Размещено на http://www.allbest.ru/

80

Введение

окисление отравление тетрахлорметан

Свободно-радикальное окисление (СРО) является необходимым процессом для нормального функционирования клеток, но вместе с тем это и один из универсальных механизмов их повреждения [1]. Неконтролируемая генерация активных форм кислорода, кислородных метаболитов и сбой в функционировании антиоксидантной системы вызывают окислительное повреждение биомолекул [2], что приводит к дисфункции клеток и тканей организма. Окислительный стресс играет ключевую роль в патогенезе многих патологических состояний: гипоксических и ишемических повреждениях органов; сахарном диабете и его осложнениях; при интенсивных физических и психоэмоциональных нагрузках, переутомлении, старении, а также при заболеваниях печени и интоксикациях химическими агентами [3].

Действие многочисленных химических веществ на организм человека сложно и многообразно. К числу ксенобиотиков с наиболее высокой степенью избирательной гепатотоксичности и нефротоксичности относятся хлорированные углеводороды, типичным представителем которых является тетрахлорметан (CCl4) [4]. Имеющиеся данные свидетельствуют, что развитие CCl4-гепатита сопряжено с интенсификацией СРО [5].

Важную роль в клинической практике играют антиоксидантные средства, способные стабилизировать структуру и функции клеточных мембран и поддерживать структурный гомеостаз организма в условиях патологии [6]. Антиоксидантные препараты применяются как для профилактики, так и для лечения свободно-радикальных патологий [2]. Успешность лечения определяется комплексом мероприятий, включающих в себя, в том числе, восстановление функциональной полноценности физиологической антиоксидантной системы - активности ферментов и биоантиоксидантного витаминного статуса [7]. Наиболее токсичные радикальные продукты ПОЛ удаляются главным образом отдельными биоантиоксидантами (БАО), к которым, в частности, относится б-токоферол. Поэтому применению БАО, к которым относятся водо- и жирорастворимые витамины, все больше внимания уделяют клиницисты и ученые-экспериментаторы [8].

Целью настоящей работы явилось исследование процесса перекисного окисления липидов и активности некоторых антиоксидантных ферментов при окислительном стрессе, вызванном токсическим действием тетрахлорметана, а также изучение состояния про- и антиоксидантного статуса под влиянием б-токоферола.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. оценить процессы перекисного окисления в плазме крови и гомогенате почек контрольной группы животных и у животных подвергшихся воздействию тетрахлорметана;

2. сравнить концентрацию продуктов ПОЛ - МДА и ДК в плазме и почках у животных с введенным б-токоферолом до воздействия токсиканта и после;

3. исследовать активность СОД и каталазы в плазме и гомогенате почек крыс в норме и в условиях развития патологического процесса, вызванного введением CCl4;

4. определить активность антиоксидантных ферментов в плазме и почках под действием витамина Е, введенного до и после воздействия тетрахлорметана.

Работа выполнена на базе кафедры медицинской биологии ИФБиБТ Сибирского федерального университета.

1. Обзор литературы

1.1 Пути генерации активных форм кислорода в организме

Организм существует в аэробных условиях, и кислород является одним из активных метаболических соединений в тканях. Известно, что О2 обладает высокой реакционной способностью, но в силу спинового запрета происходит поэтапное использование потенциальной окислительной способности О2 . Это обеспечивает ступенчатое восстановление кислорода, которое является энергетически более выгодным [9].

В тканях организма благодаря наличию сложных ферментативных комплексов со специфическими электрон-транспортными простетическими и коферментными группировками восстановление кислорода протекает по 4-х электронному пути с образованием воды. Это основной путь метаболизма кислорода в организме, сопряжённый с генерацией энергии. Существуют и другие пути превращения кислорода, приводящие к образованию реакционно-способных соединений - активных форм кислорода (АФК). В физиологических концентрациях эти соединения участвуют в работе регуляторных систем клеток, с которыми связана функциональная активность клеток, их жизнедеятельность (Рисунок 1) [3].

Рисунок 1 - Основные пути участия АФК в метаболических процессах в организме

АФК - это группа различных соединений радикальной и нерадикальной природы, которые различаются по продолжительности их существования и активности. Понятие АФК носит чисто условный характер, эта группа включает разные по своей химической структуре соединения: молекулы (Н2О2), свободные радикалы (ОН*, НО*2), ион-радикалы (О2*?) [10]. Основными компонентами АФК являются супероксидный анион-радикал (О2*?), гидроксильный радикал (ОН*), перекись водорода (Н2О2), синглетный кислород (?О2), гипогалоиды (окисленные галогены) - НОСl, НОВr, НОI, пероксильный (алкилдиоксил) (RО2*) и алкоксильный (RО*) радикалы, оксид азота (NО*), пероксинитрит (ОNОО?). Все эти соединения обладают высокой реакционной способностью. Хотя понятие АФК с физико-химической точки зрения не совсем правомочно, тем не менее широкое использование его не вызывает особых возражений [11].

Образование АФК с химической точки зрения происходит в результате процесса постепенного восстановления кислорода:

(1.1)

Источником доноров электронов в большинстве биологических систем являются металлы переменной валентности - Fe++, Сu+, Со++, Мn++, V++, Сr+ + + +, основными из которых являются железо и медь [12].

АФК являются продуктами метаболических процессов, ферментативных и неферментативных, которые в норме протекают в организме [13]. Генерация АФК происходит по ходу окислительно-восстановительных реакций с участием кислорода в различных субклеточных структурах клетки и при различных её функциональных состояниях [14].

Основные источники активных форм кислорода в субклеточных структурах клетки: митохондриальная электрон-транспортная цепь, плазматическая мембрана (монооксигеназы, простагландинсинтетаза, НАДФН-оксидаза (фагоцитоз), ПОЛ), пероксисомы (оксидазы, флавопротеины), эндоплазматический ретикулум и ядерная мембрана (транспортная система цитохрома Р450, цитохром b558) [13].

Известно, что молекулярный кислород активно участвует в реакциях, катализируемых оксидазами, оксигеназами (моно- и диоксигеназами). Оксидазы катализируют реакции окисления различных субстратов, в результате которых наблюдается прямое восстановление кислорода за счёт присоединения одного, двух или четырёх электронов с последующим образованием О2*? (ксантиноксидаза), Н2О2 (оксидазы аминокислот) и Н2О (цитохромоксидаза, аскорбатоксидаза) [9].

Оксигеназы катализируют реакцию активации молекулярного кислорода с последующим непосредственным внедрением одного или двух атомов кислорода в субстрат. Вклад этих реакций в общее использование кислорода невелик по сравнению с дыхательными ферментами митохондрий. Эти оксигеназы участвуют в метаболизме стеринов, некоторых витаминов, простагландинов, в обезвреживании ксенобиотиков и т.д. Оксигеназы подразделяются на диоксигеназы и монооксигеназы и гидроксилазы. Диоксигеназы катализируют реакцию включения всей молекулы кислорода в обследуемый субстрат, монооксигеназы - одного атома, а второй переходит в состав образующейся воды. По ходу отдельных ферментативных реакций могут образовываться О2*? и Н2О2. С диоксигеназными реакциями чаще связано образование О2*?. Генерация АФК может осуществляться и неферментативным путём с участием гемсодержащих белков, биогенных аминов, флавоноидов и т.д. [15].

1.2 Характеристика основных активных форм кислорода

Согласно классификации Ю.А. Владимирова [1], все образующиеся в организме радикалы в зависимости от происхождения могут быть разделены на природные и чужеродные. В свою очередь, природные можно разделить на 3 категории: первичные, вторичные и третичные. Среди причин появления чужеродных форм радикалов можно выделить 3 основных фактора: радиация, УФ-излучения и ксенобиотики [3].

Первичные - образуются из молекул за счет реакций одноэлектронного окисления с участием металлов переменной валентности. Это компоненты дыхательной цепи, такие, как радикалы убихинона (коэнзима Q), супероксидный анион-радикал и окись азота. К вторичным, относятся радикалы, образующиеся из перекиси водорода, липоперекисей и гипохлорита в присутствии ионов Fe2+. Это гидроксильный радикал, липидные радикалы, участвующие в реакциях цепного окисления ненасыщенных ЖК цепей липидов биомембран и липопротеинов плазмы крови. Третичные - радикалы, которые образуются при действии вторичных радикалов на молекулы антиоксидантов и других легкоокисляющихся соединений. Первичные радикалы специально вырабатываются организмом и выполняют жизненно важные функции: переноса электронов в дыхательной цепи (убихинон), защиты от микроорганизмов (супероксидный анион-радикал), регуляции кровяного давления (окись азота), тогда как вторичные радикалы оказывают цитотоксическое действие и, как правило, наносят организму большой вред. АФК могут выполнять функции вторичных мессенджеров в процессах жизнедеятельности клеток. АФК участвуют в сигнальной трансдукции, влияя на метаболизм кальция, гидролиз фосфолипидов, фосфорилирование, модуляцию некоторых факторов транскрипции [1].

Деление активированных кислородных метаболитов на природные и чужеродные оправдано с позиций их биологической значимости. Действительно, основной функцией природных АФК является регуляторная, затем защитная, в определённых ситуациях, как правило, патологических, они могут становиться токсичными и индуцировать развитие деструктивных процессов, однако такие ситуации являются исключением, а не правилом [15]. Образующиеся при действии радиации или в процессе фотодинамической терапии чужеродные АФК, также как радикалы, возникающие в процессе метаболизма ксенобиотиков, обладают выраженным цитотоксическим и деструктивным действием [3].

1.2.1 Супероксидный анион-радикал

Среди АФК супероксидному анион-радикалу отводят особую роль, так как считается, что именно он является родоначальником многих других активных форм кислорода. По оценке Halliwell B. 1 - 3% поступающего с дыханием кислорода переходит в О2*?, что составляет в год около 2 кг [16].

Супероксидный анион-радикал или диоксид образуется в результате одноэлектронного восстановления кислорода. Время жизни его составляет 10-6 с, что определяет радиус его действия ? 0,3 мкм [12].

Основным источником генерации О2*?, как и других АФК, являются ферментативные системы, к которым относят НАДФН-оксидазу, функционирующую при состояниях «дыхательного взрыва» в фагоцитирующих клетках, и НАДФН-оксидазу нефагоцитирующих клеток, ферментативные комплексы системы тканевого дыхания и микросомального окисления, ксантиноксидазу, альдегидоксидазу, дигидрооротатдегидрогеназу, флавиновые гидроксилазы, НАДФН-цитохром-с-редуктазу, ферменты метаболизма арахидоновой кислоты [10]. Уровень спонтанно образующегося О2*? в живых системах колеблется в пределах 10-12 - 10-11 моль. Наибольшее количество О2*? продуцируется в фагоцитирующих клетках в процессе «дыхательного взрыва» [17].

Образование супероксидного анион-радикала осуществляется в результате переноса электрона с цитозольного НАДФН на О2 с образованием

О2*?.НАДФН + 2О2 > НАДФ+ + 2О2?? + Н+(1.2)

Образующийся в результате «дыхательного взрыва» супероксидный анион-радикал проявляет бактерицидное, цитотоксическое и иммунорегуляторное действие [2].

Супероксидный анион-радикал обладает амфотерными окислительно-восстановительными свойствами. Во многих биологических системах О2*? может выступать в качестве донора электронов, участвуя в реакциях восстановления ряда соединений. В физиологических условиях О2*? является относительно слабым окислителем [9]. Так как супероксидный анион-радикал обладает зарядом, проникновение его через мембрану затруднено и требует наличия анионных каналов, которые обнаружены, в частности, в эритроцитарной мембране [13].

Одноэлектронное восстановление О2*? приводит к образованию гидродиоксид-иона (НО2?) и его протонированной формы - перекиси водорода.

1.2.2 Перекись водорода

Реакция образования перекиси водорода в физиологических условиях при нейтральном значении рН протекает в две стадии:

О2*? + Н+ - НО2?,(1.3)

НО2? + О2*? + Н+ - Н2О2 + О2(1.4)

Также образование Н2О2 может осуществляться за счёт непосредственного двуэлектронного восстановления кислорода [9].

Перекись водорода относится к окислителям средней силы, способным взаимодействовать с веществами радикальной и нерадикальной природы. Однако, в физиологических условиях при отсутствии соответствующих катализаторов (ферментов, ионов металлов переменной валентности) Н2О2 относительно стабильна и неспособна выступать в качестве окислителя. Перекись водорода, являясь электростатически нейтральной молекулой, легко проникает через мембраны в другие клетки и ткани [3].

Физиологический уровень Н2О2 в тканях колеблется в пределах от 10-9 - 10-7 моль. На долю Н2О2 приходится до 13 - 20% кислорода, поступающего в организм. Наибольшее содержание Н2О2 выявлено в печени (75%), где она активно используется в процессах дезактивации ксенобиотиков экзогенного и эндогенного характера [13]. Генерация перекиси водорода в тканях, в основном, связана с функционированием ферментативных систем. Основным местом генерации Н2О2 являются пероксисомы. В меньших количествах Н2О2 может образовываться и в других органеллах. В митохондриях за счёт действия ряда оксидаз (сульфитоксидаза - КФ 1.8.3.1) наблюдается образование Н2О2. Супероксиддисмутаза является источником перекиси водорода [18].

1.2.3 Гидроксильный радикал

Гидроксильный радикал является наиболее токсичным из АФК, проявляя цитотоксическое и мутагенное действие при состояниях окислительного стресса. ОН? обладает наибольшей реакционной способностью среди АФК и фактически может атаковать любое химическое соединение. Время жизни его колеблется по разным оценкам от 2 ? 10-9 до 8 ? 10-9 сек. [12]. Диффузный пробег ОН? до вступления в реакцию оценивается расстоянием, равным почти двум его молекулярным диаметрам (менее 0,001 мкм) [19]. Образование ОН?, как одного из наиболее токсических соединений среди АФК, в основном, связывают с металл-зависимым распадом Н2О2. Генерация гидроксильного радикала происходит в результате реакции одноэлектронного восстановления перекиси водорода:

Меn + Н2О2 > Меn+1 + ОН? + ОН?,(1.5)

Н2О2 + е? - ОН? + ОН?(1.6)

Экспериментально показано, что в качестве металлов переменной валентности могут выступать железо, титаний, кобальт, марганец, комплексы ванадия и никеля [12]. В организме образование ОН? связано, в основном, с ионами железа и меди. Взаимодействие двухвалентного железа с перекисью водорода составляет основу реакции Фентона:

Fе2+ + Н2О2 > Fе3+ + ОН? + ОН?(1.7)

При наличии в биологической среде Н2О2 и О2*? реакция может протекать в две стадии. Она представляет модифицированный вариант реакции Фентона, впервые описанный Haber F. и Weiss J. J.:

Fе3+ + О2*? > Fе2+ + О2,(1.8)

Fе2+ + Н2О2 > Fе3+ + ОН? + ОН?(1.9)

Суммарная реакция:

О2*? + Н2О2 Їсоль железа> О2 + ОН? + ОН?(1.10)

В настоящее время проведены обширные экспериментальные исследования, в которых чётко показана генерация ОН? в присутствии ионов железа, меди, О2*? и Н2О2. Роль О2*? в этих процессах сводится к восстановлению окисленной формы металла [10].

1.2.4 Синглетный кислород

Переход кислорода из триплетного состояния в возбуждённое синглетное состояние связан с обращением спина одного из электронов кислорода. Для синглетного кислорода в отличие от триплетной формы не существует спинового запрета и, соответственно, он обладает высокой реакционной способностью, атакуя биологические молекулы в области двойных связей. Исходя из этого, синглетный кислород активно участвует в окислительно-восстановительных реакциях, являясь причиной окислительного повреждения белков, липидов, нуклеиновых кислот [9].

В организме пока не обнаружены специализированные системы, участвующие в генерации синглетного кислорода. Но 1О2 может возникать по ходу ряда ферментативных реакций, к которым относят каталазу, пероксидазы, супероксиддисмутазу, липооксигеназу [20]. Образование синглетного кислорода наблюдается в большинстве пигментных систем при экспозиции их на свету, в частности, в хрусталике глаза. Молекулы хлорофилла в растениях и фотосинтетических микроорганизмах являются активными генераторами синглетного кислорода. Это позволило предложить использовать производный хлорофилла в качестве сенсибилизаторов при фотодинамической терапии [10].

С помощью хемилюминесценции показано, что стимулированные эозинофилы могут генерировать 1О2. Существуют сведения в пользу генерации синглетного кислорода нейтрофилами в процессе «дыхательного взрыва» [18]:

НОСl + Н2О2 > Н2О + Сl? + Н+ + 1О2(1.11)

1.3 Перекисное окисление липидов

Высокая агрессивность молекулярного кислорода в отношении органических радикалов лежит в основе развития цепных процессов свободнорадикального окисления. Большой вклад в изучение таких процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических системах был сделан Б.Н. Тарусовым и его учениками (Ю.А. Владимиров, А.И. Журавлёв, А.И. Арчаков) [1].

Свободнорадикальное окисление липидов наблюдается во всех тканях аэробных организмов, главным образом в мембранах и липопротеиновых структурах, и является вырожденно-разветвлённым цепным процессом. На сегодняшний день теория и кинетические параметры развития процессов ПОЛ в разных экспериментальных системах хорошо разработаны и изучены. Весь процесс ПОЛ делят на стадии: зарождение цепей, развитие цепных реакций и их разветвление, обрыв цепей. Данные стадии принято описывать последовательностью реакций [9]:

Характерные реакции, протекающие при окислении углеводорода (RH) в присутствии кислорода и ингибитора (InH)

Зарождение цепей окисления: RH > R?

Продолжение цепей окисления: R? + О2 > RО2?

RО2? + RH > RООН + R?

Вырожденное разветвление цепей: RООН > RО? + ?ОН

RООR? > RО? + ?ОR?

Обрыв цепей окисления: R? + R? > RR

RО2? + R? > RООR

RО2? + RО2? > RООR + О2

RО2? + InH > RООН + In?

RО? + InH > RОН + In?

R? + InH > RH + In?

RО2? + In? > RООIn

Прочие реакции с участием ингибитора RООН + In? > RО2? + InH и продуктов его превращений: In? + In? > молекулярные продукты

In? + RH > InH + R?

InH + RООН > In? + RО?

+ Н2О

InH + О2 > In? + НО2?

RООIn > RО? + InО?

Примечание. RH - углеводород (липид); R?, RО? и RО2? ? алкильный, алкоксильный и перекисный (пероксидный) радикалы, соответственно; RООН - органический гидропероксид; InH - ингибитор; In? ? радикал ингибитора.

На начальной стадии зарождения цепей из валентно-насыщенных молекул липидов в биологических системах образуются свободные радикалы. Зарождение цепей с образованием первичных радикалов R? может происходить под действием экзогенных физических или химических факторов, таких, как ионизирующая радиация, ультрафиолетовое излучение, ксенобиотики, озон и др. [21]. При ряде патологических процессов инициирующие окисление радикалы имеют преимущественно эндогенное происхождение и возникают в результате активации ферментных радикалгенерирующих систем, включая НАД(Ф)Н-оксидазы, ксантиноксидазу, митохондриальную цитохромоксидазу, NO-синтазы и др. [12]. Образующиеся в энзиматических реакциях сравнительно малоактивные супероксидный анион- радикал и оксид азота NO?, а также пероксид водорода Н2О2, как правило, не способны непосредственно инициировать процессы ПОЛ, однако в результате ряда последовательных реакций с участием ферментов и ионов металлов переменной валентности они могут давать начало высокореакционным гидроксильным радикалам (ОН?), гипогалогенным кислотам (НОСl, НОВr), синглетному кислороду (1О2), оксидам азота (NO, NO2?), обладающим энергией, достаточной для разрыва С - Н-связей и образования первичных липидных радикалов [22].

В аэробных условиях алкильные радикалы быстро взаимодействуют с молекулярным кислородом, который выступает в качестве активного акцептора электронов:

R? + О2 > RО2?(1.12)

В результате этой реакции образуется пероксидный радикал (RO2?), который в свою очередь, атакует липидные молекулы, приводя к возникновению гидропероксида ROOH и нового радикала R?, индуцирующего продолжение окислительной цепи:

RО2? + RH > RООН + R?(1.13)

Важная особенность липидов клеточных структур - большое количество в них непредельных соединений: моно- и полиненасыщенных жирных кислот и их эфиров, ненасыщенных алифатических спиртов (сфингозин) и углеводородов (сквален), полициклических ненасыщенных спиртов гидроароматического ряда (стерины, витамины группы Д) и др. Присутствие в структурах липидов непредельных фрагментов способствует их лёгкому окислению, поскольку такие структуры содержат связи С - Н с относительно низкой энергией, а скорость процесса пероксидации в значительной мере лимитируется скоростью реакции молекулы RН с перекисным радикалом RO2?, зависящей от энергии разрыва С - Н-связи [23]. Принципиальное значение для протекания ПОЛ имеет накопление в процессе окисления перекисных соединений ROOH. Энергия пероксидной связи О - О в 2-3 раза меньше, чем энергия связей С - С или С = С, поэтому липидные перекиси - неустойчивые соединения, легко подвергающиеся дальнейшим превращениям с образованием более стабильных вторичных продуктов окисления: альдегидов, кетонов, спиртов, низкомолекулярных кислот (муравьиной, уксусной, масляной), а также эпоксисоединений, многие из которых токсичны для клеток [9]. Кроме того, перекиси склонны к гомолитическому распаду:

RООН > RО? + ?ОН,(1.14)

прямым следствием, которого является разветвление цепей окисления.

Разложение гидроперекисей значительно ускоряется под действием ионов металлов переменной валентности (прежде всего Fe2+,Cu2+), облигатно присутствующих в клетках и внеклеточных средах:

RООН + Fе2+ > RО? + ОН? + Fе3+,(1.15)

RООН + Fе3+ > RО2? + Н+ + Fе2+(1.16)

или суммарно:

2 RООН > RО? + RО2? + Н2О(1.17)

Образующиеся в процессе окисления свободные радикалы могут рекомбинировать с образованием неактивных молекулярных продуктов, однако в реальных условиях в биологических системах в силу низкой концентрации свободных радикалов вероятность протекания таких реакций крайне мала, и свободные радикалы со значительно большей скоростью взаимодействуют с молекулами субстрата или с ингибиторами, которые всегда присутствуют в клетках и межклеточных средах [19]. В организмах млекопитающих ингибиторами или антиоксидантами выступает широкий спектр соединений различной химической природы: витамины Е, К, С, коэнзим Q, мочевая кислота, каротиноиды и др. При взаимодействии с данными соединениями образуются неактивные радикалы, не способные участвовать в продолжении цепи окисления [3].

В организме человека процессы ПОЛ имеют большое значение для обновления липидов мембран клеток и посредством этого поддержания структурного гомеостаза. Поэтому разные по своим свойствам антиоксидантные системы необходимы для поддержания активности ПОЛ на стационарном уровне в условиях значительных изменений активности образования радикалов. Недостаток поступления облигатных антиоксидантов приводит к развитию свободнорадикальных патологий - таких, как авитаминозы Е и К, беломышечная болезнь [24]. Действие внешних прооксидантов (радиация, ультрафиолет, загрязнители воздуха, гипероксия и др.) и активация эндогенных механизмов генерации АФК приводят к напряжению механизмов антиоксидантной защиты и развитию окислительного стресса, который может проявляться на клеточном, тканевом и организменном уровнях. Окислительный стресс - важный патогенетический фактор многих заболеваний, особенно бронхолёгочных и сердечно-сосудистых, связанных с функциональным нарушением биологических барьеров [11].

Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. Повреждаются белковые структуры и липидный бислой в целом [23]. В последнее время ученые уделяют все большее внимание взаимодействию мембран с нуклеиновыми кислотами в ядре и митохондриях. По-видимому, одним из результатов пероксидации липидов может стать повреждение этих макромолекул со всеми вытекающими последствиями. Наиболее изучены три прямых следствия перекисного окисления липидов [10].

Во-первых, перекисное окисление липидов сопровождается окислением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков (Pr), в результате неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты [1]:

Pr-SH + L· > LH + Pr-S,(1.18)

Pr1-S· + Pr2-S· > Pr1-SS- Pr2,(1.19)

Pr-S· + O2 > Pr-SO2· > молекулярные производные (1.20)

Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Ca2+-АТФазы. Инактивация этого фермента приводит к замедлению "откачивания" ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция что, в свою очередь, ведет к активации фосфолипазы А2, а также высвобождению арахидоновой кислоты, что может привести к некрозу клеток и тканей [23]. Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток, в митохондриях, что приводит к их набуханию и ведёт к ещё большему повреждению мембран [18].

Второй результат перекисного окисления липидов связан с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость билипидного матрикса. Так показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирование разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического голода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры [1].

Третий, самый важный результат пероксидации - это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций [3].

1.4 Метаболизм ксенобиотиков

Многие ксенобиотики, попав в организм, подвергаются биотрансформации и выделяются в виде метаболитов. В основе биотрансформации по большей части лежат энзиматические преобразования молекул. Биологический смысл явления - превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма, и тем самым, сокращение времени его действия [7].

Метаболизм ксенобиотиков проходит в две фазы. В ходе первой фазы окислительно-восстановительного или гидролитического превращения молекула вещества обогащается полярными функциональными группами, что делает ее реакционно-способной и более растворимой в воде [25]. Во второй фазе проходят синтетические процессы конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, в результате чего образуются полярные соединения, которые выводятся из организма с помощью специальных механизмов экскреции [26]. Метаболизм одних ксенобиотиков сопровождается образованием продуктов существенно уступающих по токсичности исходным веществам. В процессе метаболизма других веществ образуются более токсичные соединения. Примером такого рода превращений является, в частности, четырёххлористый углерод [27].

Процесс образования токсичных продуктов метаболизма называется "токсификация", а продукты биотрансформации, обладающие высокой токсичностью - токсичными метаболитами. Во многих случаях токсичный метаболит является не стабильным продуктом, подвергающимся дальнейшим превращениям. В этом случае он также называется промежуточным или реактивным метаболитом [28]. Реактивные метаболиты это как раз те вещества, которые часто и вызывают повреждение биосистем на молекулярном уровне. Общим свойством практически всех реактивных метаболитов является их электродефицитное состояние, т.е. высокая электрофильность. Эти вещества вступают во взаимодействие с богатыми электронами (нуклеофильными) молекулами, повреждая их [29]. К числу последних относятся макромолекулы клеток, в структуру которых входят в большом количестве атомы кислорода, азота, серы. Это, прежде всего, белки и нуклеиновые кислоты. Реактивные метаболиты либо присоединяются к нуклеофильным молекулам, образуя с ними ковалентные связи, либо вызывают их окисление. В обоих случаях структура макромолекул нарушается, следовательно, нарушаются и их функции [30].

Биоактивация далеко не всегда сопровождается повреждением биосубстрата, поскольку одновременно в организме протекают процессы детоксикации и репарации [31]. Интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов. Тем не менее, при введении высоких доз токсиканта, повторном воздействии защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что и приведет к развитию токсического процесса [22].

І фаза метаболизма в широком смысле может быть определена, как этап биотрансформации, в ходе которого к молекуле соединения либо присоединяются полярные функциональные группы, либо осуществляется экспрессия таких групп, находящихся в субстрате в скрытой форме. Это достигается либо путем окисления или (значительно реже) восстановления молекул с помощью оксидо-редуктаз, либо путем их гидролиза эстеразами и амидазами [26].

Фаза II ? этап биологической конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, такими как глутатион, глюкуроновая кислота, сульфат и т.д. Специфические системы транспорта конъюгированных дериватов обеспечивают их выведение из организма [30].

В ходе биопревращений липофильный и, следовательно, трудновыводимый ксенобиотик становиться гидрофильным продуктом, что обусловливает возможность его быстрой экскреции.

Основным органом метаболизма ксенобиотиков в организме человека и млекопитающих является печень, главным образом благодаря разнообразию и высокой активности здесь ферментов биотрансформации [32]. Кроме того, портальная система обеспечивает прохождение всех веществ, поступивших в желудочно-кишечный тракт, именно через печень, до того, как они проникнут в общий кровоток. Это также определяет функциональное предназначение органа [33]. Тончайшая сеть печеночных капилляров, огромная площадь контакта между кровью и поверхностью гепатоцитов, обеспечивающаяся микроворсинками базальной поверхности печеночных клеток, обусловливают высокую эффективность печеночной элиминации токсиканта на клеточном уровне [34].

Продукты I фазы метаболизма поступают в общий кровоток и могут оказывать действие на органы и системы. Печень выбрасывает в кровь и продукты II фазы метаболизма [26]. Из крови продукты превращения могут захватываться почками, легкими, другими органами, повторно печенью для экскреции с желчью. С желчью метаболиты поступают в кишечник, где частично реабсорбируются и повторно поступать в печень (цикл печеночной рециркуляции) [35].

Несмотря на доминирующую роль печени в метаболизме ксенобиотиков, другие органы также принимают участие в этом процессе. Почки и легкие содержат энзимы и I и II фаз метаболизма. Особенно велика роль почек, поскольку в этом органе имеется специфическая система захвата и катаболизма продуктов конъюгации, образующихся в печени [7]. Активность других органов, таких как кишечник, селезенка, мышечная ткань, плацента, мозг, кровь - значительно ниже, однако наличие энзимов, катализирующих процессы биотрансформации, при отравлении токсифицирующимися ксенобиотиками, имеет ключевое значение в развитии патологических процессов в этих органах. В процессе внепеченочного метаболизма могут образовываться продукты, как аналогичные продуктам печеночного происхождения, так и отличные от них. Иногда в ходе внепеченочного метаболизма может осуществляться активация метаболитов, образующихся в печени [36].

Энзимы, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, локализованы в основном внутриклеточно. Небольшое их количество определяется в растворимой фракции циотозоля, митохондриях, большинство же связаны с гладким эндоплазматическим ретикулумом [26]. Методом ультрацентрфугирования гладкий эндоплазматический ретикулум выделяется из исследуемых клеток в виде фрагментов мембранных структур, называемых микросомами. Поэтому основная группа ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, получила название «микросомальные энзимы» [37].

Часть ферментных систем метаболизма ксенобиотиков локализуются в жидкостях организма. Прежде всего, это эстеразы плазмы крови, участвующие в гидролизе целого ряда чужеродных веществ [38].

Разнообразие чужеродных химических веществ, способных подвергаться в организме метаболическим превращениям, является следствием многообразия энзимов, участвующих в I фазе биотрансформации и их низкой субстратной специфичности. Многие из энзимов существуют в нескольких формах (изоферменты), различающихся по своим физико-химическим свойствам (молекулярная масса, электрофоретическая подвижность, абсорбцией света с разными длинами волн), отношению к индукторам и ингибиторам и активностью в отношении субстратов различного строения [39].

Энзимы I фазы, участвующие в процессе биотрансформации ксенобиотиков, можно классифицировать в соответствии с типом активируемой ими реакции [26]:

1. Оксидазы смешанной функции: цитохром Р-450 и флавинсодержащие монооксигеназы;

2. Простогландинсинтетазы: гидропероксидазы и другие пероксидазы;

3. Алкогольдегидрогеназы и альдегиддегидрогеназы;

4. Флавопротеинредуктазы;

5. Эпоксидгидролазы;

6. Эстеразы и амидазы.

Особое значение для биотрансформации ксенобиотиков имеют микросомальные энзимы. Как уже указывалось, морфологическим эквивалентом микросом в интактных клетках является гладкий эндоплазматический ретикулум [6]. В ходе микросомального окисления часто образуются реакционноспособные промежуточные продукты. Некоторые из них нестабильны и подвергаются дальнейшему превращению, другие достаточно устойчивы. К числу таких соединений, подвергающихся биотрансформации с образованием активных промежуточных продуктов в ходе I фазы метаболизма, относится тетрахлорметан [40].

1.4.1 ЦитохромР-450-зависимая монооксигеназная система

Энзимы рассматриваемой группы, цитохромР-450 зависимые оксидазы (Р-450), как правило, обладают низкой субстратной специфичностью, вызывая превращения веществ самого разного строения, и потому часто называются оксидазами смешенной функции. Р-450 относятся к группе гемопротеинов типа цитохромов b ? пигментов, активно связывающих монооксид углерода [5].

Р-450 представляют собой семейство энзимов, локализующихся в эндоплазматическом ретикулуме, которые могут быть разделены с помощью иммунологических и иных методов на несколько подсемейств. Отдельные ткани содержат несколько различных изоформ Р-450. Встречаются тканеспецифичные формы энзимов [41]. Изоферменты Р-450 часто проявляют перекрестную субстратную специфичность, таким образом, как правило, более чем один изофермент принимает участие в метаболизме ксенобиотика [37]. Наличие специфических форм энзимов обусловлено генетическими механизмами, а повышение содержания в тканях различных изоферментов индуцируется действием на организм различных ксенобиотиков: лекарств, ядов, экотоксикантов. Р-450 подвержены не только активации, но и инактивации, как исходными ксенобиотиками, так и их реактивными метаболитами [26].

Реакции микросомального окисления, протекающие при участии Р-450, как правило, зависят от содержания O2 и НАДФН в среде. Молекулярный кислород активируется цитохромомР-450 (или другими цитохормами, например, Р-448) [26] . Активация осуществляется с помощью НАДФН при участии флавин-содержащего энзима НАДФН-цитохромР-450 редуктазы. Поскольку донором электронов в превращениях субстратов, катализируемых этими энзимами, является НАДФН, суммарное уравнение реакции может быть записано следующим образом [39]:

RH + O2 + HAДФН + Н+ > ROH + НАДФ+ + Н2О(1.21)

ЦитохромР-450, НАДФН-цитохромР-450 редуктаза и фосфолипиды биологических мембран, в которые встроены оба энзима, образуют микросомальный монооксигеназный комплекс. Несмотря на то, что энзимы комплекса связаны с биологическими мембранами, их свойства могут быть изучены in vitro [42].

Установлены основные закономерности протекания ферментативных процессов с участием микросомального монооксигеназного комплекса (Рисунок 2) [43].



Рисунок 2 ? Упрощенная схема превращения субстрата при участии цитохромаР-450

Как видно из рисунка на начальном этапе ксенобиотик (S) вступает во взаимодействие с окисленной формой цитохромаР-450. Затем к этому комплексу с помощью НАДФН-зависимой цитохромР-450 редуктазы присоединяется электрон, донором которого является восстановленный НАДФН [44]. После этого комплекс взаимодействует с кислородом. После взаимодействия со вторым электроном (донор ? НАДФН) происходит активация связанного с цитохромом кислорода, который приобретает способность связывать протоны и образовывать воду. Образовавшаяся при этом форма цитохромаР-450 гидроксилирует субстрат [7].

Метаболизируемое вещество не связывается непосредственно с геминовой группой цитохромаР-450. Оно присоединяется к белковой части цитохрома [37]. Процесс превращения ксенобиотиков чувствителен к СО, поскольку это вещество вытесняет кислород из связи с железом геминовой группы цитохромаР-450. Некоторые оксидазы резистентны к СО (образование N-оксидов) [22].

Поскольку Р-450 ? гемопротеины, их активность отчасти регулируется процессами синтеза гема, т.е. связана с метаболизмом железа [42]. Нарушение метаболизма, голодание, понижение соотношения НАДФН/НАДФ+ могут приводить к снижению активности Р-450 [45].

Окисление ксенобиотиков при участии Р-450 - основной механизм их биотрансформации в I фазе метаболизма. Р-450 катализирует окисление практически всех классов органических молекул. Субстратом для энзимов являются и простые молекулы типа хлороформа и стероиды и сложные гетероциклические соединения, например антибиотик циклоспорин [46]. Р-450 могут катализировать не только окисление, но и восстановление некоторых биосубстратов, например четыреххлористого углерода, галотана, некоторых других галогенированных углеводородов с образованием свободных радикалов. Такое необычное превращение реализуется в условия пониженного парциального давления кислорода в тканях [39].

1.4.2 Конъюгация

Превращение молекул в первой фазе биотрансформации усиливает их полярность, уменьшает способность растворяться в липидах. Уже только благодаря этому целый ряд чужеродных соединений лучше выделяется с мочой [47]. Эффект еще более усиливается, когда к образовавшимся в ходе I фазы метаболизма продуктам присоединяются такие эндогенные вещества, как ацетат, сульфат, глюкуроновая кислота, глутатион и т.д. Как и энзимы I фазы метаболизма ксенобиотиков, энзимы II фазы обладают слабой субстратной специфичностью и участвуют в превращениях большой группы химических веществ [26].

Рассматриваемую группу энзимов можно классифицировать следующим образом:

1. Энзимы, формирующие эфирные или амидные связи с промежуточными метаболитами:

? ацетил КоА: амин N-ацетилтрансфераза;

? сульфотрансфераза;

? УДФ-глюкуронозилтрансфераза;

2. Энзимы, активирующие конъюгацию веществ с глутатионом: глутатион S-трансферазы;

3. Энзимы, активирующие конъюгацию веществ с цистеином: цистеин-конъюгирующие в-лиазы [7].

В ряде случаев, в ходе метаболизма ксенобиотиков во II фазе также образуются токсичные продукты (токсификация).

Наиболее важные ферменты второй фазы относятся к классу трансфераз. Наиболее широка и многообразна активность семейства глутатионтрансфераз, метаболизирующих тысячи ксенобиотиков. Большинство этих ферментов находится в гиалоплазме, но один из них локализован в мембранах ЭПС и митохондрий, другой - в хроматине [26]. Основная реакция - конъюгация с восстановленным глутатионом (GSH) - протекает в двух вариантах: 1) присоединение к субстрату (алкены и эпоксиды) полной молекулы GSH, 2) нуклеофильное замещение по электрофильным атомам С (галоген- и нитроалканы), N (тринитроглицерин), S (тиоцианаты и дисульфиды) или P (метилпаратион) [48].

R + GSH > HRSG,(1.22)

RX + GSH > RSG + HX(1.23)

При дальнейшем метаболизме глутатионовые конъюгаты переходят в меркаптуровые кислоты или меркаптаны. Кроме того, глутатионтрансферазы восстанавливают органические гидроперекиси в спирты и изомеризуют некоторые стероиды и простагландины [49].

Локализованные в основном в ЭПС уридиндифосфат(УДФ)-глюкуронилтрансферазы присоединяют остаток глюкуроновой кислоты, а гиалоплазматические сульфотрансферазы - сульфат к фенолам, спиртам и аминам. Эти ферменты метаболизируют, например, анилин, фенол, морфин, левомицетин, салицилат, парацетамол, зидовудин (лекарство против СПИДа), пероральные контрацептивы [36].

Ацетилтрансферазы метаболизируют путем присоединения ацетила к N- (сульфаниламиды, противотуберкулезные средства изониазид и n-аминосалициловая кислота) или к О- (некоторые канцерогены). Мембранные и гиалоплазматические метилтрансферазы метилируют ОН-, NH2- и SН-группы и метаболизируют, например, пиридин, тиоурацил, унитиол, кокаин [35].

Функционирование всех ферментов второй фазы ограничивается тем, что они метаболизируют только те вещества, которые имеют функциональные группы. Именно поэтому эти ферменты чаще включаются после образования или освобождения функциональных групп ферментами первой фазы, то есть во второй фазе метаболизма ксенобиотиков [50]. Однако трансферазы имеют важные достоинства: 1) они есть во всех клетках, поэтому: 2) функционируют при любых путях поступления ксенобиотиков в организм, 3) осуществляют или завершают детоксикацию, а иногда исправляют ошибки первой фазы [39].Совместное функционирование обеих фаз метаболизма особенно эффективно. В подавляющем большинстве случаев оно обеспечивает обезвреживание десятков тысяч ксенобиотиков всех химических классов и самых разных групп: токсических веществ, мутагенов, канцерогенов, пестицидов (средств для борьбы с вредными растениями и животными), красителей, растворителей, лекарств и др. [7]. Метаболизм ксенобиотиков происходит в разных частях клетки, но наиболее активные системы находятся в ЭПС и гиалоплазме. Это обеспечивает метаболизм или связывание ксенобиотиков на дальних подступах к наиболее жизненно важным частям клетки - ядру и митохондриям. В результате увеличивается устойчивость клеток и организма, возникает возможность сохранить здоровье и жизнь в условиях загрязнения среды [26].

1.5 Механизмы воздействия тетрахлорметана

Как уже отмечалось, развитие цепных радикальных окислительных процессов сопровождается образованием перекисных (RО2?) и алкоксильных (RО?) радикалов. Многие факторы физической и химической природы могут инициировать зарождение органических радикалов в живых организмах. В данной работе более подробно следует остановиться на таком экзогенном химическом факторе как ксенобиотики [51].

Эффективными инициаторами радикалообразования, особенно в клетках печени, могут выступать монооксигеназы, с этим связано токсичное действие галогенированных углеводородов, таких как тетрахлорметан и бромбензин [52]. В клетках тетрахлорметан (ССl4) метаболизируется монооксигеназной системой с образованием трихлорметильного радикала (ССl3?) [3]. Это происходит благодаря тому, что связь углерод-хлор в молекуле ССl4 сильно поляризована, и углерод имеющий положительный заряд, легко принимает электрон с активного центра цитохрома Р-450. В результате последующего гомолитического распада восстановленного интермедиата и образуется ССl3? [53]:

CCl4 + е? > ССl4?? > ССl3? + Cl?(1.24)

Образовавшийся трихлорметильный радикал быстро взаимодействует с молекулярным кислородом с образованием трихлорметилпероксильного радикала:

ССl3? + О2 > ССl3О2?(1.25)

Трихлорметилпероксильный радикал (ССl3О2?) способен разрывать С-Н-связи в липидах с образованием липидных радикалов:

R-Н + ССl3О2? > R? + ССl3О2Н(1.26)

Показано, что CCl3O2

? очень быстро реагирует с полиненасыщенными жирными кислотами и еще более активно - с различными антиоксидантами: аскорбиновой кислотой, в-каротином, б-токоферолом, прометазаном [54]. Радикал CCl3

? реагирует с различными субстратами значительно медленнее, чем CCl3O2

?. Кроме того, CCl3? взаимодействует с полиненасыщенными жирными кислотами и антиоксидантами практически с одинаковой скоростью [55]. Поэтому б-токоферол и прометазан, эффективно ингибируя реакции CCl3O2

* с полиненасыщенными жирными кислотами, не оказывают существенного влияния на реакции этих субстратов с CCl3? [56].

Образующиеся в процессе метаболизма тетрахлорметана радикалы CCl3? и CCl3O2? вовлекаются в последующие метаболические процессы через реакции отрыва водорода и галоалкилирование. В результате первой реакции образуется хлороформ и радикал молекулы донора водорода [57]. В случае, если донором водорода являются полиненасыщенные ацилы мембранных фосфолипидов, образующиеся радикалы инициируют процесс перекисного окисления липидов. В результате реакций галоалкилирования трихлорметильная группа ковалентно связывается с различными молекулами: липидами, белками, нуклеиновыми кислотами, пиримидиновыми и пуриновыми основаниями [58]. Так как б-токоферол и прометазан ингибирует перекисное окисление липидов, инициируемое тетрахлорметаном в микросомах печени и изолированных гепатоцитах, не оказывая существенного влияния на процессы ковалентного связывания, был сделан вывод о том, что в реакции отрыва водорода участвует, главным образом, активный радикал CCl3O2, а галоалкилирование обусловлено ковалентным связыванием с различными субстратами радикала CCl3? [59]. В экспериментах in vitro установлено, что повреждение компонентов электронтранспортных цепей эндоплазматического ретикулума и инактивация системы микросомального окисления, нарушение системы кальциевого гомеостаза, секреция липопротеидов и жировое перерождение печени обусловлены, главным образом, галоалкилированием [56]. Однако показано, что основной причиной повреждения и гибели изолированных клеток печени при их инкубации в присутствии галогензамещенных углеводородов является развитие перекисного окисления липидов [59].

Повреждающее действие перекисного окисления липидов обусловлено, по-видимому, двумя механизмами. Во-первых, изменяются структурно-функциональные свойства мембран в результате потери полиненасыщенных жирных кислот и накопления окисленных липидов. Во-вторых, образуются низкомолекулярные, токсичные продукты окисления мембранных липидов [26]. Среди этих соединений особое значение придается насыщенным и ненасыщенным альдегидам. Так, малоновый диальдегид, один из конечных продуктов ПОЛ, образует внутри- и межмолекулярные перекрестные сшивки, в результате происходит инактивация ферментов, в том числе и не имеющих сульфгидрильных групп, сшивание белков и нуклеиновых кислот. Получающиеся в этих случаях флуоресцентные хромофоры, так называемые шиффовы основания, имеют следующую структуру: R-N=CH-CH=CH-NH-R1 [27].

При рассмотрении роли галоалкилирования и перекисного окисления липидов в патогенетических эффектах галогензамещенных углеводородов следует учитывать, что в нормальном организме только незначительная часть образующихся пероксидов липидов вовлекается в процессы радикального разрушения до альдегидов и других токсичных низкомолекулярных продуктов [30]. Основное количество гидропероксидов быстро восстанавливается в соответствующие оксисоединения, неспособные участвовать в дальнейших свободнорадикальных процессах [26]. Установлено, что образующиеся при ССl4-инициируемом ПОЛ гидропероксиды липидов (LOOH) быстро восстанавливаются в соответствующие спиртовые группы, не вовлекаясь в последующие процессы радикальной деградации, а сопряженные двойные связи (диеновые коньюгаты) сохраняются в молекулах образующихся продуктов (LOH) [40]. Интересно, что если в экспериментах использовались животные, предварительно содержащиеся на диете, исключающей содержание витамина Е и селена, доля гидропероксидов липидов среди продуктов ПОЛ существенно увеличивается. Напротив, дополнительное введение в пищу селена, витамина Е или других антиоксидантов приводило почти к полному ингибированию перекисного окисления липидов [60].

Таким образом, активация процессов ПОЛ под действием галогенированных углеводородов является причиной развития токсических гепатитов [3]. Перекисное окисление мембранных липидов приводит к деструкции мембран, в результате цепной реакции из липидов мембраны образуются новые свободные радикалы, уже вторично повреждающие другие органеллы клетки, что в конечном итоге и приводит к некрозу гепатоцитов [61].

1.6 Антиоксидантная защита тканей

Активные формы кислорода являются нормальными метаболитами обменных процессов в организме и выполняют определённую физиологическую роль в функционировании клетки. Но при определённых состояниях, сопряжённых с интенсивной генерацией АФК, последние начинают проявлять свою реакционную способность, связанную с разрушением клеточных структур и токсической окислительной деструкцией биомолекул тканей - белков, липидов, углеводов и нуклеиновых кислот [13]. Исходя из высокой реакционной способности АФК, их содержание в клетках должно поддерживаться на определённом уровне, необходимом для обеспечения жизненно важных метаболических процессов в клетке [12]. Это осуществляется за счёт функционирования многокомпонентной антиоксидантной системы (АОС), разнообразной по механизму действия и химической структуре. Особенностям функционирования АОС, её классификации, изучению механизма действия посвящены многочисленные обзоры и монографии [62].