, один из которых соответствует "нормальному" N-DMAM производному этой аминокислоты (М = 250), а второй образуется в результате дополнительного метилирования фенольной гидроксильной группы (М = 264). Сигналы молекулярных ионов в спектрах этих производных отсутствуют, но в обоих случаях надежно регистрируются сигналы ионов [М - СО ₂СН ₃] с т/z 191 и 205, соответственно (см. Табл. 1. Приложения).

Поведение аминокислот, содержащих вторичные аминогруппы или группы -NН в ароматических системах (пролин, триптофан), полностью согласуется с известными химическими свойствами DMF-DMA [11]. Так как образование N-DMAM продуктов для них невозможно, они превращаются в N-формильные производные. Так, единственным продуктом дериватизации пролина (М = 115) оказывается соединение с молекулярной массой 157 (ДМ = 42), что соответствует метилированию карбоксильной группы (ДМ = 14) и N-формилированию (ДМ = 28). В случае триптофана [2-амино-3-(1Н-индол-3-ил)пропановая кислота] обнаружены два продукта дериватизации: N-DMAM-Me производное и вторичный продукт его N-формилирования (см. Табл. 1).

N-DMAM-Me производные глицина и гистидина удалось получить только в растворителях (DMF, ацетонитрил). Реакция идет быстрее в ацетонитриле (1 час). Использовали смесь DMF-DMA : ацетонитрил 1:1.

3.7 Закономерности масс-спектрометрического распада N-DMAM-Me производных аминокислот

В Табл. 1 приведены значения индексов удерживания и стандартные масс-спектры продуктов взаимодействия с DMF-DMA для некоторых аминокислот.

Среднее значение разности RI(RTX-5) - RI(BPX-1) для N-DMAM производных аминокислот составляет 46 ± 14 ед. индекса (Табл. 1. Приложения), что характеризует их как более полярные соединения по сравнению с аналогичными производными монофункциональных первичных аминов.

В масс-спектрах N-DMAM-Me производных аминокислот (для целевых продуктов использован символ N-DMAM-Me, так как обе функциональные группы (-CO₂H и -NH₂) взаимодействуют с DMF-DMA) интенсивность пиков молекулярных ионов заметно ниже чем в масс-спектрах производных аминов. Присутствие в молекуле нескольких альтернативных центров локализации заряда молекулярных ионов закономерно уменьшает значения I_отн(М) [39] (для производного моноэтаноламина - 11 %), а для некоторых аминокислот они достигают всего нескольких десятых долей %. Сигналы молекулярных ионов были найдены только в масс-спектрах производных глицина, аланина, валина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, метионина и фенилаланина. Для всех остальных кислот их относительные интенсивности не превышают 0.1 - 0.2 %. Для большинства производных наиболее интенсивны пики с молекулярной массой 44 принадлежащие ионам [N(CH₃)₂]⁺ (m/z 44, I_отн 50-100 %). Другой особенностью спектров является наличие пиков обусловленных потерей метоксикарбонильных групп [M - CO₂CH₃] = [M - 59], I_отн от 0 до 100 %. Потеря боковой цепи приводит к появлению пиков ионов [M - R] m/z 143, I_отн от 0 до 100 %. В отдельных случаях присутствуют сигналы [M - N(CH₃)₂]⁺. При наличии гидроксильных групп во фрагментах R (серин, треонин) характеристичными становятся сигналы ионов [M - H₂O]⁺ и соответствующие им вторичные ионы этой серии. Аргинин, который, судя по значению RI = 1842 ± 1, образует бис-N-DMAM-Ме производное по аминогруппе и гуанидиновому фрагменту молекулы, характеризуется практически не интерпретируемым масс-спектром. Аналогичные особенности типичны и для масс-спектра бис-N-DMAM-Me производного лизина.

Влияние структуры боковой цепи на закономерности распада N-DMAM-Me производных аминокислот может быть проиллюстрировано при сравнении спектров производных лейцина и изолейцина. В лейцине основным направлением фрагментации является потеря сложноэфирной группы с появлением сигнала, соответствующего ионам [M - CO₂CH₃] = [M - 59], m/z 141, а для изолейцина главным направлением является потеря боковой цепи с появлением сигнала, соответствующего ионам [M - R] = [M - 57], m/z 143. Индексы удерживания этих изомеров практически одинаковы (1342 ± 1, 1344 ± 1). Таким образом, проведение анализа этих изомерных аминокислот в виде N-DMAM-Me производных позволяет легко их различить. В случае же пары изолейцин - норлейцин указанные масс-спектрометрические признаки практически совпадают, но значения RI существенно различаются, что типично для изомеров с неодинаковым числом разветвлений углеродного скелета в бутильной группе.

3.8 Идентификация продуктов взаимодействия DMF-DMA с аминокислотами с использованием аддитивной схемы

На основе полученных индексов удерживания для N-DMAM-Me производных аминокислот, также может быть создана аддитивная схема, основанная на структурном преобразовании:

(4.9)

Для оценки значений индексов удерживания N-DMAM-Me производных аминокислот по значениям RI(R-CH₃) целесообразно вычислить коэффициенты регрессионного уравнения вместо среднего значения ДRI_R:

RI[R-CH(CO₂CH₃)-N=CH-N(CH₃)₂] = a + b RI[R-CH₃] (4.10)

a =886 ± 36, b = 0.95 ± 0.04, r = 0.992, S₀ = 48 N = 9

Рис. 1. Линейная зависимость индексов удерживания N-DMAM производных аминокислот от индексов удерживания их структурных аналогов, содержащих метильные группы вместо фрагмента -CH(CO2CH3)-N=CH-N(CH3)2

RI [R-CH₃] = a + b RI[R-CH(CO₂CH₃)-N=CH-N(CH₃)₂] (4.11)

a = -911 ± 78, b = 1.04 ± 0.05, r = 0.992, S₀ = 50, N = 9

Рис. 2. Линейная зависимость индексов удерживания структурных аналогов аминокислот, содержащих метильные группы вместо фрагмента -CH(CO2CH3)-N=CH-N(CH3)2 от индексов удерживания N-DMAM производных аминокислот.

Величины генеральной дисперсии S₀ определяют точность получаемых результатов, которая составляет около 48-50 единиц индекса. Уравнение (4.10) предназначено для оценки RI N-DMAM производных по значениям RI их простейших структурных аналогов вида R-CH₃. Второе же, наоборот, позволяет оценивать значения RI таких аналогов по значениям индексов удерживания производных аминокислот. Сочетание этих двух уравнений позволяет не только получать необходимые оценки RI, но и контролировать правильность экспериментальных данных. Такие возможности можно проиллюстрировать следующими примерами.

Пример 1. N-DMAM производное цистеина (HSCH₂CH(NH₂)CO₂H) в ходе работы не было получено ввиду отсутствия аминокислоты. Проведем оценку значения индекса удерживания производного, учитывая возможность метилирования сульфгидрильной группы, и, как следствие, образования двух видов производных: Cys-N-DMAM-Me и Cys-N-DMAM-Me₂. В качестве структурных аналогов выберем этантиол (HSCH₂CH₃, RI = 502 ± 8) и метилэтилсульфид (CH₃SCH₂CH₃, RI = 605 ± 10). Используя уравнение (4.10) получим индексы удерживания: RI (Cys-N-DMAM-Me) = 1363 ± 36, RI (Cys-N-DMAM-Me₂) = 1461 ± 36.

Пример 2. N-DMAM-Me производное лизина характеризуется практически не интерпретируемым масс-спектром. Определение его структуры может быть проведено по индексу удерживания (RI = 1961 ± 1).

Исходя из свойств DMF-DMA, лизин при взаимодействии с ним должен образовывать бис-N-DMAM-Me производное (CH₃)₂N-CH=N-(CH₂)₄CH(CO₂CH₃)-N=CH-N(CH₃)₂. Для доказательства его структуры, сначала оценим индекс удерживания его структурного аналога (CH₃)₂N-CH=N-(CH₂)₄CH₃, используя уравнение (4.11) и RI (N-DMAM-Me) = 1961 ± 1. Учитывая ориентировочный характер вычислений, оценки погрешностей результатов в них опущены. RI((CH₃)₂N-CH=N-(CH₂)₄CH₃) = 1128.

Далее оценим значение индекса удерживания 1-пентанамина. Инкремент соответствующий трансформации (CH₃)₂N-CH=N-(CH₂)₄CH₃ > H₂N(CH₂)₄, был посчитан ранее и равен 396 ± 16. Тогда индекс удерживания 1-пентанамина равен: 1128 - 396 = 732. Так как его справочное значение RI = 717 ± 9, такое совпадение является однозначным подтверждением структуры бис-N-DMAM-Me производного лизина.

Таким образом, описанные аддитивные схемы, позволяют подтверждать структуру продуктов реакции, используя только газохроматографические индексы удерживания.

При исключении из рассмотрения серина, значение генеральной дисперсии существенно снижается. Возможно, это происходит из-за образования молекулярных связей N^....H-O в N-DMAM производном серина приводит к занижению значения RI

RI[R-CH(CO₂CH₃)-N=CH-N(CH₃)₂] = a + b RI[R-CH₃] (4.10')

a =914 ± 26, b = 0.92 ± 0.03, r = 0.996, S₀ = 32 N = 8

RI [R-CH₃] = a + b RI[R-CH(CO₂CH₃)-N=CH-N(CH₃)₂] (4.11')

a = -979 ± 60, b = 1.07 ± 0.04, r = 0.996, S₀ = 35, N = 8

3.9 Дериватизация карбонильных соединений DMF-DMA. Идентификация продуктов взаимодействия карбонильных соединений и DMF-DMA с использованием аддитивных схем

Второй частью моей дипломной работы стала проверка возможности дериватизации соединений с активными метильной и метиленовой группами.

Результаты дериватизации (газохроматографические индексы удерживания и масс-спектры продуктов) представлены в Табл. 1 Приложения. Реакция идет селективно, в -положение к карбонильной группе.

(4.12)

На основании полученных результатов могут быть вычислены инкременты этих структурных преобразований для различных типов исходных соединений:

X-CH₃ > X-CH=CH-N(CH₃)₂ (4.13)

X-CH₂-R > X-C(-R)=CH-N(CH₃)₂ (4.14)

Этот инкремент представляет собой среднее значение разностей индексов DMAM производных и исходных субстратов, ДRI_i. Экспериментальные данные, представленные в Табл. 1 Приложения, требуют вычисления отдельных инкрементов для различных типов исходных соединений. Инкременты приведены в Табл. 4.3.

Табл. 4.2. Значения структурных инкрементов ДRIi для различных соединений. (* единичные данные представлены без стандартных отклонений.)

Номер инкремента ДRIi	Фрагменты структур исходных соединений	Инкременты превращений (4.13) и (4.14), (ДRIi)
1		709 ± 19
2		630 ± 19
3		801 ± 8
4		640*
5		451
6		746
7		675 ± 21
8		525
9		700

Инкремент ДRI₁ вычислен на основе данных для шести соединений (производные 2-гексанона, 2-пентанона, 2-гептанона, ацетона, 2-бутанона и метилацетата, образовавшегося в результате гидролиза и последующего декарбоксилирования диметилмалоната); ДRI_{2 -} трех (производные 2-гексанона, 2-петанона и 2-гептанона); ДRI_{3 -} двух (производные ацетофенона, п-метилацетофенона). ДRI₄ и ДRI₅ существенно различаются, их усреднение нецелесообразно. Такие различия этих инкрементов можно объяснить влиянием разветвленного алкильного радикала в DMAM производном изовалерофенона, что приводит к нарушению сопряжения в фрагменте O=C-C(R)=CH-N(CH₃)₂ и, как следствие, уменьшению индекса. ДRI₆ (ацетилацетон) не дает однозначного ответа о том, по какой группе идет реакция (CH₃- или -CH₂-). Однако, большей реакционной способностью обладает -CH₂ группа. Значение инкремента ДRI₇ результат усреднения значений ДRI DMAM- производных ацетоуксусного эфира и диметилмалоната. Существенное различие ДRI₈ и ДRI₉ обусловлено уменьшением сопряжения в фрагменте -CH=CH-NMe₂ DMAM производного циклогексан-1,3-диона из-за стерических затруднений.